一种含有carp基因及其相关产物的抗癌药物及其用途的制作方法

专利名称：一种含有carp基因及其相关产物的抗癌药物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物及其用途，属于生物制药领域。
背景技术：
癌症是严重危害人类健康的一类疾病。根据世界卫生组织(WHO)报告，2000年全球新发癌症病人1010万人，死亡620万人，现患癌症病例2240万。过去的10年间，全球癌症发病率增长了22％。无论从发病(120万)还是死亡(110万)来看，肺癌均为全球最主要的癌症，以死亡排序以下为胃癌、肝癌及结直肠癌。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织专家预测，未来25年全世界80多亿人口中，将有3亿人患肿瘤，其中1亿人因癌症而死亡，21世纪癌症将成为人类健康的“第一杀手”。
根据全国性死因回顾调查表明，20年来中国的癌症发病和死亡率逐年上升，每200个家庭中，有1个家庭因有癌症病人而遭受磨难。调查表明，2000年全国癌症死亡人数约150万，发病人数约200万，每死亡5人中就有一人死于癌症。
癌症是由控制细胞增生、成熟、转移与衰老的基因突变引起的赘生情形。目前癌症发生的分子机制并不十分清楚，但越来越多的证据表明，它与多个癌基因的激活以及抑癌基因的失活有关。抑制癌基因的表达，重建抑癌基因的功能是目前癌症基因治疗所追求的基本目标。寻找有效的针对癌细胞的目的基因以及高效安全的载体的应用，无疑对癌症的防治具有重要意义。
腺病毒载体是继逆转录病毒载体后，发展得较快的载体系统，它以遗传毒性低，致病性小，宿主范围广，滴度高，感染效率高，装载容量大等优势已广泛用于基因治疗。目前腺病毒载体已成为最有应用前景的病毒载体。在肿瘤的基因治疗中，基因的转移主要采取将目的基因直接转移至宿主体内的in vivo方式，要求选择的载体高效转导，只有这样才能满足临床肿瘤基因治疗的需要。因此，我们选择了腺病毒作为载体。在研究中发现，腺病毒感染效率高，能将目的基因转移到几乎100％的肿瘤细胞中去，通过GFP(绿色荧光蛋白)显示在MOI＝50时，培养细胞的感染效率即高达90％以上。如此高的转导效率对于肿瘤的体内基因治疗有很大的促进作用。
CARP基因是从成人主动脉cDNA文库中克隆到的一个新基因，该基因长2371bp，定位于10p13，CARP蛋白含有445个氨基酸残基，分子量为49.7kD，该蛋白无跨膜区，包含有一个CARD结构域(aa160-243)、一个核受体结合模体和两个EF手模体。Northern杂交显示该基因在心脏、骨骼肌、肾脏以及肝脏中高表达。
目前，针对CARP基因功能的研究还在不断深入，人们期待着能够发现与人类疾病相关的CARP基因的新功能，从而为这些疾病的诊断和治疗提供分子医学领域的辅助。

