专利名称：一种稳定蛋白药物的方法及其在微球制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属药物制剂领域，涉及一种提高蛋白药物稳定性的方法，以及该方法在微球制备中的应用。
背景技术：
近年来，随着生命相关学科的迅猛发展，涌现出了大量的蛋白质和多肽药物。与传统的小分子有机药物相比，蛋白质及多肽类药物的物理和化学稳定性差，容易发生聚集、氧化和脱酰胺等反应而失去生物活性，其中聚集对蛋白药物活性的影响较为突出。
蛋白药物均具有一定的三维空间构象，这种构象是确保其与受体结合，进而发挥治疗作用的重要条件。但是，在制剂制备过程中蛋白结构很容易受到破坏，导致蛋白聚集并且形成不溶性沉淀。蛋白的多聚体不仅没有生物活性，而且还能够诱发人体的免疫反应，因此在蛋白制剂制备过程中应尽量避免。
除了不稳定的性质之外，蛋白及多肽类药物还具有分子量大，脂溶性差，难以透过生物膜等特点，一般只能通过注射途径给药。某些用于激素替代治疗的蛋白质或多肽药物往往治疗周期长而且使用频繁，给患者造成严重的肌体损伤和精神压力。对于此类药物通常需要将其制成长效注射剂以改善患者的顺应性。目前，所谓的长效注射剂主要指可生物降解微球，如载有重组人生长激素(rhGH)的乳酸-羟基乙酸共聚物微球(CN1187120A)。
生物降解微球大多由人工合成的亲脂性材料制成，因此制备微球时需要使用二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等有机溶剂。在制备过程中，蛋白药物暴露于大面积的油水两相介面，导致其发生严重的聚集并沉淀。与有机溶剂接触后，可溶性蛋白中的一部分转变为二聚体，这种存在形式其稳定性较天然构象的蛋白大大降低，为制剂的稳定性埋下了隐患。由此可见，提高蛋白药物在包封过程中的稳定性是设计长效制剂需要解决的关键问题之一。目前普遍被人们接受的解决方法是在处方中加入聚氧乙烯单月桂酸山梨醇酯(Tween)(Bam N.B.，Cleland J.L.et al，J.Pharm.Sci.871554)。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定蛋白药物的方法，该方法用于蛋白药物微球的制备，可提高蛋白药物的稳定性。尤其可提高蛋白药物与有机溶剂接触时的稳定性。
在制备生物降解微球时，通常需要将蛋白药物的水溶液与含有生物降解材料的有机溶剂制成油包水(w/o)型乳剂。本发明采用在水相中加入非离子型表面活性剂提高微球制备过程中蛋白药物的稳定性。
本发明所述的用于稳定蛋白药物的非离子型表面活性剂为聚氧乙烯与聚氧丙稀的ABA型嵌段共聚物(商品名为泊洛沙姆，poloxamer)。共聚物的平均分子量为5,000-16,000，其中，聚氧乙烯的含量为60％-80％。优选平均分子量12,600、聚氧乙烯含量为70％的共聚物(泊洛沙姆407)。所述共聚物用作蛋白药物稳定剂在内水相中的浓度为0.2％-15％，优选2％-10％，可以在蛋白药物之前或之后加入到内水相中。
所述内水相用于溶解蛋白药物与稳定剂，可选自磷酸盐、枸橼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、硼酸盐和三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液，以及上述任意两种缓冲盐的混合溶液。
内水相中可以选择性加入寡聚糖或糖醇以进一步提高蛋白药物在微球中的稳定性，包括海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。
本发明所述的与内水相进行乳化的有机溶剂包括二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环和乙醚，以及上述溶剂的混合物。
本发明涉及的用于制备生物降解微球的材料包括乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、聚己内酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述材料的混合物和共聚物。
上述成球材料优选乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，平均分子量范围为4,000-1,000,000，其中乳酸单体的含量为1％-99％，末端为游离羧基或其它封闭基团。成球材料占微球总重量的60％-99％。为了获得理想的释放与降解速度，可以将具有不同分子量、乳酸单体含量和末端基团的PLGA混合使用。
上述微球制备中，为了提高释放过程中药物的稳定性，抑制聚合物降解产生的酸性物质对药物的破坏，微球中可以加入适量的抗酸剂，如Mg(HO)2、MgCO3、Mg(OAc)2、Ca(HO)2、CaCO3、Ca(OAc)2、Zn(HO)2、ZnCO3和Zn(OAc)2。抗酸剂的用量占微球总重的0.1％-10％，其最佳范围为1％-5％。
