专利名称：金黄色葡萄球菌肠毒素在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗艾滋病的药物，具体地说是金黄色葡萄球菌肠毒素在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用。
背景技术：
艾滋病是由人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染引起的，导致被感染者免疫功能的部分或全部丧失，继而发生机会性感染、肿瘤等疾病。HIV侵入人体后主要攻击的是一种带有CD4的淋巴细胞(T4淋巴细胞)，这种细胞是免疫系统的基本组成部分，HIV通过大量、不断地复制与释放，导致T4淋巴细胞大量死亡，使人体内的T4淋巴细胞明显减少，感染者免疫功能受到严重破坏，造成免疫缺陷；临床表现为各种机会性感染与肿瘤。HIV一旦进入人体，这个人就成为HIV的感染者，先是处于潜伏期，以后可逐渐发展成为艾滋病病人；处于潜伏期限的感染者免疫功能没有受到严重破坏，因而没有明显的临床症状。从HIV感染者到艾滋病病人这段时间的长短与感染者的年龄、生活条件、生理状况、感染病毒的类型等多种因素有关，短则几个月，长者20年以上；当感染者的免疫系统遭到一定程度的破坏(检查发现T4淋巴细胞计数显著下降，CD4/CD8淋巴细胞计数比值≤1)，可出现一系列的临床症状(如发生各种细菌、真菌、病毒的感染及肿瘤的发生)，就发展成为艾滋病人；人一旦受到HIV病毒的感染将终身携带该病毒，因此HIV携带者和艾滋病病人都能传播病毒。
目前尚无可根治HIV感染的药物，也没有证据表明人体会对HIV产生保护性免疫，因此大多数病人会死于反复的继发感染及肿瘤，但早期治疗预防可延缓病程的发展，提高生活质量；HIV感染者可定期检测T4淋巴细胞计数(下常值为500～1600/微升，T4/T8比值为(1.5～1.7)∶1)，当T4淋巴细胞计数≥200/微升时，可按免疫功能正常情况对感染者进行处理。目前临床上常用的治疗方法有以下三个方面(1)抗病毒治疗如用叠氮胸苷(AZT)、双脱氧胞苷(DDC)等到，目前国际上认为联合用药效果好，但费用昂贵，一般发展中国家的感染者难以承受。(2)各种机会性感染和肿瘤的处理由于HIV感染者免疫功能异常，发生感染时往往病情较重，难以控制，加上感染导致肝、肾功能不全，使用药物治疗时还要注意HIV感染者容易出现药物的毒副作用或过敏反应。(3)支持疗法以提高机体的免疫力为主要目的，同时要重视心理治疗和营养疗法。
随着社会的发展，艾滋病越来越严重威胁着人们的健康，尤其是我国，艾滋病的发病呈现一个上升趋势；从目前世界范围来看，用于治疗艾滋病的药物大多为人工合成的化学物质，而且价格昂贵，给社会和病人造成了沉重的负担。
肠毒素的分子量为28000D～30000D，具有耐热、稳定的特性；从血清分类学看，肠毒素是一类金黄色葡萄球菌分泌的肠外蛋白，可被分为A、B、C1、C2、D、E和F几种类型，这些蛋白都可以引起人们的食物中毒，其中肠毒素F又称为中毒性休克因子(TSST-1)，人体服用了被肠毒素污染的食品2～6小时内，即可出现呕吐、腹泻等症状；从其结构上看，各个类型的肠毒素蛋白分子量都相近似，在分子中都有一个二硫键的环，易溶于水和盐的溶液，相对于其它蛋白来源，它们较耐热，可抵抗蛋白酶的作用；由于它们具有较高的类似性，所以具有相同的临床症状，如发热、血压升高，中毒的症状；肠毒素的性质如表1所示。
表1.金黄色葡萄球菌肠毒素的生理性质
参考文献a.Schantz，E.J.，Roessler，W.G.，Woodburn，M.J.，Lynch，J.M.，Biochemistry11，360，1972.
