专利名称：重组血小板源生长因子水凝胶制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的水凝胶制剂的制备方法，具体地，本发明涉及一种重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂的制备方法。
背景技术：
糖尿病是全球性高发疾病之一。1998年的统计数字显示，全球糖尿病患者约有1.43亿人。美国目前大约有1600万人患有糖尿病，中国糖尿病人更是高达4000多万，并且还以每年1‰的速度递增。据WHO专家估计，到2025年全球糖尿病患者将达3亿，其中75％的糖尿病人在印度、中国等发展中国家。
糖尿病人的一个特殊问题是足部及下肢发生溃疡，简称糖尿病足(干性坏疽)。周边神经病变、肢端缺血和感染是三个主要的致病因素。其发病率随着患者年龄增加而增大，多发于40岁以上的患者中。糖尿病足很难治愈，目前临床主要有维持、预防感染和营养神经三种治疗方法，但都无法从根本上使组织再生，促进创面愈合。病人的溃疡长期不能愈合，甚至迟迟无皮肤生长的现象，并发感染，最终的结果是截肢。据统计，美国每年由各种类型糖尿病导致截肢的有5.6万人，单是住院治疗和截肢的总费用平均每人就需要4万美元，为此美国每年支出的医疗费用超过22亿美元，给家庭和社会带来极大负担。而血小板源生长因子可以促进创面组织再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危险。
血小板源生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，以下简称PDGF)是一种通常储存于血小板α颗粒中的碱性蛋白质，由血小板、趋化到受损部位的巨噬细胞、受损血管附近的平滑肌细胞和受损部位的血管内皮细胞等多种细胞所分泌，具有促进中胚层源细胞分裂；刺激白细胞、平滑肌细胞、单核细胞和成纤维细胞的趋化作用；参与创伤修复过程中的炎症的反应，参与组织和细胞的分化与增殖过程；对正常和病理状态下的创伤修复有促进作用等。
PDGF是由A、B两种单体构成的二聚体结构，其分子量为28-31KDa，可形成PDGF-AA，BB和AB三种异构体，在人类血小板来源中约85％-90％为AB型(分子量为22.5KDa，其中A链为13.3KDa，B链为12.2KDa)，约10％-15％为BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高达30％，而新鲜的血小板也可含有高达27％PDGF-AA。PDGF亚型的浓度是直接与创口愈合过程相关的。本发明涉及的重组血小板源生长因子为PDGF-BB型(以下简称为rhPDGF-BB)。
大量研究表明，慢性伤口如糖尿病足部溃疡、压迫性溃疡的微环境中缺乏活性生长因子是造成它们难以愈合的主要原因。因此在这一领域中生长因子的潜在治疗作用开始受到人们的广泛关注。有关PDGF，EGF，TGF等生长因子的治疗作用迅速展开。实验表明PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程中起重要作用，参与创口愈合的全过程。特别是针对慢性难愈性疾病如糖尿病溃疡，慢性静脉性溃疡，褥疮，放射性溃疡等效果显著。另外，血小板是进入创口的第一个细胞成分，通过释放生长因子促进平滑肌细胞胶原蛋白的合成来启动创口愈合过程。因此理论上说，PDGF应该对所有创面愈合均有促进作用，包括烧伤、烫伤、手术创口、皮外伤等急性创伤及对慢性静脉溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有促进愈合作用。
在各种疤痕的治疗方面，PDGF也显示了良好的效果，现在已经有一系列基于PDGF的用于治疗痤疮等留下的疤痕的修复用化妆品相继问世。
到目前为止，PDGF是国外唯一一个在三期临床上证明有效并已作为药物上市的生长因子。1997年12月16日，美国食品及药品管理局批准Ortho-McNeil公司生产的REGRANEX药物上市，Regranex的有效活性成分是Becaplermin(0.01％)，即人重组血小板源生长因子(PDGF-BB)。Becaplermin由重组DNA技术在酵母菌中表达生产，原料Becaplermin由美国Chiron公司生产(U.S.LicenseNo.1106，Emeryville，CA 94608)；Regranex由Ortho-McNeilPharmaceutical公司推向市场(U.S.License No.1196，San German，Puerto Rico 00683)，用来治疗皮下深层、有充足血管供应的糖尿病足部溃疡。Regranex是一种羧甲基纤维素型软膏，为无色或淡粉色，1g含100ug Becaplermin，有2g，7.5g和15g的包装，限于外用。是目前唯一的一种PDGF剂型。
