血小板衍生生长因子c、其编码dna及其应用的制作方法

专利名称：血小板衍生生长因子c、其编码dna及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及结缔组织细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和神经胶原细胞的生长因子和/或内皮细胞的生长因子，尤其涉及新的血小板衍生生长因子/血管内皮生长因子样生长因子，编码这种因子的多核苷酸序列，以及利用或衍生自这种因子的药物和诊断组合物和方法。
背景技术：
在发育的胚胎中，初生血管网的形成是通过中胚层细胞原位分化实现的，这个过程称为血管发生。随后的所有涉及胚胎中新生血管的产生或者成体中新血管的生成的过程，都由已形成的脉管系统中的毛细血管的出芽或者分裂过程决定，这个过程称为血管生成(Pepper et al.，Enzyme & Protein，1996 49 138-162；Breier et al.，Dev.Dyn.1995 204 228-239；Risau，Nature，1997 386 671-674)。血管生成过程不仅与胚胎发育和正常组织的生长、修复和再生相关，而且涉及雌性生物的生殖周期、妊娠的形成和保持和外伤与骨折的恢复过程。血管生成不仅在正常个体中发生，还与大量的病理过程相关，尤其与肿瘤的生长和转移相关，还与其它一些与血管增殖，尤其是微血管系统增殖的病理过程相关，例如糖尿病引发的视网膜病、牛皮癣和关节炎。那么，抑制血管生成就有助于预防疾病的发生或者减轻疾病的症状。
另一方面，在一些需要进行血管化或者需要促进血管化的场合，例如在组织或者器官移植后，或者常见于冠心病、闭塞性血管炎中需要在创伤组织或者狭窄的动脉旁建立分支时，促进血管的生成过程又是希望进行的。
血管生成过程高度复杂，包括维持内皮细胞处于细胞周期，降解细胞外的基质，迁入并插入周围的组织，最后形成管道。血管生成过程复杂的分子机制还远远超出人们现在对它的认识。
由于血管生成在许多生理和病理过程中的重要作用，人们已经对与控制血管生成相关的因子进行了细致的研究。许多生长因子被证明可以调控血管生成过程。这些生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转移生长因子α(TGFα)和肝细胞生长因子(HGF)。见Folkman et al.，J.Biol.Chem.，1992267 10931-10934(review)。
有人认为，内皮细胞特异性的生长因子家族中的特殊的一类，即血管内皮生长因子(VEGFs)，VEGFs以及它们所对应的受体与刺激内皮细胞的生长和分化，从而分化成为具有特定功能细胞的过程直接相关。这些因子都属于PDGF家族，并且主要都是通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)实现功能。
PDGF家族中的九种不同的蛋白质已经被确定，分别命名为PDGF-A、PDGF-B、VEGF，剩余的六个蛋白质和VEGF十分相近，分别是VEGF-B，可见国际专利PCT/US96/02957(WO 96/26736)和美国专利5,840,693和5,607,918(Ludwig癌症研究院和Helsinki大学)；VEGF-C，可见Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298和Lee etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 1988-1992；VEGF-D，可见国际专利PCT/US97/14696(WO 98/07832)和Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553；胎盘生长因子(P1GF)，可见Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271；VEGF2，可见可见国际专利PCT/US94/05291(WO 95/24473)(HumanGenome Sciences，Inc.)和VEGF3，可见可见国际专利PCT/US95/07283(WO 96/39421)(Human Genome Sciences，Inc.)。VEGF家族中的成员与VEGF相比较，氨基酸序列都有30％-45％是相同的。VEGF家族的成员都含有一个VEGF的同源结构域，由六个半胱氨酸残基构成的半胱氨酸结。VEGF家族的功能包括改变内皮细胞有丝分裂的程度、引起血管渗透性、血管生成和淋巴管性质的变化。
血管内皮生长因子(VEGF)是同源二聚糖蛋白，可以从多种来源中分离。VEGF可以高度特异的使内皮细胞产生有丝分裂活动。在胚胎血管发生过程中形成新的血管或者在成体的血管生成过程中，VEGF都起着非常重要的调控作用(Carmeliet et al.，Nature，1996380 435-439；Ferrara et al.，Nature 1996 380 439-442；Freeara，Davis-Smyth，Endocrine Rev.，1997 18 4-25)。如果使一个VEGF的等位基因失活，胚胎就会因为脉管系统无法发育而致死，可见VEGF所执行功能的重要性(Carmeliet et al.，Nature，1996 380 435-439；Ferrara etal.，Nature 1996 380 439-442)。此外，VEGF对单核细胞还具有很强的化学诱导作用，可以诱导内皮细胞中产生血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，还可以促使微血管产生通透性。由于可以促使微血管产生通透性，所以常常也被称为血管渗透因子(VPF)。VEGF的分离方法和性质可以参见Ferrara et al.，J.Cellular Biochem.，1991 47 211.218和Connolly et al.，J.CellularBiochem..1991 47 219-223。VEGF基因在mRNA水平上的截短产生了五种VEGF的异构体。
VEGF-B和VEGF相比，具有相似的血管生成和其它性质，但是表达VEGF-B的组织和表达VEGF的不同。VEGF-B在心脏中大量表达，而在肺中很少，而VEGF恰恰相反。这表明，虽然VEGF-B和VEGF在许多组织中都同时被表达，但是可能行使的功能有差异。
VEGF-B是通过酵母共杂交相互作用捕获筛选技术进行分离的。筛选可以和I型细胞树脂状酸性结合蛋白(CRABP-I)发生相互作用的细胞蛋白。具体的分离过程及其性质可见专利PCT/US96/02957和Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 932576-2581。
VEGF-C是从培养PC-3前列腺癌细胞系(CRL1435)的培养基中，根据是否可以对内皮细胞上特异的受体酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)进行酪氨酸磷酸化这一现象进行筛选得到的。其中，VEGFR-3由转染的细胞系表达。再利用连有重组VEGFR-3的亲和层析柱对VEGF-C进行纯化，再将其从PC-3 cDNA文库中克隆出来。具体的分离过程和它的有关性质可见Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298。
VEGF-D可以从人类乳腺cDNA文库中分离得到，这个文库可以从Clontech直接购买。以人cDNA文库中的“Soares Breast3NbHBst”(Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553)这一EST作为杂交探针进行筛选。具体的分离过程和它的有关性质可见国际专利PCT/US97/14696(WO98/07832)。
VEGF-D基因在成人体内广泛表达，但当然也不是到处都表达。VEGF-D在心脏、肺和骨骼肌中大量表达。VEGF-D的中间体在脾、卵巢、小肠和结肠也有表达，在肾脏、胰腺、胸腺、前列腺和睾丸中的表达程度降低。而在脑、胎盘、肝或者外周白细胞中检测不到VEGF-D的mRNA。
PlGF可以从足月的胎盘cDNA文库中分离得到。具体的分离过程和它的有关性质可见Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271。其具体的生物学功能目前尚不清楚。
VEGF 2可以从不依赖雌激素的人类乳腺癌细胞系中分离得到。VEGF 2和PDGF具有22％的同源性，与VEGF具有30％的同源性。现在还没有方法可以分离编码VEGF2的基因，也没有VEGF 2生物学活性的有关数据。
VEGF 3可以从来源于结肠组织的cDNA文库中分离得到。VEGF3与VEGF相比，有36％的部分是相同的，66％的部分是相似的。现在还没有方法可以分离编码VEGF3的基因，也没有VEGF 3生物学活性的有关数据。
两个蛋白的相似程度是通过比较氨基酸序列和两个蛋白质之间保守氨基酸的变化决定的，而比较两个蛋白质的相同程度只是比较氨基酸序列，而不比较两个蛋白质之间保守氨基酸的变化。
PDGF/VEGF家族成员可以和酪氨酸激酶受体结合。现在已经发现有五种内皮细胞特有的酪氨酸激酶受体，分别命名为VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)、Tie和Tek/Tie-2。它们全都具有信号传导必须的酪氨酸激酶活性。在血管发生和血管生成中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie和Tek/Tie-2起着非常关键和特异的作用，这已经通过在小鼠胚胎中通过定点突变使这些受体失活的试验得以证明。
现在所知的能和VEGFs结合的酪氨酸激酶受体为VEGFR-1VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2可以高特异的和VEGF结合，同时VEGFR-1还可以和VEGF-B和PlGF结合。VEGF-C是VEGFR-3的配体，同时也可以激活VEGFR-2(Joukov et al.，TheEMBO Journal，1996 15 290-298)。VEGF-D和VEGFR-2和VEGFR-3都可以结合。关于Tek/Tie-2的配体可以参见国际专利No.PCT/US95/12935(WO 96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)。Tie的配体至今仍然没有发现。
最近，一种新的VEGF异型体的特异受体已经被纯化并克隆，大小为130-135Kda(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。这个VEGF受体可以通过外元7编码的序列非常特异的和VEGF165结合，但是它和肝素只有较弱的结合能力(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。令人惊讶的是，这个受体与人类NP-1是相同的，NP-1是涉及神经早期发生的一个受体。PlGF-2也可以和NP-1发生作用(Migdal et al.，J Biol.Chem.，1998 273 22272-22278)。
VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3都由内皮细胞表达。VEGFR-1和VEGFR-2由血管内皮表达(Oelrichs et al.，Oncogene，1992 8 11-18；Kaipainen et al.，J.Exp.Med.，1993 178 2077-2088；Dumont et al.，Dev.Dyn.，1995 203 80-92；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。VEGFR-3由成体组织的淋巴内皮表达(Kaipanen et al.，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，1995 9 3566-3570)。VEGFR-3同时也可以由围绕肿瘤的血管表达。
去除VEGFR基因会导致血管系统发育异常，使得在妊娠中期胚胎死亡。通过对带有完全失活VEGFR-1基因的胚胎的分析显示这个受体在内皮功能性组织过程中是必须的(Fong et al.，Nature 1995376 66-70)。但是，仅仅缺失了编码VEGFR-1的胞内酪氨酸激酶区域部分的基因却产生可以存活的具有正常血管系统的小鼠(Hiratsukaet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998 95 9349-9354)。上述差异的原因仍然有待解释，但是可以由此推测通过酪氨酸激酶进行的受体信号传导对于VEGFR-1的正常功能的实现并不是必须的。通过对具有失活的VEGFR-2基因的纯合体小鼠的研究表明，这个受体对于细胞增殖、血细胞生成和血管系统的生成是必须的(Shalaby et al.，Nature，1995 376 62-66；Shalaby et al.，Cell，1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活会造成心血管系统的错误，因为这会使得大血管异常重组(Dumont et al.，Science，1998 282 946-949)。
虽然VEGFR-1主要在发育过程中在内皮细胞中表达，但是在胚胎发生早期在生血前体细胞中也产生(Fong et al.，Nature 1995 37666-70)。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达这种受体(Barleon etal.，Blood，1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1被绝大多数，但不是全部血管表达(Breier et al.，Dev.Dyn.，1995 204 228-239；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。
受体VEGFR-3在胚胎发育早期在内皮细胞中广泛表达，但是随着胚胎发生的进程，它在静脉内皮和淋巴内皮中的表达量是有限的(Kaipainen et al.，Cancer Res.，1994 54 6571-6577；Kaipainen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92 3566-3570)。VEGFR-3在成体组织的淋巴内皮细胞中被表达。这个受体在胚胎发生过程中对于血管发育是非常关键的。把小鼠的VEGFR-3基因进行定向的失活，由于带有缺陷腔体的大血管发生异常自组，会导致有缺陷的血管的形成，从而使得液体在心包腔中滞留，在性交后9.5天心血管系统发生功能障碍。根据这些发现，可以推测VEGFR-3在从初级血管网向更大的血管发育过程中是必须的。但是，VEGFR-3在淋巴管发育中的功能现在无法研究，因为上述的小鼠胚胎在淋巴系统形成之前已经死亡。科学家们推测VEGFR-3在淋巴发生和成体中的淋巴内皮细胞中有一定的表达，从而对淋巴管发育和淋巴发生起作作用。这是根据在转基因小鼠的皮肤中发现VEGF-C的异位表达现象而作出的推测，得到的是一种VEGFR-3的配基，它的产生是由于真皮中淋巴内皮细胞的增殖和血管的增大。这个发现还进一步的显示，VEGF-C也许最基本的功能是它在淋巴内皮中的作用，另外辅助功能是与VEGF共同行使在血管生成中的作用，并且对血管渗透压进行调控(Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298)。
