与基因沉默相关的方法和组合物的制作方法

专利名称：与基因沉默相关的方法和组合物的制作方法
交叉参考本申请要求了提交于2002年8月12日的美国临时专利申请60/402,769、提交于2002年8月30日的美国临时专利申请60/407,543、提交于2003年5月2日的美国临时专利申请60/467,541的优先权。这些专利申请在此引入作为参考。
背景技术：
采用短的双链RNA(siRNA)的RNA干扰(RNAi)是在哺乳动物细胞中沉默(silencing)基因表达的一种强大工具(参见，例如美国专利号6,506,559、国际公开号WO 01/29058、国际公开号WO 01/68836、国际公开号WO 01/75164、美国公开号20020224784、美国公开号20030125281、美国公开号2002162126、美国公开号20030108923、美国公开号20020173478、Fire，et al.Nature 391806-811(1998)；Yang，etal.，Mol.Cell.Biol.217807-7816(2001)；Elbashir，et al.，Nature411494-498(2001)；Hammond et al.Nat.Rev.Genet.2110-119(2001)；Sharp，Genes Dev.15485-490(2001))。
获得siRNA的标准方法依赖于预先确定的短序列的昂贵的化学合成。由于并不是目标序列的所有部分在沉默过程中都是等效的，因此有必要生成化学合成片断的文库来鉴定那些有效的序列(Holen et al.Nucleic Acids Res.301757-1766，2002))。
另外一种获得siRNA的方法依赖于体外转录(参见，Donze andPicard，Nucleic Acids Res.301757-1766(2002)和Paddison et al.Genesand Dev.16948-958(2002))。虽然这种方法不需要化学合成，但是它依然需要挑选和检测单独的短序列以鉴定哪些是最有效力的。
数种将双链RNA分子剪切成短片断的酶学方法已经被报道了。一种据信能够在体内条件下剪切大的dsRNA以产生siRNA的进化保守的酶已经被鉴定为DICER(Bemstein，et al.，Nature 409363-366(2001))。这种酶含有解旋酶基序(motif)、PAZ(PIWI-ARGONAUT-ZWILLE)结构域和与RNaseIII类似的催化结构域的串联重复。可能含有DICER的果蝇抽提物与大的dsRNA在体外条件下混合，可以产生在一定大小范围内的短dsRNA。在这种混合物中对于RNAi应用的优先大小已经被Tuschl等人确定，是21-23个核苷酸(国际公开号WO 01/75164)。采用含有假定的剪切酶的粗细胞抽提物所带来的相关问题是，比如，不清楚蛋白混合物中什么蛋白是必要的，而且足够可以产生上述观察到的效应。另外，这种抽提物在剪切大的双链RNA时显得不是非常有效，只有相对少量的起始材料会在体外条件下被剪切成所需要的大小，甚至是在经过延长的处理时间之后(Paddison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.991443(2002))。
最近，哺乳动物的Dicer已经由杆状病毒细胞表达系统重组获得。在杆状病毒侵染的昆虫细胞中产生的重组DICER的裂解物被报道可以在锰离子缓冲液存在的情况下由大的双链RNA生成短的双链RNA片断。经过纯化的siRNA片断被用于在培养的哺乳动物细胞系中“沉默”同源基因的表达(Myers et al.Nature Biotechnology，21324-328(2003))。这种方法的局限包括昂贵的杆状病毒表达系统、双链RNA起始材料的不完全消化，以及需要基于胶的纯化或者其它纯化步骤以便在进行沉默实验之前除去前体RNA。
另外一种生成小的双链RNA的酶学方法是采用大肠杆菌的RNaseIII在锰离子存在的条件下部分消化大的双链RNA(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 999942-9947(2002))。与这种方法相关的问题包括在大于大约15个核苷酸的特定大小范围内双链片断的低回收量，以及为了避免消化过度或者消化不足而要进行的滴定所带来的相关的不方便。除非消化被仔细地监控，否则在锰离子存在的条件下用RNaseIII剪切大的双链RNA会生成非常小的片断，这一般被认为在RNAi中是没有用途的。仔细的滴定和掌握最佳的部分消化时间会在整个胶上出现拖尾(smear)，之后，具有特定大小的部分就可以被分离出来，用于培养的哺乳动物细胞的RNA沉默(Yang，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 999942-9947(2002))。这种方法的问题是在下述一些方面缺少确定性(a)终止产物，在这里终止产物涉及具有大于大约15个核苷酸的特定大小的dsRNA的产率，(b)剪切产物所代表的大双链RNA序列的范围。后者可能很重要，因为并不是长的双链RNA序列的所有部分都被认为在基因沉默中具有等同的效应，也许重要的序列所占的比例不够，而不重要的序列所占的比例过大。
由于基因沉默已经成为理解细胞和生物体中分子功能的重要方法，这就需要有一种快速、费用低廉和可靠的方法来获得适合于任何基因的沉默的双链RNA。
发明概述本发明的一个实施方案提供了用于产生不均一siRNA(hsiRNA)混合物的方法，这个方法包括在含有二价过渡金属阳离子和RNaseIII的反应混合物中消化大的双链RNA的制备物。在过渡金属离子存在的条件下用RNaseIII消化大的双链RNA，可以在RNaseIII与大双链RNA的重量比为大约0.005∶1到25∶1之间时进行。在更加特别的情况下，这个重量比在大约0.0125∶1到10∶1之间。可以用于制备hsiRNA混合物的过渡金属离子包括锰、镍、钴、锌和镉。二价过渡金属离子的合适浓度大约是5-100mM。尽管浓度不是非常关键的，但10-20mM的锰离子是优选的范围。hsiRNA的生成可能在大约6小时之内就完成了，优选在大约2小时之内完成，或者更优选在1个小时之内或者甚至在大约5分钟的时间内完成。
本发明的一个实施方案提供了产生不均一siRNA(hsiRNA)混合物的方法，这个方法包括在含有RNaseIII的反应混合物中在酶与底物的重量比高于或者等于大约0.25∶1时消化大的双链RNA的制备物。
在本发明的一个实施方案中，沉默或者降低一个或者多个目标基因的表达的方法包括向宿主细胞中导入能够沉默或者降低目标基因的表达的hsiRNA混合物。相应地，这种hsiRNA可以通过下面两种方法制备(a)在含有二价过渡金属阳离子和RNaseIII的反应混合物中消化大双链RNA的制备物，或者(b)在含有RNaseIII的反应混合物中在酶与底物的重量比高于或者等于大约0.25∶1时消化大双链RNA的制备物。一系列不均一双链RNA片断可以被导入到宿主细胞中，其中这些片断具有重叠的序列，而且大小为大约15-30个碱基。通过应用RNaseIII的体外酶切由大双链RNA获得了hsiRNA，这套hsiRNA所具有的序列则代表了上述大双链RNA的序列的实质部分。在上述这些方法中，大双链RNA具有的核苷酸序列与整个或部分的目标基因或mRNA互补。
本发明的一个实施方案提供了一系列双链RNA片断，其中包括多个大小为大约15-30个核苷酸的重叠片断，这些重叠片断来自于一个或者多个大双链RNA的体外酶切，其中酶优选纯化的，所述重叠片断代表了所述的一个或者多个大双链RNA的序列的实质部分。大双链RNA的其中一条链特征地具有与目标信使RNA的部分或者整个序列互补的序列。优选地，在任何胶纯化步骤之前，这一系列片断中至少有大约50％的片断的大小在21-22个核苷酸之间。
大双链RNA的序列中被这一系列双链RNA片断代表的实质部分的比例可以超过50％，或者优选超过65％。另外，这一系列RNA片段中有超过30％的RNA片断可以具有大约18-25个碱基对的片段大小。此系列中至少一个片断，但多达至少50％，或者75％或者甚至是100％的片断都可以导致目标mRNA的剪切。这些片断另外还可以在被导入到真核细胞的时候导致基因沉默。
本发明的另外一个实施方案提供了构建DNA克隆文库的方法，其中，每个克隆对应于来自于hsiRNA混合物的一个或者多个双链RNA片断。这个方法包括步骤(a)将hsiRNA混合物变性，形成未配对的RNA链的混合物；(b)将第一单链DNA引物连接到未配对的RNA链的3’端，将第二单链DNA引物连接到未配对的RNA链的5’端；(c)反转录嵌合的DNA-RNA产物，形成互补DNA片断；(d)采用第二单链引物来合成第二链，从而由被反转录的DNA-RNA产物合成双链DNA，或者采用依赖于聚合酶的扩增方法来扩增这种DNA-RNA产物；以及(e)将一个或者多个DNA片断插入到载体中，形成DNA克隆文库。这个实施方案还可以包括在第一个连接步骤之前用酶学方法去除各条链5’端磷酸的步骤，以及在第二引物连接之前将第一引物连接的产物的5’端通过酶学方法进行磷酸化的步骤。
在上述(b)步骤中，RNA链的5’端可以被去磷酸化，而RNA链的3’端可以含有羟基。上述的第一DNA引物可以在5’端和3’端都含有磷酸基团，它在第二引物被连接到5’端之前连接到RNA链的3’端。另外，已与第一引物连接的RNA链可以进一步被磷酸化，然后再与第二引物连接。在这个反应中第二引物可以在其3’端没有被磷酸化。在上述方法中用到的载体可以是pUC19或者Litmus载体。然而，任何适合于克隆DNA片断的载体都可以使用，包括那些用于在真核细胞中表达的载体。
通过上述方法产生的DNA克隆可以用于降低真核细胞中一种或者多种目标基因的表达。在细胞或者生物体中降低目标基因的表达提供了分析在这样的细胞或者含有这样的细胞的组织或者整个生物体中由此导致的表型变化的手段。对基因表达在表型中的作用的理解可以为了解疾病的机理和治疗和诊断疾病的方法提供深入的认识。它还可以为增强生物体中某种需要的特性提供途径。利用上述的hsiRNA混合物或者DNA克隆进行的基因沉默所导致的基因表达的改变可以为分析该基因产物在其中发挥功能的生化通路提供有价值的工具，而且可以与其它试剂比如抗体一起使用。
上述DNA克隆的可用性为制造非人类的转基因动物创造了机会，其中特定目标基因的表达由于可表达特定siRNA片断的重组DNA的存在而被改变。
在本发明的一个实施方案中，提供了制备hsiRNA混合物的试剂盒，其中包括RNaseIII的制备物、含有浓度范围为大约5mM-100mM的锰离子的RNase缓冲液，以及用于合成大双链RNA的可选的试剂。
本发明的一个实施方案提供了获得大双链RNA分子的方法，它包括(a)将编码双链RNA的DNA片断或DNA片断文库插入到载体中，该载体的克隆位点的两侧具有相反方向的启动子比如T7启动子；(b)进行体外或者体内转录；以及(c)获得大的双链RNA分子。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于鉴定hsiRNA混合物是否能够增加目标基因沉默的快速发现方法，它包括(a)合成一系列大双链RNA，每个大双链RNA都具有与目标基因的一个片段互补的序列；(b)在锰离子存在的情况下用RNaseIII消化各个大双链RNA，生成相应的hsiRNA混合物；(c)将各hsiRNA混合物导入到真核细胞中检测是否有基因沉默发生；以及(d)确定哪一种hsiRNA混合物导致了增强的基因沉默。可以通过组合一种预选的hsiRNA混合物和第二种被挑选的hsiRNA混合物，或者，基于沉默作用的活性(silencingactivity)，将来自于hsiRNA混合物或其一部分的各个siRNA片断组合起来以进一步增强基因沉默的效果。这些片断可以被组合，形成一种具备所需的基因沉默活性的新的混合物。
本发明的一个实施方案提供了由mRNA中的剪切位点来鉴定对应于siRNA的序列的方法，这个方法包括(a)通过酶学方法获得hsiRNA混合物；(b)将hsiRNA导入到细胞中；(c)从该细胞中提取被剪切的mRNA；(d)确定被siRNA剪切的mRNA的剪切位点处的末端核苷酸的序列；以及(e)通过剪切位点的序列和邻近的核苷酸由完整的mRNA鉴定出siRNA的序列。这种方法可以被利用以获得一系列的siRNA片断，其包括大小为约15-30个核苷酸的与mRNA特异性地结合以起始mRNA的剪切的双链RNA。


图1A显示的是Mn2+离子浓度对hsiRNA混合物的生成的影响。
20微升的反应混合物中含有对应于人类PKR基因的400bp的双链RNA(0.25微克)、大肠杆菌RNaseIII(终浓度0.05μg/μl)，以及5、10、20、50mM的氯化锰缓冲液(泳道2-5)或者10mM的氯化镁缓冲液(泳道6)，将反应物在37摄氏度温浴20分钟。消化产物用20％的TBE丙烯酰胺凝胶分析。在各种浓度的锰离子存在的情况下获得的20-25bp的片断的量都比在镁离子存在的情况下要多。
图1B显示的是不同的RNase浓度在20mM锰离子缓冲液中对hsiRNA混合物的形成的影响。
50微升的反应混合物中含有对应于萤火虫荧光素酶的1000bp的双链RNA(2.5μg)，以及0、0.5、1、2、4、8和16微升的RNaseIII(1.36mg/ml)，在37摄氏度消化20分钟。反应被终止以后，将每个反应的40μl样品用20％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。大小在20-25个碱基对之间的hsiRNA混合物(用括号标示)的量用荧光密度计检测溴化乙锭染色的胶来确定，结果如直方图所示(荧光强度×面积)。4微升的RNaseIII(1.36mg/ml)就足以产生一定比例的在所需大小范围内的片断。
图1C表示的是如何确定RNaseIII和底物的优化比例以有效地产生hsiRNA混合物，其中使用可变数量的RNaseIII和固定量的底物。
50微升的反应混合物中含有对应于线虫几丁质合成酶的1000bp的双链RNA(0.56μg)，用不同量的RNaseIII消化。泳道2-5的RNaseIII和底物的重量比分别被计算出来，为1.7、0.8、0.4和0.2。该剪切缓冲液含有10mM的氯化锰。泳道2-9的每个50微升样品中含有的酶的数量是0.1、0.05、0.025、0,012、0.006、0.003、0.0015、0.0007μg/μl。泳道1含有双链DNA标记分子，泳道10不含有酶。
图1D表示的是如何确定RNaseIII和底物的优化比例以有效地产生hsiRNA混合物，其中使用固定量的RNaseIII和可变数量的底物。