在向中国知识产权局申请的专利中有一个申请号为96198773.1的专利申请含生长因子的凝胶制剂，其权利要求书的所要求保护的也是PDGF的凝胶制剂，其有效药物成分为血小板生成生长因子PDGF为PDGF-B的同二聚体，凝胶基质为纤维素聚合物，及可药用的带电荷化学物质，选自包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鱼精蛋白、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、色氨酸、氨基胍、锌和镁的组合，其中组合物为粘度在室温下约1000-500,000cps范围内的水性凝胶。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂，它基本上含有1)、药物成份重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝胶基质；3)、一种稳定剂；4)、一种等渗剂；5)、一种PH调节剂。
本发明的目的之二是提供一种制备新的重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂的方法。
本发明提供的重组血小板源生长因子的水凝胶制剂，是根据rhPDGF-BB药物自身的特点即主要是用于治疗糖尿病患者溃疡伤口的外用药而制备的，其特点在于在润湿的环境下，有利于伤口的愈合，使伤口不会结痂；基质本身具有弹性和柔软性，同时外观呈透明状，有利于对伤口愈合情况的观察，且与皮肤创面有较好的接触性能；同时药物需要通过凝胶层进行释药，具有缓慢持续释放药物的作用，因此药效作用维持的时间长等等。
本发明的技术方案之一为是提供一种新的重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂，它基本上含有1)、药物成份重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝胶基质；3)、一种稳定剂；4)、一种等渗剂；5)、一种PH调节剂。
本发明的技术方案之二为提供一种制备新的重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂的方法，包括如下步骤1)、取水凝胶基质适量，加注射用水，充分浸泡，使之溶涨完全。然后滴加适量的PH调节剂，使胶液的PH值达到5.0-9.0之间；加入一定量的等渗剂，搅拌至溶解，放于适宜的容器中，高压流通蒸汽灭菌30分钟(121℃，115Pa)，室温下充分冷却，制备得A液；2)、取一定量的稳定剂，加水溶解，置于2-8℃保存，制备得B液；3)、取rhPDGF-BB药液为C液；4)、取B液，使之通过0.22μm滤膜，在不断搅拌A液的条件下加入到A液中，温度控制在2-8℃，继续搅拌至均匀，加入C液，保持上述温度条件，至均匀。
5)分装。
具体地，因为本发明提供的制剂是用于伤口创面，因此为了保证用药的安全性、低刺激性和良好的顺应性，本发明研制的rhPDGF-BB水凝胶制剂应具有无菌、等渗、PH值与皮肤接近等特点。在上述原则的指导下，我们对基质的种类、稳定剂、防腐剂等赋形剂以及制备工艺进行了筛选，以确定产品的处方和制备工艺。
本发明采用的水凝胶基质为纤维素类聚合物材料，我们首选的是聚丙烯酸类的卡伯姆(Carbopol)。卡伯姆是一种聚丙烯酸交联树脂，在很低的浓度下即可形成较高粘度的凝胶。卡伯姆在国外已经广泛用于化妆品和药品的研究生产中，并且被多国药典收载，在制剂中可作为凝胶基质、生物粘附材料等。常用的卡伯姆有Carbopol910NF、934NF、941NF、980NF、981NF、971NF、974NF，以上8个型号产品均取得中国大陆药品注册许可证，在市场均有出售。同时卡伯姆作为本实验用基质具有外观澄明、柔软、吸附性强和生物粘附性质，因此本发明选用卡伯姆作为水凝胶基质。
可用于制备水凝胶的卡伯姆的型号较多，主要有两类。其中Carbopol940的特点是分子链较短、粘度高，吸附能力适中，药物释放较慢。因此使用Carbopol940作为PDGF的基质时，该凝胶剂具具有药物释放缓慢、药效作用持久的特点。经过我们的摸索，发现当卡伯姆940的浓度为0.1％(W/W)-2％(W/W)，有较理想的活性结果，同时经过粘度测定，粘度值适中。其中，优选地，当卡伯姆940的浓度为0.4％时具有最好的稳定性和药效实验结果。
