专利名称：基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备预防和治疗关节炎病药的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及物质的医药用途，更具体说是用基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在预防和治疗关节炎方面的应用。
TIMPs是一种分泌型的多项功蛋白，最常见的是能抑制MMPs(Biochim Biophys Acta，2000.1477267-83.)。由于MMP与TIMP的比例不均衡，明显高于TIMP比例的MMP是造成关节组织破坏的重要因素。探索发现若改变这种不均衡比例，提高TIMP的比例，会抑制关节炎。早些时候，我们克隆了基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4，(Cell，1996.85307-10.)，并运用全身肌内基因治疗方法说明TIMP-4对裸鼠体内肿瘤生长起到的作用(Oncogene，2001.204337-43.)也可以通过电穿孔的疗法注射TIMP-4表达质粒达到维持的TIMP-4血清水平(Oncogene，2001.204337-43.)。在此项研究中，以辅剂关节炎模式，通过注射裸DNA可抑制关节炎，并且探索出TIMP-4基因抑制关节炎的病理机制。因此，人们至今未揭示基质金属蛋白酶组织抑制TIMP-4在预防和治疗关节炎的应用。
本发明另一目的是提供一种对受治疗者系统给予TIMP的途径。
风湿性关节炎病理机制表明，MMPs不仅破坏关节炎表层，还破坏恢复治疗。由于T细胞的活性释放出促进炎症反应的调节因子引起关节炎。TNF-α与IL-1激活巨噬细胞和成纤维细胞释放MMPs，从而造成关节组织被破坏。抑制促进炎症反应的调节因子的表达早已应用于临床，(J Clin lmmunol，1999.19305-13.)，但抑制MMPs活性的试验正在进行中(Br J Pharmacol，2000.1311513-20.)。
在关节炎的病人中，血中和组织中促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF都很高。本发明描述了一种抑制血中和组织中Interleukin-1α和TNF水平的方法，通过体内导入能有效抑制炎症反应的适量的TIMP-4。
关节组织中的MMP酶的升高是关节炎病人关节软组织直接受损伤的关键原因。TIMP特意性的抑制MMP酶的活性。本发明描述了一种抑制血中和组织中升高的MMP酶活性的方法，通过给予受治疗者一定量的能有效抑制MMP的TIMP如TIMP-4。发明者证实在用TIMP后，患有关节炎的动物血中和组织中升高的MMP酶会降到正常水平。
本发明目的可以通过以下措施来达到基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在预防和治疗关节炎中的应用，关节炎包括风湿性关节炎和非风湿性关节炎；TIMP-4进入受治疗者的途径是介导和表达一个编码TIMP-4蛋白的DNA序列进入受治疗者足够数量的细胞内，细胞为平滑肌细胞；所述的编码TIMP-4蛋白的DNA序列是通过肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法介导的，或者是通过包括肌内注射脂质体配方的裸DNA的方法介导的；TIMP-4可以作为纯化的重组TIMP-4蛋白或从天然物质分离的TIMP-4蛋白给予受治疗者。
本发明相比现有技术具有如下优点本发明采用的是基因疗法，并且通过裸DNA肌内注射然后电穿孔的方法来转移基因，而没有用病毒做载体，可以有效地抑制促进炎症反应的调节因子interleukin和TNF-α，亦可以有效的抑制关节炎患者关节组织中MMP酶的活性，因此操作简单，没有毒性。
图1中的上图用Western blot测定血中TIMP-4蛋白的水平。
图1中的下图用Western blot中TIMP-4的带进行密度测定来表达血中TiMP-4蛋白的相对含量。
图2肌内注射TIMP-4表达质粒可以有效的抑制诱发的关节炎。