50微升的反应混合物中含有浓度为0.1μg/μl的RNaseIII和可变数量的几丁质合成酶双链RNA，其中泳道1-4中的底物浓度分别是0.69μg/μl、0.37μg/μl、0.17μg/μl和0.06μg/μl，RNaseIII和底物的比例(重量比)分别是0.2、0.4、0.8和1.7。
图1E表示的是在10mM锰离子存在的条件下温浴时间对hsiRNA混合物形成的影响。5.6微克的双链RNA(1000bp)在100微升溶液中用10微克总RNaseIII消化。每个泳道含有反应混合物的十分之一，对应的反应时间为1、10、20、30、40、60、90、120和180分钟(泳道1-9)。泳道10含有双链DNA标记分子。
图1F显示的是在Pharmacia Q Sepharose HP阴离子交换柱上纯化hsiRNA。将1毫克CREB双链RNA(800bp)在50mM Tris-HCl，pH7.5、20mM MnCl2、1mM二硫苏糖醇中于37摄氏度用1毫克RNaseIII消化20分钟。消化后的样品直接上样到1毫升的Q Sepharose HP柱子上，用5毫升的10mM Tris-HCl，pH7.5(缓冲液A)清洗，用梯度为0-2.0MNaCl的缓冲液A进行洗脱。使用的流速为2ml/分钟。RNaseIII在NaCl浓度为0.025-0.2M之间时从柱子上洗脱下来。泳道1-10显示的是来自于柱子的hsiRNA洗脱物的谱图，箭头(泳道6)对应于主要是大约18-25个碱基长度的hsiRNA被洗脱下来的梯度(0.40-0.45M NaCl)的位置。
图2显示的是Mg2+、Mn2+、Co2+和Ni2+对RNaseIII消化GFP双链RNA(800bp)的影响。
每个终体积为50微升缓冲液的反应混合物中含有1微克GFP双链RNA，以及终浓度为10mM的金属离子Mg2+(泳道1和2)、Mn2+(泳道3和4)、Co2+(泳道5和6)、Ni2+(泳道7和8)，对于每种金属离子分别使用0.04μg/μl和0.02μg/μl的RNaseIII。泳道9是全长的GFP双链RNA。泳道M含有的标记是20、40、60、80bp长的双链DNA。
图3A显示的是用嵌入染料检测的DNA片断(左边)与用放射性标记的hsiRNA片断作为探针检测的DNA片断之间的相关性，其中hsiRNA片断来自于对应于DNA底物的双链RNA。
p53的DNA片断被用作模板来生成hsiRNA混合物，如实施例VII所示。泳道1显示的是未消化的DNA；泳道2显示的用AciI消化的DNA；泳道3显示的是100个碱基的梯度标记。DNA样品在琼脂糖凝胶上分离之后，用溴化乙锭染色(左图)，然后根据实施例III再被转移到膜上。然后这些DNA被经胶纯化的标记hsiRNA混合物检测(右图)。
图3B显示的是图3A中第二泳道中各条带的溴化乙锭荧光强度(线)和放射性活性(条形图)的定量分析。染色胶和放射性胶上的条带的强度对应于基于片断大小的预测信号。DNA杂交的信号表明，放射性hsiRNA可以代表母本RNA的整个长度。
图4A是克隆RNaseIII消化产物的方法示意图。
图4B是malE转录子的序列(SEQ ID NO1)，其两侧为被反向的T7启动子围住的Litmus 28i多接头序列(polylinker sequence)。开始被用来将malE克隆到Litmus的限制性位点被标记出来。箭头对应于如图4A中所示的被克隆的序列；箭头所指的方向标示着该序列对应于所示的序列(从左到右)或者其互补链(从右到左)。
图4C是GFP转录子的序列(SEQ ID NO2)，其两侧为被反向的T7启动子围住的Litmus 28i多接头序列(polylinker sequence)。开始被用来将GFP克隆到Litmus的限制性位点被标记出来。箭头对应于如图4A中所示的被克隆的序列；箭头所指的方向标示着该序列对应于所示的序列(从左到右)或者其互补链(从右到左)。
图4D是一个直方图和表格形式的总结，它报告了插入到各个DNA克隆中的插入物的长度。这些数字是通过分析所有malE和GFP克隆而得到的。y轴代表克隆的数目，而x轴表示的是插入物的长度。
图5表示的是，用Ffluc的hsiRNA混合物转染果蝇细胞(实施例VI)，基本上沉默了GL-2萤火虫荧光素酶，而在Mg2+存在和Mn2+缺乏的条件下获得的RNaseIII消化产物没有这样的效果。
特异的目标基因沉默是通过比较在同时表达萤火虫荧光素酶和海肾(Renilla)荧光素酶的果蝇细胞被针对萤火虫荧光素酶的hsiRNA混合物转染之后其细胞提取物的发光来证明的。该比较是用直方图来表示萤火虫荧光素酶发光和海肾荧光素酶发光的比值，即相对发光单位(RLU)。在直方图中显示的是对照细胞，没有转染任何形式的双链RNA片断；对应于荧光素酶的未消化的双链RNA(luc1.2kb)；在镁离子存在的条件下用RNAseIII剪切后的Ffluc双链RNA(luciiimg)；转染了Ffluc hsiRNA的细胞(luciii mn)；和转染了22bp的化学合成的针对GL3荧光素酶的siRNA的细胞(siluc)。
图6A显示的是，用荧光显微技术观察到的GFP hsiRNA混合物有效地沉默绿色荧光蛋白(GFP)在HEK-293细胞中的表达。(i)对照，其中细胞已经转染了含有GFP cDNA的质粒；以及(ii)转染了含有GFP cDNA和对应于GFP的hsiRNA的质粒的细胞(实施例III)。
图6B显示的是，对于所使用的hsiRNA，基因沉默是特异性的。HEK-293细胞中荧光素酶的量通过发光强度(RLU)来测量，在没有转染双链RNA(ctrl)的细胞和转染了来源于GFP双链RNA的hsiRNA(GFP-RNAsesIII)混合物的细胞中都没有观察到对荧光素酶活性的影响。
图6C显示，hsiRNA混合物和合成的hsiRNA同样有效地沉默荧光素酶。HEK-293细胞中的荧光素酶是通过发光强度(RLU)来测量的。没有转染双链RNA的细胞(ctrl)；转染了来自于萤火虫荧光素酶双链RNA的hsiRNA混合物的细胞(Ffluc-hsiRNase)；转染了针对GL3荧光素酶的合成siRNA的细胞(GL3-siRNA)。hsiRNA混合物和siRNA混合物结果都导致目标荧光素酶的沉默。
图7显示的是在COS-7细胞中用GFP hsiRNA进行目标基因沉默的潜力。荧光显微技术显示，转染了表达GFP的质粒和6ng GFP hsiRNA的细胞有基因沉默发生(b)，转染了表达GFP的质粒和30ng GFPhsiRNA的细胞有基因沉默发生(c)，而在对照细胞(没有转染双链RNA)(a)、用5ng PKR hsiRNA转染的细胞(d)或者用30ng PKRhsiRNA转染的细胞(e)中都没有可检测到的基因沉默发生。
图8显示的是，猴COS-7细胞在用人类p53 hsiRNA混合物或者Rluc-hsiRNA混合物转染之后内源性的猴p53和转染的人p53的表达沉默。COS-7细胞同时转染了表达海肾荧光素酶(Rluc)的质粒。
图8A显示的是用抗p53抗体对细胞抽提物的蛋白质印记分析。E＞指示的是内源p53的位置，而T＞指示的是转染的p53片断(氨基酸100-353)的位置。蛋白质印记反映了细胞中转染的p53和内源的p53的数量用50ng Rluc-hsiRNA转染之后(泳道1)；用50ng人类p53hsiRNA混合物转染之后(泳道2)；用100ng人类p53 hsiRNA混合物转染之后(泳道3)；以及没有转染(泳道4)。
图8B显示的是，Rluc-hsiRNA沉默所转染的细胞中的海肾荧光素酶表达，如图8A中所示，而p53-hsiRNA混合物对于荧光素酶的表达没有任何影响。直方图中标记着1、2和3的条柱对应于图6A中的泳道1、2和3，这里测量的是海肾荧光素酶的表达水平(RLU)。直方图显示，在泳道1，Rluc-hsiRNA混合物沉默了荧光素酶的表达，但没有沉默p53；在泳道2和3，有效地沉默内源p53和人类p53的p53-hsiRNA混合物对海肾荧光素酶没有明显的沉默效应。
图9是试剂盒的示意，该试剂盒可以用于制备任何所需的大双链RNA，它在锰存在的条件下用RNAseIII剪切，这样就形成了可以转染到细胞中以用于基因沉默研究的hsiRNA混合物。
图10A是使用了抗DnMt1抗体的蛋白质印记，它说明了三种hsiRNA混合物对DnMt1的基因敲除效应，其中每一种混合物对应于一段不同的DnMt1片断。这种基因敲除效应是通过对应蛋白条带的减弱或者消失来检测的。
泳道1含有来自未转染细胞的抽提物；泳道2含有转染了表达DnMt1的质粒的细胞的抽提物；泳道3含有转染了表达DnMt1的质粒和对应于荧光素酶的100ngsiRNA的细胞的抽提物；泳道4含有转染了表达DnMt1的质粒和对应于DnMt1片断1的100ng hsiRNA的细胞的抽提物；泳道5含有转染了表达DnMt1的质粒和对应于DnMt1片断3的100ng hsiRNA的细胞的抽提物；泳道6含有转染了表达DnMt1的质粒和对应于DnMt1片断2的100ng hsiRNA的细胞的抽提物。
图10B是使用了抗p53抗体的蛋白质印记，它表明在图10A中所示的三种混合物缺乏对p53表达的基因敲除效应。泳道1-6含有的抽提物如图10A所述。
图11是用于鉴定目标mRNA中siRNA诱导的剪切位点的示意(a)具有已知序列的目标mRNA，它将接受hsiRNA混合物的处理，所述的hsiRNA混合物是在20mM锰离子存在的条件下用RNaseIII剪切大双链RNA而获得的hsiRNA混合物。
(b)剪切后的mRNA片断。
(c)被标记过的延伸DNA引物和延伸产物。
(d)引物延伸产物在测序凝胶上被分析。
实施方案描述在存在含有锰离子或者其他二价过渡金属离子的缓冲液和/或高的酶与底物比的条件下，用RNaseIII消化得到不均一的小双链(ds)RNA片断的混合物，其含有相互重叠的序列，代表着大双链RNA序列的实质上的一部分，这些片断可以有效地沉默基因表达。
由大双链RNA生成用于基因沉默的小双链RNA的酶学方法比化学合成方法具有优势。然而，DICER抽提物或者重组DICER只能够以较低的量获得，而且其在体外条件下的剪切相对不是很有效。另外，DICER剪切RNA的机制可能导致在所产生的混合物中只有很少的能够作为用于沉默的潜在siRNA(Zhang et al.EMBO J.215875-5885(2002)；Amarzguiouri，et al.，Nucleic Acids Res.31589-595(2003))。
相反，可快速地大量制备且活性很高的RNaseIII却迅速地将大双链RNA剪切成对于基因沉默没有效果的片断。
RNaseIII的酶学特性已经由于基因沉默之外的其它原因而被研究过了。在这些实验中，一些实验用其他二价阳离子代替了酶缓冲液中的镁离子。然而，结论是这样的替换对于RNaseIII活性来说，其效果还不如镁。(Li et al.Nucleic Acids Res.211919-1925(1993)；Yang，etal.，Mol.Cell.Biol.217807-7816(2001)；Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413437-13441(1997)；Robertson，et al.，J.Biol.Chem.24382-91(1968)；J.J.Dunn，“The Enzymes”，(P.D.Boyer，ed.)，p.485，Academic Press，New York(1982)；D.Court，“Control of Messenger RNAlity”(J.G.Belasco and G.Brawerman，eds.)，p.71 Academic Press，NewYork(1993)；and Nicholson，FEMS Microbiol.Rev.，23371(1999))。Sun和Nicholson(Biochem.405102-5110(2001))利用Mn2+离子阐明了这种酶与一个60个碱基长的发夹RNA的反应机制，所述的RNA对应于RNaseIII的一种已知的天然底物。这篇文献报道说在锰离子存在的条件下，RNaseIII的活性高峰是在3mM的锰离子浓度时，然后随着锰离子浓度的升高活性急剧下降。锰被认为在高浓度时会结合到该酶的抑制位点上。
尽管在现有技术中用其它的二价阳离子替换镁离子带来的结果并不是乐观，锰离子对RNaseIII活性的影响还是在这里被研究，以确定其对大双链RNA的剪切的影响。在此报道的发现为制备新的耗费低的、生物上有效的基因沉默试剂的新方法提供了基础。
在此描述的方法具有的优势包括(a)通过一个快速且耗费低的程序获得增加浓度的具有适合于基因表达沉默的大小的双链RNA片断，而且这个流程不依赖于基于胶的大小分离步骤。这种方法提供了hsiRNA混合物，其含有一系列的双链RNA片断，其中少于大约5％是未被剪切的大双链RNA，多于大约8％是具有18-25个碱基对之间的片段大小。事实上，在这种方法的一个实施方案中，混合物可以含有超过15％、20％或者40％的片断具有的大小在18-25个碱基对之间。由于它的简单性，这个方法可以胜任自动化和高通量；(b)形成具有基因沉默活性的双链RNA片断的制备物，而不需要鉴定引起基因沉默效应的特定片段；(c)提供了利用该方法的产物的一种手段，即克隆单个的片断或者形成克隆文库或克隆阵列，使得能够将这些片段相对于它们所源自的RNA进行作图，以及检测这些单个的片断的基因沉默活性；(d)提供siRNA试剂以用作以下应用采用标准的核酸转染或者转化技术来沉默真核细胞或者生物体中的单个基因或者基因家族以研究其功能；以及(e)利用这些siRNA试剂作为治疗药物或者将其应用于治疗试剂筛选或者目标的确认分析。
在说明书和相应的权利要求中使用的下面这些术语已经在下面被定义。除非在这些术语被使用的上下文中另有规定，这些定义应该都是适用的。
“hsiRNA混合物”意指不均一(h)小双链RNA片断的混合物，这种混合物含有至少一个适合于沉默基因表达的片断(siRNA)。hsiRNA混合物中的这些RNA片断中总是有一部分(超过片断总数目的15％)片断具有18-25个碱基对的长度，这是通过溴化乙锭染色的非变性聚丙烯酰胺胶分析得到的结果。大于25个核苷酸或者小于18个核苷酸的片断的存在并不被排除。这种hsiRNA混合物优选在二价过渡金属离子——优选锰离子——存在的条件下，通过RNaseIII消化“大”双链RNA而得到。
“沉默”意指通过有目标地抑制细胞中的基因表达而导致部分或者全部的功能丧失，也可以称为“敲除”。根据环境和关注的生物学问题，部分地降低基因表达可能是优选的。作为选择，可能需要最大程度地降低基因表达。沉默的程度可以通过本领域已知的任何方法来确定，所述方法的一部分被总结于国际公开号WO 99/32619，这篇文献在此引入作为参考。根据分析方法的不同，基因表达的定量允许检测不同程度的抑制，比如大于10％、33％、50％、90％、95％或者99％。
