稠合的吡咯化合物在治疗关节软骨或软骨下骨组织退化中的用途的制作方法

专利名称：：稠合的吡咯化合物在治疗关节软骨或软骨下骨组织退化中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及稠合吡咯化合物、尤其是ML3000、其盐或衍生物的用途，其在哺乳动物中作为治疗和预防所述哺乳动物炎症关节中的软骨和/或软骨下骨组织破损和损耗的手段。这种对软骨和/或软骨下骨组织的损伤是骨性关节炎发生在哺乳动物身上时自然产生的发展后遗症和结局。获得这种意想不到的效果的能力被称之为“软骨保护作用”。
背景技术：
：非甾类抗炎药(NSAIDs)如乙酰水杨酸盐(ASA)、双氯芬酸、吲哚美辛、布洛芬和萘普生在临床中被广泛应用。从药理学观点出发，它们扮演环加氧酶(COX)抑制剂的角色。药理学作用相近的吡咯里嗪(pyrrolizine)类化合物已经从大量的出版物中获知。例如，具有消炎活性的吡咯里嗪类化合物在Arch.Pharm.319，65-69(1986)；319，231-234(1986)；318，661-663(1985)；318，663-664(1985)；319，500-505(1986)；319，749-755(1986)；327，509-514(1994)；330，307-312(1997)以及J.Med.Chem.1987，30，820-823和1994，37，1894-1897中述及。其它吡咯里嗪类化合物可从US5,260,451(对应于EP0397175)以及WO95/32970、WO95/32971和WO95/32972中获知。这些化合物的结构式如下并且都具有稠合的二芳基吡咯部分以及第三酸性残基R3。这些化合物的特征在于亲脂性高、生物利用度良好和半衰期适中，参见DrugsoftheFuture，1995，20(10)1007-1009。DE19845446.6和WO01/05792描述了其它结构相似的吡咯里嗪类化合物。此外，根据US4,232,038，烷基亚磺酰基苯甲酰基和烷基磺酰基苯甲酰基取代的吡咯里嗪类化合物据说具有抗炎、止痛、解热特性。根据DE19624290.8和DE19624289.4，这种类型的某些化合物具有降脂作用。式(Ia)的ML3000([2，2-二甲基-6-(4-氯苯基)-7-苯基-2，3-二氢-1H-吡咯里嗪-5基]-乙酸)是一种非抗氧化剂平衡的、COX和5-脂加氧酶(5-LO)的双重抑制剂(3)。该药物是COX的非选择性抑制剂，同时抑制COX-1和COX-2。这种药物具有止痛、解热和抗炎活性，且已证实其在许多动物模型、包括角叉菜胶诱导的大鼠足趾水肿模型和大鼠佐剂性关节炎模型中具有强效抗炎活性(4)。骨性关节炎(OA)是最常见的肌肉骨骼病。它主要影响负重的动关节性关节如胯和膝，也影响其它关节如指节间关节和脊柱。这种疾病的结构性改变包括关节软骨的进行性浸蚀、骨赘的形成以及在疾病临床阶段中出现的不同程度的滑膜炎。与这些改变相关的还有软骨下骨组织的显著重构，根据若干研究可知，该重构是疾病早期阶段的过度骨重吸收，随之而来的是过度骨形成，导致骨硬化和软骨下骨组织增厚加剧。导致在骨性关节炎(OA)中所见的结构改变的发生和发展的机制是多重的和复杂的，且在很大程度上是未知的。它们不仅涉及软骨，其中可观察到许多形态学改变，而且涉及滑膜，那里是各种程度和严重性的炎症反应发生的场所(1)。据信，有许多途径导致了软骨基质的分解代谢，包括可溶性因子例如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和前列腺素的上调，而软骨基质的分解代谢可诱发骨关节软骨的丧失。对软骨细胞的直接损伤也刺激了基质金属蛋白酶如胶原酶、溶基质素和明胶酶的活性(MMP)，并刺激各种炎症介质的产生(2)。必须考虑的是代谢过程在任何给定的关节中均持续发生，其对于继关节承受损伤如跌打损伤后的修复和正常化是必须的。因此，一种化合物要成为可接受的软骨保护剂，首先必须能够维持这种软骨细胞代谢的活性，即不能抑制或干扰细胞复制和基质成分的生物合成，这是治愈过程的一部分。在这方面，熟练的技术人员将认识到许多NASID对细胞外基质的主成分的生物合成显示明显的抑制作用。同时，可接受的软骨保护剂必须能够抵抗介质对软骨的降解作用，所述介质如各种细胞因子、前列腺素和蛋白酶。相应的，本领域内已认同潜在的软骨保护药物应该从其对合成代谢途径的积极作用以及其抑制分解代谢过程的能力两方面进行评估。通常检测的分解代谢包括、尤其是溶基质素的释放和抑制、对前列腺素和白三烯生物合成的影响以及药物抑制IL-1介导的关节软骨降解的能力。大量的具有针对抑制COX酶活性的药物如非甾体抗炎剂，已经使用多年。尽管它们可有效地减轻骨性关节炎的症状如疼痛，但是它们在减轻实验性OA的体内进程方面的作用有限(8，9)。虽然用同时具有环加氧酶-1(COX-1)和COX-2抑制作用的两种NASID替尼达普和卡布洛芬进行治疗显示出抗OA的作用(8，9)，但其它NASID如双氯芬酸或ASA是无效的(10)或甚至被证实加速了OA实验性狗模型中的软骨损伤(11)。同样，在人体中，对膝OA患者的近期研究已证实基于X射线标准，用另一种非甾体抗炎剂苯噻丙酸进行治疗，5年内不能延缓软骨损伤的进展，用吲哚美辛甚至加速其进程(15)。令人惊讶的是，已发现某些稠合的吡咯化合物如ML3000，可显著减少实验性狗OA的损伤的发生。这些化合物的保护作用在减少软骨损伤的发展方面尤其显著。这种现象不仅与PGE2和LTB4生成的明显抑制相关，而且与涉及软骨退化的两种主要分解代谢因子即IL-1β和胶原酶-1的原位减少相关。发明概述因此，本发明涉及通式(I)代表的稠合吡咯化合物及其光学异构体、生理可接受的盐和衍生物用于治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损伤的用途其中X代表CR8R9、S、O、NR12或C(O)；A代表CR10R11或X与带有残基R6和R7的原子之间的键；基团R1、R2、R3的其一代表任选被一个或多于一个取代基取代的芳基，取代基独立地选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷氧基、烷硫基、羟基、硝基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基、N-烷基氨磺酰基、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；或代表芳香族或非芳香族的、单或二环的、任选苯并稠合的杂环基，其具有1、2或3个独立地选自N、O和S的杂原子且任选被一个或多于一个取代基取代，取代基独立地选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷氧基、烷硫基、羟基、硝基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基、N-烷基氨磺酰基、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基团R1、R2、R3的其二代表任选被一个或多于一个取代基取代的烷基，取代基独立地选自卤素、环烷基、烷氧基、三氟甲氧基、羟基和三氟甲基；任选被一个或多于一个取代基取代的环烷基，取代基独立地选自卤素、烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、卤代烷氧基和羟基；任选被一个或多于一个取代基取代的芳基，取代基独立地选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷氧基、烷硫基、羟基、硝基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基、N-烷基氨磺酰基、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；或芳香族或非芳香族的、单或双环的、任选苯并稠合的杂环基，其具有1、2或3个独立地选自N、O和S的杂原子且任选被一个或多于一个取代基取代，取代基独立地选自卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷氧基、烷硫基、羟基、硝基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基，N-烷基氨磺酰基、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基团R1、R2、R3的其三代表H、烷基、卤代烷基、羟基烷基、-CHO、-COOH、卤素、氰基、烷基磺酰基、氨磺酰基或B-Y，其中B代表任选被羟基或烷氧基取代的亚烷基或亚烯基；Y代表-COOH、SO3H、OPO(OH)2、OP(OH)2、-CHO或四唑基；或基团R1、R2、R3的其二和其三与和它们相连的原子一起代表饱和或不饱和的环烷基；R4至R11可以相同或不同，其代表氢、烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、羟基、COOH或酰氧基，其中相邻基团也可以代表价键或偕二基团，和与它们相连的碳原子一起也可以代表羰基或环烷基；R12代表氢、烷基或苯基。术语“烷基、烷氧基等”包括直链或支链烷基如CH3、C2H5、正丙基、CH(CH3)2、正丁基、CH(CH3)-C2H5、异丁基、C(CH3)3、正戊基或正己基，尤其是CH3、C2H5或CH(CH3)2，除非另外指明，优选具有1至8个碳原子、特别是1至6个碳原子且更优选1至4个碳原子；作为基团R1至R12的取代基，“烷基、烷氧基等”优选含有1至4个碳原子。