控制正常大鼠；模拟诱发关节炎的大鼠，給予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4，诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒氟联苯丙酸诱发关节炎的大鼠，给予抗炎药氟联苯丙酸，纵坐标是大鼠关节的直径。
图3A肌内注射TIMP-4表达质粒对MMP酶和胶原蛋白水解酶活性的抑制作用示意图。
关节组织中Gelatinase(MMP)酶的活性。辅剂用辅剂诱发关节炎。Pcl-neo(模拟)对诱发关节炎的大鼠处理不含TIMP-4基因的质粒。Pcl-neo-TIMP-4对诱发关节炎的大鼠处理含有TIMP-4基因的质粒。和模拟比较*P＝0.0003图3B肌肉注射TIMP-4表达质粒对MMP酶和胶原蛋白水解酶活性的抑制作用示意图。关节组织中胶原蛋白水解酶活性。
控制正常大鼠关节组织中的胶原蛋白。只有辅剂诱发关节炎的大鼠关节组织中胶原蛋白。TIMP-4+辅剂诱发关节炎的大鼠被TIMP-4治疗后，其关节组织中的胶原蛋白。
图4A肌内注射TIMP-4表达质粒对促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF的表达水平的抑制作用示意图。
关节组织中Interleukin-1α和TNF的表达水平。控制正常大鼠；模拟诱发关节炎的大鼠，给予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒。和Sham比较，*P＝0.019。
图4B肌内注射TIMP-4表达质粒对促进炎症反应的调节因子，Interleukin-1α和TNF的表达水平的抑制作用示意图。
血中Interleukin-1α和TNF的表达水平控制正常大鼠；模拟诱发关节炎的大鼠，给予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒。和模拟比较*P＝0.046；**P＝0.001
实施例1 肌内注射TIMP-4表达质粒的试验利用一次性胰岛素注射器以及一支25号针，将50μl(150μg)TIMP-4表达质粒DNA(TIMP-4 cDNA插入pCI-neo哺乳动物表达载体，Promega Corporation，Madison，WI)或仅质粒DNA注射入10周大的雄性Lewis大鼠的双侧胫骨前肌肉(单次肌内注射脂质体)，然后进行电穿孔法一对电极插入肌肉，在DNA注射部位相距5mm间隙，用一个电脉冲发生器Electro Square Porator ECM 830(Genetronics，Inc.San Diego，CA)给予电脉冲。三次脉冲，每秒一次，电压为100V，传导到注射部位，每个脉冲持续50ms。然后，给予三次反向的脉冲。
图1显示肌内注射TIMP-4表达质粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。单次肌内注射150μg TIMP-4表达质粒前以及在不同时间后收集10μl的血清，用TIMP-4抗体进行western blot分析。图1表示一只鼠中血清TIMP-4水平在不同时间的变化。一次注射TIMP-4可以在5星期后在血中观察到很高水平的TIMP-4蛋白。所有5只鼠在每个时间点上均观察到相似的TIMP-4水平。
这里所说的“裸DNA”定义为包含于一个非病毒载体的DNA。正如本领域专业技术人员所知，任何以上DNA转导方法都可以结合起来。
为检验给予TIMP后是否可以抑制在大鼠上诱发的关节炎，我们建立的关节炎大鼠的辅剂模型来评价全身注射TIMP-4基因在抑制关节炎方面的影响。在治疗8个星期大的lewis大鼠在辅剂接种之前也应用了TIMP-4质粒或不含TIMP-4的对照质粒，时间为0星期。这种治疗将应用在整个关节炎发展过程中，在被辅剂诱发关节炎后的三个星期，动物的体重平均降低5g，而没有诱发关节炎的正常大鼠体重增加了60g。给诱发关节炎的大鼠注射TIMP-4，能抑制其关节炎导致的体重降低并保持平均体重增加45g左右。