由于具有抗肿瘤组织血管发生的机制，一些VEGF和VEGF受体系统的抑制剂可以抑制肿瘤的生长。可见Kim et al.，Nature，1993362 841-844；Saleh et al.，Cancer Res.，1996 56 393-401。
由上述提及的内容，生长因子的VEGF家族都是PDGF家族的成员。PDGF在结缔组织细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞的生长和运动方面均具有重要的作用(Heldin et al.，“Structure of platelet-derived growth factorImplications for functionalproperties”，Growth Factor，1993 8 245-252)。在成体中，PDGF可以促进创伤组织的愈合(Robson et al.，Lancet，1992 339 23-25)。结构上，PDGF是由二硫键连接的同源多肽链A或者B组成的同源二聚体(PDGF-AA或者PDGF-BB)或者异源二聚体(PDGF-AB)。
PDGF及其异构体是通过与靶细胞上两个结构相联系的受体酪氨酸激酶(RTKs)结合而实现其功能的。受体α和PDGF的A链、B链都能结合，而受体β只能和B链结合。这两种受体可以被许多体外培养的细胞系表达，但主要由体内的间质细胞表达。PDGFs可以在体外调控细胞增殖、细胞存活和对细胞的趋化性(可见综述Heldin et al.，Biochim Biophys Acta.，1998 1378 F79-113)。在体内，由于PDGFs在上皮细胞(PDGF-A)或者内皮细胞(PDGF-B)中表达，接近PDGFR表达的间质，所以PDGF可以以较快的方式发挥功效。在肿瘤细胞或者体外培养的细胞系中，PDGFs和PDGF受体的共表达会产生信号的自动传递环，这对细胞转型非常重要(Betsholtz et al.，Cell，1984 39 447-57；Keating et al.，J.R.Coll SurgEdinb.，1990 35 172-4)。PDGFs的过度表达在一些病理情况下被发现，包括恶性肿瘤、动脉硬化和纤维增殖病(Heldinet al.，TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair，New YorkPlenumPress，1996，249-273)。
作为细胞增殖和细胞存活调控子的PDGFs的重要性在最近进行的小鼠相关基因的定向研究中被认识到，试验显示了除了不同的PDGFRs的配基之间会发生一些重叠之外，PDGFs和它们的受体在生理过程中所发挥的特有作用。具有两个无效突变的PDGF配基或者其受体的纯合体是无法存活的。大约50％的PDGF-A缺陷的纯合体小鼠具有早期致死表现型，而剩余的存活的小鼠具有复杂的产后表现型，具体状况为由于缺少肺泡肌成纤维细胞而导致肺泡隔膜的异常形成，从而患有肺气肿(Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873)。另外，PDGF-A缺陷的小鼠还会具有表皮缺陷的表现型，特征为真皮组织较薄、畸形的毛囊和稀疏的毛发(Karlsson et al.，Development，1999 126 2611-2)。在少突神经胶质细胞的发育和中枢神经系统的髓鞘形成的过程中也需要PDGF-A(Fruttiger et al.，Development，1999126 457-67)。PDGFR-α缺陷的表现型更容易发生早期胚胎死亡、头部非完全闭合、神经冠发育异常、心血管系统缺陷和骨骼缺陷(Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)。PDGF-B和PDGFR-β缺陷的小鼠也具有与上述相似的表现型，特征常常为肾、血液和心血管系统的异常(Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Genes Dev.，1994 8 1888-96；Lindahi et al.，Science，1997277 242-5；Lindahi，Development，1998 125 3313-2)。其中肾和心血管系统的异常至少部分上与缺乏壁细胞(心血管平滑肌细胞、外膜细胞或者肾小球膜细胞)的正确重组到血管相关(Leveen et al.，GenesDev.，1994 8 1875-1887；Lindahl et al.，Science，1997 277 242-5；Lindahlet al.，Development，1998 125 3313-2)。
本发明概述本发明揭示了一种具有刺激和/或增强可以表达PDGF-C受体的细胞增殖或分化和/或生长和/或运动性功能的新的生长因子，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、结缔组织细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞。另外，由多核苷酸序列表达出的新的生长因子和用于治疗和诊断的药物组合物配方都属于本发明的范畴。
第一，本发明揭示了一种分离的并且经过纯化的多核苷酸分子，这种多核苷酸分子包括的核苷酸序列至少与

图1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、图3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位至少85％相同，有90％相同更好，最好是95％相同。图1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、图3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位编码一个初生多肽，命名为为PDGF-C(原先命名为“VEGF-F”)，它在结构上与PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D是同源的。在提出的具体实例中，核酸分子是含有图1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、图3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位的cDNA分子。同时，本发明还包括这样的核酸分子，它可以和图1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、图3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位或者它们的片段在严格条件下杂交。
第二，本发明的多肽分子具有刺激和/或增强可以表达PDGF-C受体的细胞增殖或分化和/或生长和/或运动性的功能，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、结缔组织细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞。它的氨基酸序列如图2(SEQ ID NO3)、图4(SEQIDNO5)、图6(SEQ ID NO7)或者它们的片段和具有刺激和/或增强可以表达PDGF-C受体的细胞增殖或分化和/或生长和/或运动性的功能的类似物，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、结缔组织细胞(如成纤维细胞)、肌成纤维细胞和神经胶质细胞。多肽的氨基酸序列应该和图2(SEQ ID NO3)、图4(SEQ ID NO5)、图6(SEQ ID NO7)、它们的片段或者具有PDGF-C生物学活性的类似物的氨基酸序列有85％的部分是相同的，更好是90％相同，最好是95％的部分相同。在本发明的具体实例中，多肽分子是包含有PDGF-C中的PDGF/VEGF同源域(PVHD)部分的PDGF-C截短体。这个域是从氨基酸残基230位至345位。但是，这个区域可以向N端延伸直达残基164位。在这里，PVHD被定义为PDGF-C的截短体。PDGF-C的截短体是PDGF-C的一种活性形式。
在本发明中，序列相同程度的比较是通过Lasergene软件包(DNASTAR，Ltd.Abacus House，Manor Road，West Ealing，LondonW130AS United Kingdom)中的比较工具“MEGALIGN”进行的。比较过程经过人为精化。相同程度的比例根据比较中的序列计算。
这些多肽或者由多核苷酸表达的多肽应该具有刺激和/或增强可以表达PDGF-C受体的细胞增殖、分化、运动性、存活或心血管的渗透性的功能，这些细胞包括，但不仅仅限于，心血管内皮细胞、淋巴内皮细胞、结缔组织细胞(例如成纤维细胞)、肌成纤维细胞和神经胶质细胞。另外，还应该可以促进创伤愈合。PDGF-C还具有血管生成效应，这是PDGF-C的活性之一。这些性质在下文中统称为“PDGF-C的生物学活性”，可以通过本领域中常见的方法进行鉴定。
在这里，“PDGF-C”指图2(SEQ ID NO3)、图4(SEQ ID NO5)、图6(SEQ ID NO7)的多肽分子和它们的片段或者具有上述PDGF-C生物学活性的类似物。也可以指编码PDGF-C或者其片段或者具有PDGF-C生物学活性的类似物的多核苷酸。这种多核苷酸可以是天然的，也可以是存在于一个载体中或者脂质体中。
另一方面，本发明揭示了一种具有以下氨基酸序列的多肽PXCLLVXRCGGXCXCC(SEQ ID NO1)。这些序列仅仅在PDGF-C中存在，从而可以和生长因子PDGF/VEGF家族中的其它成员相区别，区别在于在第三和第四个半胱氨酸(见图9，SEQ ID NO8-17)之间插入了三个氨基酸残基(NCA)。
将多肽进行保守的替换、插入或者缺失突变，但是仍然保持PDGF-C的生物学活性，这样的突变的多肽分子显然也属于本发明的范畴。本领域内的工作者应该了解可以得到上述多肽的方法，例如使用定点突变技术、特异的酶切处理和连接。另外，将这种多肽组成的复合物中的氨基酸残基用非天然的氨基酸或者氨基酸类似物进行替代，也有可能得到仍然具有PDGF-C活性的蛋白质复合物。可以用本领域内常见的方法制备和鉴定这些复合物。显然，这些多肽复合物也属于本发明的范畴。
另外，由于选择性截短(VEGF和VEGF-B就是由于选择性截短产生)和编码PDGF-C的核酸序列自然产生的等位变体现象而产生的PDGF-C多肽分子的可能的变体也属于本发明的范畴。等位变体是本领域内的标准术语，是指一段核酸序列在一个或者几个核苷酸的位置上发生了替代、缺失或者插入的突变，但是这些变化并不影响其表达的多肽的功能。
这样的PDGF-C变体可以通过对PDGF-C多肽的非必须区域进行修饰而得到。这些非必须区应该在如图9(SEQ ID NO8—17)所指出的高度保守的区域之外。特别是，生长因子PDGF家族，包括VEGF，为二聚体，并且VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A和PDGF-B在N端都具有完全保守的8个半胱氨酸区域，例如类似于PDGF/VEGF的区域(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 2576-2581；Joukov et al.，EMBO J.，1996 15290-298)。这些半胱氨酸可能与分子间和分子内的二硫键的形成相关。此外，在C端区域具有高度保守，但不是完全保守的半胱氨酸残基。分子内二硫键形成了每个亚基内的环1、2和3，这些位点和生长因子PDGF/VEGF家族的受体结合相关(Andersson et al.，GrowthFactors.1995 12 159-164)。
本领域内的专业人员应该了解在那些具有活性的变体中这些半胱氨酸残基应该是保守的，环1、2和3中的活性位点的氨基酸也应该是保守的。而分子中的其它区域，在生物学功能上就不显得那么重要，可以进行一定的修饰。这些经过修饰的多肽也应该可以通过常规的活性检测方法对PDGF-C活性进行鉴定，例如使用实例6中的成纤维细胞增殖分析方法。
一些经过修饰的PDGF-C多肽具有和细胞上的PDGF-C受体结合的能力，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、结缔组织细胞、肌成纤维细胞和/或神经胶质细胞，但是却不能刺激细胞增殖、分化、迁移、运动性增强和存活，或者诱导血管增殖、结缔组织发育、创伤愈合。这些修饰的多肽可以作为PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生长因子的竞争性或者非竞争性抑制剂，可以用于需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生长因子作用的场合。这些具有结合能力，但是不能诱导有丝分裂、不诱导分化、不诱导迁移、不增强移动性、不提高存活率、不促进血管增殖和创伤愈合的PDGF-C多肽变体也属于本发明的范畴。在这里称为“可与受体结合但不具有其它活性的变体”。为了激活其唯一的受体，PDGF-C形成一个二聚体。但是如果二聚体由上述的可与受体结合但不具有其它活性的变体单体和另一个野生型的PDGF-C或者野生型的PDGF/VEGF家族的生长因子单体组成，这样的二聚体应该可以与受体结合，但是无法引发下游的信号传递。
同时，还存在其它的修饰的PDGF-C多肽可以防止野生型的PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生长因子和细胞上相应的受体结合的能力，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、结缔组织细胞(如成纤维细胞)、肌成纤维细胞和/或神经胶质细胞。这样，这种二聚体将无法刺激内皮细胞的增殖、分化、迁移和存活率增加，也无法刺激结缔组织细胞、肌成纤维细胞和/或神经胶质细胞的增殖、分化和运动性的增强。这些修饰的多肽可以作为PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生长因子的竞争性或者非竞争性抑制剂，可以用于需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生长因子作用的场合。这些场合包括当初级或者迁移型的肿瘤细胞侵入正常细胞群落时发生的组织改型过程。这些和PDGF-C受体和生长因子PDGF/VEGF家族受体具有结合能力，但是不能诱导有丝分裂、不诱导分化、不诱导迁移、不增强移动性、不提高存活率、不促进血管增殖和创伤愈合的PDGF-C生长因子变体也属于本发明的范畴。在这里称为“可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体”。