取代的“烷基、烷氧基等”尤其包括卤代烷基，即部分或全部被氟、氯、溴和/或碘取代的烷基，例如CH2F、CHF2、CF3、CH2CI、2-氟乙基、2-氯乙基或2，2，2-三氟乙基；作为基团R1至R12的取代基，卤代烷基优选表示CHF2，特别是CF3；卤代烷氧基，即部分或全部被氟、氯、溴和/或碘取代的烷氧基，例如对应于前述卤代烷基残基的卤代烷氧基残基；作为基团R1至R12的取代基，卤代烷氧基优选表示OCHF2，特别是OCF3；烷氧基烷基，即被烷氧基取代的烷基，例如-CH2-OCH3或2-甲氧基乙基；羟基烷基，即被羟基优选单取代的烷基，例如羟甲基或2-羟乙基；三氟甲基烷基，即被三氟甲基优选单取代的烷基，例如羟基烷基中所述的、被三氟甲基而不是被羟基取代的残基；三氟甲氧基烷基，即被三氟甲氧基优选单取代的烷基，例如羟基烷基中所述的、被三氟甲氧基而不是被羟基取代的残基；环烷基烷基，即被环烷基优选单取代的烷基，例如羟基烷基中所述的、被环丙基、环丁基、环戊基或环己基取代而不是被羟基取代的残基。术语“环烷基”包括单环或双环烷基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等，除非另外指明，优选具有3至9个碳原子、特别是3至7个碳原子且更优选5或6个碳原子。术语“亚烷基”包括直链或支链亚烷基，如亚甲基和亚乙基，除非另外指明，优选具有1至8个碳原子、特别是1至6个碳原子且更优选1至4个碳原子。如果亚烷基被羟基或烷氧基取代，优选单取代。术语“亚烯基”包括直链或支链、单或多不饱和亚烷基，如亚乙烯基，除非另外指明，优选具有2至8个碳原子、特别是2至6个碳原子且更优选2至4个碳原子。如果亚烯基被羟基或烷氧基取代，优选单取代。酰氧基指的是-OCOR，其中R代表烷基或芳基。优选的实例有乙酰氧基和苯甲酰氧基。-COO烷基指的是烷氧基羰基，如CO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH2-C2H5、CO-OCH(CH3)2、正丁氧羰基、CO-OCH(CH3)-C2H5、CO-OCH2-CH(CH3)2、CO-OC(CH3)3，尤其是CO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH(CH3)2或CO-OCH2-CH(CH3)2。-COO烷基苯基指的是烷基部分被苯取代的烷氧基羰基，如苯氧基羰基。烷硫基指的是-S-烷基，也被称作烷基硫基或烷基巯基，如SCH3、SC2H5、SCH2-C2H5、SCH(CH3)2、正丁基硫基、1-甲基丙基硫基、2-甲基丙基硫基、SC(CH3)3。优选甲硫基。烷基亚磺酰基指的是-S(O)-烷基，也被称作烷基氧化硫(sulfoxo)，如SO-CH3、SO-C2H5、正丙基亚磺酰基、1-甲基乙基亚磺酰基、正丁基亚磺酰基、1-甲基丙基亚磺酰基、2-甲基丙基亚磺酰基、1，1-二甲基乙基亚磺酰基。优选甲基亚磺酰基。烷基磺酰基指的是-S(O)2-烷基，也被称为烷基砜，如SO2-CH3、SO2-C2H5、正丙基磺酰基、SO2-CH(CH3)2、正丁基磺酰基、1-甲基丙基磺酰基、2-甲基丙基磺酰基、SO2-C(CH3)3。优选甲基磺酰基。氨磺酰基指的是-S(O)2NH2，也被称为氨基磺酰基或者磺酸酰胺。N-烷基氨磺酰基指的是单取代的氨磺酰基-S(O)2NH-烷基，例如-S(O)2NH-CH3。N，N-二烷基氨磺酰基指的是二取代的氨磺酰基-S(O)2N-(烷基)2，其中N上连接的烷基残基可以相同或不同，例如-S(O)2N(CH3)2。烷基磺酰氨基指的是-NHS(O)2-烷基，如NHSO2-CH3、NHSO2-C2H5、正丙基磺酰氨基、NHSO2-CH(CH3)2、正丁基磺酰氨基、1-甲基丙基磺酰氨基、2-甲基丙基磺酰氨基、NHSO2-C(CH3)3。优选甲基磺酰氨基。烷基磺酰-N-烷基胺基指的是-N(烷基)S(O)2-烷基，其中N和S上连接的烷基残基可以相同或不同，例如N(CH3)SO2-CH3。羰基、CHO、-COOH、-SO3H分别指的是＞C＝O、甲酰基、羧基、羧基羰基和磺基(sulfo)。“芳基”优选是萘基、尤其是苯基。术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘原子。通常优选氟和氯，有些情况下也优选溴。“杂环残基”尤其包括5-或6-元杂环残基，其可以是芳香族的或非芳香族的、单环或双环的，和/或苯并稠合的。杂环基的实例有含氮杂环残基，如吡咯基、咪唑基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基，特别是吡啶基、嘧啶基和异喹啉基。芳香族残基也包括那些含有氧或硫原子的杂环残基，如噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基和特别地苯并呋喃基。也包括那些含有2个或2个以上不同杂原子的杂环残基，如噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、异噁唑基和噁唑基。噻吩基、吡啶基和噻唑基是优选的芳香族杂环残基。非芳香族残基包括含氮杂环残基，如吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。还包括含有2个或2个以上不同杂原子的杂环残基，例如吗啉基。取代的残基，尤其是烷基、环烷基、芳基和杂芳基，优选为单取代、二取代或三取代的残基。-位稠合物(annelland)可以是六元或特别是五元的杂环基或特别地脂环基，如果是脂环基，那么可以是不饱和的或特别是饱和的，和/或取代或未取代的。式(I)的[α]-稠合的吡咯化合物尤其包括这样一些化合物，其中X代表CR8R9且A代表X与带有R6和R7残基的原子之间的价键(吡咯里嗪类)；X代表CR8R9且A代表CR10R11(中氮茚类)；X代表NR12且A代表X与带有R6和R7残基的原子之间的价键(吡咯并[1，2-a]咪唑类)；X代表S且A代表X与带有R6和R7残基的原子之间的价键(吡咯并[2，1-b]噻唑类)；X代表S且A代表CR10R11(吡咯并[2，1-b]1，3-噻嗪类)；X代表O且A代表CR10R11(吡咯并[2，1-b]1，3-噁嗪类)；X代表O且A代表X与带有R6和R7残基的原子之间的价键(吡咯并[2，1-b]噁唑类)，具有上述含义的未提及的基团。如果[α]-位稠合物是五元不饱和残基，特别的R4和R6代表一个价键，如例如在吡咯里嗪、吡咯并[2，1-b]咪唑和吡咯并[2，1-b]噻唑中的一个价键。如果[a]-位稠合物是六元不饱和残基，特别地R4和R6代表一个价键，如在吡咯并[2，1-b]1，3-噻嗪、吡咯并[2，1-b]1，3-噁嗪或5，6-二氢中氮茚中的一个价键，并且任选地R8和R10也代表一个价键，如例如在中氮茚中的价键。根据本发明的具体实施方案，如果没有连接到特定的[a]-稠合位置，R4至R7可以相同或不同且代表氢或烷基。根据本发明的另一个具体实施方案，基团R4、R5、R6和R7中的至少一个代表羟基烷基，尤其是羟基甲基，且R4、R5、R6和R7中余下的残基独立地代表H或烷基。根据这个实施方案，R4优选是羟基烷基，尤其是羟基甲基，且R5是H或烷基，且R6、R7独立地为H或烷基。根据本发明的另一个具体实施方案，基团R8和R9中的一个代表H、烷基、羟基烷基或烷氧基烷基，且另一个代表羟基、烷氧基、羧基或酰氧基，或R8和R9与和它们相连的C原子一起代表羰基。6，7-二氢-5H-吡咯里嗪类化合物特别有用，如式(I)化合物，其中X代表CR8R9、A代表X与带有R6和R7残基的原子之间的价键，且R4、R5、R6、R7、R8、R9可以相同或不同、具有上述含义且优选代表氢或烷基。特别优选6，7-二氢-5H-吡咯里嗪类化合物，其中R4至R9是氢，或R4至R9中至少一个或两个残基、例如R6和/或R7代表烷基、尤其是甲基。根据本发明的一个重要方面，式(I)化合物特别有用，其中基团R1、R2、R3的其一和其二、优选R1和R2独立地代表一个富Il-电子体系，该体系选自芳基和芳香族杂环残基、优选苯基，任选被一个或多于一个取代基取代，这些取代基尤其独立地选自卤素、烷基和卤代烷基，尤其是CF3，R1优选为未取代的苯基且R2优选为4-取代的苯基。根据本发明的另一重要方面，式(I)化合物特别有用，其中基团R1、R2、R3的其三基团、优选R3代表酸性残基如COOH或B-Y，其中Y为COOH且B优选代表亚烷基，或代表酸性残基的前体如B-Y，其中Y为四唑基。式(la)代表的[6-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-7-苯基-2，3-二氢-1H-吡咯里嗪-5-基]-乙酸(ML3000)其生理可接受的盐和衍生物，例如生理可水解的酯，其用途是特别优选的。生理可接受的盐包括酸或碱加成盐。酸加成盐为例如式(I)化合物与无机酸如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的盐，或与有机酸、尤其是羧酸形成的盐，例如乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、扁桃酸、抗坏血酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸或磺酸，例如甲磺酸、苯基磺酸和甲苯磺酸等。碱加成盐为例如式(I)化合物与无机碱如氢氧化钠或氢氧化钾形成的盐，或与有机碱如单，双或三乙醇胺等形成的盐。生理可接受的衍生物尤其包括式(I)化合物的前药，它们在体内被再转化为式(I)化合物或其活性形式(代谢物)。例如式(I)化合物的可水解的酯，其中基团R1、R2、R3的其三基团代表酸性残基，例如其烷基(包含功能性COO烷基的R1、R2、R3的其三基团)、芳烷基(包含功能性COO烷芳基如COO烷基苯基的R1、R2、R3的其三基团)、新戊酰氧基甲基、乙酰氧基甲基、2-苯并[c]呋喃酮基、2，3-二氢化茚基和甲氧基甲基酯等。