而Carbopol981类分子链较长、粘度较低，用它作为PDGF药物的基质时，该凝胶剂具有与皮肤吸附能力较强，药物释放较快的特点。经过我们的摸索，发现当卡伯姆981的浓度为0.1％(W/W)-2％(W/W)，有较理想的活性结果，同时经过粘度测定，粘度值适中。其中，优选地，当卡伯姆981的浓度为1％时具有最好的稳定性和药效实验结果。
本发明涉及的是rhPDGF-BB的水凝胶制剂，因此要求的实验条件是无菌。同时由于rhPDGF-BB是细胞活性因子，所以整个操作过程应该保持在低温状态。
因此，本发明涉及的rhPDGF-BB水凝胶制剂的制备方法中，第一步是取水凝胶基质卡伯姆适量，加适量注射用水，使之充分浸泡，溶涨完全。滴加适量的PH调节剂，使胶液的PH值在5.0-9.0之间，加入一定的量的等渗剂，搅拌至溶解，放于适宜的容器中，高压流通蒸汽灭菌30分钟(121℃，115Pa)，室温下充分冷却，制备得A液；我们所制备的PDGF水凝胶制剂为外用药物，因此要求在制剂配方中有等渗剂。在药剂中可以作为等渗剂的常用材料为0.9％的氯化钠、5％的葡萄糖及3％的甘露醇。
其中本发明中所涉及的PH调节剂为10％的NaOH溶液。
本发明涉及的第二步骤为取一定量的稳定剂，加水溶解，置于2-8℃保存，制备得B液；这是由于rhPDGF-BB本身为细胞活性因子，因此要求加入一定量的稳定剂进行活性保护。本发明是选择了氨基酸作为稳定剂。
本发明涉及的第三步骤为取rhPDGF-BB药液为C液，其中该rhPDGF-BB药液为通过基因工程技术，构建重组人的PDGF-BB菌株，通过扩大培养，发酵、纯化过程，从而得到蛋白质纯度大于97％、蛋白含量为1mg/ml的rhPDGF-BB药液样品。本发明中，rhPDGF-BB的浓度为在1μg/g-1000μg/g范围内。
本发明涉及的第四个步骤为取上述B液，使之通过0.22μm滤膜，在搅拌下加入到A液中，温度控制在2-8℃，继续搅拌至均匀，加入C液，保持上述温度条件，至均匀。即为制备好的rhPDGF-BB水凝胶制剂。
另外，由于rhPDGF-BB本身具有一定的疏水性，加入一定的离子有助于增加其在水中的溶解性能，同时可以更好地保持活性，经过实验我们发现在rhPDGF-BB的药液中加入浓度为20mM的醋酸钠，可以使药物更好地发挥活性。
同时创面外用药剂的特点决定了该制剂在一定时间内应该处于无菌状态，因此可以处方中加入一定的防腐剂，在药剂学中常用的防腐剂有水溶性的苯甲酸钠和尼泊金类，优选的为0.8％的尼泊金乙酯。另外加入金属离子络合剂可以起到稳定的作用，优选的为0.3％的EDTA-Na。
通过对本发明提供的重组血小板源生长因子的水凝胶制剂进行的动物药效学实验研究表明，本发明提供的水凝胶制剂对糖尿病大鼠皮肤创面具有明显的促修复作用，其剂量效应与国外同类制品的促创面愈合疗效相似。
通过对本发明提供的重组血小板源生长因子的水凝胶制剂进行动物(猕猴)药代动力学试验研究表明，猕猴皮肤缺损涂抹了rhPDGF-BB后，各猴血浆抗原浓度随时间的变化，循环血中rhPDGF-BB抗原浓度均在动物本底水平波动，与本底水平相比没有统计意义上的升高。各组相同时间点抗原浓度对比也无统计意义的差别。猕猴全层皮肤缺损局部用药后的生物利用度表明，全层皮肤溃疡创面局部敷用rhPDGF-BB水凝胶制剂后，各时间点血浆样品抗原浓度均在本底水平波动，各样品抗原浓度水平与本底水平相比均无统计意义差别。生物利用度计算值为-15.8％。本发明提供的水凝胶制剂局部应用后全身吸收可以忽略不计。
具体实施例方式
实施例1 rhPDGF-BB药液的制备本发明涉及的rhPDGF-BB药液，是通过用通用的基因工程技术，构建重组人的PDGF-BB菌株，通过扩大培养，发酵、纯化过程，从而得到蛋白质纯度大于97％、蛋白质含量为1mg/ml的rhPDGF-BB药液样品。
实施例2 rhPDGF-BB的水凝胶制剂的制备下述整个过程是在无菌条件下进行操作的。
1)、空白基质的制备取4.0克的Carbopol940，加水约900毫升，使之充分浸泡，溶涨完全。在机械搅拌的条件下，滴加10％NaOH溶液适量，使胶液的PH值在5.0-9.0之间，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，搅拌直到溶解，放置到适宜的容器中，高压流通蒸汽灭菌30分钟(121℃，115Pa)，室温下充分冷却，置冰箱中冷藏保存，备用。
2)、赖氨酸溶液的配置取5.0克的赖氨酸，加入适量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃)保存，备用。