一个可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体的例子是一种突变了的PDGF-C，这种突变可以防止蛋白酶对CUB结构域的切割。可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体可以由具有活性的单体，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF，连接以突变了的可以耐受蛋白酶切的CUB结构域而形成。由上述可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体和连接有突变了的CUB结构域的单体构成的二聚体应该不能和它们相应的受体结合。
上述二聚体的一种变体是在由具有活性的单体，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF和突变了的CUB结构域之间，再插入一个蛋白酶切位点。插入的这个蛋白酶切位点可以切开CUB结构域和活性单体的连接，释放出可以和相应受体结合的活性体。通过这种方式，可以制备出可控制活性单体释放的二聚体。
第三，本发明揭示了一种编码上述多肽或者多肽片段的核酸分子。核酸分子可以是DNA、基因组DNA、cDNA或者RNA，可以是单链，也可以是双链的。核酸的来源可以从细胞或组织中抽提得到，也可以重组得到，或者直接合成的。由于遗传密码的简并性，所以可以表达具有图2(SEQ ID NO3)、图4(SEO ID NO5)、图6(SEQ ID NO7)所示的多肽分子、它们的片段、具有相应的生物学活性的类似物、可与受体结合但不具有其它活性的变体或者可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体的氨基酸序列的核酸分子种类应该有许多种。
第四，本发明揭示了带有cDNA分子或者如第三方面所述的核酸分子的载体，以及可以被载体或者核酸分子转化或者转染的宿主细胞。它们可以来源于真核，也可以来源于原核。宿主细胞应该适于表达本发明所述的多肽分子，包括昆虫细胞如Sf9细胞，可从美国标准菌种保藏组织(ATCC SRL-171)得到，可以用杆状病毒载体转染；或者人胚胎肾细胞系293-EBNA，可以被合适的表达质粒转化。本发明首选的载体是由上述的核酸序列连接一个或者几个合适的启动子或者其它调控序列而成的表达载体，再将这可以表达本发明所述的多肽分子的载体转化或者转染宿主细胞。其它推荐的载体还有那些适于转染不如动物细胞，或者可用于基因治疗的载体，例如腺病毒、牛痘病毒、反转录病毒载体或者脂质体。
本发明同时揭示了一种制备可以由其带有核酸分子表达出多肽的载体的方法，包括的步骤为在载体中，将核酸分子与一个或者几个合适的启动子或者调控序列相连。
本发明同时揭示了一种制备本发明所述的多肽分子的方法，包括的步骤为在宿主细胞中将核酸分子或者载体进行表达，再从宿主细胞或者培养细胞的培养基中分离出所表达的多肽分子。
第五，本发明得到了一种可以和本发明所述的多肽分子或者其片段进行特异反应的抗体分子。这种抗体可以识别PDGF-C的变体、具有免疫活性的片段、类似物和重组体。这样的抗体可以作为PDGF-C的抑制剂或者激动剂，可以对PDGF-C进行检测和定量。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。可以使用这样的单克隆或者多克隆抗体收集本发明所述的多肽分子及其它们的变体、片段和类似物。可以在多肽序列上连接一个表位标记，例如FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)，以便于进行亲和层析富集。在某些场合，例如在临床上需要使用单克隆抗体抑制PDGF-C活性时，应该使用人源的单克隆抗体。这些抗体中可以进一步加入细胞毒性或者细胞抑制试剂。制备上述物质，包括重组DNA的方法都是本领域内常见的技术。
同时，可以特异的识别PDGF-C，并且自身带有标记的抗体也属于本发明的范畴。
为了便于检测，本发明所述的多肽分子或者抗体可以带有可检测的标记物。这样，带标记的多肽分子就可以原位检测其相应的受体。多肽分子抗体可以共价的，也可以非共价的与超磁物质、顺磁物质、电子密度物质或者放射性物质连接，以便于检测。如果用于诊断分析，可以使用放射性的或者非放射性的标记。放射性标记包括放射性同位素，例如125I或者32P。非放射性标记包括酶标试剂，如辣根过氧化物酶和荧光试剂，如FITC。标记可以是直接标记，也可以是间接标记，可以是共价标记，也可以是非共价标记。
本发明在临床上的应用包括加速移植的组织或者器官的血管发生过程、刺激创伤组织的愈合、刺激结缔组织的发育、建立损伤组织和动脉堵塞(例如冠心病)的旁路连接、抑制肿瘤组织或者糖尿病视网膜症中的血管生成过程和抑制初级或者迁移性肿瘤细胞侵入正常细胞群落过程中发生的组织转型。另外，在肿瘤活检中，对PDGF-C的量进行检测，对于判断肿瘤转移危险性非常有帮助。
此外，PDGF-C和许多肺的生理现象相关。PDGF-C的检测可以用于许多肺病的诊断中。PDGF-C同时可以用于许多肺病的治疗当中，以增强肺部血管流通，提高肺部空气和血的交换。相似的，对于心脏病缺陷患者，PDGF-C还可以用于增强心脏的血管流通和氧气的渗透性。同样，对于慢性气管堵塞症患者，PDGF-C还可以增强血液和气体交换。
本发明揭示了一种可以刺激哺乳动物血管生成、淋巴管生成、神经网络生成、结缔组织发育和创伤愈合的方法，包括的步骤为对哺乳动物施加有效剂量的PDGF-C、其片段或者具有PDGF-C生物学活性的类似物。可以将PDGF-C、其片段或者类似物与以下一种或者几种VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A、PDGF-B、FGF和/或肝素同时施加给试验动物。
PDGF-C激动剂(例如抗体或者可以竞争性或非竞争性的结合PDGF-C形成二聚体并且和受体结合的抑制剂)可以用以处理例如心脏充血障碍的情况，通过在别的器官，例如肺中增加血管的渗透性，以造成液体的积累，从而抵消心脏中的血管渗透性的问题。PDGF-C同时还可以处理可在肺、肾和肝中发现的纤维变性的状况。在肠道中施加PDGF-C，可以治疗消化不良症，但同时肝、肾的血液流通和血管渗透性都增强了。
本发明还揭示了一种可以抑制哺乳动物血管生成、淋巴管生成、神经网络生成、结缔组织发育和创伤愈合的方法，包括的步骤为对哺乳动物施加有效剂量的PDGF-C激动剂。激动剂可以是任何能够抑制PDGF-C活性的物质，机制可以是抑制PDGF-C与细胞上相应的受体结合，也可以是抑制受体的激活，例如通过使用“可与受体结合但不具有其它活性的变体”。激动剂包括，但不仅仅限于，抗PDGF-C的抗体，可以竞争性的或者非竞争性的抑制PDGF-C及其受体结合的抑制剂，例如上述的“可以形成PDGF-C生长因子二聚体但不具有其它活性的变体或中间体”，可以结合PDGF-C并且修饰PDGF-C以使其失去活性的复合物，还有上述多核苷酸序列的反义核酸分子。
本发明还提供了一种确定与PDGF-C的活性片段结合的试剂的方法，步骤为将PDGF-C的活性片段和检测试剂混合，使用适当的方法监测结合的程度。试剂可以包含复合物和其它蛋白质。
本发明还提出了一个寻找可以和PDGF-C的活性片段结合的筛选系统。先制备PDGF-C的活性片段，将其与待检测的试剂混合，再使用适当的方法定量测定待检测的试剂与PDGF-C的活性片段的结合程度。这个筛选系统也可以用于确定可以抑制对全长PDGF-C的蛋白酶切的物质，这样可以防止释放出具有活性的PDGF-C的活性片段。当然，必须先准备好全长的PDGF-C。
使用这套筛选系统可以寻找那些可能改变PDGF-C生物学活性的化合物。这种筛选方法可以改造成类似于PANDEX(Baxter-DadeDiagnostics)系统的大规模、自动化装置，以适应对可能的药物进行有效的高通量的筛选。
在这个筛选系统中，PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C要事先制备，最好采用重组DNA技术。检测试剂，例如复合物和蛋白质，被引入包含有PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C的反应容器。检测试剂和PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C的结合可以使用适当的方法确定，这些方法包括，但不仅仅限于，将检测试剂使用放射性同位素或者化学标记进行标记。其它检测试剂与PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C的结合程度的方法还可参见美国专利公开5,585,277，它是通过监测折叠了的和未折叠的蛋白质的比例确定检测试剂和PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C的结合程度。这样的检测蛋白质折叠的例子包括，但不仅仅限于，监测PDGF-C的活性片段或者全长的PDGF-C对特异的蛋白酶的耐受程度，或者检测蛋白质和可以特异结合蛋白质折叠态的抗体的结合程度。
本领域内的工作者都应该了解IC50值的大小和所选择的检测试剂相关。例如，IC50值小于10nM的检测试剂非常适用于药物治疗情况。但是，其实特异性更高而结合强度更低的试剂更使用于这一情况。本领域内的工作者应该认识到关于试剂的结合能力、抑制活性和特异选择性的信息对于研究相应的药物非常有用。
当在治疗中使用PDGF-C或者PDGF-C激动剂时，使用的剂量和方式将由被施加的个体和具体的待处理的情况决定，由医师和兽医根据判断自行决定。给药的方式包括口服、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、植入、局部使用和不经过消化系统的使用方式等等。局部使用PDGF-C的方法和使用VEGF的方法相似。例如在促进创伤愈合时，或者其它需要增强血管生成效应的场合，可以将PDGF-C直接施加到需要的组织或者器官上，有效的剂量按照给药量/体重的比值在0.1至1000μg/Kg之间。
PDGF-C或者PDGF-C激动剂可以结合适当的药物载体使用。最后的组成为，具有药效的适当量的PDGF-C或者PDGF-C激动剂，生物相容的无毒的盐类以及生物相容的固体或者液体的载体或者佐剂。这样的载体或者佐剂的例子包括，但不仅仅限于，碱盐、缓冲碱盐、Ringer溶液、矿物油、滑石、淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸二钙、氯化钠、葡萄糖、水、甘油、乙醇、增稠剂、稳定剂、悬浮剂或者上述物质的组合。它们可以制成溶液、悬浊液、片剂、胶囊、软膏、西也剂、糖浆、糯米纸囊剂、油膏或者其它的形式。药物的形式应该根据给药的方式决定。在这里，含有PDGF-C的成分也可以换成一种或者几种下列的物质PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF和/或肝素。药物中含有的活性物质PDGF-C的重量比在0.1％至90％之间，一般在10％至30％之间。
对于肌内制剂，应该是无菌的形式，PDGF-C的活性片段以可溶性盐例如盐酸盐的形式存在，溶解在药物稀释剂中，例如不含致热源的蒸馏水、生理盐水或者5％的葡萄糖溶液。对于不溶的化合物可以制备成悬浊的水溶液，或者使其悬浮在生物相容性的油碱中，例如含有长链脂肪酸的酯中，例如乙基油酸酯。
本发明的发明思想还可以用作制造诊断/疾病预测设备，例如以检测试剂盒的形式。在本发明的一个具体的试剂盒的实例中，试剂盒包括抗PDGF-C的抗体，以及一种检测，更确切的说，测量估计PDGF-C及其抗体之间结合状况的方法。在另一个具体实例中，上述的抗PDGF-C抗体称为一抗，其上除了能与PDGF-C结合的位点外，还具有某种动物的抗原，另外试剂盒还提构了一种二抗抗体分子，抗一抗上具有的动物抗原。二抗上具有可检测的标记物，PDGF-C或者未标记的一抗结合在基底的表面，这样PDGF-C和一抗的相互作用程度可以根据基底上相应的标记物的数量决定，这种标记物是通过使二抗和结合了PDGF-C的一抗结合而引入的。在一个具体实例中，本发明所述的诊断/疾病预测设备就是以酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒的形式给出的。
在本发明的另一个具体实例中，这种诊断/疾病预测设备也可以包含聚合酶链式反应的方法，以扩增出待检测的个体，并将其序列结构与本发明公布的序列结构进行比较，以检测有无异常，判定PDGF-C表达的异常是否与某些疾病的特定阶段相关。
另外，本发明的具体实例中，还可以使用限制性长度多态性(RFLP)分析方法，使用限制性内切酶切割待测样品的基因组DNA，电泳，产生特异性的DNA条带。再将这些条带与本分明中公布的序列条带进行比较，以检测有无异常，判定PDGF-C表达的异常是否与某些疾病的特定阶段相关。
本发明包括一种可以检测可能与疾病阶段相关的待检测样品的PDGF-C基因是否发生异常的方法。这种方法的步骤为从样品中得到DNA或者RNA样品，加入特异的引物，通过PCR的方法，选择性的扩增出PDGF-C相关的基因，将从样品中扩增出的核酸序列和图1(SEQ ID NO2)或者图3(SEQ ID NO5)中的序列进行比较。那些包含有能够特异的结合样品的PDGF-C基因的引物，和可以将PDGF-C基因从DNA样品中扩增出来的聚合酶的试剂盒也属于本发明的范畴。
本发明给出了一种在生物样品中检测PDGF-C的方法。具体步骤为将能够和PDGF-C结合的试剂与样品混合反应，再检测结合程度。其中可以结合PDGF-C的部分最好是抗PDGF-C的抗体，最好是单克隆抗PDGF-C抗体。在一个具体实例中，结合程度是通过可检测的标记物实现检测的，适用的标记物上文已经讨论。
本发明涉及到有PDGF-C构成的蛋白二聚体，特别是由二硫键连接的蛋白二聚体。二聚体可以是由两条PDGF-C多肽组成的同源二聚体，也可以是由一条PDGF-C多肽和一条VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A或者PDGF-B组成的异源二聚体。
本发明还给出了分离PDGF-C的方法，包括的步骤为将表达PDGF-C的细胞用肝素处理，以使得细胞释放PDGF-C，再将释放出的PDGF-C进行纯化。
本发明还给出了一种包含反义核酸序列的载体。其中的反义核酸序列至少与编码PDGF-C、PDGF-C片段或者具有PDGF-C生物学活性的类似物的DNA序列部分互补。或者，反义核酸序列也可以和PDGF-C基因的启动子区域作用，或者和基因的其它非编码区相互作用，从而达到抑制，至少是降低PDGF-C的表达程度。