b.Sdhntz，E.J.，Roessler，W.G.，Wogman，J.，Spero，L.，Biodhemistry4，1011，1965.
c.Borja，C.R.，Bergdoll，M.S.，Biochemistry 6，1467(1967).
d.Abena，R.M.，Bergdoll，M.S.，Biochemistry 6，1474(1967).
e.Chang.P.C.，Bergdoll，M.S.，Biochemistry 18，1937(1979).
f.Borja，C.R.，Ffanning，E.，Huang，I.Y.，Bergdoll，M.S.，J.，Biol.Chem.247，2456，1972.
在SEA、SEB、SEC1、SEC2和SEE中赖氨酸天门冬氨酸和酪氨酸的含量较高，SEA和SEE中，甲硫氨酸、亮氨酸和精氨酸的含量基本一致，在这一点上它们不同于SEB、SEC1和SEC2；SEB是由此239个氨基酸组成的，在第92个氨基酸和第112个氨基酸之间形成一个二硫键，其它的肠毒素也有这一结构；肠毒素的氨基酸序列分析和免疫交叉反应表明肠毒素可以分为两类SEA，SEE和SED一类，SEC和SEB为另一类，氨基酸序列表明SEA和SEE的序列基本相同，而SEC和SEB序列基本相同。结果如表2、表3所示。
表2.肠毒素中的氨基酸序列
参考文献Iandolo，J.J.，Annu.Rev.Microhiol.，43，375，1989.
表3.肠毒素中氨基酸的组成(100g)蛋白中的含量
参考文献*Schantz et al，1972+Bergdoll，M.S.，Chu，F.S.Huang，I.Y，Rowe，C.，Shih，T.，ArchBiochphys，112，104，1965++Huang，I.Y，Shih，T.Borja，C.R.Avena，R.M.，Bergdou，M.S.，Biochemistry，6，1480，1967t$Borja et al，1972发明内容本发明的目的是提供金黄色葡萄球菌肠毒素的新用途，即在治疗或预防艾滋病药物中的应用。
据推测肠毒素是通过影响肠中的呕吐受体来发挥作用的；这些毒素也能刺激H淋巴细胞的有丝分裂，及淋巴因子、溶血素和血清蛋白酶的产生，已知通过肠毒素所诱导的细胞因子有干扰素、肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-2等。而且这些毒素也可以抑制免疫反应，增加自然细胞的细胞毒性，诱导发烧和高血压的产生；金黄色葡萄球菌肠毒素也是效力最强的T细胞的有丝分裂源，如SEA在浓度为10-13-10-16M的条件下，即可引起T细胞的增殖，所有的肠毒素都可引起CD4和CD8值的增加，而这些有丝分裂源的活性是通过组织相容性分子II的抗原得以限制的；此外这一类物质的生理活性包括它们的有丝分裂作用，及所诱导产生的干扰素，白介素和肿瘤坏因子的活性，而且这些所有的细胞因子都能诱导产生发热和休克。
本发明采用的技术方案为所用的抗原(肠毒素)是从金黄色葡萄球菌的发酵液中分离提取得到的，其为SEA、SEB、SEC1、SEC2和SED；作为药用金黄色葡萄球菌的发酵液提取物中肠毒素的含量应大于等于95％；其中肠毒素以口服方式给药，剂量为每日15～90ng。
本发明具有如下优点金黄色葡萄球菌肠毒素给病人服用后，能明显提高病人的抗病毒能力，显著提升CD4/CD8的比值。
具体实施例方式
实施例1金黄色葡萄球的培养与发酵液的分离方法一般来说，分离纯化肠毒素的步骤比较复杂，其制备按以下步骤进行1)菌种的复苏采用产生金黄色葡萄球菌肠毒素的A、B、C1、C2、C3、D及TSST-1的标准菌株，在LB琼脂科面上培养复苏，37℃培养20小时，LB培养基配方如下0.5～1％胰蛋白胨，0.1～0.5％酵母浸出物，0.1～0.5％氯化钠；2)接种无菌操作，将复苏菌种接种于300mlLB液体培养基中，37℃振荡20小时培养4℃保存作为种子液，保存时间不超过48小时；3)扩大培养于细菌发酵罐培养液中，配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分，冷却至37℃后按5％量将种子液转种于发酵罐培养液中，80％溶氧量，PH6.0～7.8连续发酵20小时；4)收集上清液4℃离心30分，弃菌体，收集上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
