治疗局部缺血的基因转移配方及方法

专利名称：治疗局部缺血的基因转移配方及方法
技术领域：
本发明涉及通过转移并表达能够编码血管生成因子的核酸而刺激血管的生成，具体地讲，本发明涉及可以用来改善外周血管及冠状动脉疾病中局部缺血症状的配方及方法。本发明的优先权是基于2000年10月20日的第60/242,277号美国临时申请和2001年5月29日的第60/294,454号美国临时申请。
背景技术：
“局部缺血”(ischemia)是描述机体某一器官或组织供血不足的医学术语。局部缺血通常是由向组织供应富氧血液的动脉血管狭窄或阻塞所引起；严重的、拖延的局部缺血可导致相关组织死亡(梗死)。
冠状动脉疾病(CAD)是指为心脏的肌肉组织(心肌)供应氧合血的血管疾病所导致的心脏局部缺血。一条或多条冠状动脉血管发生狭窄或闭塞，将导致心脏局部缺血。暂时性的局部缺血是指由于运动负荷加大、紧张等原因使得血供不能满足心脏对氧的需求而导致的状况，这会引发心绞痛或胸部疼痛。严重的或完全的血流梗阻将使心肌死亡，也即通常所说的“心肌梗死”(心肌梗塞发作，heart attack)。在美国，心脏病已是死亡的主要原因。目前，治疗心脏局部缺血的方法主要有通过药物疗法和体育调节以降低心脏对氧供的需要，或者利用药物、血管成形术、旁路搭桥术等，以改善心脏的血液流动。
外周血管性疾病(PAD)是指除心脏及大脑之外的血管性疾病。腿部及上肢肌肉的血管狭窄是外周血管性疾病的典型病因，髂肌-腘动脉轴的一处或多处狭窄，将导致下肢肌肉及皮肤血流灌注减少并发展为进行性组织局部缺血。外周动脉性疾病则是一种与冠状动脉疾病及颈总动脉性疾病相似的症状。
在外周动脉性疾病中，脂肪沉积在动脉管壁并影响血液循环，尤其是对腿部及脚部的动脉影响更为明显。动脉粥样硬化是导致下肢慢性动脉阻塞疾病的最常见原因，其临床症状表现有间歇性跛行(局部缺血疼痛)、溃疡、坏疽等。动脉粥样硬化导致的动脉狭窄或阻塞，在运动或休息时会减少下肢血流量，其严重程度有赖于侧支循环建立及利用的程度。最易受动脉粥样硬化影响的是股浅动脉及腘动脉，其次是远端主动脉及主动脉分为两支髂动脉处的主动脉叉。
每年用于医疗保健的开销中，外周动脉性疾病占了相当大的比例。而且，除了经济因素外，外周动脉性疾病也是导致残疾、失业/降薪及生活不便的主要原因(参阅Rosenfield，K.和Isner，JM.(1998)Comprehensive Cardiology Medicine，J.Topol编辑，Lippincott Raven出版商，费城，3109-3134)。据估计，在美国，每20个年龄在50岁以上的人中就有1个罹患外周动脉硬化，或者说其总数已达8,000,000人，且男性比女性更多(参阅Creage，MA.(2001)CardiolRev.9，238-245)。
对于外周动脉硬化的治疗方法除了手术疗法外，还有非手术法，比如体育锻炼、危险因子调节(risk factor modification)及药理学治疗等，包括放射干涉法如血管成形术、支架置入以及手术疗法如动脉内膜切除术、搭桥术及切除术。血管成形术是将一根顶端带有一气囊的导管伸入动脉狭窄部分，该气囊事先排除气体，然后将该气囊充气而达到扩张狭窄部分的目的。但是，目前尚无有效的治疗下肢血管形成缺陷的药理学方法。
许多患有持续性局部缺血性溃疡的患者并不适宜进行手术或采用血管内的治疗方法。
为了适应血流灌注不足，患有冠状动脉疾病的心脏的血管就会生成额外的血管，可将其称之为侧支组织(collateral)；这些血管能够在狭窄的冠状动脉区域重建立血流通路，并以此灌注心肌。在治疗心肌及外周组织的局部缺血时，导入促血管生成因子或促血管生长因子，可能能够增加局部缺血组织的灌注。
最近，在动物的心肌局部缺血和后肢局部缺血模型研究中，其结果证实了采用重组促血管生成因子来促进形成侧支动脉的可行性，如采用成纤维细胞生长因子(FGF)家族(Yanagisawa-Miwa等人，Science，2571401-1403(1992)和Baffour等人，J Vasc Surg，16181-91(1992))、内皮细胞生长因子(ECGF)(Pu等人，JSurg Res，54575-83(1993))、血管内皮生长因子(VEGF)(Takeshita等人，Circulation，90228-234(1994)和Takeshita等人，J Clin Invest，93662-70(1994))以及血管生成因子β-1(angiopoietin)与内皮细胞生长因子的组合(Chae，J.K.等人，Artherioscler Thromb Vasc Biol.December 2000)。
为了使局部浓度到达最高，而要反复地在肌肉内应用生长因子，这种反复的应用正是重组蛋白疗法的主要限制。在治疗过程中，重复应用重组蛋白，只会产生间歇性的蛋白浓度高峰。将重组的内皮细胞生长因子65(VEGF65)与成纤维细胞生长因子b蛋白(bFGF protein)应用于心肌局部缺血的患者，其最近的第二阶段的试验结果为患者在三个月时呈现阴性或者在一年时呈不确定状态，这说明重组蛋白在组织内存留期较短，不能获得期望的治疗效果(Chiron Crop.PressRelease 3/12/2000；http//www.prnewswire.com/CHIR；Henry，TD等人(1998)，J.Am.Coll.Cardiol.31，65A.)。
最近，基因治疗已使得在药理学领域能够转移表达构建所携带的功能性重组基因，该此构建可以调节这些基因在宿主体内细胞的表达。将与表达调控元件相关的基因而非纯化的或重组的蛋白输送入病人体内，可在病人体内局部生成蛋白。这一病人体内生成蛋白，模仿了其自然表达，在单次给药的治疗浓度下会导致所需蛋白局部生成的延长。
动脉基因转移，为肢体局部缺血的患者提供了血管生成的另一种治疗方法(Kanno，S.等人(1999)，Circulation 99，2682-2678；Liau，G.等人(2001)，Drug Disc Today 1，689-597；Rissanen，TT.等人(2001)，Eur.J.Clin.Invest.31，651-666)。与重组基因治疗方法相比，基因转移治疗的优势在于可在数天至数周内维持局部适当高的浓度(Isner JM.和Asahara T.(1999)，J.Clin.Invest.103，1231-1236)。这一类的各种血管生成方法正在临床试验中进行验证(Carmeliet，P.和Jain，RK.(2000)，Nature 407，249-257)。
与重组蛋白治疗相比，将血管生成因子转移作为一种基因治疗手段有望提高疗效、降低用药频率、减少全身毒性反应。但是，有效的基因治疗必须能够识别可达到治疗目的蛋白，形成能够控制基因生成的表达载体，所说基因对目的蛋白进行编码，而且还要能够对转移至细胞的表达载体进行有效地定位转移，该表达载体能够表达目的蛋白而又不引起局部组织损伤及全身毒性反应。
人类临床实验证实以转移编码血管内皮细胞生成因子的DNA作为外周性血管疾病的基因治疗手段，可促进血管生成。
然而，在接受治疗的90例患者中有31例(34％)发生了下肢水肿，说明血管内皮生长因子表达可能会有增加血管通透性的副作用(Baumgartner等人，Ann Intern Med(2000)，132(11)880-4)。
据最近文献报道，以表面覆盖日本血细胞凝聚素病毒(HVJ)的脂质体转移肝细胞生长因子(HGF)基因，将此脂质体直接注射入心脏组织使其在心包内孵育的同时与冠状动脉直接融合并过度表达，发现梗死的心肌部位血流增加(Aoki等人，Gene Therapy 7(5)，417-427，2000)。
在有效的基因治疗中，最关键的是转移基因的方法或载体必须不能伴发组织损害。据报道，可以应用病毒载体在体内将基因转移至血管组织的方法，包括采用泊洛沙姆(poloxamer，聚羟亚烃)凝胶来限制病毒在给药部位的扩散(Feldman等人，Gene Therapy(1997)4，189-198；Van Belle等人，Human Gene Therapy(1998)9，1013-1024；Hammond等人，US Patent No.6,100,242)。
Wolf等人在美国专利5,693,622中描述了用直接注射法将非病毒的裸露DNA转移入心脏；Leiden等人在美国专利5,661,133中也描述了用直接注射法将基因转移入心脏。也有报道，采用选择压力将病毒转移入心脏来调节冠状动脉的逆输注(Boekstaegers等人，GeneTherapy(2000)7，232-240)。但是，病毒载体有几个严重的缺点它必须在哺乳类动物培养物中才能生存，并且能被来自宿主细胞其他的病毒污染，或者被某些必须媒介物成分如小牛血清等污染；病毒载体还肯定会将外源的病毒蛋白导入宿主体内。在体内应用这些载体很可能会使宿主产生强烈的免疫反应。
在过去的5年中，以血管生成因子治疗进展性缺血性心脏病的领域已取得长足进展(Simons等人，Circulation(2000)102e73-e86)。尽管近来在治疗局部缺血的疗法方面取得了进展，但仍需进一步对用作基因治疗的蛋白作出鉴定，选出能够促进局部缺血性组织中侧支血管生成而又没有副反应的蛋白，并且所使用的转移方法和配方应该能将基因高效转移到局部缺血组织但又不引起局部的或全身毒性反应或病理性免疫反应。
发明概述本发明者发明了一种新型的将血管生成因子高效转移至心脏及外周血管的方法，并且该方法能够避免发生现有转移技术所固有的毒性反应问题。
在具体实施方案中，基因聚合物转移系统(polymeric genedelivery system)能够保护表达血管生成因子的质粒不被细胞外核酸酶降解，并帮助其在注射点周围被骨骼肌纤维及心肌纤维吸收。
在具体实施方案中，还提供了一种有效转移基因的复配表达系统(formulated expression system)，该基因可以编码新型血管生成因子即内皮细胞发育位点-1(Del-1，Developmental Endothelial Locus-1)蛋白。
在具体实施方案中，还提供了一种能够编码内皮细胞发育位点-1(DEL-1)的质粒DNA，它可以使内皮细胞发育位点-1在局部持续表达，表达方式与内流性内皮细胞发育位点-1的自分泌/旁分泌方式非常相似。局部转移的方式减少了全身性应用以及与全身性应用有关的毒性反应。
在具体实施方案中，还发现了一种非病毒质粒介导(Dlasmid-based)的内皮细胞发育位点-1基因配方(formulation)，该配方可以用作远端肢体、心肌、患有肾血管性疾病的肾脏的局部性缺血，以及因脑血管疾病、创伤愈合、非连续性骨折、缺少血供的股骨头坏死等造成的局部缺血的治疗。内皮细胞发育位点-1基因的应用途径有肌注、血管内注射、关节腔内注射或通过逆行静脉进行灌注；在具体实施中，这种逆行静脉灌注可以是肢体静脉、肾静脉、肝静脉、脑静脉或心脏静脉等。
在具体实施方案中，内皮细胞发育位点-1表达系统配方包括质粒表达系统并配有泊洛沙姆基因聚合物转移系统，该质粒表达系统含有能够编码人类全长内皮细胞发育位点-1蛋白的真核表达盒(expression cassette)。
在具体实施方案中，复配的内皮细胞发育位点-1表达系统可保存于单个小瓶中、并在2-8℃时性质稳定；如有必要，可以重复应用复配的内皮细胞发育位点-1表达系统治疗组织局部缺血。
内皮细胞发育位点-1(Del-1)是α-V-β-3(avb3)整合素(integrin)受体的配体。因而，在另一具体实施方案中，将内皮细胞发育位点-1与另一种生长因子结合，该生长因子是另一种不同的受体的配体，而该配体对于新血管的生成是很重要的。
在具体实施方案中，将编码内皮细胞发育位点-1的核酸与编码血管内皮生长因子(VEGF)的核酸一起转移，以调节毛细血管的生成和血管的生成，VEGF是血管内皮生长因子-2(VEGF-2)受体的配体。联合应用内皮细胞发育位点-1及血管内皮生长因子基因，可以解决几点医疗中未遇到过的需要，如冠状动脉疾病、创伤愈合、外周动脉疾病及类风湿性关节炎等。