发明内容
在前期的研究中，我们将CARP稳定转染7种肿瘤细胞系肺癌A549和PG细胞系，黑色素瘤WM451细胞系，前列腺癌PC-3和PC-3M细胞系，肝癌H7402细胞系以及膀胱癌BIU87细胞系，结果发现相比较于转染空载体和未经转染的细胞，转染了CARP的细胞增殖被显著的抑制了1.2-5倍(P＜0.02)。本发明则以肺癌A549细胞系作为靶细胞，腺病毒载体介导，进一步验证CARP基因在体内体外对肿瘤发生生长的抑制作用。探索腺病毒介导CARP基因高表达治疗癌症的可行性，为癌症的基因治疗提供候选基因，并为癌症基因治疗的临床前研究提供实验依据。
本发明的目的是提供一利含有抑癌基因CARP的基因抗癌药物以及调控此基因的相关化学、生物产品。
本发明的另一个目的是提供这种药物在癌症治疗方面的用途。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其有效成分为CARP基因、或其剪接体、或其反义寡核苷酸、或其编码的肽和肽段中的一种或几种。
一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其有效成分为携带有CARP基因的载体。我们通过Clontech公司的多种肿瘤组织cDNA芯片，分析了CARP在肿瘤组织与正常组织间的表达差异，结果显示CARP在13种肿瘤组织中相比于其对应的正常组织均表达下调，尤其在乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌和前列腺癌中下调的程度较高。该结果提示，CARP基因极可能是上述肿瘤的抑癌基因，通过携带有CARP基因的载体将其导入体内，可以有效抑制肿瘤的生长。
在体外，我们用携带CARP基因的腺病毒(Ad-CARP)、腺病毒空载体(Ad-GFP)或PBS分别感染A549细胞，发现Ad-CARP能够明显抑制A549细胞的增殖。在体内实验中，我们发现经过Ad-CARP感染的A549细胞注射到裸鼠皮下，不能形成肿瘤；而由Ad-GFP或PBS处理过的A549细胞注射到裸鼠皮下后，成瘤率为100％。同时，在接种A549细胞的裸鼠肿瘤模型中，用Ad-CARP、Ad-GFP和PBS分别进行治疗，相比于两个对照组，Ad-CARP对肿瘤生长的抑制率分别为72.6％(相比于PBS组)和64.3％(相比于Ad-GFP组)。这些结果都表明，腺病毒介导CARP基因的高表达对于肿瘤的发生及生长有着明显的抑制作用。
所述CARP基因、或其剪接体、或其反义寡核苷酸整合于载体上。
所述载体为基因治疗载体，选自裸体质粒、腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒中的一种或几种。其中，所述载体可以是裸体质粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)、逆转录病毒(Retrovirus和Lentivirus)等基因治疗载体。这些载体均实现了商业化，可以方便地购得，使用其进行基因工程操作属于本领域通用技术。
所述载体内含有一个拷贝正常的CARP基因或突变体CARP基因，具有抑制肿瘤的作用。
所述载体为腺病毒。
所述腺病毒为E1、E3缺失的C种5血清型人腺病毒，带有CMV启动子，属于第二代腺病毒载体。其重组系统为购自QUANTUM公司的AdEasyTM系统，系统由两种质粒组成，一种是包含有E1、E3缺失的腺病毒基因组DNA的大质粒(骨架质粒)；另一种是小的穿梭质粒，其带有目的基因表达盒以及在表达盒两侧的与大质粒上的目的基因拟插入部位同源的序列(左、右臂)。
所述腺病毒的浓度为1012病毒颗粒/毫升。
所述药物中还含有磷酸盐缓冲液溶剂(PBS)。常用的如在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加水至1L。
该药物可用于治疗治疗肺癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌和前列腺癌等癌症。
由于CARP是癌症发生发展的一个重要的抑制基因，是抑制癌症组织生长的关键靶点，一切化学、生物、天然、人工合成的能够调整CARP表达的药物都会成为有效的抗癌药物，因此也包含在本发明的范围之内本发明的有益效果是本发明采用本实验室克隆的新的抑癌基因-CARP基因，通过基因工程的方法将其整合到重组腺病毒载体中，制备成抗肿瘤的药物。通过细胞学、体外及动物实验证实，其肿瘤抑制作用非常明显，且毒副作用低，致病性小。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开的内容进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。


图1为实施例1的Northern杂交结果图，A图为CARP特异探针与Cancerprofiling array杂交结果，B图为对照基因(Ubiquitin)与Cancer profiling array杂交结果。
图2为利用pAdEasy-1系统产生重组腺病毒技术线路。
图3为重组腺病毒载体的PacI酶切鉴定图谱。
图4为重组腺病毒的PCR鉴定图谱。
图5为MTT法检验腺病毒介导的CARP对A549细胞生长的抑制图。
图6为经过PBS、Ad-CARP或Ad-GFP处理的A549细胞接种裸鼠后的肿瘤生长曲线。
图7为Ad-CARP对肿瘤生长抑制的效果图。
具体实施例方式
下述实施例使用的材料和主要试剂
一、生物材料1、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV(购自QUANTUM公司)2、腺病毒骨架载体pAdeasy-1(购自QUANTUM公司)3、大肠杆菌(E.Coli)BJ5183(本实验室保存)4、宿主菌E.Coli DH10B(本实验室保存)5、293细胞系(购自中国协和医科大学基础所细胞中心)二、工具酶及常用试剂盒各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A等均为TaKaRa或NEB公司产品。转染试剂Lipofectamine2000购自Gibco BRL，硝酸纤维素膜和Northern Blot尼龙膜购自Schleicher & Schuell公司，PVDF(ImmobilonTM-P)膜购自Millipore公司，随机引物试剂盒(Prim it)购自QIAGEN，PCR产物回收纯化试剂盒购自鼎国。
三、主要化学试剂1、杂交标记试剂盒(e-a-Gene Labeling System)购自Promega，杂交液(ExpressHyb Hybridization Solution)购自BD Biosciences Clontech，质粒提取试剂盒(Hispeed Plasmid Midi Kit)购自QIAGEN，DMEM、F12培养基购自GibcoBRL，胎牛血清购自Hyclone，氯化铯(CsCl)购自Sigma。
其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。
2、试剂的配制1)磷酸盐缓冲液(PBS)在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加水至1L。
2)DMEM高糖培养基取1L包装DMEM(high glucose)加1000ml三蒸水，充分溶解。加3.7g NaHCO3，完全溶解后，用HEPES调PH值至7.2，过滤除菌。
3)F12培养基取1L包装F12加1000ml三蒸水，充分溶解。加1.374g NaHCO3，完全溶解后，用HEPES调PH值至7.2，过滤除菌。
4)LB培养基胰蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl10g用10mmol/L NaOH调pH值为7.0，加入去离子水至总体积为1L。
5)溴化乙锭(EB)溶液(10mg/ml)取EB100mg于棕色瓶中，加ddH2O10ml溶解，室温避光储存。
6)TE缓冲液10mmol/LTris.Cl(pH＝7.0)1mmol/L EDTA (pH＝8.0)7)腺病毒透析缓冲液10mM Tris-Cl pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油8)2×病毒储存液10mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，0.1％BSA，50％甘油实施例1、CARP基因在肿瘤组织中表达下调--多种肿瘤组织芯片分析一、材料多种肿瘤组织芯片(Cancer Profiling Array I，Catalog#；7841-1)购自Clontech公司，包括乳腺癌，子宫癌，结肠癌，卵巢癌，胃癌，宫颈癌，肺癌，肾癌，直肠癌，甲状腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小肠癌13种肿瘤组织及其对应的来自同一病人的正常组织的总共241对cDNA。
二、方法(一)制备CARP基因特异探针的模板1、以下列引物从含有CARP基因cDNA的质粒(pAd-CARP)中扩增CARP基因cDNA的319-1243位上游引物5’-TGGCGGGATTGTTCAGAGGAAGAGC-3’，下游引物5’-TCTGGACCACTGGAGCCCTGATCAG-3’。
2、PCR(聚合酶链式扩增反应)体系