根据特殊方面，本申请涉及选自式(I)化合物的软骨保护剂的用途。这里所用的术语“软骨保护剂”可理解为涉及那些主要作用位点是软骨的化合物。还应该理解的是这类软骨保护剂还可具有与滑膜有关的抗炎作用，还可以对软骨下骨组织和其它结缔组织如滑膜成纤维细胞中的细胞生物合成产生积极的影响，且可以调节炎性细胞的迁移以阻止炎性进程。本发明提供了治疗方法、可用于其中的药物组合物以及其适宜的包装，它们可用于那些在一个或多个关节上患有或将来可能患有关节软骨和/或软骨下骨组织损伤、破坏或损耗的哺乳动物。使用式(I)化合物较其它NSAID、特别是那些常用的NSAID具有更突出的优势，后者实际上可加剧骨性关节炎的进程，特别是当长期使用时。令人惊讶的是，式(I)化合物在哺乳动物相关关节中可用于治疗或预防这种关节软骨损伤，同时对炎症进程没有不利的影响。式(I)化合物所具有的扭转最终可导致关节软骨和/或软骨下骨组织损坏和损耗的疾病进程的能力，对于安全且有效地治疗哺乳动物、特别是那些正处于关节软骨和/或软骨下骨组织退化或损坏的早期阶段的哺乳动物具有深远的意义。这里所使用的术语“哺乳动物”指的是任何哺乳动物，优选人类、猫、狗或马，其中存在大量不同的品种。根据本发明，在需要这种治疗的哺乳动物的一个或多个关节治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织损坏和损耗，包括向所述哺乳动物施用对治疗或预防所述关节软骨和/或软骨下骨组织损坏和损耗而言治疗有效量的一种或一种以上式(I)化合物。所述治疗或预防特别包括改善、削弱、积极地治疗、逆转或预防任何关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏，例如损伤、损坏或损耗，特别是随所述变性或破坏的早期阶段而来的变性或破坏。在这里，提及施用本发明的软骨保护化合物所使用的表述“治疗或预防”应该指的是所述施用的治疗性目标以及所述施用实际所取得的治疗结果。如上所讨论，由施用所述化合物所完成的治疗的范围包括疾病过程的改善至显著削弱，且超出疾病的有效治疗范畴，还包括疾病过程的逆转。更高程度的疗效可产生对所述关节软骨和/或软骨下骨组织变性的早期阶段之后的关节软骨和/或软骨下骨组织的任何损伤、损坏或损耗的预防作用。表述“关节软骨和/或软骨下骨组织退化的早期阶段”指的是关节软骨和/或软骨下骨组织的初始病理改变的最开始阶段，其确定并成为疾病发展的结果。软骨是纤维结缔组织，以多种形式存在，例如玻璃样软骨、弹性软骨和纤维软骨。它是包含水、胶原和蛋白聚糖的结缔组织，所述组分可共同形成独特的被纤维强化的水凝胶，其坚硬而又有弹性，且具有显著的吸收震动能力。关节软骨是可见于哺乳动物关节中的软骨。它包含活细胞(软骨细胞)，所述活细胞生成间质物质且被间质物质包绕，间质物质通常被称为细胞外基质。产生软骨细胞外基质的软骨细胞具有高度活性，该基质的完整性由分解代谢的细胞因子IL-1α、β和TNFα与合成代谢的细胞因子IGF和TGFβ的作用之间的平衡维持。IL-1α、β和TNFα通过诱导特定的基质降解金属蛋白酶的生成而发挥作用，而IGF和TGFβ作为生长因子诱导软骨、胶原和蛋白聚糖的大分子构建块的生成。其它细胞因子和它们的抑制剂，以及金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)，也影响这种平衡，该平衡被称为基质自稳态。这里使用的术语“金属蛋白酶”指的是基质金属蛋白酶(MMP)，特指该酶家族中通常在关节软骨退化时表现为浓度增高的酶，即溶基质素、胶原酶和明胶酶。胶原酶通常在天然胶原的降解方面起作用；溶基质素通常在蛋白聚糖的降解中起作用；明胶酶通常在变性胶原的降解中起作用。一种具有MMP特性的酶，即聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)也包含在该术语中，因为它在关节变性早期出现的软骨蛋白聚糖聚合物的蛋白水解中起作用。三种在变性的早期阶段存在于关节软骨中的胶原酶是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)和胶原酶-3(MMP-13)。三种溶基质素是溶基质素-1(MMP-3)、溶基质素-2(MMP-10)和溶基质素-3(MMP-11)，其中只有溶基质素-1在关节软骨变性的早期阶段出现。由于骨性关节炎被定义为动(可活动，滑液内衬)关节性关节的功能障碍，因此断定在这种关节中通常可见至少两个可移动的骨表面，但实际上它们为滑膜所包绕，滑膜分泌滑液，滑液是一种充盈于关节腔的透明的碱性粘液，而插入于两个关节骨表面之间的关节软骨通常取代滑膜的位置。骨性关节炎的最早的总的病理发现是关节表面习惯性负载区域的关节软骨的软化，对哺乳动物的膝关节而言、特别是在涉及膝关节十字韧带横切的骨性关节炎模型中，所述区域由股骨髁和胫骨坪组成。随着骨性关节炎的进展，软骨表面的整合性丧失且关节软骨变薄，出现垂直裂缝，裂缝延伸至软骨深处，称为纤维化过程。关节活动可导致纤维化的软骨脱落碎片，暴露出下面的骨组织(软骨下)，而后经历硬化过程。软骨下囊肿也会发展，被滑液充盈。在关节边缘可形成骨赘(骨刺)。软骨下骨组织的变化也在软骨退化和破坏的病理改变中发挥作用。对已经历前部十字韧带横切的哺乳动物、特别是狗的关节的研究显示软骨下硬化和骨质减少，即软骨下小梁的骨质丢失。随这些变化而来的是软骨下板的增厚。软骨下骨组织的丢失增加了覆盖其上的关节软骨的机械劳损，导致其变性。随之而来的软骨下板的增厚对骨内部的修复机制有负性影响，从而促进了软骨毁坏的进展。软骨细胞外基质的毁坏伴随着软骨细胞的有丝分裂，随后形成簇。软骨的葡糖胺聚糖成分减少且片状蛋白聚糖减少。在许多区域，以增厚致密的平行胶原束的细胞外基质为特征的纤维软骨取代了透明软骨。然而，应注意的是这些和以上描述的关节软骨的病理变化是骨性关节炎的晚期特征，而增厚，即关节软骨的增厚首先发生，如十字韧带缺损哺乳动物、特别是狗的膝关节模型所示。软骨增厚起因于关节软骨中的水含量增多、蛋白聚糖合成增加和蛋白聚糖的含量和浓度的增加。这种关节软骨肥大修复的阶段可持续一段时间，但所形成的修复的软骨组织缺乏正常透明软骨所具有的对机械应激的弹性和阻力。最终，蛋白聚糖的生成减退且软骨细胞不再能够保持其细胞外基质。该最后阶段导致关节软骨的全厚度丧失。导致软骨损伤和损耗的早期病理变化涉及通过增加基质大分子的合成而进行的修复。但修复后软骨的组成是有缺陷的，是因为葡糖胺聚糖组分的组成和分布发生改变，且其与透明质酸组分聚集的能力发生变化。在这些病理改变期间释放的颗粒也会导致滑膜的炎性变化。然而，尽管存在这种病理学的变化，软骨损伤和丢失的初始阶段仍可以是无症状的，相对而言几乎没有疼痛。因此，适当的目标是鉴别那些细胞外基质组分和细胞因子，通过确定其可测量的变化，而在病灶软骨损耗可通过放射线识别前诊断出哺乳动物受试者处于软骨损伤和损耗的早期阶段。达到此目标可在明显的软骨变性发生前对受试哺乳动物进行诊断性分类，以便进行早期药理学干预。所述关节软骨的病理改变包括关节软骨的组成、形式和密度相比所述疾病过程发生前发生的改变，其可导致所述关节软骨的有益特性的退化，包括强度、回弹性、弹性、构造完整性和稳定性、存活力以及成功抵抗不同类型机械应激的能力，特别是吸收机械振荡的能力。这些组成上的病理变化特别包括存在于关节软骨中的葡糖胺聚糖和胶原纤维的类型和数量上的变化。软骨下骨组织的病理改变包括其硬化、密度逐渐增加且回弹性和弹性逐渐降低，以及成功抵抗不同类型的机械应激的能力、特别是吸收机械振荡的能力减弱。这些病理变化特别包括小梁微细裂缝的不适当修复，伴小梁增厚，以及成骨细胞代谢物生成和分化型表型的病理变化。滑膜炎，即滑膜、滑液膜的炎症，可促成软骨损伤和损耗的病理学。滑液炎症的特征在于滑液被单核细胞广泛浸润、滑液膜细胞增生以及淋巴样聚集。滑膜炎在类风湿性和其它炎性关节病变的软骨损伤中起明显作用。滑液炎症在早期OA中的作用所知很少，然而滑膜炎存在于骨性关节炎的临床阶段。根据本发明的一个方面，式(I)化合物的用途涉及治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏，其中所述退化或损坏与骨性关节炎有关。具体而言，所述用途涉及治疗或预防与之相关的病理改变。因此，本发明也涉及骨性关节炎的治疗，其中所述治疗伴随着对关节软骨和/或软骨下骨组织的治疗上有用的影响。治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织退化或损坏还可以包含施用除一种或多于一种式(I)化合物外的一种或多种基本上选自聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、强力霉素和二甲胺四环素的成分。此外，本发明的式(I)化合物也可以与其它治疗活性剂结合，所述其它活性剂对于本领域技术人员是显而易见的，且通常由施用本发明的治疗剂的情形所确定。例如，当关节同时被微生物如细菌、真菌、原生动物、病毒等严重感染时，最好是将本发明的活性剂与一种或多种抗生素、抗真菌药、抗原虫药、抗病毒药或类似治疗剂联合施用。本发明的活性剂也可以与NSAID以及其它炎症介质的抑制剂联合施用。其它类型的这种抑制剂及其实例包括例如H1-受体拮抗剂；激肽B1-和B2-受体拮抗剂；前列腺素抑制剂如PGD-、PGF-PGI2-和PGE-受体拮抗剂；血栓素A2(TXA2)抑制剂；PAF-受体拮抗剂；aurothio基团中的金与各种亲水基团；免疫抑制剂例如环孢霉素、巯唑嘌呤和氨甲喋呤；抗炎糖皮质激素例如地塞米松；广谱抗寄生虫抗生素，例如阿维菌素(avermectin)和米尔倍霉素；青霉胺；羟氯喹；抗通风药例如秋水仙碱，黄嘌呤氧化酶抑制剂例如别嘌醇以及促尿酸制剂例如丙磺舒，苯磺唑酮和苯溴马隆。