为了更好地理解本发明，现结合附图，采用优选的实施方案加以详细阐述。
图1显示了质粒与泊洛沙姆188的浓度对转移至鼠骨骼肌的质粒表达的影响。
图2显示了与聚合物转移系统(polymer delivery system)相比，体内注射荧光素酶表达质粒等渗盐水的大鼠胫前肌肉中荧光素酶的表达。
图3a和图3b显示了人内皮细胞发育位点-1质粒表达图。
图4显示了鼠内皮细胞发育位点-1在小鼠胫前肌肉的表达。
图5显示了在常氧状态下，内皮细胞发育位点-1的表达小鼠骨骼肌毛细血管密度的影响。
图6显示了在常氧状态下，注射不同剂量鼠内皮细胞发育位点-1质粒的CD1小鼠的胫前肌肉中，CD31的表达与鼠内皮细胞发育位点-1的表达的关联。
图7显示了结扎股动脉造成后肢局部缺血后，人内皮细胞发育位点-1对运动耐受情况的影响、图8显示了内皮细胞发育位点-1与血管内皮生长因子基因药物对兔模型的后肢局部缺血的作用。
图9显示了心肌内注射复配的pLC1088质粒(10微升)后，荧光素酶在鼠类心肌的表达。
图10显示了直接进行心肌内注射(10微升)后，荧光素酶在鼠类心肌中表达的代表性数据资料。
图11a显示了在心脏膈膜处通过冠状窦将转移导管插入。
图11b显示了在心脏胸骨面将转移导管置入心脏大静脉。
图12是用于pDL1680表达质粒的人内皮细胞发育位点-1的序列(SEQ ID NO1)。
图13是用于pDL1680人内皮细胞发育位点-1表达质粒(SEQ IDNO2)的序列。
图14显示了用含聚合物的配方进行表达时其重复性得以改进。
图15显示了人内皮细胞发育位点-1mRNA在猪心脏中的表达，该受体猪已用pDL1680盐溶液或pDL1680与5％泊洛沙姆188复配物进行了rIV转移处理。
图16是密码子优化的血管内皮生长因子165(SEQ ID NO3)的核酸序列。
图17显示了第七天进行CD31染色的结果(A)对照组；(B)内皮细胞发育位点-1；(C)血管内皮生长因子；(D)内皮细胞发育位点-1神经细胞生长因子。
图18是表示泊洛沙姆及逆转泊洛沙姆特征的表格。
图19是用于肌肉转移的泊洛沙姆特征。
优选实施方案的详细描述本发明中，术语“血管生成蛋白”(angiogenic protein)是指任何能够直接或间接导致新血管生成的蛋白、多肽、突变蛋白或片段；这样的蛋白包括如内皮细胞发育位点-1(Del-1)、酸性和碱性的成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、α-和β-转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、血小板衍生内皮生长因子(PDECGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素生长因子(IGF)、促红细胞生长素、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)以及氧化氮合成酶(NOS)。优选地，血管生成蛋白包含一段分泌信号序列，以便分泌蛋白。Del-1及血管内皮生长因子均为优选的血管生成蛋白。
内皮细胞发育调节位点-1(Del-1)是最近鉴定的、具有内皮细胞特异性的细胞外基质蛋白，它在胚胎期血管发育过程中即开始表达(Penta，K.等人(1999)，J.Biol.Chem.274，11101-11109)。Del-1基因是在转基因鼠通过增强子诱捕(enhancer trap)而获得，它主要在发育中的脉管系统的内皮以及直接比邻细胞中表达(Hidai，C，等人(1998)，Genes Dev.1，21-33)。Del-1蛋白及人和鼠Del-1的核苷酸序列均为美国专利US5,877,281及US5,874,562的研究对象，在此引用这两件专利作为对比文件。
对实体肿瘤中及急性局部缺血性啮齿类骨骼肌中的Del-1表达进行进一步分析，发现Del-1基因的表达在活性血管生成区域中局部上调。出生后，在正常状况下Del-1不表达，但在局部缺血及受到其他血管生成性刺激时其表达上调；通过封闭α-v、β-3整连蛋白受体显示Del-1与内皮细胞的粘附、迁移有关；绒毛膜尿囊膜分析显示重组的Del-1能促进血管形成。
由Del-1编码的全长Del-1蛋白，可以对质粒进行编码，其分子量大约为52kDa，包括三个表皮生长因子(EGF)样重复片断以及随后的两个网柄菌素I样的结构域；在Del-1中第二个表皮生长因子样重复片段的B环中包含有一个RGD序列，该序列可以调节与α-v、β-3(avB3或avb3)整连蛋白受体的结合。已经证实，RGD序列是一种与纤连蛋白、网柄菌素I、巢蛋白/触觉蛋白及肌腱蛋白结合的细胞结合位点(Anderson，1990，Experientia 462)。Del-1的整体结构见图3a。
已有的资料表明，Del-1的作用机制与已知的整连蛋白受体的配体及血管生成因子不同。与av 3整连蛋白结合的配体为局部缺血内皮提供抗凋亡信号，并且对于血管生成也是必须的。鉴于Del-1蛋白的复杂结构以及全长Del-1序列C末端粘附于内皮，但并不诱导血管生成，因而推测Del-1可能是与地第二种尚未知道的受体发生作用(Penta等人J.Biological Chemistry(1999)27411101-11109)。
本发明者将非病毒性的复配Del-1表达体系通过肌注方式导入后肢局部缺血的小鼠及兔模型，研究其治疗潜能。通过结扎18只新西兰白兔髂外动脉远端及切除股动脉，制作成左后肢局部缺血模型；手术当天，对白兔缺血侧肢体进行血管造影。术后第三天，将编码VEGF、Del-1或者作为阴性对照的空白载体的质粒5mg注射入白兔左侧股四头肌中。治疗后30天，再次对白兔缺血肢体进行血管造影术，并且通过RT-PCR、CD-31免疫测定方法，采集股四头肌，对疗效进行评估，分析侧支血管在中间大腿处的形成情况。通过结扎髂内动脉远端及股动脉和股深动脉分杈点的方法，制作32只CD-1小鼠的局部缺血模型。术后当天，将70mg编码VEGF、Del-1或者空白载体的质粒通过肌注给药途径导入小鼠。也采用了假对照组，即其后肢如前述进行手术但术后不给予质粒注射。使这些实验动物在活动平板上跑动，记录下他们运动衰竭的时间。在新西兰白兔模型中，给予复配非病毒质粒的VEGF、Del-1治疗组，其新生侧支血管的生成有显著的差别(P＜0.01)。在小鼠模型中，Del治疗组的毛细血管与肌细胞的比率较对照组增加1.5倍，具有显著差异(P＜0.05)，并且Del-1治疗组在活动平板实验中衰竭时间也显著提高(P＜0.05)。
在另一具体实施方案中，采用Del-1联合另外一种内皮细胞生长因子共同调节毛细血管的形成与血管的形成，后者的受体与Del-1的受体不同。Del-1是avb3整连蛋白受体的配体(Hidai，C等，Genes andDevelopment 1998，1221-33.)。
相反，血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1，a.K.a.flt-1)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2，人类a.k.a KDR)的配体。目前的资料表明，flt-1介导的信号主要参与内皮细胞的迁移，但对促进内皮细胞扩增的作用不象KDR是必须的。VEGFR-1可能有拮抗VEGFR-2活性的作用(Yancopoulos，GD等人，Nature(2002)407242)。avb3整连蛋白受体和VEGF受体-2与两条重要的信号转导通路有关。刺激avb3整连蛋白受体，可以调控内皮细胞的迁移，对血管发生具有重要作用。VEGF受体-2是一受体酪氨酸激酶，受到刺激时可以发生自身磷酸化，促发一系列激酶的级联反应从而引起内皮细胞的扩增和运动增强。刺激VEGFR-2可以引起avb3上调。尽管通过结扎VEGFR2能使avb3上调，但在基质中可能已存在足够的配体使体系最大化，而进一步添加Del-1将不再会产生添加效应。本发明者发现，添加Del-1(一种独特的血管生成整连蛋白受体)，不仅能够协同VEGF促进血管生成，而且能够显著促进内皮细胞迁移与扩增。
本发明者意外地发现，上述两种基因在亚剂量(sub-maximallevel)时进行转移，其促使内皮细胞迁移的效果要明显优于单一基因最大剂量(maximal dose)时的情况。以前的研究证明，在受刺激时这两种受体之间会发生相互作用，尽管它们中的任一个均不需要通过直接与其配体结合而与另一个结合。然而，一个受体的刺激和未结合受体的随后结合，只能产生部分结合。本发明的基础是，同时给予两种配体Del-1及VEGF，可以达到avb3整连蛋白受体与VEGFR-2的完全结合。
此处所用的术语“Del-1基因”是指编码Del-1基因家族功能蛋白的所有DNA序列。根据本发明，任何能够编码Del-1基因产物氨基酸序列的核酸序列，可以用来产生分子重组体，这种重组体可以控制Del-1基因产物的表达。由于先天性基因编码缺陷，其它的、能够编码基本上同样的氨基酸序列或功能上等效的氨基酸序列的DNA序列，也可以用于本发明。这样的DNA序列包括那些在“严格条件”下能够杂交到鼠和/或hDel-1序列的DNA序列；此处，术语“严格条件”是指如下的杂交条件(1)使用低离子浓度和高温清洗，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS 50℃；(2)在杂交过程中使用甲酰胺等变性剂，例如42℃的50％(vol/vol)的甲酰胺溶液并添加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH为6.5的磷酸钠缓冲液(含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠)；或者(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M焦磷酸钠、5×Denhard’s溶液、超声降解的鲑鱼精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS、10％硫酸右旋糖苷，并于42℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中清洗。本发明所使用的改性后的DNA序列可能包括不同核苷酸残基的缺失、插入或者替换等，从而生成能够编码相同的或者功能等效的基因产物的序列。基因产物本身在Del-1序列内可能会出现氨基酸残基的缺失、添加或者替换，这会导致沉默改变，从而可以产生功能等效的Del-1蛋白。此类氨基酸替代物可以根据其在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或残基的双亲性等方面的相似性来制备。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸；具有不带电荷极性首基的氨基酸具有相似的亲水性，包括甘氨酸、天冬酰氨、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；具有非极性首基的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、色氨酸。可以根据不同的目的，来设计本发明的DNA序列，以改变Del-1的编码序列，包括可以改进基因表达及加工的改变，但不仅限于此。例如，利用本领域所熟知的技术可以诱导突变发生，如位点导向的诱变、插入新的限制位点、改变糖基化方式、磷酸化等。在本发明的另一具体实施方案中，Del-1或者修饰的Del-1序列与异种序列结合后编码融合蛋白。为了表达具有生物学活性的Del-1，将编码Del-1或者编码Del-1功能等效物的核苷酸序列插入到一个合适的表达载体，例如具备可以转录和翻译所插入编码序列所需要素的载体。
此处所用的术语“Del-1蛋白”是指所有由Del-1基因序列衍生的核酸所编码的、具有Del-1活性的多肽序列。