“大双链RNA”意指长度大于大约40个碱基对的任何双链RNA，比如大于100bp的双链RNA，或者更加特定的情况，大于300bp的双链RNA。大双链RNA的序列可以代表mRNA的一个片断或者整个mRNA。大双链RNA的最大长度在这里没有限制。双链RNA可以包括修饰的碱基，其中所述修饰可以是在磷酸-糖骨架上或者是在核苷上。这样的修饰可以包括氮或者硫杂原子或者本领域已知的任何其它修饰。双链RNA可以通过酶学方法、通过重组技术和/或通过化学合成或采用商业化的试剂盒比如MEGASCRIPT(Ambion，Austin，TX)以及本领域已知的方法来制备。本发明的一个实施方案是利用HiScribeTM(新英格兰生物实验室公司，贝佛利，麻萨诸塞州)来制备大双链RNA。其它的制备和储存大双链RNA的方法在国际公开号WO 99/32619中有所描述。
双链结构可以由自身互补的RNA链来形成，比如发夹(hairpin)结构或者微RNA(micro RNA)中出现的情况，或者通过两个不同的互补RNA链的退火来形成。
“不均一(heterogeneous)”在用于hsiRNA混合物时，意指在二价过渡金属离子存在的条件下单个大双链RNA或者大双链RNA混合物经过RNaseIII剪切所产生的具有不同序列的双链RNA片断。这些片断从总体来看包含了来自于整个长度的大RNA的序列，因而形成了不均一的混合物。
“RNaseIII”意指自然发生的酶或者它的重组形式，而且可以包括突变体和衍生物或者同源物。在此描述的细菌RNaseIII可以在哺乳动物细胞中用于沉默操作的实用性也支持了在本实施方案中采用来自于真核生物或者原核生物的RNase。本发明的实施方案并不排斥使用多于一种的RNase来制备hsiRNA混合物。在此定义的RNaseIII的特征是蛋白上的氨基酸保守序列[DEQ]-[kRQT]-[LM]-E-[FYW]-[LV]-G-D-[SARH](PROSITEPDOC00448文档，关于RNaseIII)。
在本实验中，当单位(units)被用于描述RNaseIII的浓度时，转换成重量/体积的公式为32个单位＝1μg/μl RNaseIII。可溶的细菌RNaseIII酶可以从重组来源方便地纯化，而且现在已经商业化了(新英格兰生物实验室公司，贝佛利，麻萨诸塞州)。
“完全消化”意指这样的RNaseIII反应，其中大于大约50个碱基对的双链RNA片断(除了滞留在上样孔中或者与酶结合的消化物质之外)已经不再能够在20％聚丙烯酰胺凝胶上用溴化乙锭染色检测得的。
“宿主细胞”意指培养的真核细胞或者动物细胞，包括脊椎动物比如哺乳动物，包括人类，以及无脊椎动物比如昆虫。宿主细胞也意指来自植物或者微生物的细胞。
“重叠(overlapping)”意指此时两个RNA片断具有的序列可以通过多个核苷酸重叠在一条链上，比如，其中所述的多个核苷酸(nt)的数目可以少至2-5个核苷酸或者是5-10个核苷酸或者更多。
“互补序列”意指这样的序列，它不一定要与与之杂交的序列100％相同，但是可以在严紧条件(stringent conditions)下与特定的核酸杂交，其中所述的严紧条件可以包括400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或者70℃温浴12-16个小时之后清洗。序列差异可以被容忍，比如这些差异是由于遗传突变、株系多样性、进化差异或者化学修饰造成的。
信使RNA的“部分或者全部”意指mRNA上与大双链RNA互补的部分。
“实质部分(substantial portion)”意指大双链RNA序列中被hsiRNA混合物中含有的序列所代表的序列的量。在一个实施方案中，代表的序列的比例超过20％。在另外一个实施方案中，代表的序列的比例可以大于30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％。
“一个或者多个双链RNA”意指就序列而言彼此不同的双链RNA。
“目标基因或mRNA”意指任何感兴趣的基因或者mRNA。事实上，以前通过遗传学鉴定或者通过测序鉴定的任何基因都可以代表一个目标。目标基因或者mRNA可以包括发育基因和调控基因，以及代谢基因或结构基因，或者编码酶的基因。目标基因可以在那些其表型正在被研究的细胞或者生物体中以一种直接或者间接影响表型特征的方式表达。目标基因可以是内源也可以是外源的。这样的细胞包括成年动物或者胚胎期动物体内的任何细胞，或者包括接合体在内的植物的任何细胞，或者是任何分离出的细胞，比如无限传代(immortal)细胞系或者原代培养细胞。
要将hsiRNA混合物导入到脊椎动物、无脊椎动物、植物或者原生质体细胞或者微生物，可以将其直接引入细胞或者导入到细胞外的腔室或者肠道空间中，使其进入生物体的循环体系，可以通过口服、通过浸泡、通过透皮途径、通过穿透黏膜的途径、通过局部施用或者通过采用病毒载体来使DNA侵染宿主。
转染或者转化的标准程序可以用于将siRNA导入到培养的细胞中，比如采用Lipofectamine 2000、Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)、TRANS-IT TKO(Mirus Corp.，Madison，WI)、Targefect(Targeting Systems，Santee，CA)、磷酸钙或者电穿孔的程序。经过改造的含有hsiRNA片断或者siRNA片断的载体可以包括细菌载体、质粒或者用于转化或者转染整个生物体的病毒载体。可以利用用于植物的基因枪，比如导入双链RNA到叶绿体中。导入外源核酸到生物体或者细胞的方法已经在本领域广为人知。将hsiRNA混合物的DNA克隆导入到整个动物中可以通过用于导入核酸的标准技术来实现，所述的DNA克隆表达来自于特定的hsiRNA混合物的单个片断。
在本说明书以及权利要求中，单数形式“一个”(a或者an)、“这个”或“那个”(the)包括了对复数形式的引用，除非上下文容清楚地在另有说明。
剪切的条件虽然下面提供了剪切的特定条件，但这些条件并不是限制性的。等同的配方和缓冲液可以方便地替代目前的实施方案。
hsiRNA混合物可以由大双链RNA、RNaseIII酶和标准的含有二价过渡金属的缓冲液形成。优选的过渡金属是锰而不是钴、镍、镉、锌或者其它也可能用于生成hsiRNA混合物的过渡金属离子(实施例II)。所需反应产物的形成对于金属离子浓度不是非常敏感(实施例I)。图1A显示，锰离子浓度在大约5-50mM之间的MnCl2浓度产生了所需的hsiRNA混合物。优选的浓度似乎在大约10到20mM锰离子浓度之间。
为了消化大双链RNA底物以形成hsiRNA混合物，对不同的酶反应参数进行了优化，如下所述(a)缓冲液条件在实施例中使用的缓冲溶液是50mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH7.9(25℃)、1mM DTT，以及进一步包括所选的过渡金属，或者是100mM NaCl、50mM Tris-HCl、1mM DTT和10mMMnCl2，pH7.5(25℃)。然而，使用其它的缓冲液和不同浓度的盐也在本实施方案的范围之内。类似地，对pH的改变也在本实施方案的范围之内。优选的pH范围在大约pH7到8.5。
(b)反应时间在过渡金属离子特别是锰离子存在的条件下用RNaseIII产生hsiRNA混合物的剪切反应在10分钟之内(图1E)。当反应时间延长到180分钟时，得到的是类似量的hsiRNA混合物(图1E)。需要正视的是，反应时间并不是一个极其关键的参数，根据实验者的方便，反应时间可以低于10分钟或者长于180分钟，比如4个小时或者6个小时或者更长。低于1分钟的反应时间或者只有5秒钟的反应时间都被应用，而且都得到了成功的结果。
(c)反应混合物中酶的浓度当酶被滴定且反应产物在胶上被分析时，图1B表明，RNaseIII终浓度高于0.025μg/μl的时候就足以完全消化2.5μg大小为1000个碱基的双链RNA(总体积是50μl)。在实施例I中，hsiRNA的最大产量是用0.1μg/μl的RNAseIII在37℃消化0.056μg/μl1000bp的双链RNA 30分钟之后得到的(这对应于大约一个RNaseIII单体对每22bp的双链RNA等同物)。
(d)RNaseIII酶对底物的量(重量比)RNaseIII酶对底物的比例(重量比)可以在大约0.005∶1到25∶1这个范围内被应用，在二价过渡金属离子存在的情况下将大双链RNA剪切成hsiRNA混合物。事实上，相对于底物的高浓度RNaseIII比如质量比在2∶1到3∶1之间可以有效地用于在没有过渡金属二价阳离子存在的情况下，在聚丙烯酰胺凝胶上得到对应于21-23个核苷酸的条带。这个条带中物质的数量随着酶与底物比例的增加而增加。然而，在没有过渡金属二价阳离子存在的情况下获得的产量一般要低于有过渡金属二价阳离子存在的情况下的产量。
图1B描述的是采用大约0.0125∶1到8.8∶1范围的酶与底物比例得到的剪切产物，优选的比例是高于或者等于0.25∶1。图1B显示，在锰离子存在的条件下图1B中重量比为0.5∶1的酶与底物可完全消化大双链RNA。在RNaseIII和大双链RNA为高浓度比时的剪切(比如，0.25∶1到2∶1到15∶1的质量比)使得对应于15-30个核苷酸，特别是21-23个核苷酸的组份的产量增加。在锰离子存在的条件下，高浓度的酶进一步增加所需大小片断的产量。
(e)除了锰之外使用其它的过渡金属二价阳离子hsiRNA混合物可以在除了锰离子之外的其它二价过渡金属离子如Co2+、Ni2+、Cd2+或者Fe2+存在的情况下生成(比如图2和实施例II中所示)。比如，MnCl2、CoCl2、NiSO4、CdCl2或者FeSO4可以以0.1-100mM，更优先的是5-100mM，比如10-20mM的浓度，加入到反应混合物中。在这里已经针对锰离子存在的情况详细描述了可优化反应的参数，可以肯定的是，也可以针对在其它二价过渡金属存在的情况下的RNaseIII，确定优化反应条件，可以采用实施例I-VII中描述的方法确定pH、缓冲液条件、温度、反应时间、酶和底物的浓度以及比例。在10mM浓度的各种二价过渡金属阳离子存在的条件下RNaseIII生成hsiRNA混合物的表现已经与在镁离子存在的情况下的表现进行了比较(图1A和图2)。
基因沉默领域内的一个问题就是鉴定能够达到有效地切割特定信使RNA的目标的短双链RNA(15-30bp)。在本发明的实施方案中，这个问题是这样解决的利用大双链RNA，该大双链RNA具有的序列和包括未翻译的mRNA在内的目标mRNA的整个序列或者部分序列相同，然后再将该大RNA剪切成多个重叠的大小适合于基因沉默的片断。实施例III和IV证明，这种剪切产物代表了大双链RNA的整个长度，实施例VI表明，这种hsiRNA混合物其中含有能够导致基因沉默的片断，这是通过转染包括昆虫细胞和哺乳动物细胞在内的各种细胞实现的。
一旦hsiRNA混合物被获得，就有可能制备含有对应于混合物中单个双链RNA片断的DNA序列的克隆文库(实施例IV)。如果提供合适的启动子，各个克隆都可以用于转染细胞，这样就提供了用于长时间地沉默基因所需要的源源不断的短双链RNA。相比于通过向细胞转染双链RNA本身所达到的暂时基因沉默效果，向目标细胞或者生物体中转染单个克隆或者所选的克隆的混合物所导致的基因表达沉默可以例如在治疗应用方面具有特别的优势。这为医疗应用提供了新的试剂，提供了特异性地调控特定基因的表达的源源不断的药物。
获得单个片断的克隆的其它优点是，正如在这里描述的，包括(a)为了解在通过双链RNA的剪切而得到的片断混合物中哪一个片断或哪一部分片断可以导致基因沉默，而其它片断不可以导致沉默提供了资源；(b)为研究为什么一些RNA片断在基因沉默中有效，而其它则无效提供了工具；(c)确定特定的hsiRNA针对特定的mRNA的特异性；(d)确定由一种特定RNaseIII产生的hsiRNA混合物与不同的RNaseIII相比的独特特征，以及(e)表征目标mRNA上被hsiRNA诱导剪切发生的位点；以及(f)基于克隆片断的统计分析，产生用于设计合成的siRNA的计算机算法。
基因沉默的特异性对于特定的目标mRNA的基因沉默特异性可以通过应用目标mRNA序列的BLAST分析，确定在该RNA中没有延伸的区域(超过20个碱基长度)与其它基因转录子相同以避免非特异性的基因沉默来确认。
采用在这里描述的方法，针对基因家族中的单个成员具有特异性而不沉默这个基因家族的其它成员的mRNA的hsiRNA制备物可以由长双链RNA制备，所述长双链RNA与目标mRNA的一个片断(也称为长双链RNA片断)序列互补。另外，也可以制备对一个基因家族中的任何基因都有特异性而对该基因家族以外的其它基因没有特异性的hsiRNA制备物。
合适的基因沉默效果可以通过以独特的mRNA序列或者形成一个mRNA家族的保守区域的部分或者全部的mRNA序列作为目标来完成。
可以根据本方法制备“具超级潜力”的siRNA片断混合物，其中可选择性地被克隆且已经被鉴定能在目标mRNA的位点上诱发剪切的单个siRNA片断被组合在一起，从而获得具有所需要的基因沉默效果的混合物。
本实施方案的一个优势是能够快速制备hsiRNA片断的混合物，这些hsiRNA片断可以在体内条件下被检测其活性，其中具有特定的序列特异性的一部分片断可以按照需要被挑选出来，而无需昂贵的化学合成来合成寡聚核苷酸片断，也无需由部分酶解或者含有天然发生的DICER的细胞粗提物所提供的更具偶然性的方法。在二价阳离子存在的条件下RNaseIII消化的一个优点就是整个大双链RNA基本上都被重叠的片断所代表。图4表示，超过50％的NheI-BsrGI GFP序列被hsiRNA混合物中互补的siRNA片断所覆盖。已经预料，这一百分比还被低估了。一条链获得的克隆与另一条链获得的克隆相比较，发现有明显的偏差，这可能是涉及作为连接子的特异性引物或者克隆片断的部分取样。
对基因沉默的深入认识可以通过改变由DNA模板表达得到的大RNA相对于目标mRNA的大小和序列特征来获得。比如，被进行一系列缺失操作或者被随机剪切的DNA模板可以用于生成不同大小的双链RNA，经过在此描述的RNaseIII消化之后，可以检测它们在沉默中的效果(实施例VIII)。
实施例VIII说明了，对应于mRNA的片断并在二价阳离子存在的条件下被RNaseIII降解的双链RNA是如何有效地敲除培养细胞的基因表达的。不同的片断可能产生具有不同的敲除活性的混合物。比如，这个方法可以用来理解mRNA中与翻译序列相邻的长末端重复(LTR)区域的调控功能。
对应于DnMT的片断1、3或2(按有效性增加的顺序)的hsiRNA对DnMT1的敲除是通过对应的蛋白条带的降低或者消失(比较泳道4、5、6与泳道2、3(上部的图))来检测的。在所有被检测的三种情况中，(片断1、2和3)hsiRNA处理的细胞都表现出目标DnMT1表达的有效敲除。片断2hsiRNA的沉默效果要高于片断1和3hsiRNA。相反地，p53条带的强度不被所有对应于DnMT1的hsiRNA混合物影响(图10C)。