因为关节软骨变性的早期阶段常见于老年哺乳动物，本领域技术人员认为，也可将式(I)化合物与其它用于治疗老年哺乳动物常见的疾病状态、综合征和症状的活性剂联合施用。这种治疗剂和它们被用于治疗的病症包括，例如对抗记忆丢失和损伤的认知治疗剂，以及抗运动障碍/抗帕金森活性剂，例如司立吉林。另一大类这种治疗剂包括抗高血压药物和其它用于对抗高血压、心肌局部缺血包括心绞痛、充血性心力衰竭和心肌梗塞的心血管药物，例如利尿剂；血管扩张剂如肼苯哒嗪；β-肾上腺素能受体拮抗剂如普萘洛尔；血管紧张素II转换酶抑制剂(ACE抑制剂)如用于治疗患二尖瓣关闭不全的老年哺乳动物的依那普利，且依那普利单独或与中性内肽酶抑制剂联用；血管紧张素II受体拮抗剂如氯沙坦(losartan)；肾素抑制剂；钙通道阻断剂如硝苯地平；交感神经阻滞剂如甲基多巴；α2肾上腺素能激动剂如可乐定；α-肾上腺素能受体拮抗剂如哌唑嗪，以及HMG-CoA-还原酶抑制剂(抗高胆固醇血症药)如洛伐他汀或阿伐他汀。其它类型的这种治疗剂包括用于治疗各种癌症的抗肿瘤药，特别是抗有丝分裂药，包括长春花属生物碱如长春碱和长春新碱；用于治疗肾衰的治疗剂；用于治疗哺乳动物超重问题的减肥药；用于治疗常滋扰哺乳动物的体内和体外寄生虫的抗寄生虫药；以及用于治疗哺乳动物不同类型瘙痒的止痒药。其它可与本发明的抗炎剂联合使用的药物包括生长激素促分泌素；强力止痛药；局部和全身麻醉药；以及H2受体拮抗剂和其它胃保护剂。本领域技术人员将认识到一些上述治疗剂的组合最常用于治疗哺乳动物的各种急性病症，例如与退行性关节疾病同时发生的细菌感染。然而，这些技术人员对治疗哺乳动物的慢性病症方面也具有即使不是更大的也是同样的兴趣。根据用于此目的给药方案，式(I)化合物预计将与其它用于治疗慢性病症如高脂血症的、按常规预定基础使用的药物联合施用。也可以设想联合施用可具有多种不同的形式且仍在本发明的范围内。例如，式(I)化合物可能仅仅与一种或多种其它形成预计组合的治疗剂一起配制成方便的剂型如口服片剂，包含所有形成组合的药物。不同药物的不同半衰期可由本领域技术人员在制备制剂时进行调节，通过生产具有不同释放时间的所述药物的控释形式，从而获得相对均匀的给药过程。以所述剂型使用的药用饲料也可按照制剂领域熟知的原理制得，其中联合使用的药物可仅以混合物的形式共同存在于饲料组合物中。本发明还涉及联合施用，其中药物联合是通过同时施用组合指定药物完成的。这种联合施用甚至可通过不同的剂型和施用途径进行。本发明还涉及根据不同的但却有规律的连续给药计划的这种组合的用途，其中即使构成组合的单个药物不是被同时施用于所述哺乳动物，但相关药物的血浆水平在被治疗哺乳动物中被维持在所需水平。所有这些组合都在本领域的修改和调整的技术范围内。当式(I)化合物被用作本发明的方法和组合物中的活性成分时，可将它们加入标准药物剂型中。这样，本发明也涉及药物组合物，其包含可药用载体和对于治疗或预防所述关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏而言治疗有效量的以上定义的式(I)化合物。例如，当它们以全身或局部、口服或胃肠外制剂施用时是有用的，为此可与常用的药用赋形剂、稀释剂和佐剂联用，例如有机和无机的惰性载体材料如水、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、树胶，聚亚烷基二醇等。这些药物制剂可以固体形式使用，例如以片剂、胶囊和特别地与适合于哺乳动物的美味食物成分联合或混合使用；或它们可以液体形式施用，例如以溶液和酏剂形式施用。可加入的药用赋形剂和佐剂包括防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂和其它稳定剂；润湿、乳化和助悬剂，以及防结块化合物；芳香和着色添加剂；以及增强抗压性或使活性成分延迟、缓释或控制释放的组分；以及用于改变药物制剂的渗透压或作为缓冲剂的各种盐。已成功使用的具体剂型包括静脉内注射用的5％ML3000的混合胶粒溶液、3％的调味糊剂(palatablepaste)和口服片剂。可将如上定义的治疗有效量的式(I)化合物通过全身方式施用于所述哺乳动物，其中所述全身施用包括(1)将含有所述化合物的药物组合物以适当的液体形式如水溶液、乳剂或混悬剂注射或输注至适当的机体组织或体腔中，所述液体形式用于动脉内、皮内或经皮(包括皮下)或经脊柱内、特别是鞘内且更常见用于肌内或静脉内施用，或作为施用储库使用；(2)将含有所述化合物的药物组合物以适当的固体形式滴注至适当的机体组织或体腔中，所述固体形式例如包含生物可相容和生物可侵蚀物质组成的基质，其中具有软骨保护作用的式(I)化合物的固体颗粒分散其间，或者具有软骨保护作用的式(I)化合物的液态小球或分离体可能包埋于其中，用作用于延迟、持续和/或控制释放的固体植入组合物；或(3)摄入或施用含有所述化合物的药物组合物，其具有适当的固态或液态形式，用于其经皮释放，例如经皮帖剂或表皮下(皮下)植入剂，或用于其口服释放。这里述及的大量剂型都可以配制，以便提供活性成分由所述剂型中的控释、缓释和/或延迟释放。根据本发明，有用的ML3000的控释剂型是一种在单次口服剂量为5mg/kg后可保持ML3000的血浆水平在一天中的大部分时间内大于100ng/mL的剂型。根据本发明，优选的ML3000的口服控释剂型是这样的剂型，当所述控释剂型和即释剂型以相同剂量施用时，其将ML3000的血浆浓度保持在超过100ng/mL水平的时间远远长于ML3000的即释剂型可保持相当的血浆水平的时间。含有2.5和5mg/kg剂量的ML3000的即释剂型可将血浆ML3000浓度保持在100ng/mL和200ng/mL以上分别达8小时。优选的全身施用的口服剂型是固体剂型，例如可口的口服组合物，如速溶的美味薄片(wafer)、片剂、胶囊、囊片等；和液体剂型，例如溶液剂、混悬剂、乳剂等。适合哺乳动物口服施用的特定类型的药物组合物可以使用且包括但不限于这样一些形式，如施用于所治疗哺乳动物的舌后部的口服糊剂、通过掺入哺乳动物食物中被施用的颗粒形式，和其中活性成分与美味的咀嚼物一起被消耗的可咀嚼形式，或在所治疗哺乳动物咀嚼过程中通过滤去不被消耗的成分而施用活性成分的可咀嚼形式。所定义的治疗有效量的式(I)化合物也可局部施用于所述哺乳动物，其中所述局部施用包括(1)将含有所述式(I)化合物的药物组合物注射或输注至关节软骨和/或软骨下骨组织退化或损伤的局部位置，所述组合物为有利于其传输的液体形式，包括可提供所述化合物至所述局部位点的延迟释放、控释和/或缓释的组分；或用作用于其释放的储库，其中所述组合物提供所述化合物的贮存以及其后的延迟释放、缓释和/或控释；或(2)向所述局部位置滴注药物组合物，所述组合物含有所述化合物，其为适宜的固体形式，用作用于其释放的固体植入剂，所述组合物任选提供所述化合物的延迟释放、缓释和/或控制释放。局部施用集中于适宜的关节组织，可将具有软骨保护作用的式(I)化合物注射、注入、植入、存放、插入或滴注其中。这种施用还包括但不限于关节内、软骨内、肋内、韧带内、髓内、肌肉内、骨骼内、盆骨内、脊柱内、胸骨内、滑液内、跗骨内、鞘内或静脉内施用。含有具有软骨保护作用的式(I)化合物的药物组合物具有可将液体注射进入或非常接近于关节位置的优势。通过直接将式(I)化合物注射至关节内，可以使所述化合物在短时间内达到较高的浓度。这样，不仅显著增强了所述化合物进入关节组织的能力以及因此增强了式(I)化合物的治疗活性，而且同时使否则可能发生的不利副反应的发生率降至最小。其结果就是式(I)化合物的高局部浓度，伴以与之相应的全身性的低浓度残留。注射剂可以由含有具有软骨保护作用的式(I)化合物的药物组合物制成，其中药物组合物为延迟释放、控释或缓释的形式。这些公认的组合物的制剂可以是固体、半固体、凝胶或其它液体/固体联合的形式，其中使用易侵蚀的基质或包衣系列以使式(I)化合物以预定的速率或者如果需要以可变的速率连续释放。术语“延长释放”(extended-release)和“长效”以及其它术语用来描述这些制剂。所有这些制剂均采用生物可侵蚀的聚合物(例如各种纤维质聚合物)和天然材料，(例如玉米淀粉和硬脂酸镁)的各种组合，以使基质中所含的式(I)化合物能够缓慢和/或均一的配放。这些药物组合物如果是适当的液态或可混悬的形式，则可以被注射至关节位置，如果本质上更接近固体则可以采用其它方式施用。式(I)化合物用以治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏的治疗有效量，是以一定的量施用于所治疗的哺乳动物，所述量以每天所述哺乳动物每千克体重给予的毫克量表示的，即“mg/kg/day”。这里使用的表述“每天”不应被解释为必须要求任何特定的剂型都基于每天施用于所治疗的哺乳动物。“每天”的表达方式仅仅指示一种最小的方便而任意的时间段，其被当作总计量单位的一部分，以衡量所施用的具有软骨保护作用的化合物的剂量。剂量，即用以治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏的式(I)化合物的治疗有效量，通常约0.1mg/kg/天至约20.0mg/kg/天、优选约0.1mg/kg/天至约12.0mg/kg/天、更优选约0.5mg/kg/天至约10.0mg/kg/天且最优选约0.5mg/kg/天至约8.0mg/kg/天。ML3000的通常剂型和用量包括以2.5至5.0mg/kg体重的剂量口服施用。对技术人员而言必要的是不仅要确定优选的施用途径和相应的剂型和用量，而且必须确定给药方案，即给药频率。通常情况下，最可能的是在每日一次(s.i.d.)给药和每日两次(b.i.d.)给药之间选择，前者可提供更迅速而深远(profound)的治疗，而后者可提供的治疗虽缺少深度但更加持久。但是，这种概括并没有将重要变量考虑进去，如相关的关节软骨或软骨下骨组织的退化或损坏的特定类型、相关的特定治疗剂及其药代动力学，以及相关的特定患者(哺乳动物)。