专利名称：α－干扰素质粒DNA－脂质体制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及α-干扰素质粒DNA-脂质体制剂的制备方法。
背景技术：
HPV引起的生殖器扁平或尖锐湿疣，由于其复发率高，因而成为临床治疗的难点。α-干扰素(Interferon，IFN)具有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节作用，为FDA批准的抗HPV药物，治疗效果肯定。目前用IFN治疗生殖器疣时，主要有两种给药途径系统给药如肌肉注射给药及病灶内直接注射给药。IFN长期系统给药会引起一系列副作用，如流感样综合症、突发性听力损失、持续神经毒、甲状腺机能异常等，另外全身系统给药治疗生殖器疣势必造成药物的浪费，增加成本；病灶内直接注射给药产生的疼痛让患者难以接受；IFN霜剂局部给药，虽然方便，但IFN分子为生物大分子(15KD或21KD)，较难进入皮肤角质细胞内发挥疗效，临床表现为治疗效果差，复发率高。为了提高疗效，方便给药，降低成本及副作用，人们正致力寻求新的IFN给药治疗途径。
经皮基因传递系统(Cutaneous gene delivery system，CGDS)治疗由可溶性细胞因子异常调控诱发的许多皮肤疾病时，为一极具吸引力的基因治疗战略。尽管大分子很难透过角质层，但是皮层泡细胞及其附近结构不仅能传递外部分子进入活性皮肤细胞，而且还可促进转基因表达的可溶性蛋白扩散进入周围结构及循环系统。要使基因重组DNA转染进活性皮肤角质层内的靶细胞，发挥皮肤基因治疗的目的，就必需有一合适载体介导质粒DNA进入具有渗透障碍的角质层及其附器。目前，将外源基因转染进皮肤细胞发挥经皮基因治疗的方法有基因枪递药(Gene gun delivery)，SV40载体系统(如pSG5质粒)及病毒载体如腺病毒或疱疹病毒载体等。用基因枪转染外源基因，转染效率低，不能达到基因治疗所需药物浓度；用病毒载体时，有较严重的组织炎症反应和组织细胞毒性；而利用脂质体介导，可将目的基因选择性靶向皮肤角质毛囊角质细胞，有较高的转染效率，且不会出现炎症反应和细胞毒性。所以利用脂质体介导IFN质粒DNA，制备局部透皮转基因制剂，对治疗生殖器疣，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-干扰素质粒DNA-脂质体制剂的制备方法。
本发明步骤将α-干扰素质粒DNA亚克隆进真核表达载体pSG5(Stratagene)，制得表达质粒；将甘油二月桂酸酯(GDL)、胆固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和α-生育酚混合后，70℃溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，再加热至70℃，将70℃无菌水缓慢滴入脂混合物中，使脂类的总浓度达到≥1g/ml，快速混匀两相，冷却至室温，该脂质体储于4℃备用；室温下超声处理上述脂质体，加入含上述表达质粒≥0.1ng/ml的等体积水溶液，混匀后孵育，得到α-干扰素质粒DNA-脂质体。
上述本发明方法中，甘油二月桂酸酯(GDL)、胆固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和α-生育酚各成分之间的比例可以是任意比例，通常为(0.5～10)∶(1～100)∶(1～100)∶(0.1～10)∶(0.1～20)的重量比，优选为5∶25∶27∶1∶2的重量比。
上述本发明方法中，将无菌水缓慢滴入脂混合物中后，脂类的总浓度通常为100～500g/ml。
上述本发明方法中，所加入的含表达质粒的水溶液中，质粒的浓度一般为0.1ng/ml-1g/ml，浓度过高不限。
上述本发明方法中，孵育的温度通常是室温或36℃-42℃，温度过高不限。孵育的时间通常为1～60分钟，时间过长不限。
本发明可为临床提供一种经病灶部位透皮给药后，转基因表达抗乳头瘤病毒(HPV，临床表现为生殖器疣)的新制剂。
本发明方法所得到的制剂具有以下有点(1)疗效显著。由于本制剂通过透皮吸收，直接作用于病灶，作用快速，疗效显著。
(2)使用方便，克服了以往制剂给药的不方便性。
(3)安全，无副作用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
以下是本发明的优选实施例将α-干扰素质粒DNA亚克隆进真核表达载体pSG5(Stratagene)，制得表达质粒。将甘油二月桂酸酯(GDL)、胆固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、α-生育酚按重量比45∶25∶27∶1∶2混合后，70℃溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，再加热至70℃，将适量70℃无菌水缓慢滴入脂混合物中，使脂类的总浓度达到100g/ml，快速混匀两相，冷却至室温，该脂质体储于4℃备用。室温下超声处理上述脂质体，加入含上述表达质粒(25mg/m1)的等体积水溶液，混匀后37℃孵育0.5小时，得到α-干扰素质粒DNA-脂质体。
权利要求
1.一种α-干扰素质粒DNA-脂质体制剂的制备方法，其步骤是将α-干扰素质粒DNA亚克隆进真核表达载体pSG5，制得表达质粒；将甘油二月桂酸酯、胆固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和α-生育酚混合后，70℃溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，再加热至70℃，将70℃无菌水缓慢滴入脂混合物中，使脂类的总浓度达到≥1g/ml，快速混匀两相，冷却至室温，该脂质体储于4℃备用；室温下超声处理上述脂质体，加入含上述表达质粒0.1ng/ml～1g/ml的等体积水溶液，混匀后孵育，得到α-干扰素质粒DNA-脂质体。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是甘油二月桂酸酯、胆固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、α-生育酚按(0.5～10)∶(1～100)∶(1～100)∶(0.1～10)∶(0.1～20)的重量比混合。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是甘油二月桂酸酯、胆固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、α-生育酚按5∶25∶27∶1∶2的重量比混合。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是将无菌水缓慢滴入脂混合物中后，脂类的总浓度为100～500g/ml。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是孵育的温度为室温或36℃-42℃，孵育的时间为1～60分钟。
全文摘要
本发明涉及一种α－干扰素质粒DNA－脂质体制剂的制备方法。将α－干扰素质粒DNA亚克隆进真核表达载体pSG5，制得表达质粒。将甘油二月桂酸酯(GDL)、胆固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE－10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、α－生育酚混合后，70℃溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，再加热至70℃，将70℃无菌水缓慢滴入脂混合物中，使脂类的总浓度达到≥1g/ml，快速混匀两相，冷却至室温，该脂质体储于4℃备用。室温下超声处理上述脂质体，加入含表达质粒的等体积水溶液，混匀后孵育，得到α－干扰素质粒DNA－脂质体。本发明方法可为临床提供一种经病灶部位透皮给药后，转基因表达抗乳头瘤病毒(HPV，临床表现为生殖器疣)的新制剂。
文档编号A61P31/12GK1528464SQ03146998
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者苏薇薇, 季爱民, 杨立伟, 朱永湘, 吴忠, 王永刚 申请人:中山大学