PCR参数94℃ 5分钟

72℃ 10分钟3、PCR产物纯化(试剂盒购自鼎国)1)PCR产物进行琼脂糖电泳，切取含有DNA片段的琼脂糖胶(100-200mg)，按1∶3(切取体积∶溶液A体积)的比例加入溶液A；2)65℃水浴5-10分钟，待胶完全溶化，加入15μl溶液B，混匀；3)混和液移入离心柱中，静置2分钟，10,000rpm离心1分钟；4)倒掉液体，加入500μl溶液C，8,000rpm离心1分钟；5)重复步骤4)；6)倒掉液体，加入500μl溶液D，8,000rpm离心1分钟；7)重复步骤6)；8)12,000rpm离心1分钟，甩干残存的液体；9)离心柱置入新的离心管中，敞开管盖5-10分钟使乙醇挥发殆尽；10)加入20μl溶液E(50℃预热)，静置2分钟；11)12,000rpm离心2分钟，管底溶液即为所需的纯化产物，放-20℃保存。
(二)标记探针在一个0.5ml离心管中加入下列试剂(室温放置1小时)

PCR产物需在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟。
(三)探针纯化将纯化柱子先颠倒混匀，去掉底部片状物放入离心管中，700g离心3分钟，将标记好的探针加到柱子中，换一个新的离心管，700g离心3分钟。
(四)预杂交将膜用6×SSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡，加入6ml预杂交液(15ml购于Clontech的杂交液加1.5mg鲑精DNA 98℃变性5分钟后，立即冰浴2分钟)，68℃预杂交1小时。
(五)杂交倒掉预杂交液，加入上一步剩下的杂交液9ml及探针(纯化好的探针加入150μg鲑精DNA在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟)，68℃杂交5-6个小时。
(六)洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在68℃洗膜四次，每次30分钟。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在68℃洗30分钟，共两次，最后用200ml2×SSC室温洗5分钟。
(七)压片及洗片用滤纸吸去膜上的液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上，压片；-70℃曝光适当时间，洗片。
三、实验结果如图1和表1所示，杂交结果显示CARP在这13种癌组织中相比于其对应的正常组织均表达下调，尤其在乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌和前列腺癌中下调的程度较高。
表1、CARP在所检测的13种癌组织中下调的统计情况。

实施例2、重组腺病毒载体的构建以及重组病毒的获得为了进一步证实CARP基因对肿瘤的抑制作用，我们构建了携带CARP基因的重组腺病毒载体pAd-CMV-CARP，以及另一腺病毒空载体pAd-CMV-GFP作为负对照。载体构建好之后，我们利用293细胞包装、扩增出大量的重组腺病毒，并将所得的病毒进行纯化以及滴度的测定。
一、材料方法(一)将目的基因CARP克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中1、由于CARP基因cDNA上751-758位有一个PacI酶切位点(TTAATTAA)，因此多设计一个中间引物5’-GGCAGCCAAAGTTTGATTAATCTCCTGCTGACGGG-3’，将第753位的A点突变为G。
上游引物5’-CGCCGGTACCCCATCATGTCCGAACTGAC-3’(下划线为KpnI酶切位点)，下游引物5’-ATACCTCGAGAAATTAATTTAGTGAAGGAGAGC-3’(下划线为XhoI酶切位点)。
2、第一轮PCR以中间引物为上游引物，与下游引物一起进行扩增1)PCR体系