根据上文所述，这样包含反义核酸序列的载体可以用以抑制，至少是降低PDGF-C的表达程度。在那些PDGF-C表达与疾病相关的场合中，使用这种可以抑制PDGF-C表达的载体是相当有效的，这些场合例如，肿瘤产生PDGF-C以促进血管生成，或者组织重建，该过程发生在初级的或迁移的肿瘤细胞侵入正常细胞群体时。用携带有反义核酸序列的载体转化该肿瘤细胞将抑制或阻碍肿瘤的生长或组织重建。
发明的另一方面与发现全长PDGF-C蛋白可能是潜在的生长因子有关。该生长因子需要通过蛋白水解释放具有活性的PDGF/VEGF同源结构域而被激活。已知的蛋白水解位点位于全长蛋白的残基231—234，即残基-RKSR-。这是二元基序。该位点在鼠PDGF-C中结构保守。在PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D中也发现已知的-RKSR-蛋白水解位点。在这四种蛋白中，在PDGF/VEGF同源结构域的最小结构域的前方序列中也发现了已知的蛋白水解位点。所有这些事实都表明-RKSR-是蛋白水解的位点。
优选的蛋白酶包括，但不仅仅限于，纤维蛋白溶酶、因子X和肠激酶。N-端CUB结构域可能作为抑制结构域起作用，该结构域可能用于保持PDGF-C以潜在的形式存在一些细胞外室中，当需要PDGF-C时该结构域可以通过特定的蛋白水解除去。
该发明提供了一种产生活化的截短形式的PDGF-C或调节PDGF-C的受体结合的特异性的方法。这些方法包括表达含有可编码具有PDGF-C生物学活性的多肽的多核苷酸的表达载体，和支持至少一种酶的水解以用于处理表达的多肽产生有活性的PDGF-C的截短体。
本发明同时也提供了一种选择性激活具有生长因子活性的多肽的方法。该方法包括表达可编码具有生长因子活性和CUB结构域的多肽的多核苷酸的表达载体，在该多肽中，CUB结构域和具有活性的多肽片段之间含有一个蛋白水解位点，该方法支持至少一种酶的水解以用于处理表达的多肽产生激活的具有生长因子活性的多肽。
另外，本分明还包括分离编码具有PDGF-C生物学活性的多肽的核酸分子，和分离编码内部含有氨基酸序列为RKSR的蛋白水解位点或者内部含有结构保守的氨基酸序列的多肽的核酸分子的方法。
这个方面也包括一种分离的二聚体，此二聚体由具有活性的PDGF-C的单体和激活的连有CUB结构域的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的单体构成，或者反过来，由激活的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的单体和具有活性的的连有CUB结构域的PDGF-C的单体构成。该种二聚体可能包括也可能不包括位于激活的单体和CUB结构域连接处的蛋白水解位点。
如上所述的多核苷酸，这些多核苷酸的片段，以及与可以与这样的多核苷酸或者多核苷酸片段在严格条件下进行杂交的非编码的多核苷酸链具有充分相似性的多核苷酸的变体，它们均可用于识别、纯化、分离编码其它的非人源的哺乳类的PDGF-C的多核苷酸。因此这些多核苷酸片段和变体用于发明方面。严谨的杂交条件的例子如下杂交温度42℃，5X SSC，20 mM Na3PO4，pH6.8，50％甲酰胺；清洗条件42℃，0.2X SSC。本领域的人员应该了解需要根据要进行杂交的核酸序列的长度和GC碱基对的含量改变具体的条件。具体实例见“分子克隆实验手册”，第二版，页9.47-9.51，冷泉港，纽约冷泉港实验室(1989)。
另外，纯化和分离的可编码其它、非人源的、哺乳类的PDGF-C的多核苷酸也属于本发明的范畴，正如纯化和分离由此编码的多肽和可与非人源PDGF-C变体进行特异性免疫反应的抗体。因此，这项发明包括纯化和分离哺乳类PDGF-C多肽，也包括纯化和分离编码多肽的多核苷酸。
显而易见，这项发明中的核酸和多肽可以通过合成或者重组的方法得到，也可以从天然物质中提取、纯化。
在这里，当举具体的实例时，“包括”的意思是“包含，但不仅仅限于”。
附图简述图1(SEQ ID NO2)显示编码人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的完整的核酸序列；图2(SEQ ID NO3)显示推测的含有345个氨基酸残基的全长hPDGF-C的一维序列(cDNA的翻译部分对应于图1中的核苷酸37到1071)；图3(SEQ ID NO4)显示编码人PDGF-C(bPDGF-C)(1536bp)的片段的cDNA序列；图4(SEQ ID NO5)显示hPDGF-C的片段的氨基酸序列(即图3中的第3位到第956位的核苷酸序列的翻译)；图5(SEQ ID NO6)显示鼠PDGF-C(mPDGF-C)的cDNA的核苷酸序列；图6(SEQ ID NO7)显示鼠PDGF-C的片段的氨基酸序列(由图5中的第196位到1233位核苷酸的cDNA翻译而成)；图7显示图2中的人PDGF-C的氨基酸序列和鼠PDGF-C的氨基酸序列的比较；图8显示鼠PDGF-C的图解结构，由信号肽(用斜线框表示)，N端Clr/Cls/胚胎sea urchin蛋白Uegf/骨形态发生蛋白1(CUB)结构域，和C端PDGF/VEGF-同源结构域(用空白框表示)；图9显示人和鼠的PDGF-C的PDGF/VEGF同源结构域的序列比较，并和生长因子的VEGF/PDGF家族的其他成员相比较(SEQ IDNO8-17)；图10显示几种属于VEGF/PDGF家族的生长因子的进化树；图11提供存在于人和鼠的PDGF-Cs的CUB结构域的氨基酸序列的比较(SEQ ID NO18和19)和其他的存在于人骨发生蛋白-1(hBMP-1，3个CUB结构域CUB1-3)(SEQ ID NO20-22)和人NP-1(2个CUB结构域)(SEQ ID NO23和24)的CUB结构域的氨基酸序列；图12显示几种人组织中PDGF-C表达的转录物的Northern杂交的分析；图13显示由低氧诱导的PDGF-C的mRNA的表达水平的变化；图14显示人肿瘤细胞系中的PDGF-C的表达；图15显示在转染的COS-1细胞中通过免疫印迹技术检测全长的人源PDGF-C的结果；图16显示全长PDGF-C的分离过程和部分特征；图17显示只含有PDGF/VEGF同源结构域的人源PDGF-C的截短体的分离和部分特征；图18为标记的PDGF-BB同源二聚体结合到表达PDGF α-受体的PAE-1细胞上而得到的标准曲线；图19提供代表抑制标记的PDGF-BB结合到表达PDGF α-受体的PAE-1细胞上的图形，该抑制可通过增加大量的纯化的全长和截短的PDGF-CC蛋白；图20显示全长和截短的PDGF-CC同源二聚体对PDGF-α-受体的磷酸化的影响；图21显示全长和截短的PDGF-CC同源二聚体对成纤维细胞的致有丝分裂活性；图22显示截短的PDGF-CC结合到PDGF受体上的鉴定结果；图23显示未消化的全长PDGF-C蛋白和纤维蛋白溶酶发生的26-28kDa的蛋白片段的免疫杂交；图24表示全长PDGF-C和截短的PDGF-C的竞争性结合到PDGER-α受体的鉴定结果；图25显示在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE对人PDGF-C CUB结构域进行分析的结果；图26A-26V显示正在发育的小鼠胚胎中的PDGF-C的表达状况；图27A-27F显示正在发育的的肾中PDGF-C，PDGF-A和PDGFR-α的表达状况；
图28A-28F显示从野生型(图28A和28c)，PDGFR-α-/-(图28B和28F)，PDGF-A-/-(图28D)和PDGF-A/PDGF-B double-/-(图28E)肾而来的E 16.5肾的组织学。
优选实施例的具体描述图1(SEQ ID NO2)显示完整的编码人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的核酸序列，该hPDGF-C是VEGF/PDGF家族的新成员。比较编码hPDGF-C的克隆#4(见图3和图4-SEQ ID NO4和5)与鼠蛋白(相对应的27个氨基酸)得知克隆#4不是全长序列，缺乏了大约80个碱基对的编码序列。从人胎儿肺cDNA文库中分离出的另外的cDNA克隆包括上述缺失序列的插入片段。克隆#10比克隆#4有更长的插入。克隆#10的插入从5’区域开始，并含有缺失的序列。克隆10#包括人PDGF-C的全序列。图1(SEQID NO2)中列出一些5’-未翻译的序列，一些已翻译的编码人PDGF-C的cDNA的序列和一些3’-未翻译的核酸序列。终止密码子位于起始ATG上游21bp处(图1中起始ATG下端划线)。
通过对NCBI的EST数据库和dbEST的搜索，寻找到一个人的EST序列(W21436)，该序列编码鼠PDGF-C中与人同源的部分。由此，可以开始进行分离未发现的人PDGF/VEGF的工作。根据所得的人EST序列，两个寡核苷酸链设计如下5’-GAA GTT GAG GAA CCC AGT G-3’5’端引物(SEQID NO25)5’-CTT GCC AAG AAG TTG CCA AG-3’3’端引物(SEQID NO26)使用上述的寡核苷酸引物可以通过PCR技术扩增出人胎儿肺5’-STRETCH PLUSλgt10 cDNA文库中的长度为348bp的多核苷酸。再将PCR产物克隆到TA克隆试剂盒的PCR 2.1-载体上(Invitrogen)。随后，根据标准的技术，长度为348bp的PCR产物克隆可用于构建hPDGF-C探针。
人胎儿肺5’-STRETCH PLUS gt10 cDNA文库(Clontech)中的106种λ-克隆可根据标准的方法用hPDGF-C探针进行筛选。在几个阳性克隆中，重点分析克隆#4，根据标准的方法，使用内部的和载体寡核苷酸确定其上插入的核苷酸序列。克隆#4的插入片段含有编码全长的人PDGF-C(hPDGF-C)的cDNA的部分核苷酸序列。图3(SEQ ID NO4)显示了克隆#4插入的核苷酸序列(1536bp)。此cDNA翻译的部分包括核苷酸第6位到第956位。图4(SEQ ID NO5)显示了推测可能是插入序列的翻译部分的氨基酸序列。该氨基酸序列构成的多肽缺乏全长hPDGF-C多肽的最初28个氨基酸残基，但是该多肽包括可以充分激活PDGF α受体的蛋白水解片段。应该注意到SEQ ID NO为5的第一个甘氨酸(Gly)并没有在全长hPDGF-C中发现。
在通过对NCBI的dbEST数据库的搜索，找到一个小鼠EST序列(AI020581)，该序列编码部分一个新的小鼠PDGF、PDGF-C的一部分。绝大多数的小鼠cDNA是通过使用来源于小鼠胚胎λgt10cDNA文库中的DNA作为模板进行PCR扩增而得到的。为了扩增cDNA的3’端，需要使用根据小鼠EST序列得到的有意义链引物(该引物的序列是5’-CTT CAG TAC CTT GGA AGA G，引物1(SEQ ID NO27))，为了扩增cDNA的5’端，需要使用根据小鼠EST序列得到的无意义链引物(该引物的序列是5’-CGC TTGACC AGG AGA CAA C，引物2(SEQ ID NO28))。λgt10载体引物是有意义链引物5’-ACG TGA ATT CGA CAA GTT CAG CCTGGT TAA(引物3(SEQ ID NO29))和无意义链引物5’-ACG TGGATC CTG AGT ATT TCT TCC AGG GTA(引物4(SEQ ID NO30))。载体引物和源自小鼠EST的内部引物被用于标准的PCR反应。被PCR扩增出的片段的大小分别大约是750bp(3′片段)和800bp(5’片段)。这些片段克隆入PCR2.1载体并使用载体引物和内部引物进行核酸序列分析。这些片段不含有mPDF-C的全长序列，鼠肝ZAP cDNA文库用标准的方法进行筛选。构建一段32P标记的261bp的PCR片段作为探针，利用引物1和引物2并使用源于鼠胚胎λgt10文库的DNA作为模板(见上)。将阳性的噬菌斑纯化，再通过亚克隆获得插入的核苷酸序列。载体特异性引物和内部引物被使用。通过分析产生的PCR克隆和分离出的克隆的核苷酸序列信息，可以推断出mPDGF-C的全长的氨基酸序列(见图6)(SEQ ID NO7)。
图7显示了鼠和人的PDGF-C的氨基酸序列的比较情况(SEQIDNO分别是6和2)。该比较表明人和鼠的PDGF-Cs有大约87％的相同性，在蛋白全长的345个氨基酸残基中有45个氨基酸被替换。几乎所有观察到的氨基酸的替换本质上是保守的。预测的mPDGF-C中信号肽酶水解的位点位于残基G19和T20之间。这一点会产生鼠类的可分泌的由326残基构成的多肽。
图8提供了带有信号序列(用斜线框表示)、N-端CUB结构域和C-端PDGF/VEGF同源结构域(用空白框表示)的鼠PDGF-C的图解的结构域的结构。划线显示的氨基酸序列与CUB结构域或与VEGF-同源结构域没有明显的相似性。
高度的序列相同性表明人和鼠的PDGF-C有几乎相同的结构域结构。氨基酸序列的比较显示鼠和人的PDGF-C均有一个新的结构域结构。除了位于两种蛋白质(残基164到345)的C-端区域的PDGF/VEGF-同源结构域之外，在两种PDGF-Cs的N-端区域均有一个结构域可归于CUB结构域(Bork and Beckmann，J.Mol.Biol.，1993231，539-545)。该大约110氨基酸的结构域最初从补体因子Clr/Cls中被鉴别出，但是最近又在其它几种细胞外蛋白中发现，包括，信号分子，例如骨发生蛋白1(BMP-1)(Wozney et al.，Science，1988 242，1528-1534)，受体分子，例如NP-1(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。尽管CUB结构域的功能不清楚，但是它有可能参与蛋白-蛋白相互作用或者参与与蛋白聚糖硫酸肝素之类的碳水化合物相互作用。
图9显示人和鼠的PDGF-Cs的C-端PDGF/VEGF-同源结构域的氨基酸序列的比较以及与PDGF/VEGF家族成员如VEGF165、PLGF-2、VEGF-B167、Pox Orf VEGF、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A和PDGF-B的C-端PDGF/VEGF-同源结构域的氨基酸序列的比较(SEQ ID NO8-17)。在这张图中VEGF-C和VEGF-D的N-端和C-端区域的一些氨基酸序列被略去了。间隙被引入以优化比较。该比较用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250残基权重表得到。用方框表示的残基显示的是与位于两个远距离单元内部的PDGF-Cs相匹配的氨基酸。
该比较显示PDGF-C有预料中由半胱氨酸残基构成的结构，除了一个例外。在半胱氨酸3和4之间，通常由2个残基隔开，有三个氨基酸(NCA)的插入。PDGF-C中这种序列的特点是出乎意料的。
根据图9中的氨基酸序列比较，可以构建出图10显示的进化树。数据表明PDGF-C同源结构域与VEGF-C和VEGF-D的PDGF/VEGF-同源结构域密切相关。