对于已批准上市的产品，这些信息的大部分已经由为获得批准而进行的临床研究的结果提供。在另一些情况下，这种信息也可以以直接的方式、按照技术人员根据其知识和技能提取的本说明书中所包含的教导和指导而获得。也可以将获得的结果与在同样实验中相应的已批准产品的评价数据进行相关性分析。同样可以认为，本发明还将提供用于在需要所述治疗的哺乳动物的一个或多个关节治疗或预防关节软骨和/或软骨下组织的退化或损坏的适用于商业的包装，其包括适宜的外部纸板盒和其中所放置的可移动的内部容器；在所述容器中含有以上所述的适宜剂型的式(I)化合物；以及与所述硬纸板或容器有关的印刷的使用说明和信息资料，其可贴于所述纸板盒或所述纸板盒中包含的所述容器上，或作为所述纸板盒或容器的固有部分被展示，所述使用说明和信息资料用文字告知读者所述活性成分在一个或多个关节的关节软骨和/或软骨下组织退化或损坏的情况下施用于哺乳动物时，可改善、减轻、积极治疗、扭转或预防关节软骨或软骨下骨组织的任何损伤、损害或损耗。在一个优选的实施方案中，所述的包含如上所述的纸板盒和容器的包装可以符合所有与治疗哺乳动物的药物的销售和使用有关的规范性要求，包括特别是所述使用说明和信息资料。可以认为，本发明还将提供一种上述类型的包装，其包括如上所述的适宜的容器；所述容器中装有口服剂型的式(1)化合物；还有与所述容器相关的如上所述的印刷的使用说明和信息资料。本发明的方法还可以被定义为包括两个基本步骤(I)确定受试哺乳动物的状态，即所述哺乳动物的一个或多个关节在当前还是预期处于关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏的状态，从而确定所述哺乳动物需要所述治疗；随即(II)通过向所述哺乳动物施用对于治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏而言治疗有效量的具有软骨保护作用的式(I)化合物。以上已详细讨论了步骤(II)的各个方面。因此，现在详细讨论步骤(I)的各个方面。就诊断而言，根据本发明可方便地确定候选治疗的哺乳动物的状态，即所述哺乳动物是否当前或预期处于一个或多个关节的关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损坏状态下。这里使用的“当前或预期的”指的是根据下述的作决定的方法，可以鉴别受试哺乳动物是当前需要这种治疗，或在不久的将来很可能或期望需要这种治疗。对治疗的预期需要可通过那些肯定因素的测定结果决定，根据技术人员的经验，所述结果可直接导致关节软骨和/或软骨下骨组织退化或损坏的情形。例如，技术人员可由哺乳动物临床检测结果确定其具有初始髋关节结构异常，并可用射线成像证据确定这一结论，从所述证据中可依据已建立的度量方法确定该哺乳动物在不久的将来将发生髋关节结构异常。具体而言，所述哺乳动物的状态，即是否当前或预期处于所述退化或损坏状态且特别是所述早期阶段，并是否需要这种治疗，是根据以下情况确定的(A)来自受试哺乳动物的临床关节内窥镜检查和关节评价的阳性结果(positiveresult)。已经讨论了初始或事实髋关节异常结构的诊断。其它临床症候和迹象包括那些对受试哺乳动物关节直接检查所获得的结果；(B)对受试哺乳动物的一个或多个关节进行的任何有创性外科操作的效果，所述外科操作仅可在本身具有充足的理由的情况下决定需要所述治疗方式。从事实而言，对哺乳动物关节实施的有创性外科手术不可避免地降低了所述关节与手术前一样有效的承载常规负荷的能力。以一个熟练技术人员的经验出发，在关节上增加的机械压力将直接导致关节软骨和/或软骨下骨组织退化的早期阶段。这种关节手术还将导致血液和其它含有细胞因子和其它因子的流体的渗出，这些因子是炎症的诱发剂，从而使得这些物质可转移并吸收进关节的固态组织中，包括软骨和/或软骨下骨组织。技术人员可以判断这也将直接导致关节软骨和/或软骨下骨组织退化的早期阶段；(C)来自于采用包括放射成像和磁共振成像技术(MRI)在内的无创性操作对所述哺乳动物的一个或多个关节进行检查的阳性结果。后一种技术比前者更适合于对软组织进行测定。MRI是一种多平面人体成像技术，可以显示增强的软组织对比分辨率。由于MRI可以使软组织的改变形象化，因此它适合于对关节软骨和软骨下骨组织退化的早期改变的病理学进行成像；(D)来自于对受试哺乳动物的体液或关节组织进行的任何生化实验的阳性结果，所述结果涉及一种或多种以下物质增加的白介素-1β(IL-1β)；增加的肿瘤坏死因子α(TNFα)；增加的IL-1β相对IL-1受体拮抗蛋白(IL-1Rα)的比例；增加的p55TNF受体(p55TNF-R)的表达；增加的白介素-6(IL-6)；增加的白血病抑制因子(LIF)；未改变或减少的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)；减少的转化生长因子β(TGFβ)；未改变或减少的血小板衍生生长因子(PDGF)；未改变或减少的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)；增加的硫酸角质素；增加的溶基质素；增加的溶基质素相对金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的比例；增加的骨钙蛋白；增加的碱性磷酸酶；增加的对激素攻击有响应的cAMP；增加的尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)；增加的软骨寡聚基质蛋白；以及增加的胶原酶。以IL-1α和IL-1β存在的IL-1是一种分解代谢细胞因子，其可调节哺乳动物关节的关节软骨损伤和损失。其通过以下方式发挥作用抑制关节软骨中可见的II型胶原质的合成、同时促进作为成纤维细胞特征的I型胶原的合成；诱导与基质退化有关的酶的产生；抑制软骨细胞合成新蛋白聚糖的能力。为了引起分解代谢酶的产生而被占据的IL-1受体，其数量在退化早期的关节软骨的软骨细胞表面仅是所需正常值的四分之一(1％对4％)。IL-1及其调节剂IL-1Rα由相同的滑液巨噬细胞以自分泌和旁分泌的形式产生，IL-1Rα的产生在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下可以增加。但是，IL-1和IL-1Rα的效能存在显著的不同，如在软骨细胞和软骨植入体上测定到的，消除IL-1的作用需要大约130倍的IL-1Rα。IL-1和IL-1Rα之间的任何不平衡都会进一步加剧关节软骨的恶化。因此，适当的目标还可以是测量处于早期关节软骨退化的哺乳动物中的IL-1和IL-1Rα水平及它们之间的比例，并且测量没有如此受病患折磨的哺乳动物中的相同的数值，以便确定可测量的改变，根据所述改变，可在病灶软骨丧失可通过放射成像的方式确定前概括出受试哺乳动物处于软骨损伤或损耗的早期。这些结论可提供在显著的软骨退化发生前预计接受早期药物干预的受试哺乳动物的诊断分类。此外，可以测定处于关节软骨退化早期阶段的关节滑液和滑液组织中存在的IL-1α和分泌IL-1β的巨噬细胞的比例，其显著大于从正常关节、即非关节软骨退化早期阶段的关节的滑液和滑液组织中分离到的相同细胞的比例。这些结论再次提供了在显著的软骨退化发生前预计接受早期药物干预的受试哺乳动物的诊断分类。另外，由于引发并维持炎症过程的细胞因子能够通过钙化带上的细小裂缝到达软骨下层，所以在关节软骨总体改变明显之前软骨下骨组织就发生改变。所涉及的软骨细胞的新陈代谢受到不利的影响，另外在关节软骨的中间地带的软骨细胞可产生许多细胞因子，包括那些引发和维持炎症过程的细胞因子。这些软骨细胞以自分泌形式发挥作用，从而促进其自身细胞外基质的破坏。关节软骨的水含量增加通过增加炎性细胞因子在基质内的扩散，也促进了这一进程。因此适当的目标是测量关节软骨退化过程中由哺乳动物的软骨细胞、滑液细胞和/或软骨下骨细胞、特别是齿突所产生各种炎症性细胞因子的水平，并且测量没有如此受病患折磨的哺乳动物中的相同的数值，以便确定可测量的改变，根据所述改变，可在病灶软骨丧失可通过放射成像的方式确定前概括出受试哺乳动物处于软骨损伤和损耗的早期。这些结论可提供在显著的软骨退化发生前预计接受早期药物干预的受试哺乳动物的诊断分类。肿瘤坏死因子α(TNFα)在软骨退化方面仅仅是IL-1的强度的十分之一，但是在哺乳动物膝关节中、特别是在十字韧带横切关节中与相对的未手术的膝关节相比，其滑液内的浓度显著增加。从这种膝关节的关节软骨中分离的软骨细胞上的p55TNF受体(TNF-R)的表达也增强。相应地，因为TNFα在软骨损伤和损耗的早期阶段发生的病理改变中发挥作用，出于同样的原因，适合的目标是测量处于关节软骨退化的早期阶段的哺乳动物关节中的TNFα和TNF-R水平，并且测量没有如此受病患折磨的哺乳动物中的相同的数值，以便确定可测量的改变，根据所述改变，可在病灶软骨丧失可通过放射成像的方式确定前概括出受试哺乳动物处于软骨损伤和损耗的早期。这些结论可提供在显著的软骨退化发生前预计接受早期药物干预的受试哺乳动物的诊断分类。白介素-6(IL-6)是一种多功能细胞因子，但发挥炎性作用，且发现同对照的正常四肢相比，其在受损四肢的关节和滑液中的水平升高。IL-6也使得软骨细胞上TNF-R的表达增强和由软骨细胞生成的蛋白聚糖增加，以及诱导葡萄糖胺聚糖的释放。与对照组相对比，对处于关节软骨损伤和损耗的早期阶段的哺乳动物关节的软骨细胞、滑液和关节中的IL-6水平的测定结果可用作鉴别哺乳动物的诊断工具，所述哺乳动物在任何病灶软骨丧失通过放射成像检查被证实前预计接受药物治疗。白血病抑制因子(LIF)由单核细胞、粒细胞、T细胞、成纤维细胞以及其它与炎症情况相关的细胞类型产生。滑膜细胞和软骨细胞在IL-1β和TNFα存在下合成并分泌LIF。所以，测得LIF水平的对比增加可以在诊断上被用于挑选适宜关节软骨损伤和损耗早期阶段的药物治疗的受试哺乳动物。