实施例2。TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制诱发的关节炎。在用辅剂诱发关节炎前两周，给大鼠注射TIMP-4表达质粒或没有TIMP-4的空质粒。用辅剂诱发关节炎后两周观察各实验组关节炎的发生情况。用辅剂诱发关节炎的组和用没有TIMP-4的空质粒处理的诱发关节炎组，八只大鼠全部患有关节炎，致病100％。(表1和图2).但是在用TIMP-4表达质粒处理的诱发关节炎组中，十只大鼠没有一只患有关节炎。
更重要的是全身给药TIMP-4可以很有效地抑制在大鼠身上诱发的关节炎(表1和图2)。表1不同大鼠实验组关节炎发生频率和关节直徑
*大鼠实验组正常大鼠，没有诱发关节炎，没有质粒；空质粒，诱发关节炎+PCI-neo质粒；TIMP-4诱发关节炎+TIMP-4必要质粒；TIMP-4(C1A)，诱发关节炎+TIMP-4(C1A)质粒；Flurbiprofen，诱发关节炎+flurbiprofen.**NA＝不适合。***ND＝没有测定。
我们还选用了一种抗炎症药物flurbiprofen(氟联苯丙酸，一种能够抑制关节炎的甾体制剂)，在抗关节炎方面的作用与TIMP-4对比。我们在动物关节炎模型中也成功的使用了氟联苯丙酸。所有的患有关节炎的动物在接受了氟联苯丙酸治疗后，其关节炎症状明显减轻。(表1，图2)虽然人们发现了氟联苯丙酸抗关节炎的作用，但是其治疗作用明显小于TIMP-4。
TIMP有各种不同的生物学功能，除了其抗MMP活性以外，还包括细胞生长和凋亡的调节作用等。包括TIMP-4在内所有TIMP的抑制MMP的活性已证实由其N末端区域所介导，该末端区域与活化的MMP形成紧密复合物(Murphy et al.，Methods Enzymol.248496-510，1995；Hutton et al.，Biochemistry，3710094-8，1998)。想研究TIMP抗关节炎的作用是否与其抗MMP酶的作用有关。基于这点，构建了TIMP-4的突变体C1A。选择TIMP-4的突变体C1A是基于1位上的半胱氨酸在TIMPs抑制MMP活性方面起重要作用，同时氨基酸上的突变体导致抑制活性功能的丧失。
将突变的TIMP-4 C1A基因打入诱发关节炎的大鼠上，15只患有关节炎的动物，5只为一组，分别用不含TIMP-4的对照质粒、TIMP-4、TIMP-4的突变体C1A进行治疗，其中用对照质粒治疗的关节炎发病率为4/5，用TIMP-4治疗的关节炎发病率为0，用TIMP-4(C1A)治疗的关节炎发病率为3/5(如表1所示)。
TIMP-4的突变体失去了其抗关节炎的作用，从而证明TIMP-4抗关节炎的作用与其抗MMP酶的作用密切有关。
实施例3 TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制MMP酶的活性。用以前报道过的方法(Liu and Shi et al，J.Biol.Chem.，27220479-20483，1997)，我们测定了不同实验组关节组织中的MMP酶和胶原蛋白水解酶的活性。结果见图3A、图3B。大鼠被诱发关节炎后，关节组织中Gelatinase(MMP)酶的活性比正常的关节组织增高了十倍。但是对诱发关节炎的大鼠给于TIMP-4治疗后，Gelatinase(MMP)酶的活性几乎降到正常关节组织中酶的活性(图3A)。在诱发关节炎的大鼠关节组织中，被胶原蛋白水解酶的活性也有显著的增高(图3B)。正常的胶原蛋白在电泳上只有两条高分子的带，在诱发关节炎后的三只大鼠上，由于胶原蛋白水解酶活性的显著增高，正常的两条高分子胶原蛋白被水解成很多条小分子的带。但是在对四只诱发关节炎的大鼠给予TIMP-4全身基因治疗后，这些被水解形成的多条小分子带基本上消失了。从而证明TIMP-4有效的抑制了被诱发关节炎后而升高的胶原蛋白水解酶活性。
接着在建立的关节炎大鼠模型中检验了TIMP-4抑制MMP酶活性的有效性。大鼠被诱发关节炎后，关节组织中MMP酶的活性比正常的关节组织增高了十倍(图3A)。胶原蛋白水解酶的活性也有显著的增高(图3B)。全身给药TIMP-4后，MMP酶的活性和胶原蛋白水解酶的活性显著下降，其酶活性和没有诱发关节炎的大鼠关节一样。
