专利名称：红厚壳内酯e2的制备方法及其在制备抗sars的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及红厚壳内酯E2(calanolide E2)的制备方法及其在制备抗SARS的药物中的应用。
背景技术：
现有的红厚壳内酯E2(calanolide E2)的制备方法存在以下缺点a.红厚壳内酯E2(calanolide E2)在植物果中的含量不太高，生产成本较高；b.制备方法需要有机溶剂量较大，可能造成环境污染。
本发明的发明人研究发现，红厚壳内酯E2(calanolide E2)在滇南红厚壳(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果中的含量较高，达到0.11％。滇南红厚壳植物容易栽培，5-6年结果，15年单株产果20-30公斤，20-50年为盛果期，单株产果100-200公斤，原料有保证；不破坏资源，可持续利用。所以，研究开发从滇南红厚壳果中分离提取其中的红厚壳内酯E2，并开发出其药用价值具有重大的意义。
发明内容
本发明提供了一种从滇南红厚壳果中分离提取红厚壳内酯E2的方法，它包括以下步骤(1)取滇南红厚壳(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果阴干，粉碎成粉；(2)取粉碎的粗粉，用约6倍量(重量)的95％乙醇在室温浸泡多次，每次72小时；(3)过滤，合并滤液，减压回收溶剂得乙醇浸膏；(4)取240g浸膏，以适量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅胶，室温挥发至干，经硅胶柱层析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1V/V)梯度洗脱石油醚洗脱5000mL，检查出有少量的目标化合物，合并为第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脱10000mL，每250ml为一流份，第2至第17流份有目标化合物，随后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脱10000mL，每250ml为一流份，共得42个流份，其中第1-17流份合并为A1组分(4.5克)；(5)A1组分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重结晶，析出1.9g黄色结晶状化合物红厚壳内酯E2(calanolide E2)，得率0.11％。
上述方法中使用的溶剂均为目前制药工业常用的试剂，避免了环境污染。
本发明还提供了红厚壳内酯E2在制备抗SARS病毒的药物中的应用。
在上述的应用中，所述的药物是人体可接受的剂型，其中含有抗SARS病毒有效量的红厚壳内酯E2。
与现有的中成药复方相比，红厚壳内酯E2(calanolide E2)不是一个对症(如退热、止咳等)治疗药物，而是一个对SARS病毒有直接抑制作用的治疗药物。
图1中的图片显示了光学显微镜下观察的VERO细胞形态。
图2是红厚壳内酯E2对SARS病毒细胞病变抑制作用的剂量曲线。
图3是红厚壳内酯E2对HepG2和VeroE6细胞的毒性实验曲线。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本实施例1 从滇南红厚壳果中分离提取红厚壳内酯E2(1)取滇南红厚壳(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果阴干，粉碎成粉；
(2)取粉碎的粗粉6.1kg，用40kg 95％乙醇在室温浸泡3次，每次72小时；(3)过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得乙醇浸膏890g；(4)取240g浸膏，以适量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅胶，室温挥发至干，经硅胶柱层析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1 V/V)梯度洗脱石油醚洗脱5000mL，检查出有少量的目标化合物，合并为第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脱10000mL，每250ml为一流份，第2至第17流份有目标化合物，随后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脱10000mL，每250ml为一流份，共得42个流份，其中第1-17流份合并为A1组分(4.5克)；(5)A1组分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重结晶，析出1.9g黄色结晶状化合物红厚壳内酯E2(calanolide E2)，得率0.11％。