检测来自于不同片断的hsiRNA是简单的，这为确定不均一siRNA混合物中siRNA分子的活性提供了目标序列的快速初步筛选。
这里描述的方法还可以应用于生成可以用于同时沉默多个基因的多hsiRNA混合物。额外的用途包括用hsiRNA来靶向上游或下游调控区域以调节表达。相应地，通过一系列DNA模板的转录得到的大双链RNA的混合物可以在单个(多重化)反应中在二价过渡金属离子存在的条件下用RNaseIII消化和/或用高浓度酶消化。制备大双链RNA的方法在实施例VII中提供。
上述的用于制备选择性的siRNA片断的hsiRNA混合物或其克隆的产生可以部分或者全部通过利用在实施例VII中所描述的试剂盒来实现。制备所需的大双链RNA、生成hsiRNA混合物和用这样的混合物转染细胞的说明书已经被提供。实施例IV描述了这些混合物中的单个片断可以如何被克隆，以及它们的序列如何被分析和作图。
目标mRNA的位点特异性剪切正如在这里描述的，通过用RNaseIII在高浓度或者过渡金属离子存在的条件下剪切大双链RNA得到的一系列双链RNA片断是重叠片断的不均一混合物。这种混合物可以通过剪切目标基因的mRNA转录子来沉默基因，其中大双链RNA与该mRNA中的序列互补。采用如实施例IV和VI中提供的方法来分析产生的hsiRNA混合物，允许最有效的目标序列的特征可以用单个核苷酸的分辨率来限定。
对RNAi的机制研究已经证明，活性siRNA导致目标mRNA的位点特异性剪切，这是通过将含有特定核酸酶的RISC复合物引导至目标序列来实现的(Harmon et al.Nature 418244-251(2002)，Zamore et al.Cell 10125-33(2000)和Elabshir et al.Genes Dev.15188-200(2001))。被RISC复合物剪切的mRNA片断可以用RNA杂交来检测(Amarzguioui，et al.，Nucleic Acids Res.31589-595(2003))。剪切事件发生的核苷酸位置被发现是在离相应的mRNA末端10个碱基的位置，其对应于21个核苷酸的siRNA的中间的序列位置(Martinez et al.Cell110563-574(2002))。mRNA上的RISC剪切位点因此可以用于推测指导剪切发生的对应siRNA的序列。
从如实施例VI和VIII所述的具有基因沉默活性的hsiRNA混合物开始，有可能应用标准的方法比如RNase保护分析(Rnase protectionassay)和引物延伸分析(primer extension analysis)来分析目标mRNA上的一个或者多个剪切位点(Sambrook and Russell.Molecular CloningA Laboratory Manual，(3rded.)Cold Spring Harbor Press(2001))。比如，由目标mRNA(i)上核苷酸X处的假定剪切位点可以推测出一个siRNA(ii)。单个的被推测出来的siRNA序列然后可以被合成，并进一步检验其有效性(i)目标RNANNNNNNNN-10NNNNNNNNNXNNNNNNNNNN+10NNNN(ii)siRNA
N-10NNNNNNNNNXNNNNNNNNNN+10上述方法已经在实施例IX和图11中被举例说明。
本实施方案的另外一个优势是，一旦单个siRNA片断或者特异性的hsiRNA片断混合物或者一系列hsiRNA片断获得以后，它们就可以按照实施例IV和V中描述的方法被克隆，这样就为这些核酸提供了连续的供应或体内调节的供应，而不需要为每个实验从头合成。
示范性的应用克隆片断的可用性不但提供了试剂或者治疗药剂的连续来源，而且还提供了一种新的治疗方法，其中所需的敲除效果可以通过在整个生物体内应用基因治疗技术来实现，而不再需要重复施用siRNA片断。表达siRNA片断或hsiRNA混合物的克隆可以用于目标基因的完全的、被控制的或暂时的沉默。
来源于任何病原体的基因都可以被定向地抑制。比如，该基因可以直接导致宿主的免疫抑制，或者该基因对于病原体的复制、转移或侵染的维持是必需的。抑制性RNA可以在体外或者离体导入细胞中，然后被置于在生物体中实施治疗，或者该生物体可以直接通过体内施用的方式被治疗。比如，有被病原体侵染的危险的细胞或者已经被侵染的细胞，特别是人类免疫缺陷病毒(HIV)的侵染，可以根据本发明导入RNA来有目标地进行治疗。目标基因可以是病原体进入其宿主、病原体或者宿主进行药物代谢、病原体基因组复制或整合、侵染在宿主中建立和传播、或者下一代病原体组装所需的病原体基因或者宿主基因。预防的方法(即是，预防侵染或者降低侵染的危险)，以及降低与侵染相关的综合症的发生频率或严重性的方法，都可以被预想到。
本发明可以用于治疗或者发展对任何癌症的治疗方法，包括固体肿瘤和白血病，其中的一些实例已经在国际公开号WO 99/32619中列出。
本发明用下面的实施例进一步说明。提供这些实施例是为了帮助理解本发明，但是并不表示本发明受其限制。
在上文和下文引用的文献在此整入作为参考。
实施例I制备hsiRNA混合物测定锰离子对用RNaseIII剪切双链RNA的影响使用HiScribeTMRNAi转录试剂盒(新英格兰生物实验室公司，贝佛利，麻萨诸塞州)产生对应于感兴趣的基因的全长双链RNA(dsRNA)，在本实施例中该基因是hu PKR。生成双链RNA的方法在实施例VII中被详细地描述。
0.4kb的双链RNA分子(0.25μg)用30个单位的大肠杆菌RNaseIII(0.9μg)(新英格兰生物实验室公司，贝佛利，麻萨诸塞州)在37℃消化，20μl的反应缓冲液由100mM NaCl，50mM Tris-HCl，5、10、20或50mM MnCl2或者10mM MgCl2(对照)，1mM二硫苏糖醇(pH7.5，25℃)组成。含有50-100mM MnCl2的样本也被检测以提供长双链RNA的完全消化。
在不同浓度的锰离子存在的条件下RNaseIII的消化产物中大小为18-25bp的被富集。这样获得的片断混合物在这里被标记为hsiRNA混合物。相反，在没有锰离子、含有10mM Mg2+的缓冲液中用RNaseIII消化双链RNA产生了大小参差的片断混合物，这是由部分消化导致的，其中主要的片断大小小于所需的被认为是hsiRNA特征的20-40bp(图1A和2)。这种在镁离子存在的条件下RNaseIII的消化产物被发现在基因沉默中没有效果(图1A，2和5)。
用不同量的RNaseIII由1kb的双链RNA产生hsiRNA来自于GL3荧光素酶的1kb的片断(SphI-NgoMIV)被克隆到Litmus 38i中。双链RNA是从按照实施例VII描述的方法(利用生物素标记的T7引物PCR)生成的DNA模板，采用HiScribeTM试剂盒(新英格兰生物实验室公司，贝佛利，麻萨诸塞州)生成的。2.5μg的双链RNA在50μl的反应混合物中用0.5、1、2、4、8、16μl 1.36mg/ml的RNaseIII储液(对应于反应混合物中的终浓度为0.0 12、0.025、0.05、0.11、0.22和0.44μg/μl)消化，反应在含有50mM NaCl、50mM Tris-HCl、20mM MnCl2、1mM二硫苏糖醇(pH7.5，25℃)的缓冲液中进行20分钟，加入EDTA使其终浓度达到25mM来终止反应。每个反应中的40μl样品在20％的非变性PAGE胶上分析(图1B)。检测到的主要消化产物与单一序列的合成siRNA共迁移(图1B，将泳道5、6、7、8与泳道1比较)。当至少2μl的RNaseIII被使用时，消化反应被判断为完全进行(图1B，泳道5，使用0.05μg/μl终浓度的RNaseIII)。荧光凝胶密度计被用来测量作为RNaseIII浓度的函数的所产生的hsiRNA的相对量。实验中hsiRNA的最大产量是用4μl的RNaseIII(0.11μg/μl终浓度)获得的。
RNaseIII对底物的优化比例的相关性和普遍化为了进一步确定RNaseIII生成hsiRNA的优化浓度，在用不同浓度的RNaseIII消化另一种底物时，监测hsiRNA的产量。浓度范围从0.025到3.2单位/μl(其中32个单位对应于1μg的RNaseIII，这样终浓度范围是0.0007到0.1μg/μl)的RNaseIII被用来消化0.056μg/μl的双链DNA底物(1000bp，线虫几丁质合成酶基因的一部分)，反应是在含有50mM Tris-HCl，pH7.5、100mM NaCl、1mM DTT、10mM MnCl2的10μl溶液中进行的。该反应混合物在37℃温浴30分钟。RNaseIII消化通过加入0.5μl 0.5M的EDTA来终止。每个反应的一部分(2.5μl，相当于0.14μg双链RNA底物)，连同lμl上样缓冲液(含有二甲苯青和溴酚蓝)在20％非变性PAGE上分析(图1C)。
在另外一个实验中，双链RNA的浓度为0.06、0.12、0.24和0.47μg/μl，用3.2单位/μl的RNaseIII(0.1μg/μl)在如上描述的同样条件下消化(图1D)。
在本实施例中，hsiRNA的最大产量是通过用0.1μg/μl的RNaseIII消化0.056μg/μl的双链RNA底物得到的，或者说是57个单位的RNaseIII用于每微克双链RNA(图1C泳道2)。在这个浓度比例，大约每22bp长度的双链RNA片断对应一个RNaseIII单体分子。这个酶-底物比例的一半产生了稍微减少的hsiRNA(图1C，泳道3)。类似地，在图1D中，泳道3或4得到了最大量的hsiRNA。降低RNaseIII的用量，hsiRNA的积累量会降低，双链RNA被剪切成更大的片断。
这些实验表明在10μl反应体积中25-50个单位的RNaseIII用于每微克双链RNA，可以产生产量最优的hsiRNA。
双链RNA剪切的时间进程的研究生成hsiRNA的动力学通过时间进程研究来监测。消化反应进行不同的时间长度，反应采用优化的RNaseIII∶dsRNA比例(双链RNA浓度为0.056μg/μl，RNaseIII浓度为3.2单位/μl(0.1μg/μl))，在含有10mM锰离子的缓冲液中进行。加完所有成分之后，反应液轻轻涡旋混匀，在37℃温浴。经过不同的温浴时间，其中的10μl反应液被移出，并用0.5μl 0.5M的EDTA终止。样品在用20％的非变性PAGE胶分析(图1E)之前在冰上保存。
从这些实验可以明显的看出，在锰离子存在的条件下RNaseIII消化能够非常快速地产生hsiRNA的条带。经过10分钟的温浴之后，所产生的hsiRNA便可以定量了，而且没有大于hsiRNA的双链RNA可以检测得到。
制备纯化的hsiRNA大量纯化的hsiRNA通过高效阴离子交换柱色谱获得，将RNaseIII消化的双链RNA在10mM Tris-HCl，pH7.5中经过一个Q Sepharose柱(Pharmacia，Piscatway，NJ)(图1F)。大小在大约18-25个碱基之间的纯化的hsiRNA在梯度为0.40-0.45M NaCl的时候从柱子上洗脱下来，与RNaseIII(在0.025-0.2M NaCl之间被洗脱下来)和大小为30-1000个碱基的双链RNA(在0.5M NaCl或者更高浓度NaCl时被洗脱下来)分开。泳道5和6显示的主要条带含有大量的hsiRNA和量不是十分明显的其他大小的RNA。
基于上样和梯度的调整，浓度范围为1μg到1mg/ml或者更高浓度的hsiRNA可以被获得，而且不含有蛋白质杂质和高分子量的双链RNA或者DNA。这样的高浓度的纯化hsiRNA可以用作体内试剂或者治疗试剂，其中与任何污染物质的分离对于FDA认证是必要的。
实施例II用不同的二价金属离子制备hsiRNA
为了测定不同的二价阳离子对RNaseIII的剪切产物的影响，进行了如下实验1μg大双链RNA分子(800bp)分别在两个不同的大肠杆菌RNaseIII浓度(0.04μg/μl或者0.02μg/μl)消化30分钟，其中pH7.5(25℃)，50μl的缓冲液中含有100mM NaCl、50mM Tris-HCl、1mM二硫苏糖醇，金属离子是10mM MgCl237℃(泳道1和2)、10mM MnCl2(泳道3和4)、10mM CoCl2(泳道5和6)，或者10mM NiSO4(泳道7和8)。结果如图2所示。大双链RNA在0.04μg/μl RNaseIII和10mM锰离子存在条件下被完全消化，得到的双链RNA产物的大小大约是22bp(在20-40bp之间)。用0.04μg/μl RNaseIII在含有10mM镁离子而不含锰离子的缓冲液中消化得到的片断小于所需的18-25bp的长度(泳道1和2)，这些片段被发现不适合于RNAi沉默实验。相反，在存在钴和镍时所产生的片断中提供了比在存在镁离子时更多的所需的长度为18-25bp的片断。
实施例IIIRNaseIII消化得到的短双链RNA剪切产物含有代表了整个母本序列的序列用于转录p53的DNA模板(1.1kb的编码氨基酸100-393的片断)用限制性内切酶AciI消化，产生的片断在琼脂糖胶上分离。用溴化乙锭染色，照相，接着转移到尼龙膜上(HybondN+，Amersham，Piscataway，NJ)。
通过体外转录合成的1.1kb的双链RNA片断用终浓度为0.04μg/μl的RNaseIII在含有10mM锰离子，pH7.5的反应液中于25摄氏度温浴30分钟消化，如实施例II所示，产物在20％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。
这种消化产物(hsiRNA混合物)用溴化乙锭染色来显示，对应于大约21bp的条带以小胶块的形式被剪切下来，然后在用透析膜密封的小管子中电洗脱20分钟，按照下面实施例IV中描述的方法酒精沉淀。纯化的短RNA用胞苷3’，5’双(磷酸根)[5’-32P]和T4 RNA连接酶根据制造商(New England Biolabs，Inc.，Beverly MA)推荐的方法标记。该32P标记的RNA被用于探测同样的胶的DNA印记，在0.5M磷酸钠，pH7.5、7％SDS、1％BSA中于48摄氏度过夜处理。在同样的温度下在50mM磷酸钠，pH7.5、0.1％SDS中清洗三次，然后对X射线胶片曝光。
放射自显影显示，用于生成hsiRNA混合物的DNA模板的所有片断都可以与探针杂交，而分子量标记物中大量不相关的DNA片断不与探针杂交(图3A，比较泳道2和3)。
胶片被扫描以确定探针的相对量。放射性强度对条带的大小作图。图3B显示，每个条带的探针数量与片断的大小成正比，而且与对应于每个片断的溴化乙锭荧光的量相似。这些结果表明，在锰离子存在时由RNaseIII消化产生的大小为15-30bp的短RNA片断含有来自于整个母本序列的片断。