本发明采用药剂学领域的技术人员所熟知的方法制备微球，包括乳化-溶剂挥发法(又称液中干燥法)、喷雾干燥法、低温喷雾萃取法，超临界萃取技术等。具体步骤是，将本发明的含有聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物的蛋白药物水溶液分散于生物降解聚合物的有机溶液中，再利用上述方法或技术使聚合物溶液分散至所需的粒径范围，除去有机溶剂使聚合物固化形成微球。除去聚合物溶剂的过程可利用水性溶剂、低温有机溶剂或超临界状态气体进行萃取来完成。所述喷雾干燥法，可通过将聚合物溶液直接喷射到高温环境中实现。所述乳化-溶剂挥发法，其中剩余的少量药物溶剂或聚合物溶剂可采用冷冻干燥或真空干燥的方法除去。所述微球粒径控制在500μm以下，最佳的粒径范围为1-200μm。
上述微球中可以包封任何对有机溶剂不稳定的蛋白质或多肽类药物，其用量占微球总重的1％-40％，包括激素类药物如生长激素和胰岛素；细胞因子如干扰素、白细胞介素、红细胞生成素和肿瘤坏死因子等；溶血栓药物如链激酶、尿激酶和纤溶酶原激活剂等；治疗性抗体、细胞受体和疫苗，以及上述任意二种或二种以上药物的组合物。其中优选生长激素。
实验证实，本发明具有下述优点在内水相中加入聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物可以显著提高蛋白药物对有机溶剂的稳定性，避免蛋白药物因在微球制备过程中被破坏而失去活性，进而提高蛋白药物制剂的稳定性与有效性，使得将更多的蛋白药物制成长效制剂成为可能。
图1是rhGH溶液与二氯甲烷剧烈搅拌1min后的SEC色谱图，其中，虚线为未与有机溶剂接触的rhGH溶液，实线为实验组。箭头所指色谱峰先后为rhGH的二聚体和单体，二聚体之前的色谱峰为rhGH的可溶性多聚体。下同。
图2是rhGH溶液与二氯甲烷超声混合1min后的SEC色谱图。
图3是含50mg/ml泊洛沙姆407的rhGH溶液与二氯甲烷剧烈搅拌1min后的SEC色谱图。
图4是含50mg/ml泊洛沙姆407的rhGH溶液与二氯甲烷超声混合1min后的SEC色谱图。
具体实施例方式
以下为本发明的实施例。给出具体实施例的目的是为了进一步阐明本发明，但并不限制其保护范围。
实施例1生长激素稳定性实验配制含有各种稳定剂与50mg/ml重组人生长激素(rhGH)的磷酸缓冲溶液(PBS，10mM，pH8.0)，取该溶液与二氯甲烷各0.2ml混合，剧烈搅拌或超声1min，立即转移水相并用PBS(pH8.0)反复萃取油相8至10次，合并萃取液后定容至10ml。将该溶液在4℃、3000rpm条件下离心30min，取上清液注入高效液相色谱系统进行测定。
样品中rhGH的浓度采用分子排阻色谱(SEC)测定。色谱系统Agilent1100series；色谱柱TSK-Gel G2000SWXL(配备TSK-Guardcolumn SWXL预柱)；柱温25℃；流动相3％异丙醇/97％磷酸缓冲溶液(0.063M，pH7.0)；流速0.6ml/min；检测波长214nm；进样量20μl。
由图1和图2可见，rhGH溶液与二氯甲烷混合后，无论搅拌还是超声均可诱导rhGH发生严重的聚集，导致接近2/3的rhGH形成二聚体、可溶性多聚体与不溶性多聚体。
溶液中加入泊洛沙姆407可显著提高rhGH对有机溶剂的耐受性，表现为与二氯甲烷接触后，溶液中剩余的可溶性蛋白与单体蛋白含量显著高于对照组以及其它处方。与对照组相比，泊洛沙姆188虽然未能增加水相中可溶性蛋白的含量，但却使单体蛋白所占的比例明显增大。由此可见，在乳化过程中，聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物，特别是泊洛沙姆407，对蛋白药物具有稳定作用。表1是rhGH与有机溶剂二氯甲烷接触后的稳定性。
表1高速搅拌 超声混合浓度稳定剂可溶性蛋白单体可溶性蛋白单体mg/ml％(a)％ ％％对照(b)70.3 31.666.7 35.8甘露醇 45 64.7 28.459.2 25.3海藻糖 45 66.2 29.061.0 23.7蔗糖 45 70.0 30.566.0 24.6吐温20 20 80.2 54.2-(c)-聚乙烯醇 10 87.8 48.2- -聚乙二醇400 250 69.4 33.1- -牛血清白蛋白 20 69.3 32.6- -泊洛沙姆188 20 67.2 53.3- -泊洛沙姆407 20 96.4 84.5- -其中(a)可溶性蛋白指rhGH单体、二聚体以及单体-二聚体中间体；(b)对照组为经有机溶剂处理过的rhGH-PBS溶液；(c)-代表未进行测定。
实施例2泊洛沙姆浓度对生长激素稳定性的影响在含有50mg/ml rhGH的PBS(10mM，pH8.0)溶液中加入不同浓度的泊洛沙姆407，将该溶液作为内水相与二氯甲烷混合，其余操作及测定方法同实施例1。表2是非离子型表面活性剂对rhGH稳定性的影响。
表2高速搅拌 超声混合浓度稳定剂 可溶性蛋白 单体 可溶性蛋白 单体mg/ml％(a)％ ％ ％对照(b)64.1 30.164.223.62 57.9 34.263.133.6泊洛沙姆40720 87.2 73.056.648.650 97.5 90.097.089.120 74.9 59.386.163.7吐温20 50 41.3 38.1-(c)-
其中(a)可溶性蛋白指rhGH单体、二聚体以及单体-二聚体中间体；(b)对照组为经有机溶剂处理过的rhGH-PBS溶液；(c)-代表未进行测定。