哺乳动物关节软骨的退化、损伤和损耗是两种细胞因子的不平衡造成的，这两种细胞因子分别是促进上述分解代谢过程的细胞因子和维持软骨中的软骨细胞合成和增生响应的细胞因子。胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及成纤维细胞生长因子例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)就软骨细胞而言都是促有丝分裂的并且可刺激关节软骨中的基质合成。胰岛素样生长因子(IGF)以I型和II型存在，且IGF-I是软骨合成的强效调节剂。此外，它甚至在IL-1β和TNFα存在下减少蛋白聚糖的降解并促进其合成。IGF-I的血清水平是由高亲和性结合蛋白(IGF-BPs)维持的，并且IGF-I在骨和软骨的代谢中都很重要。与对照组相比，IGF-I的水平可以成为对受试哺乳动物关节软骨退化的早期药物治疗的诊断评价。转化生长因子(TGF)软骨细胞产生，对软骨和骨组织的代谢回转而言均是有力的促细胞分裂剂。此外，它可刺激基质的合成且具有抗炎活性。它还可通过刺激蛋白酶抑制剂的产生和阻止胶原酶和金属蛋白酶的释放而抑制基质的退化。此外，它可通过刺激由哺乳动物关节中的各种细胞产生的胶原、纤维结合素、纤溶酶原激活物抑制剂和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)来提高软骨修复能力。在处于关节软骨损伤和损耗早期阶段的哺乳动物的关节中，滑液的TGFβ水平较低。因此，与对照组相比，TGFβ的水平可以成为对受试哺乳动物关节软骨退化的早期药物治疗的诊断评价。随着退化的进行，即哺乳动物关节中关节软骨的分解代谢，产生了大量的代谢产物，它们可用作软骨退化发生和发展的标记物。例如，由IL-1α和IL-1β或TNFα引起的软骨退化释放葡萄糖胺聚糖(GAGS)，这可以在被测哺乳动物的滑液中测量出来。此外，GAG的水平在治疗后会改变，所以使用滑液GAG水平作为关节软骨转化(turnover)的标记物，GAG水平可以用来监控药物干预的过程。因为关节软骨的退化涉及胶原和其它软骨组分，所以几种胶原产物可作为哺乳动物软骨退化、特别是齿突关节软骨损伤和损耗的标记物。II型特定胶原分解产物，例如20至30氨基酸新表位，可在滑液、血浆、血清或尿液等体液中被测定出来。在这些体液中新表位的存在被用作OA发病和进展的指示剂。硫酸角质素是特殊的GAG，其具有表位5D4，其在滑液中的水平可用作早期关节软骨损伤和损耗的标记。相反，另一种表现为许多表位的特殊的GAG硫酸软骨素的水平与处于软骨损伤和损耗早期阶段的哺乳动物关节软骨的合成代谢有关。滑液中的这些表位的水平，尤其是3B3、7D4和846，可以通过特定的可识别它们的单克隆抗体测定。3B3表位在细胞外基质的修复和重构期间于软骨的硫酸软骨素链上被表达，因此它在滑液中的水平与上述5D4的水平呈负相关。在关节软骨的表层或中上层中的新合成的PGs上的3B3的表达意味着3B3与处于软骨退化早期阶段的哺乳动物关节软骨中的早期改变相关。相应的，测定待测哺乳动物滑液中的3B3水平并将这些水平与对照数值相比，可以形成适宜早期药物治疗的受试哺乳动物的诊断特征。另一个软骨合成代谢活性的标记物是II型原胶原前肽(PIIP)。该物质是关节软骨中的主要胶原，且由软骨细胞以原胶原的形式产生。在胶原原纤维形成的过程中，不产生胶原的氨基前肽和羧基前肽被裂开并释放进体液中，在体液中对它们进行测量能够反映关节软骨中合成代谢的活性。羧基-PIIP的水平将升高，且它在滑液中的水平与软骨改变的放射成像证据相关。相应的，测量滑液中羧基-PIIP的水平并与对照进行比较，可以鉴别适宜早期药物治疗的受试哺乳动物。处于早期关节软骨退化的哺乳动物的关节软骨和关节液中的溶基质素/TIMP的比例失衡也可用于鉴别这种哺乳动物。损伤引起的关节负荷的改变可以引起过量的溶基质素的产生，其是一种在IL-1的影响下由软骨细胞和滑膜细胞产生的酶。溶基质素在原纤维组成的软骨中的浓度远远高于其在远离相关损伤的软骨中的浓度。溶基质素水平仅可在短时间内升高，但当对关节的损伤超出关节软骨的潮间带(tidemarkzone)且到达软骨下骨组织时，通常软骨下骨组织硬化之后继发关节软骨退化的可能性很大。另外，在用于检测早期关节软骨退化的十字韧带缺损的哺乳动物模型中，涉及溶基质素、IL-1α、IL-1β和三种致癌基因蛋白c-MYC、c-FOS和c-JUN的合成的细胞数量增多。在滑膜中发现，这些主要是表面滑膜内层细胞，而在软骨中，所述细胞为表层和中层的软骨细胞，以及胫骨坪的原纤维组成区域中的细胞。此外，溶基质素和IL-1可扩散进胫骨坪的软骨基质中。溶基质素可降解包括蛋白聚糖和IX型胶原在内的结缔组织的组分，其在关节软骨退化早期的哺乳动物的滑膜中被大量合成，且是软骨损坏所涉及的主要的蛋白水解酶。溶基质素mRNA的水平增加可在这种哺乳动物的滑膜中检测到，胶原酶mRNA的水平增加同样可以检测。IL-1的两种亚型特别是IL-1β水平的增加可通过加强滑膜成纤维细胞对溶基质素和胶原酶的基因表达的诱导作用而刺激溶基质素合成的增加。同时，IL-1不诱导金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的mRNA，并且当滑膜中的金属蛋白酶水平显著增加时该抑制剂的水平仍保持不变。金属蛋白酶由软骨细胞以酶原的形式分泌，其在细胞外基质大分子可发生降解之前必须被激活。活化涉及酶级联反应，其中丝氨酸蛋白酶包括纤溶酶原激活物/纤溶酶原体系，发挥关键作用。哺乳动物关节中关节软骨的完整性取决于来自其所覆盖的骨床的充分的支持，即下面的软骨下骨组织的结构特性。骨床的改变先于关节软骨的退化改变。这些改变包括软骨下骨组织的硬化增加，伴随吸收震荡能力的丧失。这些软骨下骨组织改变是由小梁微小裂缝的不适当修复引起的，所述微小裂缝又是由关节过量负载导致。软骨下骨组织的小梁增厚是骨改变的一部分，所述改变导致了受累关节中骨矿物质密度和/或体积增加，反过来这又是由骨细胞中缺失成骨细胞引起，导致软骨下骨组织的类成骨细胞中变化的显性特征。软骨下骨组织密度的改变不仅是骨重构过程失衡的证据，而且是最终病灶点软骨损耗的关键因素。骨硬化也是由于该骨重建过程中的失调引起。另外，成骨细胞新陈代谢中出现与位点相关的差异，导致不同软骨降解分子的产生。这些成骨细胞代谢物的变化继而导致了软骨细胞代谢的相应变化，致使它们对上述类型的细胞因子诱导活性更加敏感。成骨细胞反常和分化的表型的特征在于骨钙蛋白、碱性磷酸酯酶、对激素激活响应的cAMP、尿激酶代谢蛋白溶酶原激活剂(uPA)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的生产水平不同。另一个软骨下骨活性涉及最终关节软骨退化的证据是关节腔狭窄，其可以用骨闪烁扫描法测定。这些软骨下骨组织活性的改变伴随着特定骨细胞代谢物例如骨钙蛋白的相应改变。骨钙蛋白是维生素K依赖型钙结合骨蛋白，其是骨中最丰富的非胶原蛋白。骨钙蛋白水平升高是各种疾病状态、尤其包括关节软骨退化的早期状态中骨转化的标志。骨钙蛋白的体液、特别是滑液水平与闪烁扫描法测定的软骨下骨组织的改变直接相关。除了作为哺乳动物早期关节软骨退化指示物的软骨下骨组织活性的标记之外，还有软骨和滑膜活性的代谢物也可用作指示这种早期关节软骨退化的标记。例如，检测增加的软骨低聚基质蛋白的血清水平，作为软骨转化的标记。类似地，检测体液、特别是血清中的透明质酸盐的升高的水平，作为滑液炎症的标记。在这两种情况下，这些代谢标记物的增加的体液、特别是血清水平显示早期关节软骨退化。这里所使用的表述“体液”应包括所有能得到的可用作临床样本的体液，这些体液中可以含有足够浓度的待测化合物，使其达到所用实验仪器或分析方法的检测限内。因而，体液可包括全血、血清、血浆、尿、脑脊髓液、滑液以及空隙液和其它细胞外液。因此，前述测定通常是对来自受试哺乳动物的样本进行的体外测定。附图简介图1股骨髁关节和胫骨坪的软骨变化的宏观等级列表；图2滑液组织学等级列表；图3骨性关节炎狗中的软骨细胞胶原酶-1(MMP-1)评分列表和滑膜细胞IL-1β的评分列表；图4骨想关节炎狗的股骨髁关节和胫骨坪的软骨的组织学分级；图5骨性关节炎狗的滑液中PGE2水平和培养的滑液外植体中的LTB4水平；图6狗初级成骨细胞释放骨钙蛋白；图7狗初级成骨细胞中碱性磷酸酯酶的活性；图8狗初级成骨细胞生成IGF-1；图9狗初级成骨细胞的uPA活性；图10狗初级成骨细胞生成PGE2。优选实施方案描述为进一步证实本发明的方法和成分，在下面的段落中列举了一些可在实施所述方法中使用的典型步骤的具体的描述性实例。然而，所述实例仅供说明，不应当被当作是以任何方式对本发明进行限制，为此本发明的权利要求附加在说明书之后。实施例1研究了ML3000对实验性骨性关节炎(OA)狗模型中损伤发展的治疗效果。具体而言，测定了ML3000对软骨中胶原酶-1(MMP-1)和滑膜内白细胞介素-1β(IL-1β)的合成的作用，以及其对初级成骨细胞中存在或由其产生的碱性磷酸酯酶活性、IGF-1的生成、骨钙蛋白的释放、PEG2和uPA的活性的作用。实验组取每只重20至25kg的21只成年杂种狗(2-3岁)用于该项研究。如前所述(5，6)对所有狗进行外科手术，通过刺伤的伤口，切除右膝的前十字韧带(ACL)。手术前，用戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉注射对狗进行麻醉并插管。手术后，将狗放养于家庭农场，让其在大围栏中自由活动。将狗随机分为3个治疗组。组1(n＝7只狗)由接受安慰剂(甲基纤维素胶囊)的狗组成(OA狗)；组2和3(每组n＝7只狗)于手术后次日开始每日两次接受ML3000胶囊，持续8周，总剂量分别为2.5和5mg/kg。在整个研究期间，每周/7天施用药物。