实施例IVhsiRNA片断的克隆和测序来自于RNaseIII消化的产物被克隆，在采用的策略中引物退火位点被顺序地连接到被消化的RNA的一条链的每一端(图4A)。连接的顺序通过参与连接的物质的不同磷酸化状态而被精确地控制，这同时可以防止在各连接步骤中各物质的多聚化。结果得到的RNA-DNA嵌合物被RT-PCR扩增，然后克隆到测序质粒中。作为选择，可以利用单个引物合成cDNA第二链，以替代所述PCR步骤。
连接好的寡聚核苷酸由确定的序列(没有被多腺苷酸化)组成，它们由非常不同于那些出现在以下文献中的DNA的DNA构成，这些文献是Elbashir，et al.，Genes and Development 15188-200(2001)；Lau，et al.，Science，294858-862(2001)and Lee，et al.，Science，294862-864(2001)。同样，为了防止连接反应中自身多聚化，引物1合成之后带有5’和3’端的磷酸基团。为了从由RT-PCR生成的cDNA构建出最终文库，DNA片断被扩增，然后直接克隆到质粒pUC19(克隆之前没有被串联在一起)。
1.双链RNA的生成对应于麦芽糖结合蛋白(malE)的全长双链RNA(dsRNA)是采用HiScribeTMRNAi转录试剂盒(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)生成的。为了生成体外转录所需的模板，含有malE的808bp的BglII-EcoRI片断的pLITMUS28i质粒被用于PCR反应扩增该基因片断。PCR反应是采用VentDNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在1X ThermoPol反应缓冲液[20mM Tris-HCl，pH8.8、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100]中进行的，50μl的反应体积中还包括0.4μM的T7最小引物d(5’-TAAACGACTCACTATAGG-3’(SEQ ID NO3))、400μM的dNTPs和大约20ng的质粒DNA。PCR程序采用25个循环，每个循环包括94摄氏度30秒，50摄氏度30秒，72摄氏度30秒。消化反应和PCR反应的产物都用酚/氯仿抽提，采用标准的分子生物学技术用酒精沉淀，然后再在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0、1mM EDTA)中重新溶解使得终浓度为1mg/ml(限制性酶切产物)或者125μg/ml(PCR产物)。这些模板然后被用于大规模体外转录反应以生成大双链RNA。
大规模体外转录反应被放大到反应总体积为300μl或者如制造商所述的中级规模反应的10倍。双链DNA模板也类似地从含有GFP的731bp的NheI-BsrGI片断的质粒中制备出来。对于GFP的双链RNA，10μl的消化好的模板被使用，对于malE基因片段，则每个反应使用40μl PCR反应产物。反应液中含有40mM Tris-HCl，pH8.1、19mMMgCl2、5mM DTT、1mM亚精胺、4mM的每种rNTP、50μg/mL BSA、3单位/μl的酵母无机焦磷酸酶、400单位/ml的胎盘RNase抑制剂，和5000单位/ml的T7 RNA聚合酶。反应在42摄氏度温浴2个小时，65摄氏度10分钟，然后在-20摄氏度保存。为了准备进行RNaseIII消化，双链RNA在8％的聚丙烯酰胺胶上电泳纯化之后，对应正确大小的条带被剪切下来(对于GFP或者malE分别是829bp和908bp)。通过在400μl的RNA洗脱缓冲液(0.1M醋酸钠，pH4.8、1mM EDTA、0.1％SDS)中于37摄氏度振荡温浴过夜，然后再在另外400μl洗脱液中处理4个小时，将双链RNA从胶块上洗脱下来。洗脱物样品被混合到一起，酚/氯仿抽提以去除残留的胶和SDS，之后酒精沉淀，然后再溶于100μlTris EDTA(TE)缓冲液。
2.malE全长双链RNA的RNaseIII消化进行RNaseIII消化，从malE序列中生成长度为22bp的小RNA双链。总体积为160μl的反应液含有在0.1M NaCl、50mM Tris-HCl，pH7.9、10mM MnCl2、1mM二硫苏糖醇、4μg全长malE双链RNA和4μg RNaseIII(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)，反应在37摄氏度温浴30分钟。然后样本用酚/氯仿抽提和酒精沉淀，去除RNaseIII，回收RNA片断。小RNA片断然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)处理以防止后续连接反应中的多聚化。这是通过先将样品预热到50摄氏度5分钟，然后按照制造商的描述在一个标准反应中用CIP处理来完成的，其中在50mM Tris-HCl，pH8.5、0.1mM EDTA中每微克RNA使用2.5个单位的CIP。反应在50摄氏度进行1个小时之后用酚/氯仿抽提，再用酒精沉淀。去磷酸化的RNA片断然后在25μl的TE缓冲液中溶解。
3.小RNA片断连接到引物1上小RNA片断(从上获得的总共4μg的样品)然后在其3’端与引物1，d(5’p-CTGCAGGATATCTGGATCCAC-p-3’)连接，其中引物1含有BamHI限制性位点(下划线)。RNA片断双链首先被加热到70摄氏度变性5分钟，然后再放在冰上。连接反应在60μl的含有50mMTris-HCl，pH7.8、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP和10％(v/v)DMSO、10μg的引物1和120单位的T4 RNA连接酶(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)的反应液中在20摄氏度进行了24小时。连接反应的产物然后在含有7M尿素的12％聚丙烯酰胺变性胶上电泳纯化，然后把对应于大约45个核苷酸长度的条带剪切下来。连接产物用RNA洗脱缓冲液从胶上洗脱下来，如上所述用酒精沉淀回收，再用10μl的TE缓冲液重新溶解。
4.将中间体与引物2连接上述连接产物的5’RNA端用无3’磷酸酶活性的T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK，(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany))磷酸化以避免在后续连接反应中多聚化。对来自上面步骤的整个样品进行磷酸化，反应在20μl的含有50mM Tris-HCl，pH7.8、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1 mM ATP(1X T4 RNA连接酶缓冲液，来自于New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)和10单位的T4 PNK的反应液中于37摄氏度进行30分钟。然后T4 PNK在65摄氏度加热20分钟使之失活。
磷酸化的被连接到引物1上的小RNA片断然后在其5’端连接到引物2，d(5’-CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTC-3’(SEQ ID NO5))，该引物含有一个Acc65I限制性酶切位点(下划线标示)。连接反应在30μl的含有10％DMSO、1μg引物2和60个单位的T4 RNA连接酶的1X T4 RNA连接酶缓冲液中于20摄氏度进行24个小时。该连接产物然后在含有7M尿素的12％聚丙烯酰胺变性胶上电泳纯化，然后把对应于大约70个核苷酸长度的条带剪切下来。连接产物用RNA洗脱缓冲液从胶上洗脱下来，如上所述用酒精沉淀回收，用10μl的TE缓冲液重新溶解。
5.为了克隆而进行的RNA/引物杂合物的反转录和PCR扩增反应在小RNA的5’端和3’端分别连接引物2和引物1的产物被反转录，生成用于后续PCR扩增的双链。反转录是利用引物3，d(5’-GTGGATCCAGATATCCTGCAG-3’(SEQ ID NO6))来进行，这种引物也被称为Litmus 28/38反向测序引物(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)，其带有一个BamHI位点(下划线标示)。从上一步得到的整个样品与0.1μM引物3和0.5mM dNTPs混合，然后在65摄氏度加热5分钟，接着在冰上冷却使得引物3和连接产物的3’端退火(引物3和引物1互补)。19μl的反应体积中含有50mM Tris-HCl，pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2和10mM二硫苏糖醇，在加入200单位的M-MuLV反转录酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)之前将其在42摄氏度温浴2分钟，然后再在25摄氏度反应10分钟，42摄氏度反应50分钟，70摄氏度反应15分钟。然后双链DNA通过反转录得到的cDNA产物的PCR扩增得到。PCR反应采用Deep VentDNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在含有0.2μM引物2和引物3、400mM dNTPs和2μl反转录产物的总体积为100μl的1XThermoPol反应缓冲液中进行。PCR流程采用25个循环，每个循环包括94摄氏度30秒，60摄氏度30秒，72摄氏度30秒。约70bp的PCR产物按照之前描述的办法从8％的非变性聚丙烯酰胺胶上剪切下来，经过胶纯化，用酒精沉淀回收，在50μl TE缓冲液中重新溶解。
6.将PCR片断克隆到pUC19中利用标准的分子克隆技术通过BamHI和Acc65I限制性位点将PCR片断克隆到质粒pUC19(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)中。简单来说，pUC19消化在1X NEBuffer 3(0.1M NaCl、50mM Tris-HCl，pH 7.9、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇)中进行，反应中还含有0.1mg/ml BSA，每微克pUC19使用8个单位的BamHI和4个单位的Acc65I。消化在37摄氏度进行3个小时。消化之后的pUC19质粒在1％低熔点琼脂糖胶上电泳，再根据制造商的说明用β-琼脂糖酶(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)从被剪切下来的胶块中回收DNA，由此进行胶纯化。PCR片断在同样的条件下消化，不同的是，每微克DNA使用20单位的BamHI和10单位的Acc65I，酚/氯仿抽提，去除限制性内切酶，用酒精沉淀回收。消化后的PCR片断被连接到pUC19载体中，其中插入片段与载体的比例为10∶1，在20μl的反应中含有100ng载体，含有或者不含有插入片段，和400个单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)。在16摄氏度温浴过夜之后，每个连接反应(含有和不含有插入片段)中的10μl通过在65摄氏度加热15分钟而终止，然后用SmaI消化使得任何自连接的载体被线性化。消化反应(总共50μl)中含有在1X NEBuffer 4(20mM Tris-acetate，pH7.9、50mM醋酸钾、10mM醋酸镁、1mM DTT)中的10μl连接反应产物和20个单位的SmaI，反应在20摄氏度温浴3个小时。在65摄氏度热变性15分钟之后，每1μl的消化产物采用Bio-Rad GenePulser(Bio-Rad，Hercules，CA)设备电转到大肠杆菌ER2738中。刚刚电转完毕的细胞在1.0ml的SOC培养液中37摄氏度摇晃1个小时。细胞被涂在含有100μg/ml氨苄青霉素以及40μg/ml异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的LB琼脂培养基上，在37摄氏度过夜培养。蓝色和白色克隆都被观察到，而且蓝色和白色克隆的数量分别比没有插入片断的对照高5-10倍和＞20倍。
7.测序和分析采用QiaQuick(Qiagen，Studio City，CA)spin柱将来自总共126个克隆的DNA从1.5ml的培养液中分离出来，终体积为50μl。限制性分析和自动Sanger DNA测序(ABI 377或者3100仪器)表明，126个测序克隆中有9个没有插入片断，而剩下的117个克隆含有对应于两个引物序列(引物1和2)的插入片断，它们之间所包围的对应于被克隆的RNA序列的序列的量有所不同(图4D)。这些克隆序列的长度分布如下所示(克隆的数目在括号内)13个碱基(2)，14个碱基(1)，15个碱基(3)，16个碱基(1)，17个碱基(6)，18个碱基(5)，19个碱基(4)，20个碱基(15)，21个碱基(38)，22个碱基(38)，23个碱基(1)和24个碱基(2)。这些序列可以利用引物序列分离出来，并与母本Litmus-malE或者GFP构建物的转录部分匹配(图4B和4C)。这些结果明确地证明，克隆片断覆盖了整个双链RNA起始材料，含有大双链RNA序列的相当一部分，这表明RNaseIII消化是随机的。在图4B和4C中箭头对应克隆序列；箭头的方向表明该序列是对应于所显示的序列(从左到右)还是其互补链(从右到左)。
来自于各个克隆的DNA插入片断被提取出来并测序，所述克隆携带有根据图4A的流程通过RNaseIII消化生成的片断。插入片断的长度通过确定在克隆方法中使用的引物之后计算片断中剩下的核苷酸数目来确定。来自于两个不同的转录子(Litmus 28i中的malE和Litmus 38i中的gfp)的总共126个克隆通过用插入片断长度对比出现频率来作图，在图4D中的图表中显示。
如图4D中的表格所示，65％的克隆，或者说是117个含有插入片断的克隆中有76个具有长度为21或者22个核苷酸的插入片断。这117个克隆中有1个具有长度为5个核苷酸的插入片断，即，该片段短于11个核苷酸，这样大小的片断是在采用现有技术的条件在含有镁离子而不是锰离子的缓冲液中用RNaseIII消化时经常产生的。上述克隆实验进一步确认，在含有锰离子的缓冲液中用RNaseIII消化生成的片断有相当一部分是21-22个核苷酸长度。
实施例V克隆的RNaseIII产物的文库的生成(a)通过在对各个片断进行PCR扩增之后将多个cDNA克隆到Litmus 28i、Litmus 38i(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)或其它反向T7启动子载体中，或者通过利用商业上可获得的cDNA片断，可以获得一个克隆文库。该克隆文库被用于生成双链RNA，所述双链RNA对应于用T7聚合酶体外转录的克隆序列，然后双链RNA再用RNaseIII剪切，其方法在前面的实施例中已经被描述过。