此处所用的术语“血管内皮生长因子”(“VEGF“)是一种46-48kDa(亚基为24kDa)的、同源二聚的、糖基化程度很高的蛋白，尽管糖基化并非其生物活性所必需的。同源二聚体的亚基(subunit)与二硫键相联。人类的VEGF基因大约长12kb，含有8个外显子。已证明至少有4种编码VEGF-A的mRNA，并且具有组织表达特异性。在大多数组织中，此类因子的165个氨基酸形式(VEGF-165)是最常见的形式。VEGF-121和VEGg-165以可溶性分泌的形式存在，而VEGF-189和VEGF-206大多结合在细胞表面或者基底膜中含肝素的蛋白聚糖上。这些因子通过不同的剪切方式形成，其中，含165个氨基酸残基的VEGF缺乏外显子6所编码的序列，而含121个氨基酸残基的VEGF则缺乏外显子6和7所编码的序列。
170-235kDa的、高亲和力的糖蛋白VEGF受体在血管内皮细胞上被表达。现已知道这种VEGF的高亲和力受体是VEGF-R1，并已证明其是flt-1的基因表达产物。VEGF的另一种受体KDR，也称作flk-1，现已知道为VEGF-R2。刺激信号可以通过受体KDR/VEGF-2上调整连蛋白受体的表达。
另一种与VEGF相关的因子是VEGF-B，其与VEGF或者VEGF-C(a.k.a.VEGF-2)形成异源二聚体。VEGF-C是一种23kDa的蛋白，可由一较大的前体进行蛋白水解剪切而得。VEGF-C的另一种受体是Flt-4。VEGF-D也已经被报道，其是KDR/Flk-1和Flt-4的配体。因此，KDR/VEGFR-2的配体包括VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D家族成员(Yancopoulos，GD等人，Nature(2000))。在一具体实施方案中，VEGF-A、C、D与Del-1联合应用，以促进血管的形成。
术语“适合于内部给药”是指药物混合物可以通过器官组织内给药，如肌肉内或关节腔内给药，或可以皮内给药、皮下给药或静脉内给药。
术语“核酸”既指RNA，也指DNA，包括cDNA、基因组DNA、质粒DNA、缩合核酸或者复配有能延长核酸定域生物利用度(localized bioavailability)的化合物的核酸。在优选的实施方案中，用于给药的核酸是包含“载体”的质粒DNA。
术语“逆行融合”或“逆行灌注”是指与正常血流方向相对而在静脉内给药。对于心脏的逆行融合或灌注，将一气囊阻塞导管(balloon occlusion catheter)在静脉内通至冠状窦；从冠状窦该导管可以进一步推进到冠状窦的支流，包括心大静脉(GCV)、心中静脉(MCV)、左室后静脉(PVLV)、室间前静脉(AIV)或者这些静脉的分支。这种转移形式最初是用来描述在心肌手术中药物转移、心脏保护剂或者心脏停搏抑制剂转移分布情况的(Kar等人，HeartLung(1992)21148-59；Herity等人，Catheter Cardiovasc Interv(2002)51358-63)。Wolff在WO00/15285中描述了编码标记蛋白LacZ和荧光素酶的裸质粒的逆行转移情况，但该申请中没有关于采用复配有转染促进剂的DNA的提示或建议。
术语“载体”是指含有能够编码治疗性产物的核酸序列的分子，而且具有各种调控元件可以对转录、翻译、复制等过程和转录子的活性以及其他功能进行调控。载体可以是核酸如质粒或者是其他DNA载体。另外，载体也可以是修饰过的病毒，而这种病毒的原始形式包含有病毒颗粒的基因组物质。
术语“转录子稳定剂”是载体中的一段序列，其有助于延长转录子的半衰期(减慢消失)。“翻译后加工”是指对基因表达产物的修饰，这种修饰包括侧链的添加，如糖类、脂类、无机或者有机复合物，对靶信号和前肽的剪切，也包括基因产物在细胞特定部位的定位，如线粒体、细胞核或者各种膜结构。载体可能在线性的或者是环状的结构中包含一个或者更多的基因。载体也可能包含有质粒的主链或者其他涉及基因产物的产生、加工以及分析的元件。“表达载体”是指能够利用载体中的核酸序列产生其编码产物的载体。例如，表达一种被特殊基因编码的特殊生长因子蛋白。“基因产物”是指被载体中核酸序列编码的产物。
术语“延长核酸定域生物利用度”是指，当核酸以包含某一复合物的组合物形式给药到生物体中时，其被细胞摄取利用的时间，相对于以不含这种复合物的核酸组合物形式给药时，将会持续更长的时间。对细胞来说，这种对核酸利用度的增加可以归因于包含核酸的组合物与细胞之间接触时间的增加，或者是因为核酸免受核酸酶的破坏。那些可以延长核酸定域生物利用度的复合物适合于内部给药。
可以延长核酸定域生物利用度的复合物，由于其物理的、化学的、流变学的特点，也可能达到以下一个或者多个的效应(1)保护核酸如质粒DNA免受核酸酶的破坏；(2)增加核酸如质粒DNA通过细胞外基质和细胞膜被摄取的接触面；(3)将核酸如质粒DNA因水分的去除而浓缩在细胞表面；(4)通过干扰细胞膜的渗透性、疏水性或者溶胞作用而间接地促进核酸如质粒DNA的摄取。下列的复合物适用于延长核酸定域生物活性利用度泊洛沙姆(Pluronics)；泊洛沙胺(或叫保丽视明，英文原名poloxamine；Tetronics)；聚谷氨酸酯/盐；乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)；聚乙二醇；葡聚糖(右旋糖酐)；聚乙烯吡咯烷酮；丙二醇；聚乙酸乙烯酯。这些物质可以制备成溶液、悬浮液、凝胶、乳剂和微乳剂(microemulsion)。所谓“溶液”是指水溶性的聚合物和/或表面活性剂与核酸的溶液。
这些可以延长核酸定域生物利用度的复合物，是通过分子间的相互作用力和/或价键力，如范德华力、离子偶极相互作用、离子诱导的偶极相互作用、氢键或离子键等，而与核酸发生相互作用或者联系的。这些相互作用可以达到以下功能(1)为核酸提供立体选择性的保护以免于核酸酶的破坏；(2)通过“背负式胞饮作用(piggybackendocytosis)”促进细胞摄取核酸。背负式胞饮作用是指药物或者其它分子结合到载体上，通过胞饮作用被细胞摄取。请参阅CV Ugleaand C Dumitriu-Medvichi，Medical Applications of Synthetic Oligomers.InPolymeric Biomaterials，Severian Dumitriu编辑，Marcel Dekker，Inc.于1993年出版。为了达到预期的效果，理想的是延长核酸生物利用度的复合物具有双亲性特征，也就是说，既含有亲水区域又还有疏水区域，但这并非是必须的。复合物的亲水区与核酸的较大的离子区域以及亲水区域相关联，而复合物的疏水区有阻止核酸扩散的作用，并且可以保护核酸免遭核酸酶的破坏。另外，疏水区可以特异性地(或叫针对性地)与细胞膜发生相互作用，这可能促进复合物的胞饮作用，因而使核酸和复合物相关联。这个过程有利于外周细胞对核酸的富集。具有双亲性并且一般可以用作药物治疗用的药剂如下所示泊洛沙姆(Pluronics)、泊洛沙胺(Tetronics)、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇以及聚乙酸乙烯酯，还包括共聚物体系，如聚乙二醇-聚乳糖酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚羟基丁酸(PEG-PHB)、聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(PVP-PVA)以及一些衍生的共聚物，如N-乙烯基嘌呤(或者嘧啶)的衍生物和N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物。
非病毒核酸的非缩合聚合物配方的一个特殊优点是，其应用可以显著地减少变化的系数，如图14所示，请比较盐水中的质粒与复配有非缩合聚合物PVP的质粒。
此处术语“泊洛沙姆”是指由疏水的1，2-环氧丙烷(氧化丙稀)和亲水的环氧乙烷组成的二段或者三段的嵌段共聚物，其中，聚环氧丙烷(POP)的分子式为(C3H6O)x，聚合单元的分子量为58；聚环氧乙烷(POE)的分子式为(C2H4O)x，聚合单元的分子量为44。泊洛沙姆属于聚乙二醇化学家族，其通常的化学名称是聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，化学文摘检索序号(CAS)是9003-11-6。
BASF公司生产的泊洛沙姆的商标是Pluronic。在欧洲，BASF公司生产的药用级别的泊洛沙姆的销售标志是Lutrol。Pluronic类型的泊洛沙姆三段的嵌段共聚物，其中间是疏水的1，2-环氧丙烷，两侧是亲水的环氧乙烷，呈三明治结构，其化学通式和结构为 BASF生产的倒转型Pluronic泊洛沙姆具有以下的结构 此处术语“泊洛沙胺(poloxamine)”是指聚氧丙稀-聚氧乙烯(POE-POP)嵌段共聚物，其中一个POP-POE单元通过胺基连结到另一个POP-POE单元之上，其通式结构为(POEn-POPm)2-N-C2H4-N-(POPm-POEn)2。BASF公司生产的TETRONIC和TETRONICR非离子型表面活剂是典型的泊洛沙胺。由于其胺基的特性，泊洛沙胺带有正电荷，但是并不认为在其所浓度下可以浓缩DNA。
泊洛沙胺属于烷氧基化胺。BASF公司生产的Tetronic型泊洛沙胺的化学名称为含1，2-乙二胺结构的聚合物，其分子式如下(POEn-POPm)2-N-C2H4-N-(POPm-POEn)2，其CAS序号是1111-34-5。倒转型Tetronics泊洛沙胺的分子式表达为(POPn-POEm)2-N-C2H4-N-(POEm-POPn)2，其CAS序号是26316-40-5。
BASF公司生产的下列Tetronics系列产品可以增加质粒DNA到肌肉中的转移；通过直接肌肉注射或者逆行转移，Tetronics可以增加包括编码Del-1在内的基因的转移。
TETRONIC904是平均分子量为6,700Da的液态物质；TETRONIC908是平均分子量为25,000Da的固态物质；TETRONIC1107是平均分子量为15,000Da的固态物质；TETRONIC90R4是平均分子量为7,240Da的液态物质。
实施例1提高质粒向骨骼肌纤维中转移的配方应用PINCTM(Protective，Interactive，Non-Condensing)聚合物转移体系，可以提高质粒向肌肉的转移能力。Del-1的PINCTM转移体系由U.S.P.NF级的泊洛沙姆188(PuronicF68)构成。图1显示了质粒和泊洛沙姆188浓度对表达载体在小鼠骨骼肌中转移的影响。将10微升质粒/泊洛沙姆肌注入小鼠胫前肌内，质粒和泊洛沙姆的浓度分别是0.1-0.3mg/ml和1-10％(w/v)。注射后7天采集肌肉标本并且测定荧光素酶的表达水平。数据表示的是mean(均数)+/-SEM(标准误差)(n＝10肌肉/组)。优化的配方含质粒1mg/ml、泊洛沙姆188 5％(w/v)，其产生的表达水平要比另一种由同样浓度质粒与等渗盐水配方产生的表达水平大约高出10倍。这种优化的质粒/泊洛沙姆配方随后在大白鼠骨骼肌中进行验证。
图2显示了配有等渗盐水、聚乙烯吡咯烷或者泊洛沙姆188PINCTM转移体系的萤光素酶表达质粒注入大白鼠胫前肌后萤光素酶的表达情况。萤光素酶表达质粒pLC0888合并有巨细胞病毒(CMV)启动子、合成的5’端内含子、编码萤光素酶的基因、3’端聚腺苷酸信号及牛源性生长激素基因的一段非翻译区。具有不同上标的条形图之间具有差异性(p＜0.05)。在大白鼠实验中同样观察到，复配的质粒配方中基因表达水平大约增加了10倍。机体对于肌肉注射配有泊洛沙姆188质粒的耐受情况很好，并没有发生任何严重的病理改变。
