专利名称：用于免疫刺激的ihnv g蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的用于预防传染病的疫苗的用途，尤其是一类新的在鱼类中预防传染病的疫苗的用途。本发明还涉及这样的疫苗，其包含一部分编码弹状病毒如IHNV(传染性造血组织坏死病毒(InfectiousHaematopoietic Necrosis Virus))G蛋白的核酸序列和一部分编码第二种肽的核酸序列，其中所述的第二种肽来自病原体。
背景技术：
有时在人类和兽类医学中使用重组疫苗作为基于灭活或减毒病原体的较传统方法的替代。以这种方式系统递送到身体的多种外源抗原只能激活免疫系统的一条途径，即通过刺激体液免疫反应由主要组织相容性复合体(MHC)II类途径产生抗体。然而，理想的疫苗应该也能诱导细胞反应，其通过激活MHC I类途径破坏受感染细胞。后一反应通过对感染细胞中的外源蛋白质进行胞质降解，从而这些外源物质的片段与MHC I类分子相结合并转运到细胞表面以呈递给CD8+细胞毒性T细胞(CTL)而实现。
核酸疫苗(NAVs)是相对新型的技术形式，对病原体抗原尤其是病毒抗原的递送很有用。由于疫苗编码的病毒蛋白质是通过宿主的细胞器原位表达的，理论上暗示其会引起细胞介导的免疫反应能保护受攻击动物。然而结果却是多种多样的在鱼类中，表达传染性造血组织坏死病毒(IHNV)G蛋白(表面糖蛋白)的NAVs，和表达病毒性出血性败血症病毒(viralhaemorrhagic septicaemia virus)G蛋白的NAVs分别对IHNV和VHSV感染有效。然而，使用基于其他病毒抗原的NAVs难以令人确信地显示出对鱼类的保护。
本发明的目的是提供对由病原体感染引起的多种鱼类和其他动物疾病具有更高效用的疫苗。
发明概述第一方面，本发明提供了这样的表达载体，其包含一部分编码IHNV G蛋白的核酸序列，并进一步包含一部分编码来自非IHNV病原生物的第二种蛋白质序列，条件是所述的第二种蛋白质不为全部或部分的VHSV M基因所编码。一部分编码IHNV G蛋白的序列任选地为IHNV G蛋白经分离的前导序列。第二种蛋白质优选的为来自鱼类病原体的抗原，其中所述的鱼类病原体任选地为病毒。一部分编码IHNV G蛋白的序列可与第二种蛋白质的编码序列融合。
本发明第二方面提供了包含DNA表达载体及可药用载体的核酸疫苗，其中所述DNA表达载体包含一部分编码弹状病毒G蛋白的序列，并且还在同一载体上包含一部分编码非所述弹状病毒病原生物的第二种蛋白质的序列。
本发明还提供了这样的疫苗组合物，其包含携带一部分编码IHNV G蛋白的核酸序列的第一种表达载体，并进一步包含在所述的第一种表达载体或第二种表达载体上携带一部分编码非IHNV抗原的第二种抗原的核酸序列，且还包含可药用载体。在一个实施方案中，疫苗组合物包含佐剂。
第四方面，本发明提供了用于分开地、依次地或同时施用的疫苗组分包(kit of parts)，其包含(i)分离或纯化的部分IHNV G蛋白或包含一部分编码IHNV G蛋白序列的表达载体，和(ii)分离或纯化的部分来自非IHNV病毒的第二种蛋白质或包含一部分编码非VHSV G蛋白的第二种蛋白质序列的DNA表达载体。
另一方面，本发明提供了组合物在生产用于预防或治疗动物的传染性疾病的药物中的用途，其中所述的组合物包含第一种表达载体，此表达载体包含一部分弹状病毒G蛋白的编码序列，还进一步包含所述第一种表达载体或第二种表达载体上携带的一部分第二种蛋白质的编码序列，第二种蛋白质来自能引起所述传染性疾病的病原生物，其中所述的弹状病毒不为传染性疾病的病原体。第一种表达载体可以缺乏来自弹状病毒非G蛋白部分的序列。
在另一方面，本发明提供了组合物在生产用于预防或治疗鱼类非IHNV引起的传染性疾病的药物中的用途，其中所述的组合物包含第一种表达载体，此表达载体包含一部分IHNV G蛋白的编码序列，还任选地包含所述第一种表达载体或第二种表达载体上携带的一部分第二种蛋白质的编码序列，第二种蛋白质来源于能引起所述传染性疾病的病原生物。
另一方面，本发明涉及预防或治疗动物传染性疾病的方法，包括对所述动物施用包含DNA表达载体且还包含可药用载体的核酸疫苗，其中所述DNA表达载体包含一部分弹状病毒G蛋白的序列，并在同一载体上包含一部分来源于非所述弹状病毒病原体蛋白的序列。在一个实施方案中，动物为鱼类，弹状病毒为IHNV或VHSV。