2)PCR参数94℃ 5分钟

72℃ 10分钟3)PCR产物纯化回收(方法及试剂与前面一样)3、第二轮PCR以第一轮的PCR产物为下游引物，与上游引物一起进行扩增1)PCR体系

2)PCR参数94℃ 5分钟

72℃ 10分钟3)PCR产物纯化回收(方法及试剂与前面一样)4、将第二轮的PCR产物与T载体连接，转化，提质粒，进行测序。验证无误后，经KpnI和XhoI双酶切；同时以这两种酶双酶切pAdTrack-CMV。
酶切体系

37℃水浴孵育2小时。
酶切产物纯化回收(方法与PCR产物纯化回收一样)。
两个酶切产物连接，转化，筛选得到pAd-CMV-CARP。
(二)在大肠杆菌BJ5183中通过同源重组产生腺病毒质粒1、用试剂盒(Hispeed Plasmid Midi Kit，购自QIAGEN公司)纯化pAd-CMV-CARP，pAdTrack-CMV以及腺病毒骨架载体pAdeasy-11)挑新鲜的单克隆接种于3ml LB培养基中(分别加入相应的抗生素，pAd-CMV-CARP和pAdTrack-CMV为卡那50μg/ml，pAdeasy-1为氨苄100μml)，37℃，300rpm，8小时；2)按1∶500将其接种于50ml LB培养基中(加入相应抗生素)，37℃，300rpm，12-16小时；3)收获细菌，4℃，6,000g，15分钟；
4)用6ml已加RNaseA的Buffer P1重悬细菌，充分混匀；5)加入6ml Buffer P2，小心混匀，室温放置5分钟(不能超过5分钟，以防止染色体DNA断裂)；6)准备QIAfilter Cartridge，将螺帽拧在其下面的管口上，放于一无菌的50ml管中备用；7)加入6ml预冷的Buffer P3，小心混匀以裂解细菌，不要置于冰上；8)将裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室温放置10分钟，不要插入活塞；9)加4ml Bμffer QBT用来平衡Hispeed Midi Tip，让液体靠重力通过柱子流尽；10)去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，小心插入活塞，将裂解液滤入平衡好的Hispeed Midi Tip中；11)让液体靠重力通过柱子；12)加入20ml Bffer QC，充分洗涤柱子；13)用5ml Bffer QF洗脱DNA(质粒)；14)加入3.5ml室温放置的异丙醇，混匀，室温放置5分钟；15)在此时间内，拔掉20ml注射器的栓塞，并将QIAprecipitator Midi Modμle小心的插到注射器嘴上；16)将混合物倒入20ml注射器中，插上栓塞，用力压下，使液体滤过QIAprecipitator；17)将QIAprecipitator从注射器上拔掉，再拔出栓塞，再重新插上QIAprecipitator，加入2ml70％的乙醇，与上一步一样，插上栓塞，用乙醇洗涤DNA；18)将QIAprecipitator从注射器上拔掉，再拔出栓塞，再重新插上QIAprecipitator，插上栓塞之后用力压下以空气干燥膜和DNA；重复此步一次；19)用吸水纸小心吸干QIAprecipitator的管嘴，防止乙醇上吸；20)拔掉5ml注射器的栓塞，并将QIAprecipitator Midi Modμle小心的插到注射器嘴上，加入500μl Bμffer TE，插入栓塞，将溶解的DNA滤到一个1.5ml的离心管中。此即为纯化好的质粒，放-20℃保存。
2、BJ5183感受态细菌的制备1)挑取新鲜单克隆于3ml LB(含30μg/ml链霉素)中，37℃，300rpm，12小时；2)按1∶500稀释于250ml LB中(含30μg/ml链霉素)，37℃，300rpm，4-6小时，直至OD550＝0.6；3)将菌液收集于50ml离心管中，冰浴2-4hr；4)4℃，3,000rpm离心10分钟；5)弃上清，将细菌沉淀悬浮于250ml无菌的、冰预冷的WB溶液(甘油∶水＝1∶10)中，于4℃，3,000rpm离心10分钟；6)弃上清，重复洗涤二次；7)小心吸弃大部分上清，剩约5ml，将细菌悬液转移至50ml离心管，4℃，3,000rpm离心10min；8)再次倒掉大部分上清，只留0.5ml上清；9)将细菌悬液分装于在-80℃预冷的离心管中，保存于-80℃。