实施例2金黄色葡萄球菌肠毒素A的纯化1)分子截留浓缩；将收集的上清液用10KD的膜超滤浓缩，并用0.008～0.15M磷酸钠缓冲液(PH6.0)清洗平衡，最终收集此浓缩液15～25ml，每毫升含肠毒素5～10mg；2)离子交换分离用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.0)平衡羧甲基纤维素柱，将上述浓缩液泵入柱中，用8mM磷酸钠缓冲液(PH6.0)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸钠缓冲液(PH6.0)梯度洗脱肠毒素，将洗脱下的肠毒素液的PH值调至5.7，用用羟基磷灰石柱再次分离，用8mM磷酸钠缓冲液(PH5.7)清洗平衡磷灰石(1g/3.5)装柱，用30mM磷酸钠缓冲液(PH5.7)清洗24小时后，将上一步骤洗脱下的肠毒素液泵入柱中，用0.2M磷酸钠缓冲液(PH7.5)洗脱杂质蛋白，用0.2M和0.4M磷酸钠缓冲液(PH5.7)梯度洗脱收集肠毒素蛋白，洗脱后用10KD的膜超滤浓缩肠毒素；3)分子筛纯化用含1M无机盐(例如磷酸盐)的0.5M缓冲液(例如磷酸缓冲液)(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱20小时，将5％柱体积的浓缩肠毒素洗脱液泵入柱中，用0.05M钠缓冲液(PH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，可获得肠毒素A的纯度大于99％，-20℃下冻存。
实施例3金黄色葡萄球菌肠毒素B的纯化1)分子截留浓缩；将收集的上清液用分子量10KD的膜超滤浓缩，并用0.008～0.15M磷酸钠缓冲液(PH6.0-6.2)清洗平衡，最终收集50～100ml浓缩液，每毫升含肠毒素5～10mg；2)离子交换分离用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.2)平衡羧甲基纤维素柱，将上述浓缩液泵入柱中，用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.2)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.02M和0.07M磷酸钠缓冲液(PH6.0～6.8)梯度洗脱肠毒素，洗脱液用10KD的膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐(例如磷酸盐)的0.5M磷酸钠缓冲液(PH6.8)平衡；3)分子筛纯化用含0.5M磷酸钠(PH6.8)的缓冲液平衡SepheroxyLS-200柱20(15～25)小时，将5％柱体积的浓缩液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(PH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，可得纯度大于或等于95％肠毒素B，-20℃下冻存。
实施例4金黄色葡萄球菌肠毒素C1的纯化1)分子截留浓缩；将收集的上清液用分子量10KD的膜进行超滤浓缩，并用0.05～0.3M磷酸钠缓冲液(PH5.5)清洗平衡，最终收集50～100ml浓缩液，每毫升含肠毒素5～10mg；2)离子交换分离用0.1M磷酸钠缓冲液(PH5.5)平衡羧甲基纤维素柱，将上述浓缩液泵入柱中，用0.1M磷酸钠缓冲液(PH5.5)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.02M磷酸钠缓冲液(PH6.0)分级梯度洗脱，肠毒素用0.06M磷酸钠缓冲液(PH6.8)洗脱，洗脱液用10KD的膜超滤浓缩，并用0.5M磷酸钠缓冲液(PH6.8)平衡；3)分子筛纯化用0.5M磷酸钠的缓冲液(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱20小时，将5％柱体积的浓缩液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(PH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，可得纯度大于或等于98％肠毒素SEC1、SEC3，-20℃下冻存。
实施例5金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯化