发明详述本发明基于这样的观察，即自核酸疫苗表达的IHNV G蛋白或其前导序列(也称为信号序列)与第二种抗原的串联存在能够增强免疫反应，从而提高针对产生第二种抗原的病原体的保护作用。对这种效应的解释尚未阐明，但其可能与G蛋白上存在免疫刺激基序(motif)相关。也可能抗原性蛋白质与G蛋白或其前导序列的融合导致抗原移位到细胞表面，这样增加了肽对宿主免疫系统的暴露。作为一种选择，保护的增加可能是由于通过这些效应的联合协同作用。
已经使用重组形式的IHNV G蛋白作为接种鱼类抵抗IHNV的基础(US 5,534,555)。目前已知G蛋白的氨基酸序列和核酸序列，例如Koener等，(1987)J.Virol.611342-1349，其在此引用作为参考。
IHNV是弹状病毒科的一员，此科都具有“G”糖蛋白。弹状病毒包括水疱性病毒(如水疱性口炎病毒(VSV))、狂犬病毒属(如狂犬病毒)、短时热病毒属((ephemoviruses)(如牛流行热病毒)和novirhabdoviruses。在本说明书中无论何处提及一部分IHNV G蛋白时，本发明均延伸至任一弹状病毒且尤其是任一novirhabdovirus的一部分G蛋白的用途。Novirhabdoviruses的例子包括病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、蛇头弹状病毒(SHRV)、比目鱼(hirame)弹状病毒、对虾弹状病毒、鲤鱼春季毒血症病毒。VHSV G蛋白尤其可以替代本发明的IHNV G蛋白。
弹状病毒G蛋白序列的免疫增强效应可以在任何同时具有体液和细胞免疫系统的动物中应用于治疗或预防疾病。这样的动物包括所有种类的哺乳动物(包括人类)、鱼类、鸟类和爬行动物。
我们报告了这样一个实验(实施例1)，其中IHNV G蛋白和IPNV(传染性胰腺坏死病毒)VP2抗原在一个DNA质粒上以融合蛋白的形式在鱼体内共同表达。重组IPNV VP2以前在如大肠杆菌(E.coli)的生物中表达过。并用于接种鱼类抵抗IPNV，这在某种程度是获得了成功。US 5,165,925涉及到包含VP2多肽的用于抵抗IPNV的疫苗。
如实施例1中所述将此复合核酸疫苗(NAV)注射到鱼体内，并随后用IPNV攻击。我们观察到，与使用传统的病毒制剂即油辅佐的灭活病毒进行的免疫接种相比存活率显著提高。实际上，G蛋白-VP2融合蛋白NAV的相对存活百分率(RPS)与PBS阴性对照相比超过50％，然而灭活病毒的RPS约为25％。
携带IPNV VP2蛋白而没有IHNV G蛋白的构建体造成相对于PBS阴性对照的平均RPS只有31％。因此，在构建体中包括IHNV G蛋白具有增强对IPNV VP2免疫反应的作用从而比单独VP2蛋白质的保护水平强67％。
第二个实验(实施例2)证实了IHNV G蛋白的免疫刺激作用，其中IHNV G蛋白的前导序列与ISAV血凝素(HA)基因的5′端在DNA表达载体上融合，在攻击试验中使用此载体接种鱼类以抵抗ISAV感染。IHNV G蛋白前导序列的存在大大增强了DNA疫苗中ISAV HA抗原的保护作用。
本发明包含核酸疫苗和基于重组抗原的疫苗。重组抗原疫苗包含分离或纯化的IHNV G蛋白(或其一部分)和分离或纯化的来自非IHNV鱼类病原体中的第二种抗原。部分IHNV G蛋白和部分第二种抗原任选地以融合蛋白的形式共同提供。
在备选的实施方案中，本发明的疫苗组合物可包含分离的或纯化的部分IHNV G蛋白，和包含一部分第二种蛋白编码序列的DNA表达载体；或包含一部分IHNV G蛋白编码序列的DNA表达载体和分离或纯化的部分第二种蛋白质。第二种蛋白质优选地为来源于鱼类病原体的抗原。“分离的”或“纯化的”蛋白质定义为基本上不含其来源细胞或组织的细胞成分或其他污染蛋白质，或基本上不含化学合成时的化学前体物质或其他化学物质。
优选的疫苗为在同一DNA表达载体上携带一部分IHNV G蛋白基因和一部分来自非IHNV病原体的第二种基因的核酸疫苗。备选地，这两个基因可在两个不同载体上共同施与动物。当G蛋白和第二种基因在同一载体上时，它们可以以不同的基因形式表达或以基因串联/基因融合的形式表达。当以基因串联/基因融合形式表达时，编码部分G蛋白或其片段和第二种抗原或其片段的核酸序列按阅读框架融合。
当基因按阅读框架融合时，其意思是指核酸序列中为tRNA所识别的三联体密码记录与天然存在的基因的记录一致，所以翻译得到的氨基酸序列为包含一部分IHNV G蛋白和一部分第二种肽的肽。这两个基因或基因片段优选地为直接融合，不含任何插入序列。当IHNV G蛋白和第二种蛋白质的基因序列或其部分串联融合时，IHNV G蛋白序列或其部分可以位于第二种蛋白质序列的5′端、第二种蛋白质序列的3′端或嵌入序列内部。