除了非缩合的聚合物转移系统配方以外，在一些研究中也利用电穿孔技术提高质粒向骨骼肌中的转移。利用优化的参数，电穿孔可以使质粒转移的水平提高10-100倍。这种转移水平的提高引起质粒编码的转基因在小鼠肢体多数肌细胞中的表达。电穿孔技术已经被用来研究对于局部表达Del-1的全剂量反应。临床前的研究表明，无论有没有采用进一步提高转移水平的机械技术如电穿孔术，都可以获得治疗水平的Del-1的表达成功。
实施例2Del-1表达质粒通过CMV启动子、5’合成的内含子、hDel-1 cDNA、、3’聚腺苷酸及人源性生长激素基因的一段非翻译区的合并组合(图3b)，获得Del-1表达体系。除了编码hDel-1的表达质粒外，还构建了一种类似的鼠Del-1表达质粒。mDel-1质粒在一些临床前的鼠科研究中已经被使用。图3b显示的Del-1表达盒包含于质粒主链中，该主链包含一个抗卡那霉素细菌基因(图3c)，这样就允许质粒在产生过程中进行选择性生长。可以使用的另外一些表达主链包括选择性启动子、5’和3’非翻译区和聚腺苷酸信号等，这在本领域是熟知的。图12描述的是hDel-1的核苷酸序列，而图13描述的是hDel-1表达质粒pDL1680的核酸序列(图3c中有示意图解)。
实施例3Del-1药物的药理学研究Del-1 Western一对来自于Del-1编码载体的蛋白产物进行SDS-PAGE凝胶分析。将冷冻的肌肉组织放入2ml管中，该管中含有2.5mm的硅珠的溶解缓冲液，湿重10微升/毫克，搅匀，然后通过离心的方法去除不溶性物质。用高分子量标记物(SIGMA#C3312)进行NOVEX三甘氨酸凝胶电泳，每一泳道含有50毫微克肽标准样品(PROGENITOR)，或者50毫克未知样品蛋白。凝胶被转移到硝化纤维膜上，并且在PBS/0.1％Tween20/5％干奶粉/4％BSA条件下封闭1小时。将鼠的抗Del-1单克隆作为一抗(primary antibody)，并以1∶500稀释后添加到封闭的缓冲液中过夜。在PBS/0.1％Tween-20中彻底清洗后，将二抗(secondary antibody)--抗鼠HRP以1∶10,000稀释添加到PBS/0.1％Tween-20中。纤维膜孵育一小时后进行彻底洗涤，接着在AMERSHAM ECL化学发光试剂中孵育1-2分钟，最后暴露于X-OMAT AR胶片。
IGEN一通过针对Del-1特异性的OGIGEN IGEN免疫检测，按配方组成的Del-1表达体系的蛋白产物可以被定量检测。简要的说，就是将冰冻的肌肉组织放入盛有2.5mm硅珠的溶解缓冲液的2ml管中，该管中含有2.5mm的硅珠的溶解缓冲液，湿重10微升/毫克，搅匀，然后通过离心除去不溶性的物质。所使用的检测手段包括抗生物素蛋白包裹的硅珠、生物素标记的捕捉抗体、钌标记的检测抗体。所有的试剂进行孵育让它们充分结合，然后利用IGEN仪器抽取样品，IGEN具有一个磁性的捕捉系统可以结合硅珠复合物，未被结合的部分被洗掉。当电流通过结合复合物时，含钌的成分可以发出信号，这种信号可以被探测器测量到。这种检测的动态范围是10pg-100ng/mg裂解物中的总蛋白。
RT-PCR一应用RT-PCR技术分析Del-1和VEGF-165以证明Del-1和VEGF-165 RNA的存在。RT-PCR的应用程序首先是对实验动物的后肢肌肉进行采集、冷冻、均质化。通过硅珠的搅拌或者利用Tel-Test RNA Stat 60对组织进行加工以提取RNA，使用标准的DNA酶I(Boehringer Mannheim)去除样品中的杂质DNA。应用SUPERSCRIPTTMONE STEPTMRT-PCR系统(GIBCO/BRL)完成RT-PCR。利用基因特异性的引物(primer)，cDNA的合成和PCR可以在同一个管中完成。Del-1和VEGF的引物均设计成可以跨越质粒的合成内含子。DEL-1的引物产生了一个304bp的片断(DNA杂质产生的片断为421bp)。引物是有义的5’-TGA CCTCCA TAG AAGACA CCG GGA C-3’(SEQ ID NO4)和反义的5’-GTG ATG CAA CCTCCA CAA CAC TAG A-3’(SEQ ID NO5)。VEGF引物产生了一段长724bp的片断(DNA杂质将会产生841bp长度的片断)。有义引物与Del-1相同，反义链是5’-GGA GGGGTC ACA GGG ATG C-3’(SEQID NO6)。RT反应参数和PCR循环参数如下所示。RT反应50℃持续30分钟；95℃持续2分钟；PCR循环95℃持续30秒；65℃持续40秒，循环35次。延伸阶段时65℃水平持续5分钟，然后降至4℃。
Del-1和VEGF的免疫组织学通过免疫组织化学分析我们在被治疗的肌肉组织样品中发现了Del-1和VEGF-165基因药物。将一5μm的冰冻切片用普通兔血清封闭，再与以1∶500稀释的大鼠抗小鼠Del-1抗体免疫染色1小时。接着，用PBS液对肌肉切片进行漂洗，然后再与以1∶400稀释的用生物素标记的兔抗鼠IgG(VectorLaboratories)孵育1小时。接下来对肌肉切片漂洗后再与抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，Vector Laboratories)孵育1小时。切片用PBS液漂洗完后，通过与DAB(Vector Laboratories)反应，免疫复合物就可以显影。VEGF-165的免疫组织化学定位通过3mm2石蜡切片完成。首先将切片与普通羊血清封闭，然后再与以1∶200稀释的兔抗人VEGF抗体(Intergen Company)孵育1小时，这样切片就完成了免疫染色。将生物素标记的羊抗兔IgG(Vector Laboratories)以1∶400的比例稀释，肌肉切片用PBS液漂洗后与其孵育1小时，接下来肌肉切片用PBS液漂洗后，再与抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，VectorLaboratories)孵育1小时。PBS液漂洗过的肌肉切片通过与DAB(Vector Laboratories)反应，免疫复合物就可以显影了。
定量RT-PCR按配方组成的Del-1表达体系在被治理肌肉中可以表达，其产生的RNA数量可以通过RT-PCR技术进行分析。应用RNAzol可以从肌肉样品中分离出所有的RNA。残留的质粒DNA通过用DNA酶处理RNA样品而被除去。在一个ABI-7700热循环中使用单步Taqman RT-PCR测定就可以对Del-1样品中的mRNA进行定量分析。在Del-1 mRNA中跨过5’端非翻译区内含子的5’端和3’端引物被用来扩增mRNA特异性的扩增子。
毛细血管密度及其与肌纤维比率通过针对CD-31的westernblot(蛋白质印迹实验)可以分析毛细血管密度。简单地说，就是把冷冻的肌肉在含有2.5mm硅珠溶解缓冲液(湿重10微升/毫克)的2ml管中搅匀，离心后除去不溶性物质。用高分子量标记物(Sigma#C3312)进行Novex三甘氨酸凝胶电泳，每一泳道含有50ng肽标准样品(RDI)或者50mg未知样品的总肽。凝胶转移到硝化纤维膜上，在PBS/0.1％Tween-20/5％干奶粉/4％BSA条件下封闭1小时。将以1∶500稀释的羊抗CD-31(RDI)作为一抗，添加到封闭缓冲液中，摇晃后室温下孵育过夜。在PBS/0.1％Tween-20液中彻底清洗后，再添加以1∶10,000稀释的抗山羊-HRP作为二抗。硝酸纤维素膜孵育1小时后，经彻底清洗，再于Amersham ECL化学发光试剂中孵育1-2分钟，接着将其暴露于X-OMAT AR胶片。胶片经过计算机扫描后，利用ImageQuant软件对每一条带的像素浓度进行评估。因为凝胶之间有差异，可以得出在同一电泳凝胶中肽样品CD-31的百分比数值。
毛细血管对肌纤维的比率由CD-31的免疫组织化学定位决定。5mm2冰冻切片用普通兔血清封闭后，采用以1∶1000稀释的大鼠抗小鼠CD-31抗体(PharMingen)对其进行免疫染色。接着用PBS缓冲液对切片进行漂洗并且与以1∶400稀释的生物素标记的兔抗鼠IgG(Vector Laboratories)孵育一小时。接下来用PBS液对切片进行漂洗，与抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，Vector laboratories)共孵育1小时。再次对切片进行漂洗后让其与DAB(Vector Laboratories)进行反应，这样免疫复合物就可以显影了。
使用Optimas图象分析软件可以完成毛细血管与及肌细胞比率的图象分析，这种软件可以对毛细血管和肌纤维数量进行特定的宏观分析。对来自CD-31免疫染色冰冻切片的图象进行分析，建立毛细血管与肌纤维比率的数据。
治疗性血管形成的评价应用血管造影术对白兔后肢局部缺血模型实验中形成的侧枝血管进行评价。右股动脉经导管注射4ml对照剂(VISIOPAQUETM)。记录下双测后肢连续的影像。使用盲法可以对侧枝血管的形成作出定量的血管造影分析，观察者直接对以股骨解剖标帜形成的两个互相垂直的平面内的血管计数，然后求平均。使用DIACOM VIEWTM软件将分析用的图片从照相机中取出。图象分析的完成需要3个分离的时间段，记录下观察到的均数。
活动平板实验对给药Del-1、VEGF-165、非编码质粒以及对照组的实验动物进行活动平板强度测试，以分析它们生理方面改变的情况。把动物放置在倾斜7度的活动平板上，转数每分钟5米，持续5分钟，使动物适应活动平板。起始5分钟后，将活动平板的转数提高到每分钟10米并开始计时。每间隔两分钟将活动平板的转数提高一次，直到动物出现疲劳信号。动物疲劳的信号是其步态的改变，不能够运动到活动平板的前部，在震动的格子上要花费5秒钟以上。一旦观察到这些联合信号的出现，立即终止实验，将动物从平板上移去，并且停止计时。
统计分析所有的结果以means(均数)+/-SEM(标准误差)的形式表示。利用单向的ANOVA对其统计学意义进行评价。P＜0.05表示结果具有统计学意义。
动物模型按配方组成的Del-1表达体系的临床前药理学作用已经在小鼠和大白兔动物模型中得到评估。在肢体局部缺血的动物模型中，肌肉注射按配方组成的Del-1质粒已经被证明可以增加含氧量正常的骨骼肌中毛细血管的密度，并且可以增加侧枝血管的形成以及运动耐受量。Del-1质粒产生的生物学效应具有剂量依赖性。在动物模型中没有观察到与Del-1表达有关的药物毒性或者严重的病理反应发生。
将复配的mDel-1表达质粒肌注入小鼠胫前肌，伴有或者不伴有电穿孔，mDel-1在胫前肌的表达水平和持续时间如图4所示。将10mg复配的Del-1质粒注入CD-1小鼠的胫前肌，注射后7、14、30和60天分别采集被注射的肌肉，并通过qrtPCR测定mDel-1的mRNA。数据点代表的是n＝5/组的平均值+/-标准误差。这项实验显示如果没有进行电穿孔，mDel-1的表达大约以每月一个数量级的速率下降。mDel-1编码核苷酸与电穿孔技术联合应用可以使Del-1mRNA的表达水平大约增加100倍，而且可以增加mDel-1表达的持续时间。
注射(伴有或者不伴有电穿孔)后第7天，hDel-1在含氧量正常的小鼠胫前肌内的表达效果如图5所示。将复配的Del-1表达质粒或者对照质粒肌注注入小鼠胫前肌，然后行电穿孔术以进一步增强质粒的上调(+EP)。平面A以条形图的形式描述治疗7天后毛细血管的密度，这种结果是由电脑对CD-31免疫染色的图象分析决定的。数据显示了n＝3/组的平均值+/-标准误差。带星号的组表示同与对照组有差别，具有统计学意义(p＜0.01)。平面B相片显示的是典型的肌肉横断面的CD-31的免疫染色。单份10mg剂量的hDel-1质粒可以使毛细血管/肌纤维比率增加60％(p＜0.01)。应用电穿孔可以增加hDel-1的表达，但是并不能进一步增加毛细血管/肌纤维比率。虽然数据没有说明，但人源性与鼠源性Del-1在动物模型中的表达是等效的。