另外在建立的关节炎大鼠模型中检验了TIMP-4抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF的有效性。由于关节炎中的MMP的表达是通过由巨噬细胞产生的因子进行的(Cell，1996.85307-10.)，所以我们探索了两种促炎症反应调节因子即TNF-α和IL-1α在关节炎病生理学中的表达全程。
实施例4 TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF-α的表达水平。文献已提到细胞因子在关节炎中的作用，此文献重点论述了炎症过程中的TNF-α(Cell，1996.85307-10.)。炎症过程中MMP的表达、促炎症反应的调节因子、抗炎因子均受TNF-α的调控。如图4A，图4B所示，用辅剂诱发关节炎后，如果只给动物注射不含TIMP-4的对照质粒，TNF-α在组织中的含量为6.85ng/ml，在血清中的含量为29.2ng/ml，没有关节炎的正常对照物组织中含0.9ng/ml，血清中含10.4ng/ml相比，TNF-α水平要高的多。用TIMP-4治疗后的动物与正常对照物体内的TNF-α水平相当(组织中2.4，血清中10.4ng/ml)。患有关节炎的动物和正常对照物的组织、血清相比也有较高的IL-1α水平。在未接受治疗的健康动物的组织中没有发现促进反应的调节因子IL-1α，而在血清中有2ng/ml的IL-1αl。患有关节炎的动物，血清中的IL-1α水平明显增加到3.6ng/ml，组织中的IL-1α增加到1.3ng/ml。统计来看，注射TIMP-4后，血清中IL-1α水平明显降低(1.8ng/ml)。虽然在注射TIMP-4后，组织中IL-1α的水平也有所下降(0.475ng/ml)，但并不明显。
如图4A所示，大鼠被诱发关节炎后，关节组织中和血中的IL-1和TNF的表达水平都有显著升高。但是在经过TIMP-4的全身基因治疗后，血中IL-1和TNF的表达水平降到了正常水平(图4B)。所以TIMP-4是一个抗炎症反应的有效因子，可以有效的抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF-α。
为达到将TIMP基因介导入受治疗者的目的，可以将一个包含编码TIMP的核酸的重组载体与一种无菌水溶液组合，该溶液最好是与接受者的血液等渗。可以将重组载体悬浮于含有生理上可配伍的物质如氯化钠、甘氨酸等以及与生理条件相配的缓冲PH的水中，并将该溶液灭菌。本发明的较好例子，重组载体与20-25％蔗糖组合配制于生理盐水中用以介导入哺乳动物。所给予的编码TIMP的核酸的量或者载体中编码TIMP的核酸的量足以抑制受治疗者的MMP和TNF-α。但是，确切的剂量依赖于各种因素诸如给药的目的、给药方式、组合的有效性、以及受治疗者个体药代动力学参数。本领域专业人员可以按治疗的需要决定治疗的频率和时间。
实施例1-4，分别用于风湿性关节炎或非风湿性关节炎患者。
本发明用已知的蛋白因子用于预防和治疗关节炎。
权利要求
1.基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在制备预防和治疗关节炎病药的应用，关节炎包括风湿性关节炎和非风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及一种基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP－4在制备预防和治疗关节炎病药的应用，通过给予TIMP－4来抑制促进炎症反应的调节因子interleukin－1α和TNF－α和关节炎患者中关节组织中MMP酶的活性，以预防和治疗关节炎。TIMP－4既可以通过肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法有效的给予，也可以通过常规的蛋白质如纯化的重组TIMP－4蛋白。本发明优点是没有用病毒做载体，操作简单，没有毒性，本发明用已知的蛋白因子TIMP－4用于预防和治疗关节炎。
文档编号A61P19/02GK1403159SQ0214665
公开日2003年3月19日 申请日期2002年11月1日 优先权日2002年11月1日
发明者史跃年, 刘时雨 申请人:北京深文科技开发有限责任公司