为了本发明的目的，“一部分”蛋白质理解为指任何这样的肽分子，其具有所引用蛋白质的至少7个，任选地至少15个，或至少25个，或至少50个，或至少100个连续的氨基酸。“一部分”基因或核酸序列为基因序列的任何一部分，其包含全部编码序列的至少20个，任选地至少50个，或至少100个，或至少200个连续的核苷酸。“一部分”基因或蛋白质可以为全长基因序列或氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明中使用的一部分IHNV G蛋白包含G蛋白的外膜导向前导序列，或其编码核苷酸序列。此部分任选地包含前导序列而不包含G蛋白其他部分。完整的前导序列(从N-端开始阅读)为MDTMITTPLILILITCGANS(SEQ ID NO1)。前导序列的截短但有功能的形式可以用于替代完整前导序列。
当谈及IHNV G蛋白或第二种蛋白质或其分别的编码序列时，应理解为此术语包含具有基本同源的蛋白质或编码序列。“基本同源”在本文中意思是这样的序列，当与参考序列比较时，与参考序列具有至少60％同源性，优选的至少70％同源性，更优选的至少80％同源性，更优选的至少90％同源性，最优选的至少95％同源性。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同源性百分比，为获得最佳比对效果进行序列比对(例如在第一种氨基酸或核酸序列中引入缺口以能与第二种氨基酸或核酸序列进行最佳比对，并且缺口中插入的非同源性序列为比对效果可以忽略)。
当第一种(参考)序列中的某个位点被第二种序列对应位点处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这两种分子在该位点同源(例如在所述位点具有同一性)。在核酸序列比对的情况下，如果在比对的两分子中由于遗传密码的简并性，三联体密码包括编码相同氨基酸的核苷酸，则在特定位点同样具有同源性。
两序列间的同源性百分比为序列共有的同源性位点数量的函数(即％同源性＝同源性位点数量/总位点数量)。序列的比对和同源性百分比的确定可任选地使用数学运算法则完成。适当的运算法则包含在Altschul等((1990)J.Mol.Biol 215430-10)的NBLAST和XBLAST程序中。
此外，具有相同电荷的氨基酸可以互相取代。例如赖氨酸和精氨酸可以互相取代。谷氨酸和天冬氨酸可以互相取代。谷氨酸酯和天冬氨酸酯也可以互相取代。蛋白质中氨基酸的此类电荷相互变化在本领域中是认可的并且产生的蛋白质仍包括在本发明中。
IHNV和其他病原体存在多种不同的地理分离株。这些病原体的核酸序列及其表达的蛋白质的氨基酸序列存在一定程度的变异。本发明中使用的IHNV G蛋白和第二种蛋白质并不限定于任何特定的分离株来源。当为特殊地理区域设计疫苗时，可以方便地将第二种蛋白质变体与此地理区域中流行的分离株相匹配。
本发明的一个实施方案中提供了这样的DNA表达载体，其中IHNV G蛋白和第二种蛋白质的核酸序列可操纵地与转录调节序列连接，还提供了包含DNA表达载体和可药用载体的核酸疫苗。IHNV G蛋白和第二种蛋白质的核酸序列可以连接到一起以在相同的转录调节序列控制下表达，或者可以在不同的转录调节序列控制下互相独立的表达。正如在此使用的，术语“DNA表达载体”指能转运另一个与其连接的核酸的核酸分子。优选的DNA表达载体为真核表达载体。一类载体为“质粒”，指能连接入其他DNA片断的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中其他DNA片段能连接入病毒基因组。在重组表达载体中，“可操纵地连接”意思是目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调节序列连接。
转录调节序列包括启动子和聚腺苷酸化序列。可使用其他核酸序列提高免疫反应，如具有非甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸，或者编码其他抗原性蛋白质或辅助性细胞因子的核苷酸序列。调节序列包括那些指导核苷酸序列在多种类型宿主细胞中组成型或诱导型表达的序列，和那些只指导核苷酸序列在特定宿主细胞中表达的序列(例如组织特异性调节序列)。DNA可以以裸DNA形式存在或者可与利于细胞摄入的制剂(例如脂质体或阳离子脂类)共同施用。DNA接种技术例如在WO 90/11092中进行了综述，在此引用作为参考。