免疫组织化学分析表明，复配的Del-1质粒可以引起非常微弱的炎症反应，而复配的VEGF-165质粒可以引起大量的炎症细胞浸润。其它一些研究也显示VEGF-165可以引起炎症细胞的增加，甚至有报道在VEGF-165长期表达的情况下甚至发生血管瘤(Springer M等人，Molecular Cell(1998) 2549-558；Ozawa C等人，Annu.Rev.Phar-macol.Toxicol.(2000)40295-317)。
实施例4剂量反应关系为了研究表达的Del-1蛋白与增强表达的毛细血管内皮细胞表面抗原CD31之间的关系，进行了确定注射肌肉中表达的mDel-1蛋白与CD31浓度量的实验。给小鼠肌肉注射10mg非编码质粒，10mgDel-1质粒、20mg Del-1质粒或者30mg Del-1质粒，并联合应用电穿孔术。术后7天，采集小鼠肌肉，并且通过免疫测定法测定mDel-1以及通过蛋白印迹分析测定CD31，接着进行密度检测。这项实验的研究结果如图6所示。研究结果显示mDel-1的表达量与毛细血管内皮细胞表面抗原CD31之间有着很强的相关性(R＝0.65，P＜0.01)。与Del-1浓度增加相关，CD31的EC50约为5ng/g湿肌肉。
实施例5；复配的Del-1质粒在小鼠局部缺血后肢的作用除了研究含氧量正常的小鼠后肢外，对复配的Del-1表达质粒在小鼠后肢局部缺血模型中的作用也进行了研究。CD-1小鼠(2631gm)来源于Charles River(Houston)。先给予氯胺酮7.4mg/gm、噻拉嗪0.4mg/gm、阿西喹林0.08mg/gm使小鼠保持镇静状态，然后结扎小鼠双侧股动脉。在用药侧肢体腹股沟韧带下方与髌骨近端之间做一个纵向的切口，找到股动脉起始于髂动脉处，在此位置结扎股动脉近端；找到股动脉近端分支成隐动脉与股深动脉处，对此位置也进行结扎。股动脉结扎后立即给动物肌注复配的hDel-1质粒、hVEGF质粒或者对照组质粒(非编码质粒)，注射时使用规格为1/2″的针头，对股部与下肢分五个不同的部位进行注射(每个后肢的注射总剂量是70mg，其中胫前肌10mg，腓肠肌20mg，股四头肌40mg，术后立即给药)，每次注射的配方配有浓度为1mg/ml的泊洛沙姆0.1ml。接下来对实验动物进行活动平板生理极限测试和半定量的蛋白印迹CD-31分析，这样就可以对局部缺血动物模型的血运重建进行评估。术后对动物进行功能耐量检测，每周一次，持续4周。由于已有很多研究显示VEGF的过度表达可以增强局部缺血组织的血运重建，所以实验中应用了复配的VEGF表达质粒作为对比。
图7显示的数据表示的是平均值+/-标准误差(n＝7-8实验动物/组)。与不同组相对应的不同的上标，表明不同组的运动是不同的，具有差异性(p＜0.05)。图7显示的结果表明Del和VEGF治疗组相对与对照组都可以增加动物的运动耐量，具有差异性(p＜0.05)。一项旨在评价超过6个月后Del-1质粒对小鼠骨骼肌治疗情况的检查(qRT-PCR)表明，6个月后，复配的Del-1质粒在小鼠骨骼肌中的表达水平并没有显著下降。
实施例6复配的Del-1质粒对大白兔股动脉切除的局部缺血模型的治疗效果股动脉切除的大白兔模型是用来研究局部缺血后肢中血管生成因子情况的最常用的动物模型。应用与上述小鼠相似的设计建立第一批14只雄性新西兰大白兔(4kg)后肢局部缺血模型。简要的说，首先使用氯胺酮(20mg/kg)、噻拉嗪(5mg/kg)、阿西喹林(2.5mg/kg)使大白兔麻醉，然后切除其左侧股动脉。在用药侧肢体腹股沟韧带下方与髌骨近端之间做一个纵向的切口，接着游离股动脉并且游离结扎与之相连的动脉分支。现在切除股动脉，切除的解剖位点是股动脉起始于髂外动脉处以及股动脉分支为隐动脉(sapheneous artery)与股深动脉分叉处。
对于后肢局部缺血的大白兔模型，术后三天，分别将复配的非病毒性编码Del-1的DNA、VEGF-165或者作为对照组的非编码质粒注射到其股中部10个不同的部位，注射时使用规格为1/2″的针头。注射使用的DNA的浓度是1mg/ml，配方中含有泊洛沙姆188，每次注射0.5ml，DNA量共5mg。
术后立即对模型行血管造影术，术后一月再做一次。治疗30天后对缺血患肢的血运重建水平作出评估，评估方法包括对CD31的半定量蛋白印迹分析和血管造影分析。在股中部交叉分布的新生侧枝血管的数字统计结果如图8所示。其中，对照组n＝3，Del组n＝5，VEGF组n＝6。条形图示的是股中部新生侧枝血管的mean(均数)+/-SEM(标准误差)。具有不同上标的条形图之间是有差别的，差别具有统计学意义(p＜0.01)。经过一个月的治疗，Del和VEGF引发的血管生成增加了两倍多，具有统计学意义(p＜0.05)。
实施例7配方的优化以及转移Del-1质粒到心肌细胞一些关于证明和使配方优化以及转移Del-1质粒到心肌细胞中的实验已经完成。实验结果表明，通过逆行性静脉注射聚合物配方，可以获得对左室最佳的转移效果。将复配的质粒通过这种途径给予8只猪(其中4只给予的配方中含有泊洛沙姆，另4只配方中含有阳离子脂质体)，在基因药物转移过程中猪的耐受情况良好。然而7天后，接受含有阳离子脂质体配方的猪，其心肌出现了严重的病理改变。通过相同程序将对照介质或者染剂注入，发现这些物质产生了局部的外渗并进入到左室的主质(parenchyma)内。接受含有泊洛沙姆配方的猪的Del-1mRNA的表达水平最高。一些实验将不同的配方按照直接心肌内注射的方式导入小鼠模型中，对此实验的评估表明，无论是添加缩聚葡萄糖的配方还是将质粒的浓度从1mg/ml提高到3mg/ml的配方，当用注射针头注射后，两者都可提高质粒在心肌中的转移。
实施例8经皮转移基因药物到心肌基于安全性、技术上的易行性以及质粒转移的高效性，具有潜能的经皮转移形式在猪模型中得到了测试和对比。关于这些实验的基因表达以及耐受能力数据总结于表1中。对于所有进行的经皮转移实验，需要对主要的器官进行样品采集(通常在给药7天后进行)，这样就可以对质粒的生物分布进行评估。结果(未示出)揭示质粒最初定位于心脏，与注射的途径和配方无关。
应用针注射导管转移基因药物设计两个实验取实验猪共6只，其中4只接受配方中含有泊洛沙姆188的Del-1质粒DNA，其余两只接受的配方中含有盐水而无泊洛沙姆188，注射使用BioCardia公司提供的螺旋针注射导管。在转移过程中，所有的实验动物耐受情况良好，没有见到严重的病变发生。表1中基因表达数据表明，在应用IM针导管转移方式的左心室内，Del-1的表达水平较低，而应用逆行静脉转移方式，Del-1获得了高水平的表达。
表1Del-1mRNA 阳性部位 Del-1mRNA在阳性部在LV1中 百分比 位中2IM导管23,589 20 120,184(10个部位)6,136 16 18,949逆行性IV 114,02028 405,075806,55541 2,177,9321总DNA(所有部分)中每mg单位所含的Del-1拷贝份数，LOQ＝500拷贝份数/mg)(500,000-1,000,000的典型水平在小鼠后肢肌肉中实现)2总DNA(阳性部分的均值)中每mg单位所含的Del-1拷贝数使用针注射导管将复配的DNA转移到心肌与使用针头和注射器进行肌肉内注射的情况非常类似。对小鼠实验的研究结果显示，对心肌而言，通过肌肉内注将基因药物导入产生的效果不如骨骼肌。
转移基因药物到心包腔使用Comedicus公司生产的套管针器械完成了将基因药物转移到心包腔的实验。通过这条途径，带有阳离子的脂质体配方得到了测试，动物在实验过程中的耐受情况良好，并心肌组织中检测到了Del-1mRNA的低水平表达(Del-1mRNA＜500拷贝份数/mg总DNA)。
通过逆行静脉注射将基因药物转移到左心室通过逆行静脉注射将基因药物转移到左心室的实验已经完成，实验使用的是一个7F的气囊导管(10，如图11A和11B所示)，导管通过冠状窦(20，图11A)，经心大静脉(30，图11B)，到达前室间静脉中部(40)。给气囊充气(15)以防止静脉的流出，接着或以最大的手压或以可控制的比率注入10ml复配的质粒，速率可以是容量/时间比，如1ml/秒，也可以是预定的压力。将对比介质或者染剂按此途径注入，可以观察到这些物质局部地外渗到左心室的主质中。图11A和11B中的箭头(60和70)指示的是质粒在导管中的流动方向，而箭头(80和90)表示的静脉的血流方向。
接下来使充气的气囊在一些地方停留几分钟(时间依实验而定，猪2-10分钟)以利于增加配方在组织中的滞留时间。通过这种方式将质粒导入8只猪体内，其中4只接受的配方中含有泊洛沙姆，其余4只接受的配方中含有阳离子脂质体。所有的动物在质粒转移过程中的耐受情况良好。然而给药7天后，接受含有阳离子脂质体配方的猪心肌出现了严重的病变，并且病变猪中接受1∶3(+/-)配方的病变程度要比接受1∶0.5(+/-0)的更加严重。
接受含有泊洛沙姆配方的猪，其Del-1mRNA的表达水平最高，而接受含有较高浓度阳离子脂质体配方的猪，其Del-1mRNA的表达水平显著下降，如表2所示。对基因药物的各种转移方式和配方进行测试，发现只有含泊洛沙姆配方并且通过逆行性静脉注射方式产生的基因表达水平最佳，其表达水平与小鼠以肌注方式产生的基因表达水平相当。
无论是心肌内直接注射方式还是逆行性静脉注射方式，接受含有泊洛沙姆配方的实验猪的耐受情况都很良好。
表2经皮心肌转移研究数据概要配方 技术成功1Del-1 mRNA2总体病理IM导管泊洛沙姆188 5％6/6 可检测的3阴性(n＝4)心包 阳离子脂质体(1∶3，-/+)1/3 ＜LOQ (n＝3) 轻度逆行性IV 阳离子脂质体(1∶3，-/+)2/2 ＜LOQ (n＝2) 中/重度逆行性IV 阳离子脂质体(1∶0.5，-/+) 2/2 3997(n＝2) 轻/中度逆行性IV 阳离子脂质体188 5％4/4 397279 (n＝2) 阴性1技术成功是指完成转移过程而没有出现明显的问题；2每mg单位总DNA中含有2个Del-1mRNA的拷贝份数，LOQ＝500拷贝份数(小鼠骨骼肌中以获得了500,000-1,000,000的典型水平)；3在这些样品中，运输过程中RNA的部分降解扣除了Del-1mRNA的量。
实施例9通过心肌内直接注射法将预配制的质粒注入小鼠心脏由于可以对啮齿类动物实施直接心肌注射法，通过这种方法可以对各类转移基因药物的聚合物配方的疗效进行评估。在这些实验中，在对配方检验参数的选择上要考虑观测数据。下面所有的实验都以小鼠为实施对象，实验中需使用荧光素酶蛋白报告质粒pLC0888。简要地说就是，首先用戊巴比妥麻醉小鼠，插管，接着沿胸骨中线切开使胸部开放。消毒后，用胰岛素注射器将复配的质粒注射到小鼠心脏中，在这些作用下，小鼠的心率可以缓慢地升高到500-600次/分。除非受到质粒其它方面毒性的影响，注射后小鼠的存活率超过80％。出于对比的目的，注射pLC1088(配有5％泊洛沙姆)7天后，荧光素酶在小鼠骨骼肌中的表达水平应该被记录下，大约是107RLU/mg蛋白。
这项实验的目的是确定是否增加泊洛沙姆188配方中的质粒浓度就可以增强pLC0888的转移。不过，下面图9的实验结果表明将5％泊洛沙姆188配方中的质粒浓度从1mg/ml增加到3mg/ml可以增强向心肌的转移效率。给出的数据代表的是n＝3/组的mean+/-SD。CD-1小鼠接受1，3和12/ml注射配方，而C57 BL6小鼠接受6/ml注射配方。
进一步的实验表明直接IM注射1mg/ml质粒，5％泊洛沙姆配方的确引起注射心脏中荧光素酶的适当表达。
通过直接心肌注射，将各种配方转移质粒到心肌，以进行比较。结果如图10a所示，结果表明多聚谷氨酸配方中的质粒产生的转移效果要优于其它检测的配方。一项附加的实验结果如图10b所示，这项实验相对盐水配方进一步证明了上述结果。数据分别代表的是n＝3/组(平面A)以及n＝4-5/组(平面B)的mean+/-SD。
实施例10非缩合聚合物配制的质粒在本发明的一个具体实施方案中，复合物可以与添加其中的DNA通过以下一种或者多种方法相互作用FTIR、ITC、DELSA和荧光淬火。在一定的环境中，复合物可以表现出抗核酸酶特性从而对DNA提供保护。优选的复合物不引起DNA的缩合、凝聚，而是应该有利于其在固体组织(如肌肉、肿瘤)中扩散和转移，并且能够增强DNA的表达水平。如图12所示，优选的复合物使得DNA表达能力重现性增强。