正如图11所示，将来源于几种含CUB的蛋白质的氨基酸序列进行了比较。结果显示人和鼠PDGF-C的简单CUB结构域有显著的相同性，同大多数相近的CUB结构域相比也有同样的结果。来源于人BMP-1，具有3个CUB结构域(SEQ ID NO20-22)的序列和具有2个CUB结构域(CUB1-2)(SEQ ID NO分别是23和24)的人NP-1的序列图中也有显示。间隙被引入以优化比较。该比较用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250残基权重表而得到。
图12显示了在几种人的组织中的PDGF-C转录物的表达产物的Northen杂交的分析结果。该分析表明PDGF-C由一个主要的大约为3.8-3.9kb的转录物和一个次要的2.8kb的转录物编码所得。右边的数目指的是mRNA(用kb表示)的大小。PDGF-C的组织表达由已经商业化的MTN技术检测(Clontech)。该杂交检测可根据供应商的指导进行，在68℃使用ExpressHyb溶液温育一个小时(高度严格条件)，用来源于如上所述筛选出的胎儿肺cDNA文库的353bp的hPDGF-C EST探针进行检测。该杂交随后在含有0.05％SDS的50℃ 2X SSC清洗30分钟，然后再在含有0.1％的SDS的50℃ 0.1X SSC溶液中清洗40分钟。然后将该杂交转到膜上，在-70℃曝光。杂交结果显示PDGF-C转录物在心脏，肝，肾，胰腺和卵巢中最丰富，而在其它的组织中，诸如胎盘，骨骼肌，前列腺，其含量水平很低。而在脾脏，结肠，外周血液白细胞中PDGF-C含量低于可检测的水平。
图13显示由低氧引起的PDGF-C mRNA的表达的调节状况。Marker(用kb表示)位于下面的面版的左边。估计的PDGF-C mRNAs大小显示于上面面板的左边(分别为2.7和3.5kbs)。为了调查PDGF-C是否受低氧诱导，将培养的人皮肤成纤维细胞暴露于低氧条件下分别为0，4，8，24小时。使用寡聚-dT纤维素亲和层析纯化法将Poly(A)＋mRNA从细胞中分离出来。分离出的mRNA在12％的琼脂糖中电泳，每道上样4μg mRNA，然后进行Northern杂交，即和PDGF-C的探针杂交。这两条带的大小一方面由将同样的滤膜和hVEGF、hVEGF-B和hVEGF-C探针的混合物杂交而决定(Enholmet al.Oncogene，1997 14 2475-2483)，另一方面依据已知的mRNA的大小的插值而决定。图13中显示的结果表明PDGF-C在人皮肤成纤维细胞中不受低氧的调节。
图14显示人肿瘤细胞系中的PDGF-C mRNA的表达。为了调查是否PDGF-C在人肿瘤细胞系中表达，从几种已知的肿瘤细胞系中分离出Poly(A)＋mRNA，然后进行12％的琼脂糖电泳，再通过和PDGF-C探针杂交的Northem杂交方法进行分析。图14的显示的结果表明PDGF-C mRNA在几种类型的人肿瘤细胞系中表达，诸如JEG3(人绒毛膜癌，ATCC #HTB-36)，G401(Wilms氏肿瘤，ATCC#CRL-1441)，DAMI(成巨核细胞白血病)，A549(人肺癌，ATCC #CCL-185)和HEL(人红白血病，ATCC #TID-180)。应该注意到可以通过抑制PDGF-C而抑制这些PDGF-C表达的肿瘤的进一步生长。同样，也可检测PDGF-C的表达作为一种鉴定特异的肿瘤类型的方法。
实施例1针对人PDGF-C的特异性抗肽抗体的产生两条合成的肽段被用于产生针对人PDGF-C的抗体。第一条合成肽对应于全长PDGF-C的N-端的29-48残基，其中包括N-端和C-端的额外的半胱氨酸残基CKFQFSSNKEQNGVQDPQHERC(SEQID NO31)。第二条合成肽对应于全长PDGF-C内部区域的残基230-250，其中包括位于C-端的额外的半胱氨酸残基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO32)。根据供应商的指导这两个合成肽通过使用N-琥珀酰亚氨基-1-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia Inc.)而彼此连接到载体蛋白即拴孔纠缠血蓝蛋白(KLH，Calbiochem)上，在磷酸缓冲盐(PBS)中200-300毫克连接产物分别在弗氏完全佐剂中乳化并在兔的多位点进行皮下注射。每隔两周对兔用同样量的在弗氏完全佐剂中乳化的连接产物进行皮下注射。抽出收集兔血并用已知的标准方法制备血清。
实施例2哺乳动物细胞中全长的人PDGF-C的表达将编码人PDGF-C的全长cDNA克隆入具有SV40启动子的哺乳动物表达载体，即pSG5(Stratagene，La Jolla，CA)。使用DEAE-葡聚糖将由此载体转染的COS-1细胞收集，用没有插入cDNA的pSG5载体来作阴性对照。在转染24小时后向转染的COS-1细胞中加入无血清培养基，在加入培养基24小时后收集含有分泌的蛋白质的液体。这些液体在冰浴的三氯乙酸中作用30分钟后易于产生聚沉，再用丙酮洗涤沉淀。该聚沉的蛋白在还原条件下溶解于SDS上样缓冲液中并根据标准方法用SDS-PAGE胶将蛋白分开。分开的蛋白质电转移到Hybond滤膜上再用针对全长PDGF-C的兔抗血清进行免疫杂交，兔抗血清的制备如上所述。结合的抗体可用增强的化学荧光(ECL，Amersham Inc.)方法检测出来。图15显示该免疫杂交的结果。样品只是部分还原，人PDGF-C的单体为大小为55kDa(下面的带)，而二聚体大小为100kDa(上面的带)。该结果表明蛋白质以完整的形式分泌并且在哺乳动物细胞中的分泌的过程中没有主要的蛋白水解过程。
实施例3在杆状病毒感染的Sf9细胞中的全长和截短的人PDGF-C的表达人PDGF-C的cDNA的(970bp)的全长编码部分可根据标准的条件和程序使用Deep Vent DNA聚合酶(Biolabs)通过PCR方法进行扩增。全长PDGF-C扩增30个循环，每个循环包括94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。5’端引物是5’CGGGATCCCGAATCCAACCTGAGTAG3’(SEQ ID NO33)，该引物包括一个BamHI位点(用下划线表示)用于进行克隆。3’端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT3′(SEQ ID NO34)。该引物包括一个EcoRI位点(用下划线表示)和由肠激酶位点产生的C-端6XHis tag的序列。另外，人PDGF-C的PDGF/VEGF同源结构域(PVHD)的残基230-345可根据标准的条件和方法使用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)通过PCR方法进行扩增。PDGF-C的PVHD的残基230-345扩增25个循环，每个循环包括94℃变性1分钟，56℃退火4分钟，72℃延伸4分钟。5’端引物是5’CGGATCCCG.GAAGAAAATCCAGAGTGGTG3′(SEQ ID NO35)该引物包括一个BamHI位点(下划线)用于克隆。3’端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT-3′(SEQ ID NO36)，该引物包括一个EcoRI位点(下划线)和编码由肠激酶位点产生的C-端6X His tag的序列。PCR产物用BamHI和EcoRI消化，然后克隆入杆状病毒表达载体即pAcGP67A。证实PCR产物的正确序列克隆入载体可通过核酸测序得到验证。然后根据手册(Pharminogen)将线性化的杆状病毒DNA的表达载体共转染入Sf9昆虫细胞Sf9。根据手册(Pharminogen)在开始大规模蛋白生产和纯化之前先将重组杆状病毒扩增数次。
用重组杆状病毒感染用无血清培养基培养的Sf9细胞(multiplicity of infection～7)。感染4天之后，收集含有重组蛋白质的培养基，将其和Ni-NTA-琼脂糖珠体(Qiagen)温育。将珠体收集到柱中，使用高强度的洗脱条件50mM磷酸钠缓冲液，pH8，含有300mM NaCl(洗脱缓冲液)，结合的蛋白质可通过增加洗脱缓冲液中咪唑的浓度(从100mM到500mM)洗脱下来。洗脱的蛋白质在还原和非还原的条件下通过12.5％的聚丙酰胺胶的SDS-PAGE进行分析。在进行免疫杂交的分析时，蛋白质电转移到Hybond滤膜，转移时间45分钟。
图16A-C显示全长人的PDGF-C蛋白的分离过程及其部分特征。在图16A中，通过使用针对N-端肽的抗肽抗体进行杂交(如上述)，可以看见重组的全长蛋白质。在图16B中，通过使用针对内部肽的抗肽抗体进行杂交(如上述)，可以显现出重组的全长蛋白质的条带。通过使用考马斯亮蓝染色的方法可以看见分离得到的蛋白质带。通过使用考马斯亮蓝染色的方法可以看见分离得到的蛋白质(图16C)。图16A-C底部的数字指的是用于将蛋白质从Ni-NTA柱上洗脱下来的咪唑的浓度，以摩尔表示。图16A-C显示全长的蛋白质在非还原条件下以99kDa的大小迁移，在还原条件下以55kDa的大小迁移。这一点表明全长的蛋白质是二硫键交联的二聚体。
图17A-C显示只含有PDGF/VEGF同源结构域的人PDGF-C的截短形式的分离过程和部分特征的分析。在图17A中，从Ni-琼脂糖柱洗脱下来的片段的免疫杂交的分析表明蛋白质可以根据咪唑的浓度变化洗脱下来(范围100-500mM)。洗脱下的片段在非还原条件下分析，通过使用针对内部肽的抗肽抗体进行杂交(如上述)，可以看见截短后的人PDGF-C。图17B显示和图17A中考马斯亮蓝染色的相同的片段。这一点表明该过程产生了高度纯化的物质以36kDa的大小进行迁移。图17C显示还原条件和非还原条件下的截短的人PDGF-C蛋白质以考马斯亮蓝染色后的条带。数据表明蛋白质是由二硫键连接的可分泌的二聚体，单体以24kDa的大小迁移。
实施例4全长和截短的PDGF-C的受体结合性质通过考察全长的和截短的PDGF-C与可溶的Ig-融合蛋白的结合能力(其中该Ig-融合蛋白包括VEGF-1、VEGF-2或者VEGF-3的胞外结构域)，从而可以了解全长的和截短的PDGF-C与VEGF受体的相互作用状况(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 9511709-11714)。这里融合蛋白是指VEGFR-1-Ig、VEGFR-2-Ig或者VEGFR-3-Ig，它们在人293EBNA细胞中表达。所有的Ig融合蛋白都是人源VEGFRs。转染后，将细胞保温24小时，用含0.2％的牛血清白蛋白的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)清洗，再继续培养24小时。加入蛋白A-Sepharose珠体，可以使得融合蛋白从培养基中聚沉下来。这些珠体与100μl的10X结合缓冲液(5％牛血清白蛋白，0.2％Tween 20和10μg/ml的肝素)及900μl用以培养293个细胞的条件培养基联合使用，这293个细胞已经用编码含有全长或截短的PDGF-C的哺乳动物表达质粒或用对照载体转染过，然后通过代谢用35S-半胱氨酸和甲硫氨酸作标记4-6小时。2.5小时以后，室温下，用4℃下的曾含有磷酸缓冲盐的结合缓冲液洗涤Sepharose珠体3次并在SDS-PAGE缓冲液中煮沸。结合到Ig-融合蛋白质的标记蛋白质可以通过还原条件下的SDS-PAGE来分析。用磷光分析仪可以检测出带有放射性标记的蛋白质。在所有的这些分析中，放射性标记的PDGF-C没有显示出与任何VEGF受体有相互作用。
下一步，通过分析他们与PDGF-BB竞争结合到PDGF受体上的能力，以检测全长的和截短的PDGF-C结合到人PDGF-C受体α和β的能力。结合实验以可以稳定表达人PDGF-C受体α和β的猪主动脉内皮-1细胞为对象(Erikson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。结合实验的具体过程参照Heldin et al.，EMBO J，1988，71387-1393。不同浓度的全长和截短人PDGF-C或人PDGF-BB与5ng/ml的125I-PDGF-BB在结合缓冲液(含有1mg/ml牛血清白蛋白的PBS)中混合。液体和放置于24孔培养板中的可以表达受体的PAE-1细胞冰浴90分钟。在用结合缓冲液洗涤三遍以后，通过在20mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油，1％Triton X-100中裂解细胞以抽提附着于细胞上的125I-PDGF-BB。细胞带有的放射性用β计数器检测。图18显示了125I标记的PDGF-BB同源二聚体结合到表达PDGFα-受体的PAE-1细胞上的标准曲线。加入到保温体系中的未标记的过量的蛋白质将有效的和放射性标记的示踪物的细胞结合相竞争。
图19显示截短的PDGF-C有效的竞争结合到PDGF α-受体上，而全长的PDGF则不然。全长和截短的蛋白质均不能竞争结合到PDGF β-受体上。
实施例5PDGF α-受体磷酸化为了验证是否PDGF-C引起了PDGF α-受体的磷酸化的增加，检测了全长和截短的PDGF-C结合到PDGF α-受体上和刺激磷酸化增加的能力。无血清培养的可以稳定表达人PDGF α-受体的猪主动脉内皮细胞与PBS在置于冰上90分钟，该PBS添加有1mg/ml BSA和10ng/ml PDGF-AA，100ng/ml全长人PDGF-CC同源二聚体(flPDGF-CC)，100ng/ml的截短PDGF-CC同源二聚体(cPDGF-CC)，10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml的截短PDGF-CC的混合物。全长和截短PDGF-CC同源二聚体按上述方法制备。在加入多肽后60分钟，用细胞裂解液裂解细胞(20mM tris-HCl，pH7.5，0.5％Triton-X100，0.5％脱氧胆酸，10mM EDTA，1mM orthvanadate，1mM PMSF，1％Trasylol)。PDGF α-受体可从澄清的溶胞产物中用针对人PDGF α-受体的兔抗血清进行免疫聚沉(Eriksson et al.，EMBO J，1992 11 543-550)。聚沉的受体进行SDS-PAGE。经过SDS胶电泳之后，聚沉的受体转移到硝酸纤维素膜上，该膜用抗磷酸化酪氨酸抗体PY-20检测(Transduction Laboratories)。然后该膜与连有辣根过氧化物酶的抗鼠抗体温育。用增强的化学荧光法检测结合的抗体(ECL，Amersham Inc.)。然后洗去膜上的物质，再用PDGF α-受体兔抗血清进行检查，受体的量通过和连有辣根过氧化物酶的抗兔抗体温育，再进行检测来决定。用增强的化学荧光法检测结合的抗体(ECL，Amersham Inc.)。通过对膜上PDGF α-受体抗体的检测显示所有的泳道均含有等量的受体。实验中以PDGF-AA作为对照。图20显示的是截短的而不是全长的PDGF-CC，它能够有效的诱导PDGF α-受体酪氨酸磷酸化。这一点表明截短的PDGF-CC是潜在的PDGF α-受体的激动剂。