为了在鱼体内最佳表达，可优选地选择对欲接种鱼而言为内源的转录调节序列。例如，可以考虑内源细胞因子或肌动蛋白基因启动子，或其他来源于鱼类DNA病毒的调节序列。US 5,780,448中更详细地解释了应用于鱼类的DNA接种，在此引用作为参考。
使用包含组成型和诱导型启动子的载体，已经在多种生物中(包括大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))成功表达了重组IHNV和其他病原体蛋白质。在重组疫苗中，纯化的IHNV G蛋白和第二种蛋白质可混合到一起共同施用。作为一种选择，包含这两个基因部分融合的载体可通过常规的技术构建并在宿主细胞中表达以制备纯化的重组融合蛋白质。可使用蛋白质纯化的常规方法来制备用于疫苗的重组蛋白质。表达重组蛋白质的宿主细胞裂解物任选地可用于代替经过进一步纯化步骤的重组蛋白质。
基于在此展示的结果，我们要求在动物中治疗或预防传染性疾病的方法，如在鱼类中治疗或预防传染性疾病的方法，包括给动物施用这样的组合物，其包含IHNV G蛋白一部分核苷酸序列(或所编码的蛋白质序列)，并包含引起传染性疾病病原体的第二种抗原的一部分核苷酸序列(或所编码的蛋白质序列)。我们还要求组合物在制备治疗或预防动物(如鱼类)传染性疾病的药物(疫苗)中的用途，其中所述传染性疾病由所述的病原体生物引起，和/或我们还要求组合物用于治疗或预防所述病原体生物感染中的用途，所述组合物包含一部分IHNV G蛋白或其编码核苷酸序列和来自病原体生物的一部分第二种蛋白质或其编码核苷酸序列。
本发明的“第二种”(异源的)蛋白质可以为来源于非IHNV鱼类病原体的蛋白质(或肽或抗原)。第二种蛋白质可以来源于引起传染性疾病综合征的真菌、病毒、原生动物或细菌性鱼类病原体。第二种蛋白质任选地来源于非弹状病毒或非VHSV的病毒。例如，第二种蛋白质可来源于传染性鲑鱼贫血性病毒(Infectious Salmon Anaemia Virus，ISAV)、传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV)、虹彩病毒(Iridovirus)、神经坏死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(Salmon Pancreas Disease Virus，SPDV)、鲤鱼春季毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)、病毒性出血性败血症病毒(ViralHemorrhagic Septicemia Virus，VHSV)、沙氏肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum(细菌性肾病致病体))、鲑类立克次氏体病(Piscirickettsiasalmonis)(鲑类立克次氏体败血症致病体)、弧菌属中的某些种(Vibriospp)、气单胞菌属中的某些种(Aeromonas spp)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckerii)、诺卡氏菌属中的某些种(Nocardia spp.)、假单胞菌属中的某些种(Pseudomonas spp.)、海鱺发光菌(Photobacterium damselae)等等。在优选的实施方案中，第二种蛋白质为病毒来源。已经有大量并且越来越多的来自这些和其他病原体生物的多肽得到纯化和/或克隆和表达，其可在疫苗组合物中与IHNV G蛋白或其编码序列连接来获得或提供。优选的例子包括IPNV蛋白质VP1、VP2、VP3、NS及其编码核苷酸序列；WO01/10469中公布的ISAV蛋白质，包括血凝素、核衣壳、聚合酶和片段7P4、P5蛋白质及其编码核苷酸序列；WO 01/68865中公布的鲑类立克次氏体病(P.salmons)蛋白质，包括OspA、IcmE及其编码核苷酸序列；野田村病毒蛋白质，如核衣壳；SPDV的结构多肽及其编码核苷酸序列(在WO99/58639中公布)。根据本发明的优选疫苗组合物包含这样的DNA载体，其携带与一部分IPNV VP2序列按阅读框架融合的一部分IHNV G蛋白核苷酸序列或其携带与一部分ISAV血凝素序列按阅读框架融合的一部分IHNV G蛋白前导序列。