实施例11预先配制的Del-1表达质粒的药物产品在本发明的一个具体实施方案中，泊洛沙姆188是质粒表达的促进剂，其化学结构式如下HO(CH2CH2O)80(CH(CH3)CH2O)27(CH2CH2O)80HDel-1药品包括

在具体实施方案中，复配的DNA的制备是通过将等量的质粒DNA、pDL1680和poloxamer(泊洛沙姆)无菌混合而成，如下所示

过滤完成后，将成分或者混合物冻干并贮藏。需要使用时，以冻干的成分可以在普通盐溶液中解冻。
实施例12应用电穿孔技术转移复配的Del-1质粒这里所谓的“脉冲电压器”或者“脉冲电压注射器”是指一种仪器，这种仪器可以向器官细胞发射一种定位的电脉冲，引起细胞膜发生去稳定并且导致细胞膜通道开放，从而诱发细胞吸收核苷酸的活动。这种传统的设备可以定标以允许使用者选择和/或调节预设的电压幅度，并且/或者调节脉冲持续的时间，因此人们希望将来的仪器也可以通过定标的方式来完成这项功能。这种注射仪器并不对本实验构成影响。事实上，脉冲电压器的首位重要性是其促进发明成分进入器官细胞的能力。脉冲电压注射器包括一个电穿孔装置，如U.S.专利5,439,440、U.S.专利5,704,908或者U.S.专利5,702,384所描述的，或者在PCT WO 96/12520、PCT WO 96/12006、PCT WO 95/19805和PCT WO 97/07826在所公布的，此处上述所有专利均作为参考文献。
这里所谓的“装置”与一组结合的元件有关，这些元件通过发射脉冲的方法可以使本发明的混合物转移到器官的细胞中。本发明装置的组成部件包括一个或一组注射器、各种电极、定位器及电脉冲发生器。定位器可以通过光学纤维和视频监控发挥作用，脉冲发生器可以对电压幅度、持续时间、循环次数进行定标。电极有各式各样的尺寸，并且能够选择性的将本发明的混合物注射到不同的转移深度，如哺乳动物器官的表面，或者转过表面进入主质中。
构建的基因药物进入器官细胞可以通过电脉冲联合针注射的方法，或者直接利用电脉冲。以电穿孔装置的电极直接插入靶器官或靶细胞(如表皮细胞)的方式，脉冲应用前后及时地给予载体并且使其到达靶器官细胞。
所选载体构成物的给药途径依赖于表达载体的特殊用途。总的来说，对每一个载体构成物的特殊配方研究集中在载体的转移方面，既要考虑特定的靶组织，又要考虑电脉冲转移参数，接下来需要对功效进行论证。转移研究包括评价细胞摄取载体的吸收情况分析以及选择DNA的表达情况分析，分析还包括目的DNA摄取后的定位以及维持表达蛋白稳定浓度所需要的条件，然后可以检测功效与细胞毒性。毒性作用既包括对细胞生存力的影响也包括对细胞功能的影响，肌细胞具有独特的摄取细胞外间隙中DNA的能力，所以当DNA分子以溶液、悬浊液或者固态形式注射到肌肉中后可以被肌细胞摄取，这种方法可以使DNA的表达持续几个月。
我们实施了一项实验，旨在研究当Del-1作为一种基因药物通过肌注的方法转移到的小鼠后肢肌肉中后，其增加血管密度的潜能。简要地说，将10mg聚合物复配的PINCTMmDel-1、hDel-1或者hVEGF165质粒(10mg质粒剂量)注射到雄性CD-1小鼠的胫前肌内。在一些例子中，辅助应用电穿孔以增强肌纤维的转染效率。治疗7天后，采集肌肉，快速冰冻，并且对毛细血管内皮细胞表面抗原CD 31、Del-1和VEGF165进行免疫组织化学分析。接着应用OPTIMAS图象分析软件进行图象分析，此软件装配有一个客户宏可以计算骨骼肌中毛细血管/肌纤维比率。电穿孔可以增加转染的效率，增强转基因的表达，其增幅将近100倍。电穿孔非治疗性肌肉只出现轻微或者不出现病理变化，不影响毛细血管/肌纤维比率(2.56(非电穿孔肌肉)2.52(电穿孔肌肉))。无论注射Del-1表达质粒或是VEGF165表达质粒，两者均可引起毛细血管/肌纤维比率的显著增加(p＜0.05)，较对照组高出30％-50％。由电穿孔增强的转基因表达进一步使毛细血管/肌纤维比率较对照组高出70％，但是电穿孔本身对所有实施例的作用均不显著。在转基因表达的区域附近观察到了增强的CD 31免疫染色，CD 31免疫染色的方式与Del-1、VEGF165表达质粒在注射肌肉中免疫染色的方式类似。然而，通过电穿孔技术得到的VEGF165的药理学水平与血管丛集及严重的局部水肿有关，这在其他治疗组中并未发现。这些结果表明，非病毒介导的Del-1表达系统能够刺激缺血组织中血运重建，同时还表明，电穿孔技术可作研究该效应的工具及非病毒基因治疗的治疗指数。
实施例13以盐水或泊洛沙姆制备的质粒转移至受体猪的心肌组织对测得的表达水平进行比较将以盐水或5％泊洛沙姆制备的质粒(1毫克/毫升)转移后对测得的表达水平进行比较，将5％泊洛沙姆制备的pDL1680(1毫克/毫升)与等渗盐水制备的pDL1680(1毫克/毫升)作比较，实验采用的是滑洁级Yorkshire受体猪(大约50千克)。
通过气囊导管，用rIV灌注，把待测物(10毫升，质粒剂量10毫克)转移至AIV(如果找不到AIV就用其他静脉代替)的中段。在X射线透视指引下(若有必要作放射显影对比)将导管置于目的静脉，通过利用对比介质分布范围(比如颜色发红)及估计转移位点，并以此校正导管位置使侧支分液最小。接下来将已定位导管中10毫升Del-1质粒以最大手掌压力或在约10秒或小于10秒的时间内推入转移部位。结果表明与控制压力推入者相比，以最大手掌压力推入者提高了心肌转染率。
在应用对比介质后马上应用已获得的被切成1×1立方厘米大小的待测片段(总面积约4.5×4.5平方厘米)，颜色最红的区域即心肌的靶点，这些组织标本及从靶点远处心肌获得的标本以及从肺、肾、血清中采集的标本都被用来作hDel-1转基因mRNA的定量重组RCR检测。另外，对从心肌转移的靶区域获得的样本作hDel-1蛋白的免疫组织化学分析。
上述心肌在转移过程中呈现良好耐受，并且无明显的体内变化及肉眼可见的病理变化，在部分受体猪发现于气囊充气部位有轻微挫伤。图15显示了将pDL1680盐溶液或pDL1680 5％的泊洛沙姆188溶液制备的rIV转移至受体猪后hDel-1 mRNA在其心肌组织中的表现。这些数据点代表了hDel-1 mRNA在转移的4.5×4.5平方厘米靶区域的平均水平，实心圆代表以最大手掌压力推入的结果，虚心圆代表多次转移的结果。
所有处理组的均值在图中都以水平线表示。图15中hDel-1mRNA的结果表明(无论是否以最大手掌压力推入或多次转移)以5％泊洛沙姆188制备的rIV在心肌靶区域产生的hDel-1mRNA大约为盐水制备组的6倍，Del-1转基因在心肌靶区域远处部位及远侧器官中的表达非常少或者可以忽略不计，而且不受制备方法的影响。
实施14在血管生成中联合应用Del-1和VEGF编码VEGF165的cDNA被化学合成及克隆到哺乳动物表达质粒中，此质粒包含一个(CMV)启动子、一个5’合成内含子、hDel-1cDNA、3’聚腺苷酸信号以及如图3b所示的Del-1表达质粒中的一段由人生长激素基因，而来的非翻译区段，将VEGF165与已知的高表达人蛋白中发现的优选密码子进行分析比较，仅代表已经使用的天然VEGF165序列中的八个密码子均被加以改造以和高表达人蛋白中的密码子相一致。图16中显示了这些经改造的密码子，其中天然密码子已在这些链中加以标记。
Del-1与VEGF组合对小管形成的体外分析分别在含有了Del-1、VEGF、Del-1/VEGF的3D-股原凝胶中加入人脐静脉初始内皮细胞(HUVEC细胞)。2天后给细胞拍照来比较Del-1、VEGF或者两者组合的情况下对小管形成的影响。与对照组、Del-1组及VEGF组相比，Del-1与VEGF的组合组能更好的促进小管形成。
Del-1与VEGF组合对毛细血管发育的体内分析将编码Del-1(10毫克)、VEGF(10毫克)、Del-1及VEGF(每种质粒5毫克)或者空白对照载体的、共10毫克5％泊洛沙姆188复配的质粒DNA注入雄性CD-1小鼠胫前肌。在注射复配的质粒DNA，马上进行点穿孔法。大约在注射后2分钟，用Eledtro SquarePorator(T820，Genetronics，San Diego，CA)产生375V/cm电压以及每次25毫秒的2平方波长脉冲(每秒一次)。嵌位电极包含两个平行的不锈钢板测径口(1.5平方厘米)，将它置于皮肤之上以使腿部在脉冲过程中处于半伸展位。通常情况下，小鼠的腿部被固定在两个板之间，两板之间相距3-4毫米，分别于第7天和第28天用rt-PCR技术检测转基因mRNA表达，并在以抗CD31染色的组织进行免疫组织化学分析来计算毛细血管/心肌细胞比值(”C/M”比)。在第7天，转基因mRNA表达增强，而在第28天则降低了几个数量级。如图17所示，单独的Del-1组及VEGF组的C/M比值是空白载体对照组的1.5-2倍，证实了以前的实验。与最适剂量的(为各自剂量的2倍)单独基因相比，亚最佳量下的Del-1及VEGF联合应用，会使得毛细血管内皮细胞密度的显著增加。在Del-1/VEGF组合组中，CD-31阳性结果的内皮细胞数目繁多难以计数；而且，实验发现，与空白对照质粒组及VEGF组对比，Del-1及VEGF联合应用能增加受体对运动的耐受能力。
尽管在样品中Del-1及VEGF的组合是用两种不同质粒制备的，本领域熟练人员应当知道，Del-1及VEGF的表达也可以通过一个携带有两个转录表达单位的单一质粒，或者通过一个含有内部核糖体进入位点的单一转录表达单位。
实施例15逆行法基因转移的泊洛沙姆配方在泊洛沙姆的命名法中，非专有的“泊洛沙姆”名称后有一个数字，其中，前两位若乘以100，大约就等于聚氧丙稀(POP)的分子量，第三位数若乘以10，大约就等于聚氧乙烯(POE)重量的百分比。因而，泊洛沙姆188中聚氧丙稀的分子量大约1800，聚氧乙烯的重量大约为分子总量的80％。根据泊洛沙姆命名法，泊洛沙姆188(a.k.a.F68)的聚氧丙稀平均数目如下1800/58(C3H6O的分子量)＝31，泊洛沙姆188的总分子量是1800/(1-80％)＝9000，其聚氧乙烯的平均数目如下(9000-18000)/44(C2H4O的分子量)＝163。因此，泊洛沙姆188(a.k.a.F68)的分子式即HO-(C2H4O)82-(C3H6O)31-(C2H4O)82-H。
另外，根据已知变量可由通式HO-(C2H4O)x-(C3H6O)y-(C2H4O)x-H来推测其平均分子量、聚氧乙烯的比例及数量以及聚氧丙稀的数量。这样，若知道总的分子量及聚氧乙烯的比例也可以推测其分子式聚氧乙烯的平均数可以这样得到(总的大约分子量-18(终端氢和羟基基团的分子量)×聚氧乙烯重量百分比＝聚氧乙烯的分子量÷44(C2H4O的分子量)＝POE基团个数，因此，对于F68来说其个数就等于((8400-18)×80％)＝6705.6÷44＝152.4(÷2＝76)在BASF命名法中，描述泊洛沙姆物理形式的字母后的第一个数字任意代表POP的分子量，第二个字母代表POE的百分比——F68是泊洛沙姆188的BASF商品名，以BASF法计算F68的平均分子量为8400，F68NF级的平均分子量即8600，那么POE的个数为80，所以百分比为81.6％，POP的个数为27，分子量为1566，则整个分子式为HO-(C2H4O)80-(C3H6O)27-(C3HO)80-H，由此计算，其分子量是18+7040+1566＝8624在实际操作中，泊洛沙姆是在产生具有期望分子量的疏水基因的过程中而合成，在此过程中需要有控制地将环氧丙烷加到丙二醇的两个羟基基因，之后添加环氧乙烷，使疏水基团在两个亲水基因之间，呈三明治结构，从而得到具有一定分子量的分子聚集，及亲水基团的平均百分比。
由于在这个表面活性剂家族中，EO及PO的比例及重量均不相同，BASF研制出了PLURONIC格以用图例表示聚合物分子结构、物理形态及表面活性剂特征间的关系。在PLURONIC表面活性剂格中，以每分子中疏水基因(PO)的分子量范围及亲水基因(EO)的分子量百分比作图。根据泊洛沙姆在PLURONIC格上的定位所划分的泊洛沙姆系列，在其分子量与相关疏水性方面可能有共同特征。