1)分子截留浓缩；将收集的上清液用分子量10KD的膜进行超滤浓缩，并用0.01～0.05M磷酸钠缓冲液(PH5.4)清洗平衡，最终收集50～100ml浓缩液，每毫升含肠毒素5～10mg；2)离子交换分离用20mM磷酸钠缓冲液(PH5.4)平衡羧甲基纤维素柱，将上述浓缩液泵入柱中，用20mM磷酸钠缓冲液(PH5.4)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.06M磷酸钠缓冲液(PH6.7)洗脱肠毒素，洗脱液用膜超滤浓缩，并用5mM磷酸钠缓冲液(PH5.8)清洗平衡羧甲基纤维素柱，将上一步骤洗脱下的肠毒素液泵入柱中，用5mM磷酸钠缓冲液(PH5.8)洗脱杂质蛋白，用0.005M和0.05M磷酸钠缓冲液(PH5.8)梯度洗脱肠毒素蛋白，洗脱液用10KD的膜超滤浓缩，并用0.5mM磷酸钠缓冲液(PH6.8)平衡；3)分子筛纯化用0.5M磷酸钠的缓冲液(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱，将5％柱体积的浓缩液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(PH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，可得纯度大于或等于95％肠毒素SEC2，-20℃下冻存。
实施例6金黄色葡萄球菌肠毒素D的纯化1)分子截留浓缩；将收集的上清液用分子量10KD的膜超滤浓缩，并用0.04～0.15M磷酸钠缓冲液(PH6.0-6.2)清洗平衡，最终收集50～100ml浓缩液，每毫升含肠毒素5～10mg；2)离子交换分离用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.2)平衡羧甲基纤维素柱，将上述浓缩液泵入柱中，用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.2)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.03M和0.08M磷酸钠缓冲液(PH6.0～6.8)梯度洗脱肠毒素，洗脱液用10KD的膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(PH6.8)平衡；3)分子筛纯化用含0.5M磷酸钠(PH6.8)的缓冲液平衡SepheroxyLS-200柱20小时，将5％柱体积的浓缩液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(PH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，可得纯度大于或等于95％肠毒素D，-20℃下冻存。
实验例通过上述方法所得到的肠毒素，制成5～10ng的制品，给艾滋病人服用(口服)，一日三次，一个月后，T细胞亚群的检查比较如下1.服用SEA后，治疗前及治疗后T细胞亚群检查的比较(X±S)
2.服用SEB后，治疗前及治疗后T细胞亚群检查的比较(X±S)
3.服用SEC1后，治疗前及治疗后T细胞亚群检查的比较(X±S)
4.服用SEC2后，治疗前及治疗后T细胞亚群检查的比较(X±S)
5.服用SED后，治疗前及治疗后T细胞亚群检查的比较(X±S)
从表1～5可知，金黄色葡萄球菌肠毒素在给病人服用后，能明显提高病人的抗病毒能力，显著提升CD4/CD8的比值。
权利要求
1.金黄色葡萄球菌肠毒素在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用。
2.一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素在治疗艾滋病药物中的应用，其特征在于其中所述肠毒素是从金黄色葡萄球菌的发酵液中分离提取得到的，其为SEA、SEB、SEC1、SEC2和SED。
3.一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素在治疗艾滋病药物中的应用，其特征在于其中所述肠毒素其中肠毒素的含量应大于等于95％。
4.一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素在治疗艾滋病药物中的应用，其特征在于其中肠毒素以口服方式给药，剂量为每日15～90ng。
全文摘要
本发明涉及治疗艾滋病的药物，具体地说是金黄色葡萄球菌肠毒素在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用，其为SEA、SEB、SEC
文档编号A61P31/18GK1509762SQ0215692
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者陈巨余 申请人:沈阳协合集团有限公司