接受本发明疫苗的首选鱼类为鲑鱼类，包括鲑鱼和鳟鱼，尤其是银鲑鱼(Oncorhynchus kisutch)、溪红点鲑(Salvelinus fontinalis)、褐鳟鱼(Salmotruffa)、切努克鲑鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、马苏大马哈鱼(Oncorhyncus masou)、细鳞鲑鱼(Oncorhynchus gorbuscha)、彩虹鲑鱼(Oncorhynchus mykiss)、北极嘉鱼(Salvelinus alpinus)和大西洋鲑鱼(Salmosalar)。然而对传染性疾病敏感的其他任何鱼类也可受益，如观赏鱼类、锦鲤、金鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄狮鱼、海鲷、黑鲈、梭子鱼、大比目鱼、黑斑鳕鱼、罗非鱼、大菱鲆、wolfish等等。
本发明第二种(异源性)蛋白质也可以为非鱼类的动物病原体抗原，尤其是哺乳动物如人类的病原体抗原。第二种蛋白质可来源于引起动物传染性疾病综合征的真菌、病毒、原生动物和细菌性病原体。可能病原体的非限制性例子包括肝炎病毒(如HBV、HCV)、HIV和其他的免疫缺陷病毒基因、感冒病毒、麻疹病毒、冠状病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、轮状病毒、腺病毒、乳头瘤病毒、汉坦病毒、细小病毒和特殊病毒牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV)、口蹄疫病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感3型病毒(PI3)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、猪呼吸和生殖综合征病毒(PRRSV)；梨形鞭毛虫属(Giardia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、利什曼虫(Leishmania)、阿米巴虫(Amoeba)、内阿米巴虫属(Entamoeba)、锥虫属(Trypanosoma)、弓形体属(Toxoplasma)、疟原虫属(Plasmodium)、隐胞菌属(Cryptosporidia)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、粗球孢子菌(Coccidioides)、芽生菌属(Blastomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、利斯特氏小菌属(Listeria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、艾美虫属(Eimeria)、梭菌属(Clostridia)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、分歧杆菌(Brachyspira)、沙门氏菌属(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、支原体属(Mycoplasma)(如牛支原体、猪肺炎支原体)、密螺旋体属(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、立克次氏体(Rickettsia)、布鲁氏菌(Brucella)、Neospora、梭杆菌属(Fusobacterium)、大肠杆菌(Ecoli)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、微粒孢子虫属(Anaplasma)等等。
任何脊椎动物都可以用本发明的疫苗免疫。尤其要提到的是人类、农田动物的主要物种即牛、马、羊、猪、家禽和宠物。
本发明两种成分的疫苗可以在单一疫苗组合物中制备在一起，或可以分别制备用来分别施用或共同施用。每一种成分任选地以试剂盒形式提供用来分开、依次或同时施用。两种成分可在施用前立即混合到一起。
对鱼类来说，施用本发明疫苗的优选途径为肌肉注射(尤其是注射到轴后肌肉)。可替代的选择为注射到腹腔(用于较大的鱼类)、经口饲喂、或浸入海水或淡水中。推荐体重2g或2g以上的鱼类通过注射施用本发明的疫苗，优选地为10g或以上的鱼类。对浸入或经口施用来说，优选的为体重至少0.1g的鱼类，任选的为至少0.5g，通常为至少2g。