3、电击共转化入大肠杆菌BJ51831)重组穿梭质粒(pAd-CMV-CARP和pAdTrack-CMV)分别用PmeI单酶切，使之线性化，纯化回收酶切产物；2)0.1μgpAdEasy-1与1.0μg线性化穿梭质粒混合，高压电转化入BJ5183感受态细菌中；(电转条件2,500V，200Ohms，25mFD)3)电转后立即将1ml LB培养液加入细菌中，37℃培养30分钟；4)取适量细菌涂在含50μg/ml卡那霉素的培养板上，37℃培养16-20小时；5)挑选卡那霉素抗性克隆(小克隆含阳性重组子的可能性大)，碱裂解法小量提取质粒DNA，用0.8％琼脂糖凝胶电泳初步分析，并以PacI酶切进行鉴定，阳性克隆经测序验证；6)将所得的阳性重组腺病毒质粒与上述同样条件电转化入宿主菌DH10B中(在此宿主菌中容易获得高拷贝的质粒)。这样即得到两个重组腺病毒质粒pAd-CMV-CARP和pAd-CMV-GFP。
(三)在293细胞系中包装出腺病毒1、腺病毒质粒的线性化取重组腺病毒质粒8μg，用PacI酶切(1U/1μg DNA)，37℃，2小时完全消化以切去ori和kana抗性基因等质粒元件，并暴露其反转末端重复序列(ITR)。酶切产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于无菌水中。
2、转染293细胞及病毒的包装1)转染前24小时于每T-25cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50-70％；2)转染时，将含有4μg重组腺病毒质粒(线性化好的)和10μl的脂质体(Lipofectamine2000，Gibcol)分别加到1.5ml的离心管中，然后加入500μlDMEM(无抗生素，无血清)，两种液体混合，室温放置20分钟；3)同时吸掉293细胞的旧培养液，用4ml的无血清，无抗生素的DMEM培养液洗1-2次，加入2-3ml DMEM(无抗生素，无血清)，于37℃，5％ CO2，条件下培养10分钟；4)将脂质体-DNA混合物加入上述293细胞中，轻轻混匀，于37℃，5％ CO2，培养；5)4-6小时后，吸走转染液，换入5ml的完全DMEM(10％FBS，100单位/ml的青霉素，100单位/ml的链霉素)，于37℃，5％ CO2，继续培养；6)转染后7-10天，大约30-50％的细胞已经漂起，用吸管吹下细胞转入50ml离心管中；7)将细胞冻于-70℃，30分钟，然后放入37℃水浴中融化，待半融化状态时，涡旋震荡2分钟。重复此步3次(一共4次)；8)1,000-2,000rpm，离心10分钟；9)分装上清(此即为包装好的病毒)，保存于-70℃备用。
(四)大规模扩增以得到高滴度的病毒1、首次扩增的存储病毒的获得
1)用上述收集的病毒的20-30％去感染1瓶T-25cm2培养瓶的293细胞(50-70％汇合)，感染后2-3天CPE或细胞裂解应当很明显；2)通常在感染后3-4天，当大部分的细胞脱落时，收集病毒。这称为首次扩增的存储病毒，此次扩增的存储病毒含有最低比例的RCA，所以是非常宝贵的存储病毒；3)依上述步骤(-70℃/37℃/Vortex)收集病毒上清及细胞，每瓶T-25cm2培养瓶收获的病毒溶于1-2ml PBS中，此时至少有107感染性病毒颗粒/ml；2、准备下一步大规模扩增病毒每次扩增之前，都应该作MOI试验以确定下一步扩增所需的病毒用量。
MOI试验24孔板培养293细胞，待70-80％融合，移去培养基，每孔加入以新鲜培养基梯度稀释的病毒上清，留一孔作对照。感染3小时，其间隔30分钟轻摇一次。感染后移去病毒，加0.5ml完全培养基，37℃，5％ CO2，继续培养。感染后3天产生完全CPE所对应孔的MOI即相当于10-20。
除每次的规模有所不同外，每轮扩增的方法基本相同。另外第一次大规模扩增的MOI值用10，随后几轮用25。
3、腺病毒的大规模扩增1)用10ml完全DMEM于T-75cm2的培养瓶中种植3×106个293细胞，使其在感染时约80％汇合；2)从75cm2的培养瓶中移去培养基，小心将病毒上清(MOI＝10-20)加到细胞表面，注意不要破坏细胞层，交叉方向慢摇培养皿3次以铺展混合物。于5％CO2、37℃孵育90分钟，其间每15分钟轻摇一次培养瓶；3)补加9ml的完全DMEM；4)感染后通常于CO2孵箱37℃孵育3-4天，当全部的细胞卷起，约一半细胞脱落时，准备收集病毒。
5)按前面的方法收集病毒上清，保存于-70℃。