(b)大双链RNA的RNaseIII消化产物按照如上的描述或者实施例IV中描述的方法获得并纯化，然后可以按照实施例IV中描述的方法被克隆到Litmus 28i载体中。这样，每个克隆都代表了RNaseIII剪切原始长序列所产生的一个短序列，而且其可以用于体外转录以生成一个短序列的双链RNA片断(比如18-25bp)。检测多个克隆的有效性可以通过高通量的形式来实现，因为所有的步骤(PCR、体外转录、RNaseIII剪切和转染)都可以采用标准的方法以微量滴定板的形式完成。最好的片断(在沉默中最有效果)就可以这样被鉴定，并可以导入到特殊的载体(发夹、腺病毒/反转录病毒)，或者，这些片段可以被化学合成以用于特定的下游应用。
这样的短双链RNA产物可以用于细胞转染实验或者针对同源序列的基因敲除的转基因动物研究。合适的试验可以被进行以评估沉默效果，比如细胞形态、存活、共转染报告基因表达、药物治疗的敏感性等等。所有这些步骤都可以以微量滴定板的形式自动化进行。
实施例VIHsiRNA混合物对于昆虫细胞或者哺乳动物细胞的转染基因和内源基因的基因沉默是有效的为了检测在二价过渡金属阳离子的缓冲液中用RNaseIII消化产生的hsiRNA在抑制基因表达中的效果，长双链RNA的制备物通过萤火虫GL3荧光素酶cDNA(F-Luc)(1.2.kb)、绿色荧光蛋白(GFP)cDNA(0.8kb)、p53 cDNA(1.1kb)和PKR cDNA(0.4kb)的溢出转录(run-offtranscription)来合成，采用的是HiScirbeTM试剂盒(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)和标准的重组DNA技术，如试剂盒使用手册和NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA提供的参考文献中所建议的。这些双链RNA被酚抽提，用酒精沉淀。
10μg的GFP双链RNA和F-Luc双链RNA分别在100μl反应液中在37摄氏度消化30分钟，其中反应液包括50mM Tris-HCl，pH7.5、1mM二硫苏糖醇，还含有10mM MnCl2或10mM MgCl2和RNaseIII(20μg)。消化产物用酒精沉淀，沉淀再被溶解于无菌TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5、1mM EDTA)。这些由RNaseIII生成的双链RNA在降低或去除荧光素酶、GFP或p53的表达中的效果在下列细胞中被检测(a)培养的果蝇Schneider SL2培养细胞；(b)人类胚胎肾293细胞，或者(c)猴上皮Cos-7细胞。所有的培养都在24孔板中用0.5ml合适的培养液进行。
(a)果蝇Schneider SL2培养细胞在27摄氏度在含有10％胎牛血清的Schneider培养基中培养。这些细胞在转染前16个小时以0.2×106个细胞/ml/孔的量被转移到24孔板上以准备转染。将由0.1μg基于pGL2的荧光素酶报告质粒、0.05μg海肾荧光素酶报告质粒和0.05-0.5μg——通常是0.1μg——的如上所述地用RNaseIII消化或者未消化的GL3荧光素酶双链RNA组成的混合物与3μl Cellfectin(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染试剂混合于100μl的不含血清的Schneider培养液中，在室温下温浴30分钟，然后加到转染板的一个孔中。在27摄氏度培养40个小时之后，采用双荧光素酶报告系统(Promega，Madison，WI)按照双荧光素酶使用手册中描述的方法分析细胞的荧光素酶活性。相对荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值来表示(图5)。
(b)人类胚胎肾细胞(HEK-293细胞)在补充有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养液(DMEM)中在37摄氏度，5％CO2中培养。这些细胞在转染前16个小时以每孔0.2×106个细胞的量被转移到6孔板上以准备转染。将0.1μg基于pGL3的荧光素酶报告质粒、0.1μg的pEGFP、0.05μg海肾荧光素酶报告质粒和0.1-0.5μg(一般是0.1μg)的hsiRNA(如上所述用RNaseIII消化的dsRNA)或者10pmol的GFP-22siRNA((正义链)5’GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU3’(SEQ IDNO7)和(反义链)5’GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG(SEQ IDNO8))(Xeragon；Huntsville，AL)组成的混合物与6μl CELLFECTIN(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染试剂混合于150μl的不含有血清的DMEM培养基中，在室温温浴30分钟，然后加到转染板的一个孔中。GFP和荧光素酶的表达分别通过荧光强度和发光强度来检测(图6A和6B)。对于更加有效的转染，按如上所述制备的荧光素酶hsiRNA(0.025μg-14nM的终浓度)或GL3荧光素酶hsiRNA(20pmol)((正义链)5’CUUACGCUGAGUACUUCGATT3’(SEQ ID NO9)和(反义链)5’UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT(SEQ ID NO10))(Xeragon；Huntsville，AL)被转染到HEK293细胞中，采用的是Lipofectamine 2000和OPTIMEM培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，24孔板中每孔用2μl的Lipofectamine 2000和100μl的OPTIMEM培养液。然后按照制造商的说明用双荧光素酶试剂盒(Promega，Madison，WI)对细胞进行荧光素酶活性检测(图6C)。
(c)猴上皮细胞(COS-7)在补充有5％胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养液(DMEM)中于37摄氏度，5％CO2中培养。这些细胞在转染之前24小时以0.2×106个细胞/0.5ml/孔的量转移到24孔板中，或者在转染之前6小时达到85％的铺满率(confluency)。对于每个细胞培养孔，由0.1μg pEGFP和大双链RNA消化生成并用酒精沉淀纯化的1或5μl hsiRNA(6ng/μl)组成的混合物与2μl Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照制造商的说明混合在终体积为100μl的OPTIMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在室温下温浴20分钟，然后加入到细胞中。GFP的表达通过荧光显微镜来检测，其它内源目标的表达用合适的抗体对细胞抽提物进行的蛋白质印记分析来检测。在另外的实验中，如上所述地由p53双链RNA产生的0、5或10μl hsiRNA(5ng/μl)或者由海肾双链RNA产生的10μl hsiRNA(5ng/μl)连同在pCDNA载体中表达人类p53的截短形式(残基100-393)的质粒和表达海肾荧光素酶的质粒一起被转染到细胞中。这些细胞在转染之后48小时，被裂解并采用双荧光素酶系统(Promega，Madison，WI)进行荧光素酶活性检测。来自于各个孔的裂解液也用抗p53多克隆抗体(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)进行蛋白质印记分析。这些被检测的细胞表现出对目标基因表达的有效敲除，其效率与由化学方法得到的siRNA相当甚至更好。
图5中，对应于荧光素酶的长双链RNA表明出有效的果蝇培养细胞基因沉默活性。hsiRNA混合物似乎具有带自由3’羟基的两碱基突出端(overhang)的结构，这在以前被表明是通过RNAi机制实现基因沉默所必需的(Elbashir，et al.，EMBO J.，206877-6888(2001))。在只有镁离子存在的条件下RNaseIII消化得到的产物却不能够实现荧光素酶基因的沉默。相反，在锰离子存在的条件下RNaseIII消化产物在基因沉默中非常有效。这些结果与实施例IA和IB中显示的由RNaseIII生成的片断的大小分布相一致，这说明该hsiRNA混合物中含有大小和序列都适合于引发基因沉默的分子。
对应于pGL3荧光素酶基因的化学合成的siRNA在这个检测中被发现没有效果，很可能是由pGL2/pGL3荧光素酶的对应序列中的点突变差异造成的。这一结果表明，用双链短RNA的混合物相比于用单个分子对沉默更为有效。
在图6A中，在锰离子存在的条件下的GFP双链RNA的消化产物被表明在哺乳动物细胞中对于GFP有特异性的沉默效果，这是通过与未处理的对照细胞相比缺乏发荧光的细胞而得到的。沉默的特异性和不期望的非特异性全局影响的不存在显示在图6B中，其中不是作为目标的荧光素酶的活性不受在锰离子存在的条件下得到的GFP双链RNA的影响。图6C表明由RNaseIII产生的hsiRNA有效地导致荧光素酶的沉默，其效果与由40nM GL3荧光素酶siRNA获得的沉默效果相当。
图7表明，hsiRNA片断的浓度等同于24孔板中每孔6ng时就足以导致明显的沉默效果，正如检测到的荧光细胞的数量减少所证明的。30ng的量显示出对目标GFP基因明显的高效率的敲除效应，而GFP并不被等同量的对应于不相关序列的hsiRNA片断的影响。
图8A中，靶向p53的hsiRNA混合物所导致的内源(E)和转染(T)p53的敲除可通过对应蛋白条带亮度的降低或者消失(比较泳道2、3和泳道1)来检测。相反地，海肾荧光素酶的活性只有在靶向海肾荧光素酶的hsiRNA混合物被使用的时候才会受到影响(图8B，比较样品1与样品2、3)。在所有的情况下，hsiRNA处理的细胞表现出的目标基因的有效敲除都可以与由化学方法得到的siRNA的效果相当或者更好。
这些结果表明，在锰离子存在的条件下由RNaseIII产生的hsiRNA混合物是沉默转染基因和内源基因的强大和特异性的介导者，它们可以用于调节哺乳动物细胞中基因的表达。
实施例VII用于生成hsiRNA和用于进行哺乳动物细胞的基因沉默的试剂盒提供了试剂盒，其可用于在体外条件下生成hsiRNA混合物，可选择地，还可用于将RNA片断转染到哺乳动物细胞中。
在本发明的一个实施方案中，每个试剂盒都含有用于处理多个大dsRNA的试剂，以便以24孔板的形式进行转染(足以进行100次转染)，而且包括使用说明。
试剂盒的组分所述试剂盒可以含有酶和至少一种载体、引物和缓冲液。下面是一个试剂盒的组分的实例，其中所有组分都可以单独从New EnglandBiolabs，Inc.(Beverly，MA)购得T7 RNA聚合酶，150单位/μl 25μl10X缓冲液/NTPs(参见下面的配方)60μl30X高分子量组分混合物(HMW)(参见下面的配方)20μlBT-7最小引物(19聚体)5’-生物素-dCTCGAGTAATACGACTCACTATAG-3’(SEQ ID NO11)(10μM)25μl
10X核糖核酸酶III(1.4μg/μl) 100μl10X hsiRNA缓冲液(参见下面的配方)10X MnCl2(200mM) 1000μl10X EDTA(250mM)1000μlLitmus 38iluc对照模板 1μg无RNase的糖原10μg/μl 50μl质粒DNA 500μg/ml，在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0、1mM EDTA)中。
另外，这个试剂盒可以包含转染试剂、RNA大小标记和链霉抗生物素包被珠。
缓冲液组成(a)10X缓冲液/NTPs400mM Tris-HCl，pH8.1190mM MgCl250mM DTT10mM亚精胺40mM的每种NTP(b)30X高分子量(HMW)混合物20mM Tris-HCl，pH8.11.5mg/ml BSA100单位/ml的无机焦磷酸酶(酵母)12000单位/ml的胰腺核糖核酸酶抑制剂50％甘油(c)10X hsiRNA缓冲液0.5M Tris-HCl，pH7.510mM DTT该试剂盒利用在优化的缓冲液中的RNaseIII从长双链RNA中产生大小范围为18-25个核苷酸的片断。双链RNA产物用RNaseIII来剪切，这样可以重复地得到适合于沉默基因表达的hsiRNA混合物。该混合物中不同的siRNA片断的序列覆盖了整个目标基因的序列。该hsiRNA混合物可以通过酒精沉淀而纯化，之后用于转染。
除RNaseIII之外，该试剂盒可以包括用于从两侧是T7启动子的DNA模板得到高产量的大双链RNA的体外转录试剂，以及使用说明，还可选配进行反应的反应试管。
伴随试剂盒的说明书的一个实例包括下面所列(1)在体外转录生成双链RNA之前克隆DNA模板制备用于转录的DNA模板的一种方法是将感兴趣的DNA克隆到Litmus 28i/38i双向转录载体(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)中。该感兴趣的DNA然后可以用一个T7启动子特异性引物比如BT7最小引物来进行PCR扩增，得到带有目标序列的线性产品，其中T7启动子位于所述目标序列的两侧并界定了其末端。
其它的带有T7启动子的目标基因特异性引物可以用于扩增任何特定的cDNA序列，比如，扩增引物是5’TAATACGACTCACTATAGaaggacagatggttaagtac-3’T7启动子(SEQ ID NO12)其中T7启动子(下划线)定位在5’端，其后是目标特异性的序列(黑体)，它可以用于扩增任何cDNA模板。
生物素标记的BT7引物可以用于扩增任何两侧为T7启动子的序列。可选择进行的做法是，这种被扩增的生物素标记的DNA模板可以通过结合链霉抗生物素标记的磁珠(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)来分离，然后直接用作转录的模板。为了形成固定化的DNA模板，25-50μl的链霉抗生物素标记磁珠悬浮液被加入到扩增(PCR)反应中，与等体积的1M NaCl混合，然后在室温温浴10-15分钟。在磁体存在的条件下去除上清，用0.5ml TE、0.5M NaCl清洗珠子。重悬的珠子可以直接用于转录反应，固定化DNA模板的体外转录可以得到无DNA的双链RNA。