在鱼类之外的动物中，疫苗尤其是核酸疫苗经常通过肌肉注射递送或通过粘膜递送；递送技术包括下列但不局限于电穿孔、皮下或透皮注射、显微注射、喷射注射、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)-介导的转染、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、病毒感染、微颗粒、细菌载体和生物弹(如使用基因枪的粒子轰击)。
本发明的疫苗可以为预防或治疗的目的给动物施用。疫苗能诱导对目标感染疾病的长期保护。在为鱼类的情况下，“长期”保护的意思是接种后长于7天的保护性免疫反应，更优选的为长于20天，最优选的为长于70天。
疫苗的有效剂量可以依受试对象的大小和种类并根据施用方式而变化。最佳的剂量可以通过医生、兽医和水产专家的反复试验确定。对鱼类来说，疫苗在单剂量中可包含0.01-0.5g的重组蛋白质，优选的为约0.05-0.2g的重组蛋白质。核酸疫苗适当的剂量范围为最低皮克数量级或最高毫克数量级，但通常为每单位剂量约0.01-100微克，优选的为每单位剂量0.1-50微克，更优选的为每单位剂量约1-20微克，最优选的为每单位剂量约5微克-10微克。由于鱼类对接种的反应所经受的胁迫，疫苗优选地以单剂量形式作为单次注射疫苗提供。对可注射疫苗来说，单剂量单位的体积适当地为0.025-0.5毫升，优选的为0.05-0.2毫升，任选的为约0.1毫升。
疫苗一般地制成液体溶液、乳剂或悬浮液以注射或在水中递送。也可以制成适于在施用前溶解于或悬浮于液体媒介物，或与固体食物混合的固体形式(如粉末)。疫苗可为冻干的、用无菌稀释剂重构的即用形式，任选的为冷冻干燥的。例如，冻干疫苗可以在0.9％的生理盐水中重构(任选地作为成套疫苗产品的一部分提供)。由于核酸分子的稳定性和长的贮存期限，核酸疫苗尤其适合冻干。作为一种选择，疫苗可以在盐溶液中提供。在加入围栏、槽子和养殖室通过浸没给鱼类施用前，疫苗的液体或重构形式可进一步在小体积水中稀释(如1-10体积)。本发明的药用疫苗组合物可以立即释放或慢速释放的形式施用。
可药用载体或媒介物包括常规的赋形剂并可以为例如溶剂类，如水、油或盐水、葡萄糖、甘油、蔗糖、三卡因(tricaine)、着湿剂或乳化剂、填充剂、包衣剂、粘合剂、填料、崩解剂、稀释剂、润滑剂、pH缓冲剂；或常规的佐剂如胞壁酰二肽、阿夫立定、氢氧化铝、油类、皂苷类、嵌段共聚物和其他本领域已知的物质。在为核酸疫苗的情况下，DNA表达载体可以裸DNA形式递送，或以阳离子脂-DNA复合体、脂质体、磷酸钙共沉淀物、被吸附于微粒子上等形式提供。
在一些情况下可能希望将针对传染性病原体的本发明疫苗和常规疫苗(灭活病原体或重组病原体抗原疫苗或病原体核酸疫苗)组合在组合疫苗中，或组合在包含这两种成分的试剂盒中用于分开、依次或同时施用，以治疗或预防病原体引起的传染性疾病。
实施例1在大西洋鲑鱼Salmo salar中评估针对传染性胰腺坏死病毒的核酸疫苗接种疫苗8℃温度下，将大西洋鲑鱼幼鱼(体重9-26g)放在盛有淡水的两个直径1米的圆形槽子中，并在接种前饥饿24小时。为了接种疫苗，将鱼在浓度为约0.5g/升的3-氨基苯甲酸乙酯(MS222，Sigma，Poole，UK)中麻醉。核酸疫苗在左背侧背鳍下的区域通过肌内注射施用(10μg DNA/50μl剂量)。油辅佐的灭活IPNV疫苗和PBS对照通过腹腔内注射(100μl)施用。每一处理组有40条鱼，对6种疫苗中的每一种疫苗重复两次。
测试组接受下列组合物(1)pUK载体携带卡那霉素抗性基因、CMV立即早期启动子、多克隆位点和牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH polyA)的克隆载体。
(2)pUK+VP2在载体的多克隆位点中连入IPNV VP2全部编码序列的pUK载体。
(3)pUK+IHNG在载体的多克隆位点中连入IHNV G蛋白全部编码序列的pUK载体。
(4)pUK+IHNG+VP2在载体的多克隆位点中连入按阅读框架与IHN病毒糖蛋白(G)融合的IPNV VP2蛋白质全部编码序列的pUK载体，这样G蛋白质位于VP2的5’端。
(5)IPNV+油IPN病毒的灭活制品，用油辅佐。
(6)PBS(阴性对照)。