结果表明，泊洛沙姆对蛋白的稳定作用呈现浓度依赖性，泊洛沙姆浓度越高，蛋白稳定效果越好，而且稳定效果优于同浓度的Tween 20溶液。由SEC图谱(图3和图4)可见，含有泊洛沙姆407的溶液与有机溶剂接触后，绝大多数蛋白药物能够保持其天然构象，接近90％的蛋白仍然以单体形式存在(原料药中原本含有约4.5％的非单体形式蛋白)。该结果再次证实聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物对蛋白药物具有稳定作用。
实施例3重组人生长激素微球的制备1取0.75grhGH溶解于8ml含有50mg/ml泊洛沙姆407和45mg/ml蔗糖的PBS溶液(10mM，pH8.0)中。将此溶液逐渐滴加至20ml含5g PLGA(75∶25，MW 15kD)的二氯甲烷溶液中，5000rpm乳化1min后，将形成的初乳滴加到300ml聚乙烯醇溶液(6％g/ml)中，1800rpm条件下搅拌1min，将该溶液倾入到2L蒸馏水中继续以较低的速度搅拌4h，使有机溶剂挥发完全，得到载有生长激素的PLGA微球。将所得微球在抽滤器上抽滤收集，先后用蒸馏水和0.2％的泊洛沙姆188溶液各洗涤3次，真空干燥24h得微球粉末。
实施例4重组人生长激素微球的制备2取0.6g rhGH溶解于3ml含有40mg/ml泊洛沙姆407的PBS溶液(10mM，pH8.0)中。将此溶液逐渐滴加至20ml含4g PLGA(50∶50，MW 10kD)和0.12g ZnCO3的二氯甲烷溶液中，超声乳化45s后，将形成的初乳滴加到300ml聚乙烯醇溶液(4.5％ g/ml)中，1500rpm条件下搅拌1min，将该溶液倾入到2L蒸馏水中继续以较低的速度搅拌4h，使有机溶剂挥发完全，得到载有生长激素的PLGA微球。将所得微球在抽滤器上抽滤收集，先后用蒸馏水和0.2％的Tween 20溶液各洗涤3次，冷冻干燥24h得微球粉末。
权利要求
1.一种稳定蛋白药物的方法，其特征在于采用在水相中加入非离子型表面活性剂提高微球制备过程中蛋白药物的稳定性。
2.根据权利要求1所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯与聚氧丙稀的共聚物。
3.根据权利要求2所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯与聚氧丙稀的ABA型嵌段共聚物。
4.根据权利要求2所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物，其平均分子量为5,000-16,000，其中聚氧乙烯含量为60％-80％。
5.根据权利要求2所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物，其平均分子量为12,600，其中聚氧乙烯含量为70％。
6.根据权利要求2所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物，在水相中的浓度为0.2％-15％。
7.根据权利要求2所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物，在水相中的浓度为2％-10％。
8.根据权利要求1所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述蛋白药物为任何与有机溶剂接触后易发生聚集的蛋白质或多肽药物。
9.根据权利要求8所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述蛋白药物为重组人生长激素。
10.根据权利要求1所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述微球制备过程包括将蛋白药物的水溶液与含有生物降解材料的有机溶剂制成油包水型乳剂，所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯。
11.根据权利要求1所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述微球制备材料为乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、聚己内酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述任意二种或二种以上材料的混合物或共聚物。
12.根据权利要求11所述的稳定蛋白药物的方法，其特征在于所述微球制备材料为乳酸-羟基乙酸共聚物，其平均分子量为4,000-1,000,000，末端为游离羧基或其它封闭基团，其中乳酸单体含量为1％-99％。
全文摘要
本发明属药物制剂领域，涉及一种提高蛋白药物稳定性的方法，以及该方法在微球制备中的应用。本发明采用在水相中加入非离子型表面活性剂聚氧乙烯与聚氧丙稀共聚物提高微球制备过程中蛋白药物的稳定性。本发明方法可以显著提高蛋白药物对有机溶剂的耐受性，避免蛋白药物因在微球制备过程中发生聚集而失去活性，进而提高蛋白药物制剂的稳定性与有效性，使得将更多的蛋白药物制成长效制剂成为可能。
文档编号A61K47/32GK1575792SQ20041007171
公开日2005年2月9日 申请日期2004年7月16日 优先权日2003年7月25日
发明者魏刚, 陆丽芳, 陆伟跃 申请人:复旦大学, 上海复康医药科技发展有限公司