扩增可以通过任何依赖于聚合酶的方法比如PCR实现。扩增后的产物用酒精沉淀纯化，或者通过色谱方法纯化(比如QiaQuick柱(Qiagen，Studio City，CA))，然后重新溶解在TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0、1mM EDTA，用Milli-Q水或者等同质量的水制备)中至终浓度约500μg/ml。
含有GL3荧光素酶的对照可以用Litmus 38iLuc质粒来制备，其中1.0kbp的GL3荧光素酶基因片断被克隆进Litmus 38i的SphI和NgoMIV位点。用MfeI和StuI(在分开的反应中)进行线性化，接着对混合的线性模板进行体外转录，产生长度为1.0kbp的双链RNA。
为了提供用于特定基因沉默的hsiRNA混合物，可以进行引导性的(pilot)研究，其中使用通过剪切大小为100-600bp的双链RNA而获得的一个或多个片断，所述双链RNA包括源自于cDNA的限制性酶切片断的RNA，所述cDNA已经亚克隆到Litmus28i/38i载体(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)中。
体外转录体外转录是采用如上所述地制备的DNA模板进行的。转录反应中所用的模板体积依赖于纯化的方法。对于未纯化的PCR产物，每30μl反应液中使用不超过5μl。加入的模板DNA不应该超过1μg每30μl反应体积。
无RNase水50-xμl10X缓冲液/NTPs 6μlDNA模板(约0.5-lμg) xμl30X HMV混合物2μlT7 RNA聚合酶 2μl60ul在42摄氏度的温浴可以提高含有大量二级结构的RNA转录子的产量。由于估计特定转录子中的二级结构的组成比较困难，我们建议所有的转录尽可能地在42摄氏度进行。转录产量在第一个90分钟内线性增加(近似)，2-3个小时之后达到最大值。反应可以过夜进行，如果需要的话，不过产量不会高出多少。双链RNA在37摄氏度长时间温浴时是稳定的。
该转录反应可以在1％的琼脂糖胶上分析，注意避免RNase污染。双链RNA的迁移近似于反应中所使用的DNA模板。从Litmus 38iluc对照模板上得到的转录子的期待长度是1000bp。
双链RNA转录产物通过酒精沉淀纯化。十分之一体积的pH为5.5的3MNaOAc和2倍体积的冷95％乙醇被加入。在冰上放置15分钟，或者在-20摄氏度保存过夜。以14000rpm的速度在台式离心机上离心15分钟。去除上清，加入两倍体积的80％乙醇，在室温放置10分钟，离心5分钟，然后再去除上清，让试管内液体流干。沉淀空气中干燥。将干的RNA溶解在10mM Tris-HCl，pH8.0、1mM EDTA中，或者水中。
形成hsiRNA混合物消化反应采用浓度为0.14μg/μl的1X(被稀释10倍)的RNaseIII，和0.07μg/μl的双链RNA，如下面的实例。
将下列试剂组合dH2O 105-xμl10X hsiRNA缓冲液15μl双链RNA xμl(10ug)RNaseIII15μl10X MnCl215μl150μl在37摄氏度下温育20分钟。
适当的时候加入15μl的10X EDTA来终止反应。
为了监测消化反应产物，10-20％的非变性聚丙烯酰胺胶是合适的。消化产物显示，长双链RNA已经被剪切成hsiRNA混合物，其中的片断大小范围是18-25个核苷酸，这与起始长双链RNA的长度无关。这种混合物可以在用于转染之前通过一步酒精沉淀被纯化。
hsiRNA片断的酒精沉淀加入十分之一体积的pH为5.5的3M NaOAc、2μl的糖原溶液，和三倍体积的95％冷乙醇。在-70摄氏度放置30分钟，或者-20摄氏度放置2个小时甚至至过夜。以14000rpm的速度在台式离心机上离心15分钟。小心地去除上清以避免扰动小的沉淀颗粒，加入2倍体积的80％乙醇，在室温放置10分钟，离心5分钟，倒出上清，让试管流干。让沉淀在空气中干燥。将干的RNA溶解在10mM Tris-HC1，pH8.0、1mMEDTA中，或者水中。
测定双链RNA的浓度这可以通过使用紫外分光光度计(260nm处的1OD对应于40μg/ml的双链RNA)来测量，或者使用荧光光度计(采用RIBOGREEN，Molecular Probes，Eugene，OR)，或者与本领域使用的siRNA标准比较。
转染指南酒精沉淀之后，hsiRNA混合物可以直接转染到哺乳动物细胞中，其中可以使用适合于寡聚核苷酸转染的试剂和程序，比如lipofectin2000、oligofectamine、TRANS-IT TKO(Mirus Corp.，Madison，WI)和Targefect(Targeting Systems，Santee，CA)。另外，磷酸钙和电穿孔也被报道在转染短RNA时有效。
对于每个转染孔(24孔形式)，可以使用25-100ng hsiRNA这样的用量作为初始量，其可以根据实验发现来调整。
大双链RNA可以如上所述地通过体外转录来合成，其中可以采用修饰过的转录缓冲液，其含有修饰过的核糖核苷酸以代替上述10X缓冲液中的NTP，比如这些修饰过的核苷酸是2-氟-核糖-CTP、2-氟-核糖-UTP、2-氧-甲基-核糖-CTP、2-氧-甲基-核糖-UTP、2-氧-甲基-核糖-ATP、2-氧-甲基-核糖-GTP或者其它2’修饰的核苷酸，这样的修饰核苷酸可以使双链RNA更加稳定或者更加不易于降解。一种被称为DURASCRIBE的试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI)可以用于这种目的。
实施例VIII
对应于目标mRNA的不同序列片断的hsiRNA混合物在沉默目标mRNA的过程中是有效的使用如实施例VI中描述的在10mM锰离子存在的条件下RNaseIII消化得到的混合物，测定了来自于与目标基因的不同片断互补的大双链RNA的hsiRNA混合物抑制基因表达的有效性。大双链RNA制备物是通过人类DNA甲基转移酶(DnMt1)(Acc.X63692)的3个cDNA片断的溢出转录合成的。对应于核苷酸(1737-2113)的片断1、对应于核苷酸(2114-3230)的片断2、对应于核苷酸(3231-4391)的片断3，都通过PCR被扩增，然后被克隆到Litmus 28i中。双链RNA是采用HiScribeTM试剂盒(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)和在试剂盒手册和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)提供的参考文献中给出的标准重组DNA技术得到的。双链RNA经过酒精沉淀之后，在10mM的MnCl2存在的条件下用RNaseIII处理。
这些由RNaseIII生成的hsiRNA混合物降低DnMT1的表达的有效性在猴上皮COS-7细胞中被检测。细胞按照实施例VI中的描述培养，以每孔1μg的量用表达质粒(pcDNA-4，含有融合了六聚组氨酸标记的全长人DnMT1序列)转染，并以如下形式转染a单独转染，或者b与100ng合成的针对荧光素酶的siRNA一起转染，或者c与100ng来自于DnMT1片断1的hsiRNA一起转染，或者d与100ng来自于DnMT1片断2的hsiRNA一起转染，或者e与100ng来自于DnMT1片断3的hsiRNA一起转染，按照实施例VI中的描述用Lipofectamine 2000转染。hsiRNA的终浓度是15nM。细胞在转染的48小时之后裂解，每个裂解液的一部分都用抗DnMT1抗体(New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)进行蛋白质印记分析，以测定特异性的沉默效应，并用抗p53抗体来检测非特异性的沉默效应。
蛋白质印记分析的结果(图10A和10B)表明，所有三个片段所产生的hsiRNA混合物都在降低DnMT1的表达过程中有效，但却不影响p53的表达(泳道4、5和6)。这些结果还表明来自于片断2(泳道6)的hsiRNA混合物与来自于其它两个片断的相比，在基因沉默中是更为有效，蛋白质印记上对应的条带与来自于其它片断的产物相比信号的减少说明了这一点。
实施例IX采用由RNaseIII消化的大双链RNA发现有效的siRNA序列的方法确定针对DnMT1有活性的单个siRNA对应于人类DNA甲基转移酶(DnMt1)(Acc.X63692)核苷酸片断2(2114-3230)的hsiRNA混合物在浓度为200ng/ml时采用Lipofectamine 2000导入到HEK293细胞中，以诱导DnMT1 mRNA的RNAi介导的沉默，正如实施例VIII所述。对照细胞用靶向非目标基因比如GFP的hsiRNA混合物处理。来自于被处理细胞和对照细胞的总RNA在转染之后6个小时首先用RNAwiz试剂(Ambion，Austin，TX)抽提出来，然后再用poly-A-spin试剂盒(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)按照制造商的实验流程来分离mRNA。使用标准的合成方法合成DNA反义链引物1(gtcagtctcattgggcctgccgtt)(SEQ ID NO13)引物2(gaaggcctcagggggcaggtacaca)(SEQ ID NO14)引物3(tcataccacagctggtagaagtaggt)(SEQ ID NO15)，并用α32P-ATP和高活性的多聚核苷酸激酶(PNK)(New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)根据制造商提供的流程标记其5’端。引物延伸是在两个系列的三个独立反应中进行的。一个系列采用的是来自于用hsiRNA混合物处理过的细胞的RNA，第二个系列采用的是用针对GFP的siRNA处理的阴性对照细胞的RNA。每个引物延伸反应都是采用1μg A+-RNA和Promega引物延伸系统(Promega，Madison，WI)根据制造商的指南和分子克隆手册(Molecular Cloning Mannual)(Sambrook et al.(2001))中描述的标准流程进行的。引物延伸的产物用聚丙烯酰胺测序胶分析，并且在胶上与利用引物1、2和3和利用片断2的Litmus构建物作为DNA模板而生成的Sanger测序梯度相邻，这就允许产物以单个核苷酸的分辨率被鉴定。目标DNMT1 RNA上的剪切位点通过比较引物延伸产物条带与测序梯度中那些共迁移的条带的迁移率来鉴定，比如将引物1的延伸产物与用引物1生成的测序梯度相比较。上述程序被概括在图11中。这些结果提供了mRNA剪切位点处的序列。根据siRNA以在对应于siRNA中央部位的位置导致剪切的方式结合到mRNA这些知识(Martinez et al.，Cell 110563-574(2002))，就可能由剪切位点处的序列确定与mRNA被检测到的剪切相关的siRNA片断的全长序列。一旦导致剪切的siRNA片断的序列被鉴定出来，就可以制备具有所述被鉴定的序列的DNA，使用标准技术将DNA插入到具有可以表达双链RNA的启动子的载体中，就可以获得克隆。被克隆的编码siRNA的DNA序列可以作为研究基因沉默的试剂或者用作治疗试剂。
除了以上所述，编码siRNA序列的已克隆的DNA可以被克隆。这种DNA会表达具有发卡结构的RNA。这种DNA可以作为基因沉默的试剂。另外，DNA可以被化学合成，以用于体外转录。在这种情况下，所需siRNA的序列以具有重复序列且其间插入有连接片断(spacer)的DNA的形式被合成。一旦被转录之后，这种方向相反的RNA重复就可以生成发卡产物，而所述连接片断则对应于环形区(Milligan，et al.，Nucleic Acids Res.，158783-8798(1987))。
序列表<110>新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)<120>与基因沉默相关的方法和组合物<130>NEB-208/9-PCN<150>US 60/402,769<151>2002-08-12<150>US 60/407,543<151>2002-08-30<150>US 60/467,541<151>2003-05-02<160>15<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>908<212>DNA<213>未知<220>
<223>malE转录物<400>1gggcagatct gctgccgaac ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg ctggataaag 60aactgaaagc gaaaggtaag agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg tacttcacct120ggccgctgat tgctgctgac gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc aagtacgaca180ttaaagacgt gggcgtggat aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc ctggttgacc240tgattaaaaa caaacacatg aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa gctgccttta300ataaaggcga aacagcgatg accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac atcgacacca360gcaaagtgaa ttatggtgta acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca tccaaaccgt420tcgttggcgt gctgagcgca ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag ctggcaaaag480agttcctcga aaactatctg ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat aaagacaaac540cgctgggtgc cgtagcgctg aagtcttacg aggaagagtt ggcgaaagat ccacgtattg600ccgccactat ggaaaacgcc cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg cagatgtccg660ctttctggta tgccgtgcgt actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt cagactgtcg720atgaagccct gaaagacgcg cagactaatt cgagctcgaa caacaacaac aataacaata780acaacaacct cgggatcgag ggaaggattt cagaattcct gcaggatatc tggatccacg840aagcttccca tggtgacgtc accggttcta gatacctagg tgagctctgg taccctctag900tcaaggcc 908<210>2<211>868<212>DNA<213>未知<220>