实施例2 红厚壳内酯E2的结构鉴定实验条件红外光谱(IR)用Bio-Rad FTS-135型分光光度计测定，KBr压片。电子轰击质谱(EI-MS)用Auto SPEC 3000型质谱仪测定，采用20ev的轰击电离源。[α]D用Jasco DIP-370旋光仪测定，甲醇作溶剂。核磁共振谱(NMR)用Bruker WH-400超导核磁共振仪测定，四甲基硅(TMS)作内标，氘代氯仿(CDCl3)作溶剂。青岛海洋化工厂出品的200-300目硅胶，以及日本三菱化成公出品的MCI CHP-20P、RP-18作为柱层析材料；薄层层析用青岛海洋化工厂出品的硅胶板指导分离。展开剂A乙酸乙酯-石油醚(3∶7，v/v)；B丙酮-石油醚(2∶8)；C水-甲醇(2∶98)。显色剂A、I2；B、5％H2SO4-乙醇。
结构鉴定按照常规操作方法，使用上述的实验条件鉴定实施例1中制备的红厚壳内酯E2的结构，得到的结果如下。
红厚壳内酯E2黄色，[α]D26＝+78.90°(CHCl3，c0.58)；IRvmaxcm-13500-2500(OH)，1704(C＝O)，1650(C＝C)，1624，1579，1446，1299，1193，1166，1146，1125。EI-MS(20ev)m/z388[M+](47)，374(54)，373[M-Me]+(100)，345[373-CO]+(8)，329(13)，301[329-CO]+(6)，285(1)，268(7)，257(6)，149(28)，91。1HNMR(CDCl3，400MHz) δ0.83(3H，t，J＝8Hz，H-15)，1.13(2H，m，H-14)，1.17(3H，d，J＝7Hz，H-19)，1.37(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-17)，1.43(3H，d，J＝7Hz，H-18)，1.51(1H，m，H-13)，1.78(1H，m，H-13)，2.49(1H，dq，J＝6，11Hz，H-11)，2.68(1H，br.d，J＝8Hz，H-3)，2.79(1H，br.d，J＝8Hz，H-3)；3.66(1H，br m，H-4)，4.11(1H，dq，J＝6，11Hz，H-10)；5.43(1H，d，J＝10Hz，H-7)；6.57(1H，d，J＝10Hz，H-8)；12.45(s，8b-OH)。13CNMR(CDCl3，100MHz) δ179.0(s，C-2)，38.6(t，C-3)，30.5(d，C-4)，108.9(s，C-4a)，159.9(s，C-4b)，78.2(s，C-6)，125.6(d，C-7)，115.7(d，C-8)，102.6(s，C-8a)，159.9(s，C-8b)，78.8(d，C-10)，45.7(d，C-11)，199.3(s，C-12)，101.9(s，C-12a)，157.4(s，C-12b)，35.6(s，C-13)，20.8(t，C-14)，13.9(t，C-15)，28.4(q，C-16)，28.0(q，C-17)，19.5(q，C-18)，10.5(q，C-19)。
实施例3 红厚壳内酯E2的抗SARS病毒活性研究材料和方法细胞非洲绿猴肾传代细胞(Vero)
病毒SARS病毒北京一号(BJ-01)试剂DMEM培养基(GIBCO公司产品)，链霉素，L-谷氨酰胺(美国Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美国Hyclone公司)、Hepes，MTS(美国Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氢钠(购自京科化学试剂公司进口分装)。
细胞培养液及试剂配制DMEM培养液DMEM培养基中再添加10％(v/v)新生胎牛血清、3％(w/v)L-谷氨酰胺、1％(w/v)青霉素、1％(w/v)链霉素、7.5％(w/v)碳酸氢钠，10mM Hepes；MTS/PMS染色液1)配制MTS溶液在锡纸包裹的50ml离心管中加入21ml DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)，然后加入42mgMTS粉末，充分溶解，并调节pH值到6.5左右，-20℃避光保存。2)配制PMS溶液在锡纸包好的15ml离心管中加入10ml DPBS，然后加入9mgPMS粉末，充分溶解，-20℃避光保存。3)配制MTS/PMS染色液取MTS溶液7ml，PMS溶液350ul充分混匀，备用。