(五)CsCl密度梯度法纯化重组腺病毒纯化病毒包含3个步骤不连续CsCl梯度除去大部分细胞碎片和缺陷病毒颗粒(CsCl沉降)；
连续CsCl梯度彻底从缺陷病毒颗粒中分离感染性病毒(CsCl密度梯度)；透析除去CsCl。在大多数情况下，可能是被培养基稀释的缘故，甘油或CsCl的存在不会对实验有影响，所以体外细胞学实验不必透析；但用含CsCl的病毒储存液直接注射动物组织可能诱发病变，因此体内实验必须要经过透析。
1、不连续CsCl梯度除去大部分细胞碎片和缺陷病毒颗粒1)制备CsCl低密度母液(67.2g CsCl溶于10mM Tris-HCl pH8.0缓冲液中至总重量为300g即成，密度为1.2g/ml)、高密度母液(126.6g CsCl溶于10mMTris-HCl pH8.0缓冲液中至总重量为300g即成，密度为1.46g/ml)；2)将收集的30瓶T-75cm2培养细胞于12ml PBS中彻底冻/融/振荡三次，2,000rpm离心5分钟，所得病毒裂解液上清即可用于超离；3)在超净台内，按照密度由高到低的顺序分别将4.5m高密度母液、4.5ml低密度母液以及3ml病毒裂解液上清加至13.2ml的超速离心管中，小心操作以形成密度梯度；4)用相应的转头(Beckman，SW41Ti)以10,000×g于4℃离心2小时。
5)小心地从梯度上方吸弃大部分细胞碎片等，随后用21号针头侧向刺穿位于高/低密度CsCl之间的白色条带，刺入位置在带的下面，小心吸出病毒条带。
6)用1倍体积的1×TE(pH7.9)稀释病毒，以便进行下一步连续CsCl梯度离心。
2、连续CsCl密度梯度彻底从缺陷病毒颗粒中分离感染性病毒离心前估计样品与CsCl梯度体积的比例，尽量使上样体积不超过CsCl体积的20％。
1)如上将高密度CsCl母液、低密度母液、病毒条带溶液加至13.2ml离心管中；2)10,000×g，4℃离心20小时；3)如上操作吸弃目的病毒带上方的许多空衣壳和不成熟的大分子等，随后侧向穿刺小心吸出病毒条带，准备用于透析。
3、透析除去CsCl
将上面吸出的病毒条带加入透析袋(MD-25，12-14kD)中透析12小时，其间更换透析缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油)3次。透析完全后，用2×病毒储存液(10mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，0.1％BSA，50％甘油)按1∶1稀释病毒，0.22μm滤膜过滤，分装后放-70℃保存。这样即得到纯化好的两个病毒Ad-CMV-CARP(简称Ad-CARP)和Ad-CMV-GFP(简称Ad-GFP)。
(六)病毒滴度测定进行体内实验需要定量的病毒浓度指导，因此在这之前必须测定病毒的确切滴度。
1、OD法初步测定取15μl纯化好的病毒用0.435ml H2O稀释，另外用0.435ml H2O稀释15μl高密度CsCl母液作为空白对照，在260nm检测OD值，按1012VP/OD260进行换算。
2、GFP法(适用于带GFP的腺病毒滴度测定)将病毒储存液作不同比例的稀释，取500μl稀释液加至T-25cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30分钟，换新鲜培养基继续培养36小时，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度＝GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5ml＝pfu/ml计算。
(七)重组腺病毒CARP基因的PCR鉴定1、病毒基因组DNA提取收集正常及2种病毒感染后发生病变的各组293细胞，弃上清，加入2ml PBS，刮下细胞，混匀，冻融细胞4次，于4℃ 10,000rpm离心10分钟，取上清，加入200μl蛋白酶K(5mg/ml)，并加入2ml SET裂解液(1％SDS，10mM EDTA，20mMTrisCl pH8.0)，56℃消化2小时，12,000rpm离心10分钟，取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20μl TE溶解。
2、PCR鉴定以上述病毒基因组DNA为模板，以扩增CARP基因的引物进行扩增。
1)PCR体系