所有狗在手术后8周处死。各个实验组的所有狗都完成了研究。用ML3000治疗的各组中的狗没有发现药物毒性临床症状，包括那些与胃肠道有关的症状。来自3个实验组中的所有狗的每天的活动水平相似，并且在整个实验期间，狗的体重没有变化。统计学分析数值以平均值±SEM表示。用Mann-WhitneyU检验进行统计学分析。P值小于0.05，则认定为是显著的。宏观分级处死后立即将每只狗的右膝解剖，置于冰上并吸取滑液。由2个独立的不知情的观察者(DVJ、JCF)检查每个膝关节总体形态的改变，这些改变包括是否有骨赘形成和软骨损伤，如前所述(5，6)。骨赘形成的程度通过测量每个股骨髁骨刺的最大宽度(mm)来分级。在股骨髁关节中间和侧面以及胫骨坪上的软骨变化分别在解剖显微镜(Stereozoom；Bausch&Lomb，Rochester，NY)下分级。测量关节表面变化的面积，用mm2表示。侵蚀的深度分为如下0至4级0＝表面显示正常，1＝微小原纤维形成或表面轻微浅黄色变色，2＝侵蚀扩散到表层或中层，3＝侵蚀扩散到深层和4＝侵蚀扩散到软骨下骨组织。骨赘。在安慰剂治疗的OA狗中，93％的髁中存在骨赘，测量其宽度为4.50±0.66mm。在用2.5mg/kg/天和5mg/kg/天的ML3000治疗的狗中，骨赘分别存在于93％和86％的髁中。与安慰剂治疗的OA组相比，这两个治疗组的骨赘宽度测量结果或多或少地小于前者(分别为3.57±0.56和3.86±0.66)，而且其差异没有达到统计学显著水平。软骨。在安慰剂治疗的OA狗中，一般严重等级和尺寸的软骨损伤出现在于髁关节和骨坪上，且骨坪的损伤更严重(图1)。用ML3000治疗的两组的髁关节和骨坪上的损伤尺寸均有显著降低。在2.5mg/kg/天的治疗组中，股骨髁关节的损伤尺寸降低了39％(P＜0.05)，胫骨坪的损伤尺寸降低了45％(P＜0.01)。在接受5mg/kg/天的治疗组中，股骨髁关节的损伤尺寸也减少了(61％，P＜0.04)，而对胫骨坪的影响大约与2.5mg/kg/天的治疗组相同(54％，P＜0.01)。两中ML3000浓度将胫骨坪的损伤等级显著降低至大约相同的程度。尽管接受治疗的狗的股骨髁关节的损伤显示等级降低的趋势，但没有达到统计学显著性。滑膜。安慰剂治疗的OA狗的滑膜是肥大的，显示红色和微黄色变色，并包括大量血管。在用ML3000治疗的狗中，滑液较薄，包括较少的血管，且变色程度低于安慰剂治疗的OA狗。组织学分级对文献所述(7，8)，对每个股骨髁关节和胫骨坪受损区域的软骨的径向切面进行组织学评价。分割样本，固定于TissuFix#2(GillesChaput实验室，Montreal，Quebec，加拿大)，并嵌于石蜡中，用于组织学评价。用番红菌素O对系列切片(5μm)进行染色。由两个独立的观察者(DJ，JF)使用Mankin等人(12)的组织学/组织化学等级标准，将OA损害的严重程度分成0至14个等级。这些等级评估OA损害的严重程度，是基于被番红菌素O染色的丧失(0至4级)、细胞的改变(0至3级)、潮标被血管浸润(0至1级)和结构的改变(0至6级，其中0＝正常软骨结构，6＝软骨侵蚀达到软骨下骨组织)。该等级系统是基于每个软骨截面中最严重的组织学改变。将来自膝关节腔中间和侧面槽的代表性滑膜样本也与下面的组织进行分离。将样本固定于TissuFix#2中，嵌入石蜡，切片(5um)并用苏木精和曙红染色。对来自每个腔的2个滑膜样本进行检查，连续选择整个样本并逐一分级。记录每个样本的最高评分，计算平均值并作为整个膝关节的单位。由2个独立观察者(DVJ，JCF)按照0至10的分级(13)对滑膜炎的严重程度进行分级，对于3个组织学标准增加等级滑膜内衬细胞增生(0至2级)、绒毛状增生(0至3级)和细胞被单核和多形核细胞浸润的程度(0至5级)。软骨。得自安慰剂治疗的OA狗的软骨呈现形态学改变，包括原纤维化和分裂、细胞过多和克隆、番红菌素O染色丧失。骨坪损害的组织学评分较髁关节损伤的组织学评分略微严重(图4)。在ML3000治疗的狗中，髁关节的损伤不如安慰剂治疗的OA狗严重，在最高剂量(5mg/kg/天)药物治疗组中获得了统计学显著性。这个组织学评分的降低很大程度上归因于结构改变的严重程度和番红菌素O染色的丧失降低。在胫骨坪上，两个ML3000剂量(2.5和5mg/kg/天)下均获得损伤严重程度的统计学显著降低(分别P＜0.002和P＜0.02)。这是因为除细胞克隆减少之外的结构改变的严重程度和番红菌素O染色丧失的降低。滑膜。得自安慰剂治疗的OA狗的滑液是粘稠的，具有大量的长茸毛并显示滑膜内衬细胞增生。在ML3000治疗狗中，5mg/kg/天剂量组的绒毛状增生显著地减少。滑液中PGE2的测量将处死动物时取出的滑液离心(14000g，15分钟，4℃)，上清液用于PGE2测定。用特定酶免疫测定法(EIA)(CaymanChemical，AnnArbor，MI)测定PGE2水平。得自安慰剂治疗的OA狗的滑液含有高水平的PGE2(652.8±149.9pg/ml)。用2.5和5mg/kg/天的ML3000进行治疗使该水平显著降低(图5)。在滑液外植体培养基中LTB4的生成将所有狗的代表性滑膜样本与其下面的组织无菌分离。将样本在Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM；Gibco-BRLLifeTechnologies，Burlington，Ontario，加拿大)中多次冲洗，将150mg组织在5％CO2/95％的潮湿空气中、在DMEM培养基中、在1ug/ml脂多糖(LPS；Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario，加拿大)存在下，于37℃培养48小时(一式两份)。如下法从培养的滑膜外植体中提取LTB4将膜在EIA缓冲液(1M磷酸盐，pH7.4，含有1％BSA、4MNaCl、10mMEDTA和0.1％叠氮化钠)中匀浆并离心(30000g，20分钟，4℃)。收集上清液并用EIA(CaymanChemical)测定LTB4水平。得自用1ug/mlLPS治疗的OA狗的培养的滑膜包含大量LTB4(2.48±0.69pg/mg组织)。两个ML3000治疗组均证实了LTB4水平的统计学显著降低(图5)。免疫组织化学如前述(7，14)对软骨和滑膜样本进行处理用于免疫组织化学分析。简而言之，将样本固定于4％中性缓冲甲醛水中24小时，然后嵌入石蜡。将嵌入石蜡中样本切片(5μm)置于SuperfrostPlus载玻片上(FisherScientific，Nepean，Ontario，加拿大)、用甲苯脱石蜡、用系列等级的乙醇脱水并在37℃下于磷酸盐缓冲的盐水(PBS；Sigma-Aldrich加拿大)中用软骨素酶ABC(0.25单位/ml)预培养60分钟。在那之后，以PBS清洗样本，然后以0.3％过氧化氢/PBS清洗30分钟。切片进一步用封闭溶液(DakoDiagnostics，Mississauga，Ontario，加拿大)和5％脱脂奶培养60分钟，吸干，然后用抗胶原酶-1的初级单克隆抗体(100ug/ml，稀释1∶500，OncogeneResearchProducts，Cambridge，MA)(软骨)或抗人IL-1β的初级抗体(1μg/ml，稀释1∶50；BiosourceInternational，Camarillo，CA)(滑膜)在潮湿的环境下、于室温下覆盖18小时。每个切片用PBS(pH7.4)清洗3次，并用抗生物素蛋白-生物素复合物法(VectastainABC试剂盒；DAKODiagnostics加拿大)染色。此方法需要在生物素共扼的第二抗体存在下于室温培养30分钟，然后于30分钟内加入抗生物素蛋白-生物素过氧化酶复合物。所有培养均在潮湿环境下进行，并用含过氧化氢的3，3′-二氨基对二氨基联苯(DAKODiagnostics加拿大)显色。切片用中性红(软骨)或苏木精/曙红(滑膜)复染。为决定染色特异性，按照相同的实验方法采取3个对照步骤1)使用有20倍摩尔过量的重组胶原酶-1或IL-1β的被吸收的免疫血清(1小时，37℃)；2)省略初级抗体；和3)用自体免疫前血清代替初级抗体。我们研究中使用的纯化抗原为人重组胶原酶-1(OncogeneResearchProducts)或人重组IL-lβ(Genzyme，Cambridge，MA，USA)。由每个软骨块制成几个切片，并对每个样本的切片进行处理用于免疫组织化学分析。每个切片在光学显微镜(LeitzOrthoplan；WildLeitz，St.Laurent，Quebec，加拿大)下观察，并用柯达Ektachrome64ASA胶片(Kodak，Rochester，NY)照相。软骨(图3)。在用安慰剂治疗的狗体内，软骨样本表层的大量软骨细胞对髁关节和骨坪的胶原酶-1染色呈阳性。在ML3000治疗的OA狗中，髁关节和骨坪都在胶原酶-1软骨细胞评分上呈现显著的降低，这种影响在用最高剂量药物治疗的组稍微更加显著。滑膜(图3)。检查安慰剂治疗的OA狗的滑膜样本，显示存在大量对IL-1β染色呈阳性的内衬细胞。在用ML3000治疗的狗中，对IL-1β染色呈阳性的细胞数量呈剂量依赖性且显著降低。形态测量学分析软骨。对软骨中不同抗原的量化是使用公开方法进行的(7，14)。通过测定软骨上部区域(表面和中间层的上部)染色呈阳性的软骨细胞的数量来评估抗原的存在。在这一区域，软骨被分成3个微观区域(X40；LeitzDiaplan)并进行平均。对于每个关节炎样本，要确保在评估前可检测到完整的软骨表面，用作形态测量学分析的确认标记。测定软骨细胞的总数和对特定抗原染色呈阳性的软骨细胞的数量。最终的结果用软骨细胞对抗原染色呈阳性的百分比来表示，所述抗原(细胞评分)具有最大评分100％。对每个切片进行双盲评价，得到的变异系数＜5％。为达到统计分析的目的，从中间和侧面股骨髁和胫骨坪中得到的数据被认为是独立的。