3)、水凝胶的制备将第1)步的空白基质置于冰水浴中，用机械搅拌的方法搅拌空白基质，然后将配好的赖氨酸溶液通过0.22μm滤膜的滤器，加入到空白基质中，继续搅拌直到均匀；然后在不断搅拌的条件下，加入100毫克的rhPDGF-BB药液，加注射用水至1000毫升。
实施例3 rhPDGF-BB的水凝胶制剂的制备下述整个过程是在无菌条件下进行操作的。
1)、空白基质的制备取10克的Carbopol981，加水约900毫升，使之充分浸泡，溶涨完全。在机械搅拌的条件下，滴加10％NaOH溶液适量，使胶液的PH值在5.0-9.0之间，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，搅拌直到溶解，放置到适宜的容器中，高压流通蒸汽灭菌30分钟(121℃，115Pa)，室温下充分冷却，置冰箱中冷藏保存，备用。
2)、赖氨酸溶液的配置取5.0克的赖氨酸，加入适量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃)保存，备用。
3)、水凝胶的制备将第1)步的空白基质置于冰水浴中，用机械搅拌的方法搅拌空白基质，然后将配好的赖氨酸溶液通过0.22μm滤膜的滤器，加入到空白基质中，继续搅拌直到均匀；然后在不断搅拌的条件下，加入100毫克的rhPDGF-BB药液，加注射用水至1000毫升。
权利要求
1.一种重组血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的水凝胶制剂的制备方法，包括如下步骤1)、取水凝胶基质适量，加注射用水，充分浸泡，使之溶涨完全。然后滴加适量的PH调节剂，使胶液的PH值达到5.0-9.0之间；加入一定的量的等渗剂，搅拌至溶解，放于适宜的容器中，高压流通蒸汽灭菌30分钟(121℃，115Pa)，室温下充分冷却，制备得A液；2)、取一定量的稳定剂，加水溶解，置于2-8℃保存，制备得B液；3)、取rhPDGF-BB药液为C液；4)、取B液，使之通过0.22μm滤膜，在不断搅拌A液的条件下加入到A液中，温度控制在2-8℃，继续搅拌至均匀，加入C液，保持上述温度条件，至均匀。5)分装。
2.如权利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中rhPDGF-BB的浓度在1μg/g-1000μg/g范围内。
3.如权利要求1所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中所述的水凝胶基质为卡伯姆。
4.如权利要求3所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，优选的水凝胶基质为卡伯姆940。
5.如权利要求3所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，优选的水凝胶基质为卡伯姆981。
6.如权利要求1所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中水凝胶基质的浓度为0.1％(W/W)-2％(W/W)。
7.如权利要求1所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中稳定剂为氨基酸。
8.如权利要求7所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，优选的稳定剂为赖氨酸。
9.如权利要求1所述的制备rhPDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中等渗剂为0.9％的氯化钠或5％的葡萄糖或3％的苷露醇。
10.如权利要求1所述的制备rh PDGF-BB的水凝胶制剂的方法，其中还可以加入防腐剂，优选的为水溶性的苯甲酸(钠)及尼泊金类。
全文摘要
本发明涉及制备一种药物的水凝胶制剂的方法，具体地，本发明涉及制备重组血小板源生长因子(rhPDGF－BB)的水凝胶制剂的方法。
文档编号A61P3/00GK1506113SQ02153958
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月9日 优先权日2002年12月9日
发明者卓冰, 卓 冰 申请人:北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司, 北京金赛狮生物制药技术开发有限责任