2)PCR参数94℃ 5分钟

72℃ 10分钟PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
二、实验结果1、重组腺病毒载体的构建及酶切鉴定腺病毒骨架载体pAdeasy-1与带CARP基因的穿梭载体pAd-CMV-CARP以及作为阴性对照的空载体pAd-CMV-GFP共转化大肠杆菌BJ5183，在同源重组相关酶的作用下发生同源重组。穿梭载体的右臂与骨架载体的右臂均含有Ad5病毒基因组3524bp-5772bp的序列，可介导二者的同源重组；而穿梭载体的左臂与骨架载体的左臂共有腺病毒Ad5的右端34931-35935序列，同源重组可在此区发生(PacI酶切出35kb和3.0kb片段)，也可在其共有的质粒复制原点ori处发生(PacI酶切出35kb和4.5kb片段)。PacI酶切鉴定构建好的pAd-CARP和pAd-GFP质粒，发现属于第二种情况，如图3所示，其中M为Marker(DL 15,000，TaKaRa)，1为pAd-CARP+PacI，2为pAd-GFP+PacI，3为pAd-CARP，4为pAd-GFP。
2、重组腺病毒的制备及鉴定Ad-CARP及Ad-GFP重组腺病毒，经293细胞包装、扩增并纯化后制备成病毒贮存液，各重组腺病毒的滴度测定为Ad-CARP1.0×1011pfu/mL，Ad-GFP5.0×1010pfu/mL。提取各重组腺病毒DNA，以CARP基因的引物进行PCR鉴定，结果如图4所示，其中M为Marker(DL 2,000，TaKaRa)，1、2为Ad-CARP，3、4为Ad-GFP，5为阴性对照。Ad-CARP可见1.4Kb的阳性扩增条带，而Ad-GFP和阴性对照均没有条带。
用磷酸盐缓冲液(PBS)配制病毒浓度为1012病毒颗粒/毫升的溶液，即得本发明所述的含有抑癌基因CARP的药物。该药物可用于治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌和前列腺癌等癌症。
实施例3、MTT分析CARP对肿瘤细胞增殖的影响一、材料和方法接种1,000个A549细胞(购自协和医大基础所细胞中心)到96孔板，接种前在含0.5％FBS的F12培养基中饥饿12小时，贴壁3-4小时后用不同浓度(MOI＝50或100)的Ad-CARP、Ad-GFP或PBS分别感染48小时，之后换入新鲜的培养液(F12，10％FBS)继续培养6天后(每两天换液一次)，加入20ul MTT(5mg/ml，Sigma)，37℃，5％CO2培养4小时，换入100ul DMSO二甲基亚砜)，充分溶解后490nm测OD，重复三次。
二、实验结果图5为MTT检验腺病毒介导的CARP对A549细胞生长的抑制(*，P＜0.01)，我们通过MTT方法的分析发现，腺病毒介导的CARP基因超表达能够抑制肺癌A549细胞的增殖。
实施例4、腺病毒介导的CARP基因高表达对肿瘤发生的抑制一、材料和方法(一)材料1、免疫缺陷小鼠为了排除其它因素的干扰，本实验均用免疫缺陷小鼠，即俗称的裸鼠，购自中国医学科学院动物所，BALB/c-nu、5-6周龄、雌性。这种小鼠胸腺缺失，为第11对染色体隐性遗传；由于无胸腺，不能使T细胞正常分化，故T细胞免疫缺陷；B淋巴细胞正常，但功能缺陷，抗体主要为IgM，只有少量IgG；无接触敏感性，无移植排斥反应，因此广泛用于免疫学、肿瘤学和疾病发生机理的研究。
2、细胞选用一种肺癌细胞系A549，用F12完全培养基(10％FBS，100单位/ml的青霉素，100单位/ml的链霉素)，37℃，5％CO2进行培养。待A549细胞长至70-80％汇合，分别用腺病毒Ad-CARP和Ad-GFP(作为负对照)以MOI＝10-20进行感染；另外设一对照组，加入与病毒等体积的PBS作处理。48小时后，A549细胞经0.125％胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用无血清F12离心洗涤2次，用血球计数板进行细胞计数以调整细胞浓度，最后将细胞悬浮于适量PBS中，使细胞悬液浓度为5×107cells/ml。
(二)方法1、肿瘤细胞皮下接种裸鼠用带6号针头的一次性1ml注射器抽取上述准备好的细胞悬液200μl(即大约107cells/只)，接种于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周龄)右侧腹背部皮下。每个处理组(PBS、Ad-CARP和Ad-GFP)均有7只裸鼠。2、观测肿瘤的生长状况每2-3天观察一次肿瘤的形成情况，并用游标卡尺测量肿瘤的直径。肿瘤的体积用公式V＝a×b2/2来计算，其中a为肿瘤最长的直径，而b则是与这条长径垂直的直径。
二、实验结果将经Ad-CARP及Ad-GFP以MOI 10-20的感染强度处理48小时的A549细胞，分别注射于2组裸鼠皮下，每组7只，每只注射5×107cells/ml的细胞悬液200μl，另1组7只则注射经PBS处理的A549细胞(5×107cells/ml)200μl，结果显示，1个月后注射经Ad-CARP处理过的A549细胞的裸鼠成瘤率为零，而Ad-GFP及PBS处理组成瘤率为100％，见表2和图6所示。
表2、A549细胞经Ad-CARP处理后裸鼠致瘤检测