接种疫苗后6周，用5天的时间使所述鱼适应海水。流入鱼槽的海水逐渐增加而淡水减少，这样在5天结束时鱼就在完全浓度的海水中了。
同居攻击实验807度日(degree days)接种疫苗后，IPN病毒“Cole-Deep”株冷冻的2次传代(a frozen pass 2)上清在无菌PBS中稀释5倍以达到终浓度1×107TCID50/ml。鱼在MS222中麻醉并通过腹腔内注射100μl的病毒悬液成批攻击，这样每一条鱼接受106TCID50剂量。攻击时海水的温度约为11℃，每个槽子中的水流速度约为5升每分钟。
最初观察时每天两次移出死亡的鱼。攻击后8周结束试验。
结论
基于在腹膜内注射的两岁大西洋鲑鱼中同居的攻击实验是成功的腹膜内注射的同居者中累积死亡率达到平均41.25％，这能在4个攻击槽中很接近地重复，标准差为3.95％。
油辅佐的灭活IPNV疫苗的性能通过与PBS接种对照的关系评价。灭活疫苗能提供相对存活百分率(RPS)比PBS接种对照高25％的保护。
核酸疫苗的性能或者与空质粒比较，或者与包含IHNV G蛋白基因的质粒比较。对照质粒与假接种PBS对照比较以确定空质粒或包含IHNV G蛋白的质粒是否具有保护作用。质粒载体pUK表现不显著的保护作用。当载体中包括IPNV VP2蛋白时，与PBS接种对照相比表现显著的保护(31％RPS)。当载体中包括IHNV G蛋白而没有IPNV基因时，与PBS相比的保护作用总计为17％RPS。
性能最显著的疫苗为包含与IPNV VP2串联的IHNV G蛋白基因的NAV。此疫苗接种的鱼表现出与PBS接种对照相比52％RPS的相对存活百分率。
总之，在此试验中带有油佐剂的标准灭活病毒制品已足够可行，但是包含VP2的NAVs的性能要高的多。尤其是，包含与IHNV G蛋白串联的VP2的NAV是最有效的。
实施例2评价抗ISAV的核酸疫苗平均重10g的大西洋鲑鱼幼鱼(＜6月龄)在12±1℃以2.5L/分钟速度流动的水中适应至少7天。以每天1.5％体重的比率给鱼饲喂商售粒状饲料。
接种疫苗前鱼在30mg/l的苯佐卡因中麻醉。核酸疫苗在背鳍前的轴后肌中通过肌肉内注射施用(10μg DNA/50μl剂量)。油乳剂疫苗通过腹腔内注射施用(150μl)。每一个重复的疫苗组有55条鱼，对5种疫苗中的每一种疫苗重复两次。
测试组接受下列组合物(1)pUK载体携带卡那霉素抗性基因、CMV立即早期启动子、多克隆位点和牛生长素聚腺苷酸化信号(BGH polyA)的克隆载体。
(2)pUK-HA在多克隆位点中连入ISAV血凝素蛋白全部编码序列的pUK载体。
(3)pUK-IHNg在多克隆位点中连入IHNV G蛋白全部序列的pUK载体。
(4)pUK-HA-IHNg在多克隆位点中连入ISAV血凝素蛋白全部编码序列并在其5’端与IHNV G蛋白前导序列融合的pUK载体。
(5)ISAV+油ISA病毒的灭活制品，用油辅佐。
于850.5度日对鱼进行攻击。使用同居攻击，其中相同血统的鲑鱼剪短脂肪鳍，腹膜内注射0.1ml培养的ISAV(约每条鱼104TCID50)并放入每一个处理过鱼的槽子中。
每个槽子中的鱼每天两次监测死亡率，共31天。如下计算相对存活百分率RPS＝1-(％疫苗死亡率/％pUK对照死亡率)×100结果阴性对照组(pUK质粒)的累积死亡率为94％。注射阳性对照即单价灭活ISAV疫苗能引起最佳保护(94％RPS)。注射pUK-IHNg质粒作为阴性对照引起某种非特异的保护(RPS 26％)。pUK-HA给予了高水平的保护(RPS 49％)。这种保护作用能通过在3’端加入IHNV G蛋白前导序列(pUK-HA-IHNg)显著地增强(RPS 60％)。这些结果进一步支持了在核酸疫苗中包括IHNV G蛋白序列(或至少其前导序列)以增强对其他IHNV传染性疾病免疫性的好处。G蛋白的前导序列可能在鱼类中引导异源性抗原靶向细胞表面，或者蛋白质中存在特异的基序，其非特异地刺激鱼类的免疫系统。
权利要求
1.DNA表达载体，其包含一部分IHNV G蛋白编码序列并且还包含一部分来源于非IHNV的病原体生物的第二种蛋白质编码序列，条件是所述的第二种蛋白质编码序列不为VHSV M基因的一部分序列。
2.根据权利要求1的DNA表达载体，其中所述的第二种蛋白质编码序列来源于鱼类病原体。
3.根据权利要求1的DNA表达载体，其中所述的第二种蛋白质编码序列来源于非弹状病毒的鱼类病原体。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的DNA表达载体，其包含IHNVG蛋白的前导序列。