实施例6PDGF-C对成纤维细胞的致有丝分裂作用图21显示截短和全长的PDGF-CC对成纤维细胞的致有丝分裂活性。测活方法见Moil et al.，J.Biol.Chem.，1991 266 21158-21164。无血清培养的人包皮成纤维细胞与1ml无血清培养基温育24小时，该培养基中含有0.2umCi[3H]的胸腺嘧啶核苷，又添加了1mg/mlBSA和3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml全长PDGF-CC(flPDGF-CC)，截短的PDGF-CC(cPDGF-CC)或者PDGF-AA。在三氯乙酸聚沉后，[3H]胸腺嘧啶核苷渗入DNA的程度由β-计数器决定。结果表明，不是全长的PDGF-CC，而是截短的PDGF-CC才是潜在的促成纤维细胞分裂剂。实验中以PDGF-AA作为对照。
PDGF-C不与任何已知的VEGF受体结合。PDGF-C是目前所知的唯一的能够结合PDGF α-受体，并增加其磷酸化的VEGF家族成员。PDGF-C也是目前所知唯一的潜在的促成纤维细胞分裂的VEGF家族成员。这些特征表明PDGF-C的截短形式可能不是VEGF家族成员，而是一种新的PDGF。另外，全长的蛋白质可能是潜在的生长因子，需要经过蛋白水解释放出活性的PDGF/VEGF同源结构域，它才被激活。已知的蛋白水解位点位于全长蛋白质的残基231-234(-R-K-S-R-)处的二元基序。通过比较鼠和人的PDGF-Cs，显示该位点的结构是保守的(图7)。优选的蛋白酶包括因子X和肠激酶，当然并不仅限于此。N-端CUB结构域可以作为抑制结构域，可用于在某些细胞外室定位潜在的生长因子(例如细胞外骨架)，需要的话它可以通过特定的蛋白水解除去，例如在胚胎发育过程中、组织再生期间和组织重建过程，包括骨重建，活性血管生成，肿瘤恶化，肿瘤侵入，转移形成和/或伤口愈合。
实施例7结合有截短的PDGF-C的PDGF受体通过检测截短了的PDGF-C与分别表达PDGF α或β受体的猪主动脉内皮-1(PAE-1)细胞结合的能力，以评估截短了的PDGF-C和PDGFα和β受体之间的相互作用(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。实验中具体的结合步骤可参见Heldin et al.，EMBOJ，1988，7 1687-1393。在10μl硼酸钠缓冲液中，用Bolton-Hunter试剂(Amersham)对截短了的PDGF-C蛋白(5μg)进行放射性标记，使其放射活性达到4x105cpm/ng。将含有不同浓度的带放射性标记的截短的PDGF-C的结合缓冲液(1mg/ml牛血清白蛋白PBS)，加入24孔培养板，培养板每孔中均含有可表达受体的细胞PAE-1，置于冰上90分钟，或加入未标记的蛋白，置于冰上90分钟。使用结合缓冲液洗涤三次，用裂解液(20mM Tris-HCl，pH7.5，10％甘油，1％Triton-100)裂解细胞以抽提结合在细胞上的125I-标记的PDGF-C。细胞结合的放射性剂量由γ-计数器测定。在某些实验中加入了过量100倍的截短了的PDGF-C，并未检测到非特异性的结合。所有的结合数据为三次实验的平均值，实验中实验的误差在10-15％。如图22所示，截短的PDGF-C仅仅与表达PDGF α受体的细胞结合，而不与表达PDGF β受体的细胞结合。当用过量100倍的未标记蛋白定量的替换带放射性标记的PDGF-C，结果显示结合是特异性的。
实施例8蛋白水解酶对全长PDGF-C影响为了证明全长PDGF-C是否可以被特定的蛋白水解作用激活并从CUB结构域释放出和PDGF/VEGF同源的结构域，使用不同的蛋白酶处理全长蛋白。例如，在含有1mM CaCl2、1mM MgCl2和0.01％Tween 20的20mM Tris-HCl(PH7.5)中，使用浓度为每毫升2-3单位的纤维蛋白溶酶(Sigma)处理全长PDGF-C，37摄氏度温育1.5-4.5小时。释放出的结构域与上述在转染细胞里产生的截短的PDGF-C在大小上基本是相同的。纤维蛋白溶酶消化的PDGF-C和未被消化的全长PDGF-C在还原状态下进行SDS-PAGE胶。SDS-PAGE凝胶电泳后，分开的蛋白被转移到硝酸纤维素滤膜上，滤膜用兔抗多肽抗血清探针标记，标记位置在全长蛋白的230—250位残基处(残基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO37)正好位于PDGF/VEGF同源结构域的N-末端)。用增强的化学荧光法(ECL，Amersham Inc)可以检测抗体的结合。图23显示了用55kDa未消化的全长蛋白和纤维蛋白溶酶消化的全长蛋白后的26-28kDa蛋白免疫杂交的结果。
实施例9PDGF α受体结合纤维蛋白溶酶消化的PDGF-C为了确定PDGF α受体与纤维蛋白溶酶消化的PDGF-C的相互作用，用纤维蛋白溶酶消化的PDGF-C结合猪主动脉内皮-1细胞表达的PDGF α受体，以检测其结合能力(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11 543-550)。受体结合实验按例7步骤操作，用30ng/ml I125标记的切断的PDGF-C作为示踪剂。如图24所示，增加纤维蛋白溶酶消化的PDGF-C浓度，可以比未消化的全长PDGF-C更有效地与PDGF α受体竞争结合。这些实验显示了全长PDGF-C是一个潜在的生长因子，不能与PDGF α受体相互作用，而受限于蛋白水解作用，使其释放C-末端的PDGF/VEGF同源结构域，这对于产生一个有活性的PDGF α受体的配体/激动剂是必需的。
实施例10克隆并表达人PDGF-C CUB结构域人PDGF-C基因中有430个碱基的cDNA片段编码CUB结构域(在全长PDGF-C的第23-159位氨基酸残基)，可以利用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)在标准条件和步骤下进行PCR扩增，该编码序列5’端引物用5’cgggatcccgaatccaacctgagtag3’(SEQ ID NO38)。这个引物包含一个BamHI位点(下划线)用以克隆。该编码序列3’端引物用5’ccggaattcctaatggtgatggtgatgatgtttgtcatcgtcgtcgacaatgttgtagtg3’(SEQ ID NO39)。这条引物包含一个EcoRI位点(下划线)，并且此序列C末端编码一个由肠激酶位点连接的6x组氨酸标记。扩增后的PCR片段随后被克隆到pACgp67A转化载体上。CUB-pACgp67A表达框的正确序列由自动核酸测序仪验证。然后依照制备的流程(Pharmingen)，表达载体与Baculogold线性化的杆状病毒DNA共转化到昆虫细胞Sf9中。重组的杆状病毒在大规模蛋白生产之前被扩增若干次，蛋白纯化步骤根据手册进行(Pharmingen)。
用重组杆状病毒感染用无血清培养基培养的Sf9细胞(multiplicity of infection～7)。感染72小时之后，收集含有重组蛋白质的培养基，将其和Ni-NTA-琼脂糖珠体(Qiagen)温育。将珠体收集到柱中，使用高强度的洗脱条件50mM磷酸钠缓冲液，pH8，含有300mM NaCl(洗脱缓冲液)，结合的蛋白质可通过增加洗脱缓冲液中咪唑的浓度(从100mM到500mM)洗脱下来。洗脱的蛋白质在还原和非还原的条件下通过聚丙酰胺胶的SDS-PAGE进行分析。
图25显示了考马斯亮蓝染色凝胶后的结果。人PDGF-CUB结构域是一个二硫键连接的同源二聚体，分子量在非还原状态下约为55kD，而两个约25和30kD的单体分别在还原状态下存在。造成这种差异的原因可能是在CUB结构域25和55位氨基酸这两个葡糖酰胺化位点进行了不同的N-连接的葡糖酰胺化反应。图左侧是加有标准蛋白的泳道。
实施例11PDGF-C转录子在发育的小鼠胚胎中的定位为了更多了解PDGF-C的生物学功能，在小鼠胚胎的头部(图26A-26S)和尿生殖道(图26T-26V)区域通过非放射性组织切片原位杂交技术观测PDGF-C的表达状况。非放射性组织切片原位杂交使用步骤和PDGF-A及PDGFR-α探针可参见Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873。PDGF-C探针源于小鼠PDGF-C cDNA。图26A-26V所示的杂交模型是胚胎E16.5，但在E14.5、E-15.5、E-17.5也可见到相类似的模型。检测探针作为对照，在杂交区段没有显示同样的模型。
图26A所示的是齿基(t)通过口腔的额部区段。箭头所指的是口部外胚层PDGF-C表达的位点。同时标明了舌(to)。图26B-26D显示了PDGF-C在发育齿管的上皮细胞中的表达。与发育中的腭外胚层一样(图26C右箭头)，个别细胞在这个区域显示出很强的标记(图26D箭头)。图26E显示了通过眼部的额部区段，这里发现PDGF-C在毛囊(双箭头)和发育中的眼睑处表达。同时标明了视网膜(r)。在图26F和26G中，PDGF-C的表达在发育中的毛囊根鞘外侧上皮被发现。图26H中，PDGF-C在发育的眼睑中的表达被显示。在发育开口有个别带有很强标记信号的PDGF-C阳性细胞出现。同时标明了晶状体(1)。图26I，PDGF-C在发育泪腺中的表达用箭头指出。图26J，PDGF-C在发育中的外耳表达。表达见于外部听觉道(左箭头)和表皮裂口处的早期耳廓(e)。图26K和26L是PDGF-C在耳蜗的表达。表达见于半环状管(26K箭头处)。临近发育中毛细胞的上皮细胞存在PDGF-C mRNA的极化分布(图26L箭头)。图26M和26N是PDGF-C在口腔的表达。水平切片展示了颊上皮(图26M箭头)和形成中低唇颊与齿龈上皮(图26N箭头)间裂口中PDGF-C的表达。齿原基(t)和舌(to)同时被显示出来。图26O和26P显示了水平切片上PDGF-C在发育鼻孔中的表达，。PDGF-C表达最强出现在上皮分层和正常管道形成之前(图26O和26P箭头)。发育中的鼻孔也被注明(n)。图26Q-26S显示了PDGF-C在发育唾液腺管中的表达。图26Q是舌下腺。图26R和26S显示了上颌腺、唾液腺(sg)和唾液管(sd)。图26T-26V显示了PDGF-C在尿生殖道的表达。图26T显示了PDGF-C在发育中肾的后肾中胚层的表达。图26U显示了PDGF-C在尿道(ua)和发育中阴茎的上皮周围的表达。图26V显示了PDGF-C在发育中输尿管(u)的表达。
实施例12PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α在发育中肾的表达PDGF-C表达的最强处点之一在发育的肾中，因此PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α的表达也见于发育的肾中。图27A-27F显示了非放射性原位杂交的结果，(在未染的背景下用DIC光学检测所染的蓝色)显示了E16.5时它们mRNA在肾中的表达，PDGF-C(图27A和27B)、PDGF-A(图27C和27D)及PDGFR-α(图27E和27F)。在图27B、27D和27F中的白色虚线描绘出了皮层边界的轮廓。图27A、27C和27E中短线表示250μM，图27B、27D和27F中代表50μM。
PDGF-C表达见于后肾间质(图27Amm)，在稠合间质中(图27B箭头)表达水平增强，稠合间质可以经过上皮转化进一步进行管状发育，位于输尿管芽(ub)的两侧。PDGF-C在早期肾单位上皮聚集处(B箭头处)保持较低水平的表达，在成熟肾小球(gl)到管结构没有表达。
PDGF-A表达没有在这些早期聚集体中发现，但在管发育的较晚阶段强烈表达(图24C和24D)。PDGF-A在早期肾单位的上皮聚集体中表达(图27D箭头处)，但一旦肾单位进一步发育，PDGF-A表达变得对发育的细尿管绊(图27D箭头)有限制性。在发育骨髓的细尿管绊(图27C箭头)中可见表达最为强烈。在分支输尿管(u)和输尿管芽(ub)中不见PDGF-A。
因此，PDGF-C和PDGF-A表达模式在发育肾单位中具有空间的和时间的差异。在肾单位发育的最早阶段(间质聚集体)表达PDGF-C，而在最晚阶段(细尿管绊)表达PDGF-A。
PDGFR-α表达贯穿于发育中肾的间质(图27E和27F)，因此可以成为PDGF-C和PDGF-A的靶标。在发育的肾中也表达PDGF-B，但仅发生在血管内皮细胞里。PDGFR-β表达发生在周围血管间质，PDGF-B激活PDGFR-β这一过程是肾小球中的肾小球细胞重组的必须条件。
这些结果证明了PDGF-C表达发生在PDGFR-α表达位点附近，但不在PDGF-A或PDGF-B的表达位点附近。这显示了PDGF-C可能在体内通过PDGFR-α发挥作用，且不需要PDGF-A或PDGF-B的帮助。
既然在发育的肾中PDGF-C独一无二的表达模式显示其行使PDGFR-α激动剂的功能，并且与PDGF-A和PDGF-B不相关，我们将胚胎16.5天的肾在组织学水平做了一个比较比较PDGFR-α敲除小鼠(图28B和28F)和野生型小鼠的肾(图28A和28C)，以及PDGF-A敲除小鼠(图28D)和PDGF-A/PDGF-B全部敲除小鼠(图28E)的肾。短线在图28A和28B中表示250mm，在图28C-F中表示50μm。
使用PDGF-A、PDGF-B和PDGFR-α杂合突变体(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873；Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)构建C57B16/129sv杂交系，再进行杂交以产生纯合突变胚胎。PDGF-A/PDGF-B杂合突变体被杂交来产生PDGF-A/PDGF-B敲除胚胎。由于PDGF-A-/-在E10前的高度致死性(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873)，双基因敲除的E16.5胚胎所占比例在杂交系中少于1/40。除了PDGF-A/PDGF-B双基因敲除的胚胎只获得了一例外，其余纯合的肾表现型胚胎每种基因型至少被验证了两例。
有趣的是在PDGFR-α-/-的肾皮层中(图28A箭头和图28F星号)缺少间隙充质，而在所有其它基因型中间隙充质都存在(图28C-E星号)。分支输尿管(u)和后肾间质(mm)及它的上皮衍生物在所有突变体都表现正常。在PDGF-A/PDGF-B双敲除胚胎中反常的肾小球反映出由于缺少PDGF-B导致肾小球中肾小球细胞无法进行重组。
这些结果显示了PDGFR-α敲除中有一种肾的表现型没有在PDGF-A或PDGF-A/PDGF-B敲除的个体中出现，因此反映了潜在的源于PDGF-C的信号缺失。表现型由发育中肾皮层标记的间隙充质缺失组成。在PDGFR-α-/-的肾中，这些细胞的缺失正是由于正常PDGFR-α阳性细胞相邻于PDGF-C的表达位点。