滑膜。对于滑液膜分析，对每个部位，使用我们已经公开的方法(8)测定不同样本的细胞评分。在滑膜内衬水平上，将每个样本分成5个微观区域(X40)。用上述对软骨的描述方法评估每个区域内对特定抗原染色呈阳性的细胞的百分比。对滑膜内衬细胞和单核细胞浸润分别进行细胞记数评分，每个区域的最大值为100％。成骨细胞分析如下所述将胫骨的近端除去，用冷的生理盐水冲洗并在解剖前和整个解剖过程中置于冰上。提取中间的胫骨坪以制备外植体和初级骨细胞培养基；不包括边缘皮质骨组织。首先从胫骨坪上除去其上的软骨，并从中间骨坪的中部切除插入的外植体。然后，从软骨下骨片上切去有横隔片的骨组织。所有操作均在放大显微镜下进行，以确保完全除去软骨和有横隔片的骨组织。经少许改进，按照(16)所述的方法，使用样本制备初级细胞培养基。将骨样品切成小片(2mm2)，然后将骨样本在没有血清的Ham′sF-12/Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM；Sigma)中、在1mg/mlI-型胶原酶(Sigma)存在下于37℃持续消化20、20和240分钟。这一处理方法将附着和残留的骨髓细胞从皮层骨片上除去。用相同的介质清洗后，将被消化的骨片在含有20％胎牛血清(FBS；Wisent，St.Bruno，Quebec，加拿大)的BGJ介质中培养。每2天更换这种培养基，直至在Petri培养皿中观察到细胞为止，此时用含10％FBS的新鲜介质替换培养介质。细胞富集后，细胞以25,000细胞/cm2的比例传代一次，并在分析前在24孔板(Falcon，LincolnPark，NJ)上生长5天。在这种培养条件下得到的细胞显示成骨细胞样表型，如(16)所示。在最后2天的培养中，调节培养条件，于含有2％木炭去色(stripped)FBS的Ham′sF-12/DMEM中，在50nM1，25(OH)2D3(1，25-二羟基维生素D)存在或缺失的情况下使刺激最大化，可产生对碱性磷酸酯活性和骨钙蛋白分泌的最大刺激，如(16)所示。在培养结束时收集培养基并在实验前于-80℃下冷冻。然后用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)pH7.4清洗2次，并使之在碱性磷酸酯酶缓冲液(100mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2、1％TritonX-100，pH10.5)中增溶60分钟，伴以4℃下搅拌。骨钙蛋白的释放骨钙蛋白的释放是在如(16)所述为成骨细胞样细胞培养的最后两天而制备的条件Ham′sF-12/DMEM(1∶1)中测量，它含有2％木炭去色的FBS并存在50nM1，25(OH)2D3或媒介(0.1％乙醇)。使用特定的酶免疫分析法(BiomedicalTechnologies，Stoughton，MA)测定初生的骨钙蛋白。这种分析方法的检测限为0.5ng/ml，而且2％木炭去色的FBS中包含＜0.1ng/ml的骨钙蛋白。结果见图6。碱性磷酸酯酶的活性在用于释放骨钙蛋白的细胞上测量细胞碱性磷酸酶的活性，以37℃下将细胞溶于如上所述的碱性磷酸酯酶缓冲液之后30分钟时p-硝基苯磷酸酯(终浓度12.5mM)水解释放p-硝基苯酚的量表示。立即等分测定碱性磷酸酯酶的活性。用Smith，P.K.、Krohn，R.I.、Hermanson，G.T.、Mallia，A.K.、Gartner，F.H.、Provenzano，M.D.等人，“用二辛可宁酸测定蛋白质”，AnalBiochem，150，1985，76-85中描述的二辛可宁酸法测定蛋白质。结果见图7。对初级成骨细胞中uPA和IGF-1的评价为了评价uPA和IGF-1，在融合的成骨细胞样细胞的条件介质中补入用于最后两天培养的Ham′sF-12/DMEM，不含PBS但含有1％胰岛素-转铁蛋白-硒混合物(ITS，Sigma)。首先，用特定的酶联免疫吸附剂分析法(ELISA；AmericanDiagnostica，Greenwich，CT)测定uPA水平。然后，使用Leprince，P.、Rogister，B.、Moonen，G.A.，“用比色法同时测定培养细胞的无血清条件培养基中的代谢蛋白溶酶原激活剂及其抑制剂”，AnalBiochem，177，1989，341-346中所述的方法，通过水解特异性底物DL-Val-Leu-Arg-对硝基酰苯胺(anilide)(Sigma)测定uPA的活性，所述底物释放的对硝基苯胺可于405nm测定。PAI-1水平通过ELISA、使用可得自AmericanDiagnostica(Greewich，CT)的材料测定。用高灵敏度的不与胰岛素发生交叉反应的ELISA(DiagnosticSystemsLaboratories.Webster，TX)测定IGF-1。用只含有1％ITS的介质进行内控研究，得到的任何结果都应在检测限下。对于细胞培养样品的条件介质，汇总3或4份上清液，冻干，然后于pH7.4的PBS缓冲液中重构。然后按照Mohan，S.、Bautista，C.M.、Herring，S.J.、Linkhart，T.A.、Baylink，D.J.，“在骨细胞条件培养基中测定胰岛素样生长因子-I和-II型的有效方法进展”，Endocrinology，126，1990，2534-42中所述方法处理样品。结果见图8和9。对初级成骨细胞中PGE2的评价初级成骨细胞中的PGE2的测定基本上按照与上述滑液相同的方式测定。结果见图10。从上述结果可以得出结论平衡的COX/5-LO双重抑制剂ML3000可显著减少初期实验性OA的发展，同时在体内抑制PGE2和LTB4的生成。药物的保护作用被认为在很大程度上与对主要的骨关节炎病理生理学途径、即IL-1β和胶原酶-1的过度合成的显著的抑制作用有关。这些作用中的一些显示与抑制LTB4的过度生成有关。参考文献1.PelletierJP、Martel-PelletierJ、HowellDS.Etiopathogenesisofosteoarthritis.InKoopmanWJ，editor.Arthritis&AlliedConditions.ATextbookofRheumatology.第14版，BaltimoreLippincottWilliams&Wilkins；2000.2195-245页。2.Martel-PelletierJ、DiBattistaJA、LajeunesseD、Biochemicalfactorsinjointarticulartissuedegradationinosteoarthritis.InReginsterJY、PelletierJP、Martel-PelletierJ、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GF)不变或减少；(8)碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)不变或减少；(9)硫酸角质素增加；(10)包括溶基质素的基质金属蛋白酶(MMPs)增加；(11)包括溶基质素的基质金属蛋白酶(MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的比例增加；(12)骨钙蛋白增加；(13)碱性磷酸酯酶增加；(14)对激素攻击有响应的cAMP增加；(15)尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)增加；(16)软骨寡聚基质蛋白增加；(17)II型特定胶原新表位的存在，和(18)胶原酶增加。10.权利要求1至5的任一项的用途，其中所述治疗或预防包括施用约1至10mg/kg/天的所述化合物。11.权利要求1至5的任一项的用途，其中所述治疗或预防包括施用除一种或多于一种式(I)化合物之外的一种或多种基本上选自下列物质的成分聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、强力霉素和二甲胺四环素。12.药物组合物，其包含(A)一种或多于一种如权利要求1所定义的式(I)化合物；和(B)一种或多种基本上选自以下物质的成分(1)聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、强力霉素和二甲胺四环素。13.权利要求12的药物组合物，其中所述式(I)化合物为式(Ia)的[6-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-7-苯基-2，3-二氢-1H-吡咯里嗪-5-基]-乙酸、其生理上可接受的盐或生理上可水解的酯。14.治疗或预防需要这种治疗的哺乳动物的一个或多个关节的关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损伤的方法，其包括向所述哺乳动物施用对于治疗或预防关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损伤而言治疗有效量的一种或多种权利要求1至5的任一项所定义的式(I)化合物。全文摘要本发明涉及治疗或预防哺乳动物患病关节的关节软骨和/或软骨下骨组织的退化或损伤，其通过施用式(I)化合物而实现，式(I)中的所有变量具有说明书中给出的含义。优选的式(I)化合物为式(II)化合物。这种治疗可改善、减轻、积极治疗、扭转或预防继所述早期阶段的所述退化之后的关节软骨或软骨下骨组织的任何损伤、损害或损耗。文档编号A61K31/5415GK1549711SQ02817080公开日2004年11月24日申请日期2002年8月29日优先权日2001年8月30日发明者J－P·皮尔蒂尔,J·马特尔－皮尔蒂尔,J-P皮尔蒂尔,囟皮尔蒂尔申请人:默克勒有限公司,阿森蒂亚药物公司