图6，经过PBS、Ad-CARP或Ad-GFP处理的A549细胞接种裸鼠后的肿瘤生长曲线。(PBS组与Ad-GFP组比较，差异不显著，P＝0.325)实施例5、腺病毒介导的CARP基因高表达在体内对肿瘤生长的抑制一、材料方法我们首先建立A549的裸鼠肿瘤模型，再直接注射携带CARP基因的腺病毒进行治疗，以验证CARP基因的高表达能否抑制肿瘤的生长。
1、裸鼠肿瘤模型的建立如上，取对数生长期的正常A549细胞，经0.125％胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用无血清F12离心洗涤2次，细胞计数调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS中，细胞浓度为5×107cells/ml。然后1ml注射器抽取细胞悬液200μl(大约107cells/只)，接种于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周龄)右侧腹背部皮下。大约一周后，肿瘤即开始形成，肉眼可见。同样，每2-3天测量一次肿瘤的大小。2、腺病毒介导的治疗待肿瘤长至5-10mm直径时(大约在细胞接种后10天左右)，分别给每只裸鼠注射Ad-CARP、Ad-GFP(作为负对照)或者PBS，直接注射到肿瘤内部；每两天注射一次，总共四次，其中前两次注射的病毒剂量为0.5×1010pfu/tumor，后两次注射的病毒剂量为1.0×1010pfu/tumor。每个治疗组都有6只裸鼠。病毒注射结束后，继续观测肿瘤的生长情况20天，在此期间肿瘤大小的测量和计算方法与上面一样。
二、实验结果将A549细胞制成5×107cells/ml的细胞悬液，以每只200μl的量分别注射于裸鼠右侧腹背部皮下，待肿瘤长至直径5mm左右时取瘤体较为均一的裸鼠，随机分为3组，每组6只，分别直接向瘤内注射Ad-CARP，Ad-GFP以及PBS；每两天注射一次，总共四次，其中前两次注射的病毒剂量为0.5×1010pfu/tumor，后两次注射的病毒剂量为1.0×1010pfu/tumor。此后每2-3天测量1次肿瘤大小(根据公式计算肿瘤体积)，整个治疗实验持续1个月。结果显示，在实验过程中由Ad-CARP治疗的裸鼠肿瘤明显小于Ad-GFP组和PBS组，到实验终期Ad-CARP对肿瘤生长的分别抑制率为72.6％(相比于PBS组)和64.3％(相比于Ad-GFP组)，结果见表3和图7所示。
表3、Ad-CARP对裸鼠A549肿瘤的体内治疗

*P＜0.01 vs Ad-GFP or PBS图7，Ad-CARP对肿瘤生长抑制的效果。箭头所指为安排的治疗日程。Ad-CARP组跟两个对照组相比较差异均显著(P＜0.007 vs Ad-GFP，P＜0.002 vs PBS)。
权利要求
1.一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于其有效成分为CARP基因、或其剪接体、或其反义寡核苷酸、或其编码的肽和肽段中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述CARP基因、或其剪接体、或其反义寡核苷酸整合于载体上。
3.根据权利要求2所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述载体为基因治疗载体，选自选自裸体质粒、腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒中的一种或几种。
4.根据权要求2或3所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述载体内含有一个拷贝正常的CARP基因或突变体CARP基因，具有抑制肿瘤的作用。
5.根据权利要求4所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述载体为腺病毒。
6.根据权利要求5所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述腺病毒为E1、E3缺失的C种5血清型入腺病毒，带有CMV启动子，属于第二代腺病毒载体。其重组系统为购自QUANTUM公司的AdEasyTM系统，系统由两种质粒组成，一种是包含有E1、E3缺失的腺病毒基因组DNA的大质粒(骨架质粒)；另一种是小的穿梭质粒，其带有目的基因表达盒以及在表达盒两侧的与大质粒上的目的基因拟插入部位同源的序列(左、右臂)。
7.根据权利要求6所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述腺病毒的浓度为1012病毒颗粒/毫升。
8.根据权利要求7所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物，其特征在于所述药物中还含有PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液溶剂。
9.一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物的用途，其特征在于该药物可用于治疗治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌和前列腺癌等癌症。
10.根据权利要求9所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物的用途，其特征在于所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌及前列腺癌。
11.根据权利要求1至10中任何一项所述的一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物或其用途，其特征在于所述的抗癌药物是指一切化学、生物、天然、人工合成的能够调整CARP表达的药物。
全文摘要
本发明涉及一种含有CARP基因及其相关产物的抗癌药物及其用途，属于生物制药领域。本发明的优点是本发明采用本实验室克隆的新的抑癌基因－CARP基因，通过基因工程的方法将其整合到重组腺病毒载体中，制备成抗肿瘤的药物。通过细胞学、体外及动物实验证实，其肿瘤抑制作用非常明显，且毒副作用低，致病性小。
文档编号A61K48/00GK1555890SQ20041000007
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者惠汝太, 石毅, 张震, 刘宝华, 韩玉, 王伟, 张芊, 甄一松, 张雪燕, 娄可佳, 邹玉宝 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院