5.根据前述任意一项权利要求所述的DNA表达载体，其包含全部IHNV G蛋白的编码序列。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的DNA表达载体，其中部分IHNV G蛋白编码序列和部分第二种蛋白质编码序列按阅读框架融合到一起。
7.根据权利要求2的DNA表达载体，其中第二种蛋白质来源于选自ISAV、IPNV、VHSV、NNV、虹彩病毒、SVCV、SPDV、沙氏肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)、鲑类立克次氏体病(Piscirickettsiasalmonis)、弧菌属中的某些种(Vibrio spp)、气单胞菌属中的某些种(Aeromonas spp)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckerii)、假单胞菌属中的某些种(Pseudomonas spp.)、诺卡氏菌属中的某些种(Nocardia spp.)、和海鱺发光菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.Piscicida)的病原体。
8.根据权利要求7的DNA表达载体，其中第二种蛋白质为IPNV的VP2蛋白或ISAV的血凝素蛋白。
9.包含DNA表达载体和可药用载体的核酸疫苗，其中所述DNA表达载体包含一部分弹状病毒G蛋白并且在同一载体上还包含一部分来自非所述弹状病毒的病原体生物的第二种蛋白质编码序列。
10.根据权利要求9的核酸疫苗，其中所述病原体生物为鱼类病原体。
11.根据权利要求9或权利要求10的核酸疫苗，其中所述弹状病毒为IHNV或VHSV。
12.根据权利要求9的核酸疫苗，其包含权利要求1-8中任意一项所述的DNA表达载体。
13.包含第一种DNA表达载体和第二种DNA表达载体并包含可药用载体的核酸疫苗，其中所述第一种DNA表达载体包含一部分IHNV G蛋白编码序列，第二种DNA表达载体包含一部分非VHSV G蛋白的第二种蛋白质编码序列。
14.融合蛋白，其包含一部分IHNV G蛋白和一部分来源于非IHNV的鱼类病原体生物的第二种蛋白质。
15.组合物，其包含分离或纯化的部分IHNV G蛋白，并且还包含来自非IHNV的鱼类病原体生物的分离或纯化的部分第二种蛋白质。
16.组合物，其包含分离或纯化的部分IHNV G蛋白以及含有一部分第二种蛋白质编码序列的DNA表达载体。
17.组合物，其包含含有一部分IHNV G蛋白编码序列的DNA表达载体以及分离或纯化的部分第二种蛋白质。
18.疫苗，其包含根据权利要求15-17中任意一项所述的组合物和可药用载体。
19.用于分开、依次或同时施用的疫苗组分包，其包含(i)分离或纯化的部分IHNV G蛋白或包含一部分IHNV G蛋白编码序列的DNA表达载体，和(ii)分离或纯化的来源于非IHNV的病毒的一部分第二种蛋白质或包含一部分非VHSV G蛋白的第二种蛋白质编码序列的DNA表达载体。
20.根据权利要求9的核酸疫苗的用途，用于制备预防或治疗哺乳动物病原性感染的药物。
21.根据权利要求9、13和18中任意一项所述的疫苗或根据权利要求19所述的疫苗组分包的用途，用于制备预防或治疗鱼类细菌、病毒、真菌或原生动物感染的药物。
22.根据权利要求9、13和18中任意一项所述的疫苗或根据权利要求19所述的疫苗组分包的用途，用于制备预防或治疗鱼类传染性疾病的药物。
23.组合物在制备预防或治疗鱼类非IHNV引起的传染性疾病的药物中的用途，其中所述的组合物包含DNA表达载体，所述DNA表达载体包含一部分IHNV G蛋白编码序列，还任选地在同一载体上包含一部分来源于非IHNV的鱼类病原体生物的第二种蛋白质编码序列。
全文摘要
疫苗包含鱼类病原体一部分IHNV G蛋白和一部分第二种蛋白质或包含它们各自的核酸编码序列。IHNV G蛋白的存在增强对第二种蛋白质的免疫反应，导致对第二种蛋白质所来源的鱼类病原体感染的保护作用。
文档编号A61K39/145GK1681530SQ03822041
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月16日 优先权日2002年9月17日
发明者N·C·西马德, L·M·布特兰德 申请人:诺瓦提斯公司