正如图18所示，PLURONIC格阐明了字母组合的用途以辨别PLURONIC的不同产品系列，字母序列代表了产物的物理形态“L”即液体；“P”即糊状物，“F”即固体。数字中第一位数(三位数中的两位数)乘以300，代表疏水基因的大致分子量(格子左边的垂直轴)，最后1位数乘以10代表分子中也环氧乙烷的大致含量(水平轴)。
图19显示了能够提高质粒DNA转移至肌肉效率的泊洛沙姆系列的特征，优选的泊洛沙姆已在图18中圈出，并且包括PLURONICSF38、F68、F87、F88、F108和F127表示的泊洛沙姆188。本发明者发现F68能显著提高质粒DNA在骨骼肌及心肌的转移效率，同时伴有血管生成转基因表达。
实施例16图3B及3C描述了向局部缺血组织转移血管生成的优选质粒载体的结构，如图所示，此质粒包括后转录成分(包括合成内含子及hGH聚腺苷酸信号的5’UTR)以提高蛋白表达的水平及准确性。在此方案中，如图3B所示，表达盒除了一个5’UTR中的合成内含子IVS8，还包括一个被称作UT12(SEQ ID NO8)的CMV5’UTR。
UT12序列(SEQ ID NO8)如下5’TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTG3’真核表达载体转录子的隐蔽剪接显然不理想。为了控制剪接方式及使基因表达最大化，可用强式内含子代替亚佳内含子(suboptimalintron)。为此，具有共有剪接序列的内含子应是最优选择。在本方案(IVS 8)中，合成内含子包括5’剪接位、3’剪接位和分支位点的共有序列。当合成内含子并入用来表达治疗性基因的真核载体中，其将引导RNA转录子高效、准确地剪接，因此，可使隐蔽剪接最小化，使目的基因产物地最大化。
5’剪接位共有序列的第一位和第六位是多义的。5’剪接位与U1snRNA配对。所选序列使得U1 snRNA与合成5’剪接位之间形成螺旋结构的自由能最小化。
5′ss 5′CAGGUAAGU 3′ SEQ.ID.NO9|||||||||U1 RNA3′GUCCAUUCA 5′ SEQ.ID.NO10在哺乳动物中，分支位点序列非常多义。分支位点序列中除了一膨出的A残基，均与U2 snRNA配对。此选择序列能使U2 RNA与合成分支位点序列形成螺旋结构的自由能最小；它也和酵母前mRNA剪接必须的分支位点序列匹配。分支位点通常位于3’剪接位上游18-38个nt处；合成内含子的分支位点位于3’剪接位上游24个nt处。
RP5′UACUAAC 3′ SEQ.ID.NO11||||||U2 RNA3′AUGAU G 5′ SEQ.ID.NO123’剪接位共有序列的聚嘧啶序列还未确切阐明。若使3’剪接位功能达到最佳，至少需要5个连续的尿嘧啶残基。这一点可以结合到合成内含子的聚嘧啶序列，而聚嘧啶序列具有7个连续的尿嘧啶残基。
在体外，若内含子长度大于80个nt，则剪接可达到最佳。尽管许多内含子具有千上万个碱基，大部分野生型的内含子长度是90-200个nt。在优选的方案IVS8中，合成内含子的长度是118个核苷酸，IVS8的序列(SEQ ID NO13)如下所示
5′ssPacI|BbsI PstINheIATTCTGCTCAACCTTCCTATCAGAAACTGCAGTATCTGTATTTTTGCTAGCAGTTBP 3′ss|EarI|NcoI 其中，外显子的序列是黑体的。N代表任何碱基。共有剪接信号下加双划线。限制酶辨以点加上划线，可用限制酶Bbsl准确地在5’剪接位裂解DNA，用限制酶EarI准确地在3’剪接位裂解DNA。这两个位于合成内含子地限制点BbsI基EarI使得内含子可以被容易而准确地去除。PstI及NheI位点有助于核对克隆序列。此序列的双链DNA可经成熟前长链寡聚核苷酸制备而得。
为了更密切地与通常包含许多内含子野生型基因结构匹配，要将合成内含子在许多个位点插入感兴趣的基因。插入多个内含子后，要注意使因此而得的内在的外显子长度小于300个核苷酸，如果内在外显子长于300个核苷酸，就会发生外显子跳读。
前面对本发明的公开和描述只是叙述性和解释性的；在不偏离本发明精神的前提下，可以对其大小、形状、材料以及所述体系的细节作出多种改变。本发明权利要求所用术语的含义，取决于本领域之前所推定的含义，即一个特征的引用，会涵盖一个或多个的特征，而二个特征的引用，会涵盖二个或多个的特征，如此类推。
序列表<110>瓦伦提斯有限公司<120>治疗局部缺血的基因转移配方及方法<130>265/043<140>尚未转让<141>2001-10-19<150>US 60/242,277<151>2000-10-20<150>US 60/294,454<151>2001-05-29<160>13<170>PatentIn 3.1版<210>1<211>1443<212>DNA<213>人类(H0mo sapiens)<400>1atgaagcgct cggtagccgt ctggctcttg gtcgggctca gcctcggtgt cccccagttc60ggcaaaggtg atatttgtga tcccaatcca tgtgaaaatg gaggtatctg tttgccagga 120ttggctgatg gttccttttc ctgtgagtgt ccagatggct tcacagaccc caactgttct 180agtgttgtgg aggttgcatc agatgaagaa gaaccaactt cagcaggtcc ctgcactcct 240aatccatgcc ataatggagg aacctgtgaa ataagtgaag cataccgagg ggatacattc 300ataggctatg tttgtaaatg tccccgagga tttaatggga ttcactgtca gcacaacata 360aatgaatgcg aagttgagcc ttgcaaaaat ggtggaatat gtacagatct tgttgctaac 420tattcctgtg agtgcccagg cgaatttatg ggaagaaatt gtcaatacaa atgctcaggc 480ccactgggaa ttgaaggtgg aattatatca aaccagcaaa tcacagcttc ctctactcac 540cgagctcttt ttggactcca aaaatggtat ccctactatg cacgtcttaa taagaagggg 600cttataaatg cgtggacagc tgcagaaaat gacagatggc cgtggattca gataaatttg 660caaaggaaaa tgagagttac tggtgtgatt acccaaggag ccaagaggat tggaagccca 720gagtatataa aatcctacaa aattgcctac agtaatgatg gaaagacttg ggcaatgtac 780aaagtgaaag gcaccaatga agacatggtg tttcgtggaa acattgataa caacactcca 840tatgctaact ctttcacacc ccccataaaa gctcagtatg taagactcta tccccaagtt 900tgtcgaagac attgcacttt gcgaatggaa cttcttggct gtgaactgtc gggttgttct 960gagcctctgg gtatgaaatc aggacatata caagactatc agatcactgc ctccagcatc 1020
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<223>pDL1680人类Del-1表达质粒的序列<400>2ggtacggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc60cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 420aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 480aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc 540tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc 600cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ttaattaaca ggtaagtgtc 660ttcctcctgt ttccttcccc tgctattctg ctcaaccttc ctatcagaaa ctgcagtatc 720tgtatttttg ctagcagtaa tactaacggt tctttttttc tcttcacagg ccaccaagct 780tatgaagcgc tcggtagccg tctggctctt ggtcgggctc agcctcggtg tcccccagtt 840cggcaaaggt gatatttgtg atcccaatcc atgtgaaaat ggaggtatct gtttgccagg 900attggctgat ggttcctttt cctgtgagtg tccagatggc ttcacagacc ccaactgttc 960tagtgttgtg gaggttgcat cagatgaaga agaaccaact tcagcaggtc cctgcactcc 1020taatccatgc cataatggag gaacctgtga aataagtgaa gcataccgag gggatacatt 1080
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<223>密码子优化的VEGF 165<400>3atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agcctggccc tgctgctcta cctccaccat 60gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240atgcgctgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat cggagagatg 360agcttcctgc agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420aatccctgtg ggccttgctc cgagcggaga aagcatctgt ttgtgcaaga tccgcagacg 480tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga576<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Del-1有义PCR引物<400>4tgacctccat agaagacacc gggac 25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Del-1反义PCR引物<400>5gtgatgcaac ctccacaaca ctaga 25<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VEGF反义PCR引物<400>6ggaggggtca cagggatgc19<210>7<211>576<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<400>7atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga576<210>8<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自CMV定义UT12的5’未翻译区域<400>8tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 60atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg 110<210>9<211>9