<223>绿色荧光蛋白转录物<400>2taatacgact cactataggg gcccgtgcaa ttgaagccgg ctggcgccaa gcttctctgc 60aggatatctg gatccacgaa ttcgctagcc taccggtcgc caccatggtg agcaagggcg120
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc180acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga240agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga300cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca360agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca420actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc480tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact540acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact600tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga660acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt720ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga780ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacag gcatgcgtcg accctctagt840caaggcctat agtgagtcgt attacgga 868<210>3<211>18<212>DNA<213>未知<220>
<223>引物<400>3taaacgactc actatagg 18<210>4<211>21<212>DNA<213>未知<220>
<223>引物<400>4ctgcaggata tctggatcca c 21<210>5<211>25<212>DNA<213>未知<220>
<223>引物<400>5catgcccggg tacctttcta ttctc 25<210>6<211>21<212>DNA<213>未知<220>
<223>引物<400>6gtggatccag atatcctgca g 21<210>7
<211>22<212>RNA<213>未知<220>
<223>正义链绿色荧光蛋siRNA<400>7gcaagcugac ccugaaguuc au 22<210>8<211>22<212>RNA<213>未知<220>
<223>反义链绿色荧光蛋白siRNA<400>8gaacuucagg gucagcuugc cg 22<210>9<211>21<212>DNA<213>未知<220>
<223>正义链荧光素酶GL3 siRNA<400>9cuuacgcuga guacuucgat t 21<210>10<211>21<212>DNA<213>未知<220>
<223>反义链荧光素酶GL3 siRNA<400>10ucgaaguacu cagcguaagt t 21<210>11<211>24<212>DNA<213>未知<220>
<223>引物<400>11ctcgagtaat acgactcact atag 24<210>12<211>38<212>DNA<213>未知<220>
<223>扩增引物<400>12taatacgact cactatagaa ggacagatgg ttaagtac38<210>13<211>24<212>DNA<213>未知
<220>
<223>DNA反义引物1<400>13gtcagtctca ttgggcctgc cgtt 24<210>14<211>25<212>DNA<213>未知<220>
<223>DNA反义引物2<400>14gaaggcctca gggggcaggt acaca 25<210>15<211>26<212>DNA<213>未知<220>
<223>DNA反义引物3<400>15tcataccaca gctggtagaa gtaggt 2权利要求
1.一种生成hsiRNA混合物的方法，包括(a)在含有二价过渡金属离子和RNaseIII的反应混合物中消化大双链RNA制备物；以及(b)生成hsiRNA混合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述hsiRNA混合物是大双链RNA制备物被完全消化的产物。
3.根据权利要求1的方法，其中反应混合物中RNaseIII和大双链RNA的质量比范围是大约0.005∶1到25∶1。
4.根据权利要求1的方法，其中反应混合物中RNaseIII和大双链RNA的质量比范围是大约0.0125∶1到10∶1。
5.根据权利要求1的方法，其中所述过渡金属阳离子是锰离子。
6.根据权利要求5的方法，其中所述反应混合物含有浓度范围为大约5-10mM的锰离子。
7.根据权利要求6的方法，其中所述反应混合物含有浓度范围为大约10-20mM的锰离子。
8.根据权利要求1的方法，其中所述过渡金属是选自镍、钴和镉。
9.根据权利要求2的方法，其中完全消化是在少于6小时的时间内完成的。
10.根据权利要求2的方法，其中完全消化是在少于2小时的时间内完成的。
11.一种生成hsiRNA混合物的方法，包括(a)在含有RNaseIII的反应混合物中消化大双链RNA的制备物，其中反应混合物中酶与底物的质量比大于或者等于大约0.25∶1；以及(b)生成hsiRNA混合物。
12.一种沉默目标基因的表达的方法，包括向宿主细胞中导入根据权利要求1或者权利要求11制备的hsiRNA混合物，其中在该混合物中每个siRNA的核苷酸序列都具有与目标基因互补的序列。
13.一系列的双链RNA片断，其包含大小约为5-30个核苷酸的多个重叠片断，该系列中的片断集合起来代表了一个或多个大双链RNA的序列的实质部分，这些片断是用纯化的酶通过体外剪切从所述的大双链RNA获得的，所述的每一个大双链RNA的一条链具有与信使RNA的部分或者全部互补的序列。
14.根据权利要求13的一系列片断，其中所述实质部分的比例大于大双链RNA的序列的约50％。
15.根据权利要求13的一系列片断，其中所述实质部分的比例大于大双链RNA的序列的约65％。
16.根据权利要求13的一系列片断，其中超过大约30％的RNA片断具有约18-25个碱基对的片断大小。
17.根据权利要求13的一系列片断，其中该系列中有至少一个片断、至多100％的片断能够在细胞中导致目标mRNA的剪切。
18.根据权利要求17的一系列片断，其中有至少大约50％的片断能够导致mRNA的剪切。
19.根据权利要求17的一系列片断，其中有至少大约75％的片断能够导致mRNA的剪切。
20.根据权利要求13的一系列片断，其在被导入到真核细胞中时可以在体内条件下导致RNA沉默。
21.由hsiRNA混合物生成DNA克隆文库的方法，其中每个克隆表达来自hsiRNA混合物的一个或多个双链RNA片断，该方法包括(a)使hsiRNA混合物变性以形成未配对RNA链的混合物；(b)将第一单链DNA引物连接到未配对RNA链的3’端，第二单链DNA引物连接到未配对RNA链的5’端；(c)反转录步骤(b)中的嵌合DNA-RNA产物以形成互补的DNA片断；以及(d)将一个或者多个DNA片断插入到载体中以形成克隆文库。
22.根据权利要求21的方法，其中步骤(c)进一步包括对DNA片断进行聚合酶依赖型的扩增。
23.根据权利要求21的方法，其中步骤(b)中的RNA链的5’端被去磷酸化。
24.根据权利要求23的方法，其中步骤(b)中的RNA链的3’端是3’端羟基末端，而第一DNA引物在5’端和3’端都含有磷酸根基团时，第一引物在第二引物连接之前与RNA 3’端连接。
25.根据权利要求24的方法，其中步骤(b)中连接到第一引物上的RNA链被磷酸化，然后连接到第二引物上，其中第二引物在其3’端没有被磷酸化。
26.生成克隆文库的方法，其中每个克隆对应于来自hsiRNA混合物的一个或多个双链RNA片断，该方法包括(a)使hsiRNA混合物变性以形成未配对RNA链的混合物；(b)用酶除去混合物中每条链上的5’端磷酸基团；(c)将各条链的3’羟基端连接到DNA引物上，该DNA引物在5’端和3’端都含有磷酸基团；(d)用酶磷酸化所得到的产物的5’端；(e)将各条链的磷酸化的5’端连接到第二DNA引物上，该第二DNA引物具有未磷酸化的3’末端；(f)反转录步骤(e)中的DNA-RNA嵌合产物以形成互补的DNA片断；以及(g)将一个或多个DNA片断插入到载体中以形成序列的文库。
27.根据权利要求26的方法，其中步骤(f)进一步包括对DNA片断进行聚合酶依赖型的扩增。
28.根据权利要求26的方法，其中所述载体是pUC19或者Litmus载体。
29.制备hsiRNA混合物的试剂盒，包括RNaseIII的制备物、含有浓度范围为大约5mM-100mM的锰离子的RNase缓冲液，以及选配的合成大双链RNA所需要的试剂。
30.获得大双链RNA分子的方法，包括(a)将编码大双链RNA的DNA片断或者DNA片断文库插入到载体中，该载体所具有的克隆位点的两侧有相向的T7启动子；(b)进行体外或体内转录，以及(c)获得大双链RNA分子。
31.降低真核细胞中一个或多个目标基因的表达的方法，包括(a)将根据权利要求13的一系列hsiRNA片断导入到细胞中，其中大双链RNA与各个目标基因的信使RNA转录子的所有或部分是互补的；以及(b)与没有hsiRNA的真核细胞中所述基因的表达相比，降低真核细胞中所述的一个或多个目标基因的表达。
32.降低真核细胞中一个或多个目标基因的表达的方法，包括将一个或多个根据权利要求21或26制备的DNA克隆导入到细胞中，其中这些DNA克隆表达siRNA片断，与缺乏这些DNA序列的真核细胞中的基因表达相比，这些siRNA片断适于降低目标真核细胞中的表达。
33.根据权利要求31或者32的方法，其中所述真核细胞存在于哺乳动物中，这样，降低一个或多个目标基因的表达导致表型变化。
34.根据权利要求33的方法，其中所述表型变化提供了对哺乳动物疾病的治疗。
35.根据权利要求34的方法，其中所述表型变化是哺乳动物中所期望的特征的增强。
36.根据权利要求33的方法，其中所述表型变化是对已选择的表型的诊断。
37.根据权利要求31或者32的方法，其中降低基因的表达是一种分析该基因产物在其中发挥功能的生化途径的工具。
38.根据权利要求37的方法，其中所述生化途径可以通过与诊断试剂组合来被进一步分析。
39.根据权利要求38的方法，其中所述诊断试剂是一种或者多种抗体。
40.根据权利要求31或32的方法，其中所述真核细胞存在于非人类的动物中。
41.根据权利要求31或32的方法，其中所述真核细胞是转基因动物的组分，该转基因动物是从含有所述DNA序列的受精卵细胞产生的。
42.用于鉴定能够增加目标基因的基因沉默的hsiRNA混合物的快速探索方法，包括(a)合成多个大双链RNA，每个大双链RNA都具有与目标基因的片断互补的序列；(b)在锰离子存在的条件下用RNaseIII消化各个大双链RNA以产生对应的hsiRNA混合物；(c)将各hsiRNA混合物导入到真核细胞中以测定基因沉默是否发生；以及(d)确定所述hsiRNA混合物中哪些混合物导致了增强的基因沉默。
43.根据权利要求42的方法，其中步骤(d)进一步包括组合第一hsiRNA混合物和第二hsiRNA混合物以增强基因沉默。
44.根据权利要求42的方法，进一步包括从hsiRNA混合物中选择一个个单独的siRNA片断，并将这些单个的siRNA片断导入到真核细胞中以实现所需的基因沉默。
45.由mRNA中的剪切位点来鉴定对应于siRNA的序列的方法，包括(a)用酶促方法获得hsiRNA混合物；(b)将所述hsiRNA导入到细胞中；(c)从细胞中抽提出被剪切的mRNA；(d)确定在被siRNA剪切的mRNA的剪切位点处的末端核苷酸的序列；以及(e)从剪切位点的序列和完整mRNA上相邻的核苷酸来鉴定siRNA的序列。
46.根据权利要求45的方法，其中确定序列的步骤进一步包括应用被标记的延伸DNA引物。
47.一系列的siRNA片断，包括特异性地结合mRNA从而引发mRNA的剪切的大约15-30个核苷酸的双链RNA。
全文摘要
一种通过在特定条件下酶促剪切双链大RNA来获得用于基因沉默的不均一短双链RNA分子(hsiRNA)的混合物的方法。所得到的混合物不需任何分级分离步骤便总能包含有更多的大小为21－22个核苷酸的片断。这些片断包含的序列集合起来便总体上覆盖了作为这些片断来源的整个长度的大双链RNA分子。具有可以单独地代表目标mRNA的片断的序列的双链RNA可以用这里描述的方法来分析，以鉴定可以对某基因或转录序列产生基因沉默效应的最具活性的一部分hsiRNA片段或者单独的siRNA片断。另外提供了制备和克隆编码所选的siRNA、hsiRNA混合物或者发夹序列的DNA的方法，从而提供了源自长双链RNA的基因沉默试剂的源源不断的供应。
文档编号A61P31/18GK1685063SQ03823441
公开日2005年10月19日 申请日期2003年7月18日 优先权日2002年8月12日
发明者G·采齐尼斯, G·菲何利, C·塔奇, C·诺伦, L·麦克雷诺兹 申请人:新英格兰生物实验室公司