试验方法药物对SARS病毒感染细胞病变的影响按4,000 VERO细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板，每孔培养液100ul，37℃ 5％CO2孵育24小时，细胞融合成单层后加入红厚壳内酯E2，红厚壳内酯E2按照终浓度1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.0003mg/L的浓度梯度加入，共7个浓度，每个浓度加2孔，随后每孔加入2ulSARS-BJ-01病毒。设置MTS对照、细胞对照和病毒对照。37℃ 5％CO2培养96小时。期间，显微镜下观察细胞病变，96小时后以MTS法检测细胞存活状况，即加入MTS/PMS染色液，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小时，加50ul 10％SDS，紫外分光光度仪检测O.D(490nm)。
实验结果红厚壳内酯E2对SARS病毒感染的VERO细胞病变的影响如图1所示。从图1中的细胞形态可以看出，“病毒对照”在感染病毒48小时即可出现明显细胞病变，细胞圆缩、裂解；而在加入红厚壳内酯E2的情况下，对SARS病毒对VERO细胞的攻击有显著的抑制作用；“细胞对照”生长良好。
MTS检测红厚壳内酯E2对SARS病毒细胞病变抑制作用的剂量曲线如图2所示。由图2可见，红厚壳内酯E2抗SARS病毒活性随浓度增加而增强，半数有效浓度EC50为7.721×10mg/L(即19uM)，半数有效浓度较低。
实施例4 细胞毒性试验本实施例研究了红厚壳内酯对HepG2和VeroE6细胞的毒性。
试验方法按4,000细胞/孔密度接种96孔细胞培养板，每孔加入培养液100ul，37℃ 5％CO2孵育细胞24小时后加入受试药物。红厚壳内酯E2以细胞培养液稀释后最终浓度分别为300、200、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01mg/L，共11个浓度。每个浓度加2孔。设正常细胞对照，MTS对照。37℃ 5％CO2孵育细胞96小时后，显微镜下观察细胞病变，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小时，加50ul 10％SDS，紫外分光光度仪检测O.D(490nm)，以样品读数不小于细胞对照的90％作为无毒性指标。
实验结果红厚壳内酯E2对HepG2和VeroE6细胞的毒性曲线如图3所示。由图3可见，红厚壳内酯E2的浓度在低于248mg/L时对VERO细胞无毒性，IC50为350.4mg/L。
权利要求
1.一种从滇南红厚壳果中分离提取红厚壳内酯E2的方法，它包括以下步骤(1)取滇南红厚壳(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果阴干，粉碎成粉；(2)取粉碎的粗粉，用约6倍量(重量)的95％乙醇在室温浸泡多次，每次72小时；(3)过滤，合并滤液，减压回收溶剂得乙醇浸膏；(4)取240g浸膏，以适量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅胶，室温挥发至干，经硅胶柱层析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1 V/V)梯度洗脱∶石油醚洗脱5000mL，检查出有少量的目标化合物，合并为第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脱10000mL，每250ml为一流份，第2至第17流份有目标化合物，随后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脱10000mL，每250ml为一流份，共得42个流份，其中第1-17流份合并为A1组分(4.5克)；(5)A1组分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重结晶，析出1.9g黄色结晶状化合物红厚壳内酯E2(calanolide E2)。
2.红厚壳内酯E2在制备抗SARS病毒的药物中的应用。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物是人体可接受的剂型，并且其中含有抗SARS病毒有效量的红厚壳内酯E2。
全文摘要
本发明描述了红厚壳内酯E2所具有的抑制SARS病毒特性，及其在制备抗SARS病毒药物中的应用，同时提供了一种从滇南红厚壳果中分离提取红厚壳内酯E2的方法。所述的药物是人体可接受的剂型，并且其中含有抗SARS病毒有效量的红厚壳内酯E2。研究表明，红厚壳内酯E2对感染SARS病毒的VERO细胞进行保护的半数有效浓度EC50为7.721mg/L，红厚壳内酯E2在浓度低于248mg/L时对VERO细胞无毒性，其IC50为350.4mg/L。
文档编号A61P31/00GK1563010SQ200410008528
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月25日 优先权日2004年3月25日
发明者陈纪军, 谈学海, 陈聪, 周俊, 汪建, 张雪梅 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 北京华大基因研究中心, 上海华大天源生物科技有限公司