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成内含子的5’剪接位序列<400>9cagguaagu 9<210>10<211>9<212>RNA<213>人类(Homo sapiens)<400>10guccauuca 9<210>11<211>7<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成内含子的分支点的序列<400>11uacuaac7<210>12<211>6<212>RNA<213>人类(Homo sapiens)<400>12augaug 6<210>13<211>160<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>定义为IVS8的合成内含子，其外显子序列由n表示，n可以是任何稍长或稍短的碱基<220>
<221>其它特征<222>(1)..(10)<223>任何碱基<220>
<221>其它特征<222>(151)..(160)<223>任何碱基
<400>13nnnnnnnnnn ttaattaaca ggtaagtgtc ttcctcctgt ttccttcccc ctgctattct 60gctcaacctt cctatcagaa actgcagtat ctgtattttt gctagcagtt atactaacgg 120ttcttttttt ctcttcacag gccaccatgg nnnnnnnnnn160
权利要求
1.一种刺激血管生成的组合物，该组合物包含一种功能上编码Del-1多肽的核酸和一种能够延长该核酸定域生物利用度的复合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的能延长核酸定域生物利用度的复合物是泊洛沙姆。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述的泊洛沙姆在组合物中浓度约为10％(w/v)或小于10％(w/v)。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述的泊洛沙姆含有80％或者更多的亲水成分，其疏水部分的分子量在950-4000道尔顿之间。
5.如权利要求3所述的组合物，其中，所述的泊洛沙姆选自于具有如下特征的一组泊洛沙姆中PluronicsF38、F68、F87、F88、F108以及F127。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆188，其浓度约为1-10％(w/v)。
7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述的泊洛沙姆188的浓度约为5％。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的能延长核酸定域生物利用度的复合物是聚谷氨酸酯/盐。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的编码Del-1多肽的核酸包括序列SEQ ID NO1。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的编码Del-1多肽的核酸还包括启动子、5’UTR、合成内含子以及3’UTR。
11.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的核酸为质粒。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述的质粒具有序列SEQ ID NO2。
13.如权利要求1所述的组合物，该组合物还进一步包括一种编码血管内皮生长因子蛋白的核酸。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述的编码血管内皮生长因子蛋白的核酸包括至少5个在人体中能最佳表达的密码子。
15.如权利要求14所述的组合物，其中，所述的编码血管内皮生长因子蛋白的核酸包括序列SEQ ID NO3。
16.如权利要求13所述的组合物，其中，所述的编码Del-1的核酸和编码血管内皮生长因子的核酸是分别包含在两种独立的质粒载体中。
17.如权利要求13所述的组合物，其中，所述的编码Del-1的核酸和编码血管内皮生长因子的核酸是包含于一种单一的质粒载体中。
18.如权利要求所1述的组合物，其中，所述的组合物在2-8℃℃下是稳定的。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述的组合物为冻干制剂。
20.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的组合物通过逆行静脉灌注进行转移。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述的通过逆行静脉灌注进行转移，是指转移至哺乳动物的一种选自于如下一组的器官中肢体、肾脏、肝脏、大脑及心脏。
22.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的组合物是采用选自于如下的注射方法进行转移肌肉注射、血管内注射、囊内注射。
23.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的延长核酸定域生物利用度的复合物并不浓缩该核酸。
24.一种刺激血管生成的组合物，该组合物包含载体，该载体含有编码血管生成蛋白的核酸序列，并复配有非浓缩的、选自于如下一组的聚合物泊洛沙姆、泊洛沙胺、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚谷氨酸酯/盐及其共聚物。
25.如权利要求24所述的组合物，其中，所述的血管生成蛋白能与αvβ3-整连蛋白受体结合。
26.如权利要求25所述的组合物，其中，所述的血管生成蛋白是Del-1。
27.如权利要求24所述的组合物，其中，所述的血管生成蛋白是血管内皮生长因子蛋白，所述的编码血管内皮生长因子的核酸序列包含至少5个在人体中能最佳表达的密码子。
28.如权利要求27所述的组合物，其中，所述的对于血管内皮生长因子最佳的密码子序列是SRQ ID NO3。
29.如权利要求24所述的组合物，其中，所述的载体是含有启动子、5’UTR、合成内含子及3’UTR的质粒。
30.如权利要求26所述的组合物，该组合物还进一步含有编码血管内皮生长因子蛋白的核酸；对于在人体中表达，该血管内皮生长因子蛋白是密码子优化的。
31.如权利要求24所述的组合物，其中，所述的载体为复配有泊洛沙姆的病毒载体，并能通过逆行静脉灌注转移至哺乳动物。
32.一种促进局部缺血组织中侧支血管形成的方法，包括以下步骤将编码血管生成蛋白的核酸以复配物的形式定域转移至局部缺血组织，所述复配物中含有浓度小于10％(w/v)的泊洛沙姆。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述的复配的核酸通过直接注射的方式转移至局部缺血组织。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述的局部缺血组织为心肌组织，所述复配的核酸，通过置于导流至冠状窦的静脉中的气囊导管，采用逆行静脉灌注方法进行转移。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述的导流至冠状窦的静脉选自于心大静脉(GCV)、心中静脉(MCV)、左室后静脉(PVLV)、室间前静脉以及它们的任意分支。
36.一种促进哺乳动物心脏的局部缺血区域内侧支血管生成的方法，包括如下步骤将功能上编码Del-1蛋白的核酸复配为包含泊洛沙姆的组合物，所述泊洛沙姆含有80％或者更多的亲水成分，而其疏水的分子量在950-4000道尔顿之间；其中，所述的组合物适于利用如下方法输送至心肌组织通过置于引流至冠状窦的静脉中的气囊导管，将复配的核酸按与正常血流相反的方向并给予足够压力灌注至静脉，使得复配的核酸外渗至局部缺血组织的区域。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述的引流至冠状窦的静脉选自于心大静脉(GCV)、心中静脉(MCV)、左室后静脉(PVLV)、前室间静脉(AIV)及其任意分支。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆188，其浓度约为1-10％(w/v)。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述的组合物还进一步包括编码血管内皮生长因子蛋白的核酸。
40.一种促进哺乳动物心脏的局部缺血区域内侧支血管生成的方法，包括如下步骤将包含功能上编码血管生成蛋白核酸的载体复配为包含泊洛沙姆水溶液的组合物；其中，所述的复配的核酸利用如下方法输送至心肌组织在引流至冠状窦的静脉中设置气囊导管，将复配的核酸按与正常血流相反的方向并给予足够压力灌注至静脉，并使复配的核酸外渗至局部缺血组织的区域。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述的引流至冠状窦的静脉选自于心大静脉(GCV)、心中静脉(MCV)、左室后静脉(PVLV)、前室间静脉(AIV)及其任意分支。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述的血管生成蛋白为Del-1。
43.如权利要求46所述的方法，其中，所述的组合物还进一步包括编码血管内皮生长因子蛋白的核酸。
44.如权利要求44所述的方法，其中，所述的血管生成蛋白是血管内皮生长因子蛋白，所述的编码血管内皮生长因子的核酸序列包含至少5个在人体中能最佳表达的密码子。
45.如权利要求40所述的方法，其中，所述的载体为病毒。
46.一种包含质粒的药物组合物，所述质粒包含能够编码Del-1的核酸序列，其中，所述的质粒复配有浓度为5％(w/v)的泊洛沙姆188和5.0mM的Tris-HCl缓冲液。
47.一种药物组合物瓶装制剂，其包括5毫克pDL1680、250毫克泊洛沙姆188、0.45毫克TRIS及0.70毫克的Tris-HCl。
全文摘要
本发明者发明了一种新型的转移心脏及外周血管的生成因子的方法，此方法能够避免目前已有的其他转移技术所导致的毒性作用。携带能够编码内皮细胞发育位点－1序列或内皮细胞生长因子序列或者两者兼有的载体，可用泊洛沙姆试剂或其他聚合物预先准备，然后将其转移入局部缺血组织以及通过逆行静脉注入心脏。
文档编号A61K38/18GK1531422SQ01820655
公开日2004年9月22日 申请日期2001年10月19日 优先权日2000年10月20日
发明者迈克尔·E·科尔曼, 迈克尔 E 科尔曼, 麦克罗林, 菲奥纳·麦克罗林, L 西塞, 王纪军, 特 扬, 玛丽·L·西塞, L 诺德斯特罗姆, 斯图尔特·扬, 杰弗里·L·诺德斯特罗姆 申请人:瓦伦提斯有限公司