检验PDGF-C功能的生物分析方法实验的实施是为了评估PDGF-C是否与PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D有相似的可以影响结缔组织细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞的生长和运动性，改变内皮细胞功能，调节血管生成，促进创伤愈合的作用。依据受体结合分布的研究，可以进行进一步的实验。I.对内皮细胞PDGF-C致有丝分裂为了检测PDGF-C对内皮细胞致有丝分裂能力，PDGF-C多肽被引入含5％血清的细胞培养基中，应用含10％血清的培养基繁殖牛主动脉内皮细胞(BAEs)。BAEs先被接种在24孔培养板中，每个孔中细胞密度在加PDGF-C前一天达到10,000。加入多肽3天以后用胰蛋白酶分离并计数。纯化的VEGF在此实验中作为阳性对照。
II.内皮细胞功能实验A)内皮细胞增殖内皮细胞生长实验采用众所周知的技术方法如Ferrara和Henzel，Nature，1989 380 439-443，Gospodarowics et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989 86 7311-7315，及Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acts，1995 1246 1-9。
B)细胞附着实验检测PDGF-C对于多形核粒细胞黏附内皮细胞的影响。
C)趋化性用标准Boyden腔趋化性实验检测PDGF-C对趋化性的影响。
D)纤维蛋白溶酶原活化实验内皮细胞被用来检测PDGF-C对纤维蛋白溶酶原活性抑制生成的影响，采用Pepper et al.，Biochem.Biophy.Res.Commun.，1991 181902-906的方法。
E)内皮细胞迁移实验PDGF-C刺激内皮细胞迁移并形成管状的能力在如下实验中描述Montesano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986 83 7297-7301。或者，三维胶原凝胶实验Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298中有所记述，或者可以在修饰的Boyden腔里用凝胶化膜(Glaser et al.，Nature，1980 288 483-484)。
III.血管生成实验PDGF-C在绒毛尿囊膜上诱导血管生成响应的能力在下面实验记述Leung et al.，Science，1989 246 1306-1309。或者采用大鼠角膜实验Rastinejad et al.，Cell，1989 56 345-355；这是一个体内血管生成实验可接受的方法，其结果能容易的转化到其它体内系统。
IV.伤口愈合PDGF-C刺激伤口愈合的能力可以用大多数临床相关的可见模型检测，如Schilling et al.，Surgery，1995 46 702-710中记述的或利用Hunt et al.，Surgery，1967 114 302-307。
V.促红细胞生成系统使用促红细胞生成素系统的特殊细胞群体进行各种体内和体外的实验。在小鼠体外干细胞分析的实验中，使用荧光细胞分选仪来纯化细胞，结果比较令人满意。
A)重新植入干细胞这些细胞能够重新植入经过致死照射的小鼠的骨髓，并有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+几种表现型。在这些细胞中，单独加入PDGF-C，或者将PDGF-C与其它因子一起加入细胞，随后通过掺入的3H-胸腺嘧啶核苷测量细胞的增值。
B)晚期干细胞这些细胞有相对很小的骨髓再移植能力，但是能产生D13 CFU-S。这些细胞也有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+几种表现型。在这些细胞中加入PDGF-C，然后注射到经过致死照射的接受体中，对D13脾脏菌落计数。
C)祖代富集(Progenitor-Enriched)细胞这些细胞在体外对单一生长因子的刺激有响应，并具有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+几种表现型。此实验目的为验证是否PDGF-C能直接作用于促红细胞生成素的祖代细胞。在琼脂培养基上，将PDGF-C与这些细胞温育，7-14天后将存活的菌落计数。
VI.动脉粥样硬化平滑肌细胞在发育或动脉粥样硬化的发生中扮演了重要的角色，需要它们的表现型从收缩状态变成合成的状态。通过影响平滑肌细胞的生长和表现型的变化，巨噬细胞、内皮细胞、T淋巴细胞和血小板都在动脉粥样硬化过程中起一定作用。用修饰的Rose腔，其中不同细胞类型被接种到对面，一个体外实验可以动态测量增殖率和平滑肌细胞在多细胞环境下表现型的适应性，由此它被用来检测PDGF-C对平滑肌细胞的影响。
VII.转移用Lewis的肺癌模型作PDGF-C抑制转移能力的实验，例如用Cao et al.，J.Exp.Med.，1995 182 2069-2077的方法。
VIII.平滑肌细胞的迁移PDGF-C对平滑肌细胞和其它细胞类型迁移的影响可以用Koyama et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 22806-22812记述的方法验证。
IX趋化性PDGF-C对成纤维细胞、单核细胞、粒细胞及其它细胞的影响可用Siegbahn et al.，J.Clin.Invest.，1990 85 916-920记述的方法验证。
X.在其它细胞类型中的PDGF-C
PDGF-C对增殖、分化和其它细胞类型功能的影响，例如肝细胞、心肌及其它细胞、内分泌细胞和成骨细胞等，可以用已知的技术方法验证，譬如通过体外培养基中摄取3H-胸腺嘧啶核苷。PDGF-C在这些和其它组织中的表达能被Northern斑点杂交或原位杂交技术测量。
XI.PDGF-C变异体和类似物的构建PDGF-C是PDGF生长因子家族的一员，它和PDGF-C家族其它成员保持高度相同的同源性。PDGF-C包含8个保守的半胱氨酸残基，这是这个生长因子家族的特点。这些保守的半胱氨酸残基形成了链内二硫键，产生了半胱氨酸结结构，而内链二硫键形成的蛋白二聚体也是PDGF生长因子家族成员的特点。PDGF-C和酪氨酸蛋白激酶生长因子受体相互作用。
对此蛋白结构和与受体结合必须的活性位点及其相关联的活力所知甚少，根据许多已知的PDGF家族生长因子成员中活性位点和重要氨基酸残基，设计PDGF-C活力突变体可以大大推进人们在这方面的认识。
已发表的阐明PDGF生长因子家族成员结构和活力关系的文章有许多，其中关于PDGF内容的有Oestman et al.，J.Biol.Chem.，1991266 10073-10077；Andersson et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 11260-11266；Oefner et al.，EMBO J.，1992 11 3921-3926；Flemming et al.，Molecular and Cell Biol.，1993 13 4066-4076和Anderson et al.，GrowthFactors，1995 12 159-164；关于VEGF的包括Kim et al.，GrowthFactors，1992 7 53-64；Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-328885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。这些文章中显示，由于8个保守半胱氨酸残基，PDGF生长因子家组成员都展示了特征结状折叠结构和二聚作用，以至于在二聚体分子的每个末端都形成了三个暴露的环形区，预计活性受体结合位点就定位在这里。
基于以上信息，可以利用现有的生物技术人工设计PDGF-C突变体，即保留8个半胱氨酸残基以形成结状的折叠排列和二聚体，从而可能高度保存PDGF-C活力，同时仅仅通过保留或置换保守氨基酸残基，检测在蛋白结构的环1、环2和环3区上可能的受体序列。
在蛋白结构上形成特异靶位点的突变，是蛋白化学家研究方法中的标准技术(Kunkel et al.，Methods in Enzymol.，1987 154 367-382)。这些位点直接诱变在VEGF上的范例可见Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-32885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。其实，位点直接突变是极其普通的，商业化的试剂盒很容易实现这些步骤(例如Promega 1994-1995商品目录142—145页)。
对于PDGF-C突变体来说，测试其对结缔组织细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞生长及能动活性，内皮细胞增殖活性，血管生成活性及创伤愈合的作用，可以用已建立好的筛选步骤迅速验证。例如对于内皮细胞有丝分裂实验的类似步骤Claffey等已有描述(Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9)，可以直接使用。相似的，PDGF-C对其它细胞类型增殖、细胞分化和人新陈代谢方面的影响可以用人们现有的技术检测。
上述对本发明的描述和所列举的具体实例只起着解释和说明的作用，不起限制的作用，即不意味着本发明仅仅包含上述的内容。本领域内的专业人员可以在本发明的基本发明思想的基础上，根据自己的需要，进行一定的改变和修饰，所以，权利要求中涉及的源自于本发明的扩展也属于本发明的范畴。
序列表<110>乌尔夫·埃里克松卡琳·奥瑟李旭日安尼卡·蓬滕马尔科·于特拉卡里·阿利塔洛阿恩·厄斯特曼卡尔—亨里克·黑尔丁克里斯特·贝茨霍尔茨<120>血小板衍生生长因子C、其编码DNA及其应用<130>序列表<140>60/102，461<141>1998-09-30<150>60/108，109<151>1998-11-12<150>60/110，749<151>1998-12-03<150>60/113，002<151>1998-12-18<150>60/135，426<151>1999-05-21<150>60/144，022<151>1999-07-15<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Xaa Cys Xaa Cys Cys1 5 10 15<210>2<211>2108<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2ccccgccgtg agtgagctct caccccagtc agccaaatga gcctcttcgg gcttctcctg 60gtgacatctg ccctggccgg ccagagacga gggactcagg cggaatccaa cctgagtagt 120aaattccagt tttccagcaa caaggaacag aacggagtac aagatcctca gcatgagaga 180attattactg tgtctactaa tggaagtatt cacagcccaa ggtttcctca tacttatcca 240agaaatacgg tcttggtatg gagattagta gcagtagagg aaaatgtatg gatacaactt 300acgtttgatg aaagatttgg gcttgaagac ccagaagatg acatatgcaa gtatgatttt 360gtagaagttg aggaacccag tgatggaact atattagggc gctggtgtgg ttctggtact 420gtaccaggaa aacagatttc taaaggaaat caaattagga taagatttgt atctgatgaa 480tattttcctt ctgaaccagg gttctgcatc cactacaaca ttgtcatgcc acaattcaca 540gaagctgtga gtccttcagt gctaccccct tcagctttgc cactggacct gcttaataat 600gctataactg cctttagtac cttggaagac cttattcgat atcttgaacc agagagatgg 660cagttggact tagaagatct atataggcca acttggcaac ttcttggcaa ggcttttgtt 720tttggaagaa aatccagagt ggtggatctg aaccttctaa cagaggaggt aagattatac 780agctgcacac ctcgtaactt ctcagtgtcc ataagggaag aactaaagag aaccgatacc 840attttctggc caggttgtct cctggttaaa cgctgtggtg ggaactgtgc ctgttgtctc 900cacaattgca atgaatgtca atgtgtccca agcaaagtta ctaaaaaata ccacgaggtc 960cttcagttga gaccaaagac cggtgtcagg ggattgcaca aatcactcac cgacgtggcc 1020ctggagcacc atgaggagtg tgactgtgtg tgcagaggga gcacaggagg atagccgcat 1080caccaccagc agctcttgcc cagagctgtg cagtgcagtg gctgattcta ttagagaacg 1140tatgcgttat ctccatcctt aatctcagtt gtttgcttca aggacctttc atcttcagga 1200tttacagtgc attctgaaag aggagacatc aaacagaatt aggagttgtg caacagctct 1260tttgagagga ggcctaaagg acaggagaaa aggtcttcaa tcgtggaaag aaaattaaat 1320gttgtattaa atagatcacc agctagtttc agagttacca tgtacgtatt ccactagctg 1380ggttctgtat ttcagttctt tcgatacggc ttagggtaat gtcagtacag gaaaaaaact 1440gtgcaagtga gcacctgatt ccgttgcctt gcttaactct aaagctccat gtcctgggcc 1500taaaatcgta taaaatctgg attttttttt ttttttttgc tcatattcac atatgtaaac 1560cagaacattc tatgtactac aaacctggtt tttaaaaagg aactatgttg ctatgaatta 1620aacttgtgtc rtgctgatag gacagactgg atttttcata tttcttatta aaatttctgc 1680catttagaag aagagaacta cattcatggt ttggaagaga taaacctgaa aagaagagtg 1740gccttatctt cactttatcg ataagtcagt ttatttgttt cattgtgtac atttttatat 1800tctccttttg acattataac tgttggcttt tctaatcttg ttaaatatat ctatttttac 1860caaaggtatt taatattctt ttttatgaca acttagatca actattttta gcttggtaaa 1920tttttctaaa cacaattgtt atagccagag gaacaaagat ggatataaaa atattgttgc 1980cctggacaaa aatacatgta tntccatccc ggaatggtgc3tagagttgga ttaaacctgc 2040attttaaaaa acctgaattg ggaanggaan ttggtaaggt tggccaaanc ttttttgaaa 2100ataattaa 2108<210>3<211>345<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Arg Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Set Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Set Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser
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site<400>39ccggaattcc taatggtgat ggtgatgatg tttgtcatcg tcgtcgacaa tgttgtagtg 60
权利要求
1.一种分离的核酸分子，包含具有与图1、图3或者图5(分别为SEQ ID NO2、4和6)的序列至少85％相同性的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中序列的相同性是至少90％。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中序列的相同性是至少95％。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸是cDNA。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸是哺乳动物的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述核酸是鼠类的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，包含图5的序列(SEQ ID NO6)。
8.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述核酸是人类的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸分子，其中所述核酸包含图1或者图3的序列(分别为SEQID NO2和4)。
10.一种分离的核酸分子，它编码一种多肽分子或其具有PDGF-C生物学活性的类似物或片段，该多肽分子的氨基酸序列与图2(SEQ ID NO3)、图4(SEQ ID NO5)中的氨基酸序列至少具有85％相同性。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中的氨基酸序列的相同性是至少90％。
12.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中的氨基酸序列的相同性是至少95％。
13.一种分离的核酸分子，它编码的多肽分子的氨基酸序列包括以下的氨基酸序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQID NO1)。
14.一种载体，包括权利要求1所述的核酸，该核酸与一段启动子序列可操纵相连。
15.根据权利要求14所述的载体，其为真核载体。
16.根据权利要求14所述的载体，其为原核载体。
17.根据权利要求14所述的载体，其为质粒。
18.根据权利要求14所述的载体，其为杆状病毒载体。
19.一种构建表达多肽或多肽的具有PDGF-C生物学活性的类似物或片段的载体的方法，其中所述多肽的氨基酸序列与图2(SEQID NO3)或图6(SEQ ID NO7)的氨基酸序列至少有85％相同性，所述方法包括将权利要求1、10或者13所述的分离的核酸以与启动子可操纵相连的方式插入所述的载体中。
20.用权利要求14的载体转化或者转染的一种宿主细胞。
21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为真核细胞。
22.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为COS细胞。
23.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为原核细胞。
24.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为293EBNA细胞。
25.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为昆虫细胞。
26.一种用载体转化或者转染的宿主细胞，所述载体包含与一启动子可操纵相连的权利要求1所述核酸序列，从而所述的宿主细胞表达一种多肽或其具有PDGF-C生物学活性的类似物或片段，该多肽的氨基酸序列与图2(SEQ ID NO3)或图6(SEQ ID NO7)中的氨基酸序列具有至少85％的相同性。
27.一种分离的多肽或其具有PDGF-C生物学活性的类似物或片段，该多肽具有与图2(SEQ ID NO3)或图6(SEQ ID NO7)的氨基酸序列至少85％相同性的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的分离的多肽，其为鼠多肽。
29.根据权利要求27所述的分离的多肽，其为人类多肽。
30.根据权利要求27所述的分离的多肽，其具有刺激和/或增强表达PDGF-C受体的细胞的增殖和/或分化和/或生长和/或运动的能力。
31.一种由一种多核苷酸表达产生的分离的多肽，所述多核苷酸包含与图1、图3或者图5(SEQ ID NO2、4或6)的序列具有至少85％相同性的多核苷酸序列，或者所述多核苷酸是在严格条件下与上述的至少一条DNA序列杂交的多核苷酸。
32.一种分离的多肽，包括以下的特征性序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQ ID NO1)。
33.一种分离的多肽二聚体，包含权利要求27所述的多肽。
34.根据权利要求33所述的多肽二聚体，其为所述多肽的同二聚体。
35.根据权利要求33所述的多肽二聚体，其为所述多肽与VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF形成的异二聚体。
36.根据权利要求33所述的多肽二聚体，其为二硫键连接的二聚体。
37.一种药物组合物，包含促进细胞增殖有效量的 27、31或者32所述的多肽，以及选自VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或PlGF中的至少一种其它生长因子。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，还包含肝素。
39.一种药物组合物，包含促进细胞增殖有效量的 27、31或者32所述的分离的多肽，以及至少一种药物载体或者稀释剂。
40.一种药物组合物，包含刺激PDGF受体量的的 27、31或者32所述的分离的多肽，以及至少一种药物载体或者稀释剂。
41.一种药物组合物，包含刺激结缔组织或者创伤愈合有效量的权利要求27、31或者32所述的分离的多肽，以及至少一种药物载体或者稀释剂。
42.一种在测试样品中扩增权利要求1所述的多核苷酸的装置，所述装置包含与权利要求1所述的核酸互补的至少一对引物。
43.一种在测试样品中扩增权利要求1所述的多核苷酸的装置，所述装置包含一种聚合酶和与权利要求1所述的核酸互补的至少一对引物，用于通过聚合酶链式反应扩增多核苷酸以便于将该多核苷酸与权利要求1所述的核酸进行比较。
44.一种和权利要求27、31或32所述的多肽特异反应的抗体。
45.根据权利要求44所述的抗体，其是多克隆抗体。
46.根据权利要求44所述的抗体，其是单克隆抗体，或者F(ab’)2、F(ab’)、F(ab)片段或嵌合抗体。
47.根据权利要求45或46所述的抗体，其用可检测的标记物标记。
48.根据权利要求47所述的抗体，其中所述可检测的标记是放射性同位素。
49.一种制备权利要求27、31或者32所述的多肽的方法，该方法包括以下步骤培养用载体转化或者转染的宿主细胞，所述载体包含与启动子序列可操纵相连的编码所述多肽的多核苷酸，从而编码所述多肽的该核酸序列被表达；从所述宿主细胞中或者培养所述宿主细胞的培养基中分离所述多肽。
50.一种刺激哺乳动物的结缔组织生长或者创伤愈合的方法，包括给予哺乳动物有效量的权利要求27、31或者32所述的多肽。
51.一种产生有活性的PDGF-C截短形式的方法，包括表达权利要求69所述的包含编码多肽的多核苷酸的表达载体的步骤。
52.一种调节PDGF-C的受体结合特异性的方法，包括如下步骤表达包含编码如权利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表达载体；并提供蛋白酶解量的至少一种酶，用以对表达的多肽进行处理，得到PDGF-C的活性截短形式。
53.一种选择性激活具有生长因子活性的多肽的方法，包括如下步骤表达一种表达载体，该表达载体包含一种多核苷酸，该多核苷酸编码具有生长因子活性的多肽、CUB结构域和多肽与CUB结构域之间的蛋白酶切位点；并提供蛋白酶解量的至少一种酶，用以对表达的多肽进行处理，得到具有生长因子活性的活性多肽。
54.根据权利要求27、31和32所述的分离的多肽，其包含具有氨基酸序列RKSR或者其结构保守氨基酸序列的蛋白酶切位点。
55.根据权利要求10所述的核酸分子，该核酸分子编码的多肽包含氨基酸序列为RKSR或者其结构保守氨基酸序列的蛋白酶切位点。
56.一种分离的异二聚体，其包含VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性单体和与一个CUB结构域相连的PDGF-C活性单体。
57.一种分离的异二聚体，其包含PDGF-C活性单体和与一个CUB结构域相连的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性单体。
58.根据权利要求56所述的异二聚体，进一步包含在活性单体与CUB结构域之间的蛋白酶切位点。
59.根据权利要求57所述的异二聚体，进一步包含在活性单体与CUB结构域之间的蛋白酶切位点。
60.一种分离的多核苷酸，其包含与图1、图3或图5(SEQ IDNO2、4或6)的序列至少有85％相同性的多核苷酸序列，或者与至少一种所述DNA序列在严格条件下杂交的多核苷酸。
61.一种增强哺乳动物成纤维细胞有丝分裂的方法，包括对哺乳动物施用促进哺乳动物的有丝分裂有效量的如权利要求27、31或32所述的多肽。
62.一种诱导PDGF-α受体活化的方法，包括加入刺激PDGF-α受体的量的如权利要求27、31或32所述的多肽。
63.一种抑制哺乳动物中表达PDGF-C的肿瘤的肿瘤生长的方法，包括对所述的哺乳动物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗剂。
64.一种鉴定人类肿瘤特定类型的的方法，包括获取肿瘤样品，以及检测其PDGF-C表达的步骤。
65.根据权利要求64所述的方法，其中特定的肿瘤类型为绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、巨核细胞白血病、肺癌和红白血病。
66.一种鉴定PDGF-C拮抗剂的方法，包括如下步骤将基本纯化的PDGF-C活化截短形式制备物与检测试剂混合；和利用任何适当的方式监测对PDGF-C生物学活性的抑制。
67.一种鉴定PDGF-C拮抗剂的方法，包括如下步骤将基本纯化的全长PDGF-C制备物与检测试剂混合；和利用任何适当的方式监测对CUB结构域从PDGF-C中的裂解的抑制。
68.根据权利要求27所述的分离的多肽，其中所述的细胞为内皮细胞、结缔组织细胞、肌成纤维细胞或者神经胶质细胞。
69.一种构建载体的方法，该载体表达一种多肽，该多肽包含与图2(SEQ ID NO3)或图6(SEQ ID NO7)的第230至345位氨基酸残基有至少85％相同性的氨基酸序列，所述方法包括将编码所述氨基酸残基的分离的核酸分子以与启动子可操纵相连的方式插入所述载体。
70.根据权利要求46所述的抗体，其中所述的单克隆抗体是人源抗体。
71.一种制备PDGF-C的活化截短形式的方法，该方法包括将包含编码如权利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表达载体进行表达；并提供蛋白酶解量的至少一种酶，用以对表达的多肽进行处理，得到PDGF-C的活化截短形式。
72.一种在肿瘤细胞侵袭正常细胞群体过程中抑制组织转型的方法，包括对哺乳动物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗剂。
73.一种治疗哺乳动物纤维变性症状的方法，包括对哺乳动物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗剂。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述的纤维变性症状在肺、肾或者肝中发现。
全文摘要
本发明涉及生长因子PDGF/VEGF家族的一个新成员,PDGF－C,还涉及其编码核苷酸序列,其生产方法,其抗体或其他拮抗剂,表达其的转染或转化的宿主细胞,含有其的药物组合物,及其在医药和诊断方面的应用。
文档编号A61P17/00GK1330664SQ99811565
公开日2002年1月9日 申请日期1999年9月30日 优先权日1998年9月30日
发明者乌尔夫·埃里克松, 卡琳·奥瑟, 李旭日, 安尼卡·蓬滕, 马尔科·于特拉, 卡里·阿利塔洛, 阿恩·厄斯特曼, 卡尔－亨里克·黑尔丁, 克里斯特·贝茨霍尔茨 申请人:路德维格癌症研究所, 莱森希亚有限公司