负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，属于微球测定【技术领域】。该方法包括以下步骤：1)样品准备：将微球以固定液固定后，加入染色剂结合微球中的蛋白、多肽类药物；2)纳米计算机断层扫描：将待测微球样品置于Nano-CT断层扫描设备中，对微球进行扫描，获得微球的二维投影图像；3)数据分割：通过重建，得到微球不同截面的图像，以预设的灰度阈值，将微球分割为蛋白、多肽类药物部分和微球骨架部分；4)三维结构构建：以微球的截面图像进行三维重构，得到负载蛋白、多肽类药物微球的三维结构，并计算出微球的结构参数。采用该方法，能够得到微球内的三维立体结构。
【专利说明】负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微球测定方法，特别是涉及一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法。
【背景技术】
[0002]近年来，蛋白质多肽类药物在诊断、治疗艾滋病、癌症、肝炎、糖尿病等疾病，或疫苗预防疾病等方面发挥着重要的作用。但由于蛋白质多肽类药物的体内外稳定性差，注射给药后，药物很快失活，为达到疗效往往需要频繁、大剂量给药，导致毒副作用及耐受性的产生，严重限制了其在临床上的应用。
[0003]而用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)等生物可降解聚合物，将生物大分子药物包被成缓释肌注微球(microsphere),可提高药物的生物利用度,实现药物控释或缓释，具有提高药效、降低毒副作用、提高病人顺应性与耐受性的优点。
[0004]微球在研发的过程中，局限于以载药量、包封率、粒径等作为评价指标，再采用体内外释放结果来指导和调整制备工艺因素，并且进行体内外释放行为的考察后才能验证处方的优劣，往往出现前期筛选各项指标良好，但后期释药行为不理想的现象。因此，缺乏关于微球制备工艺、处方因素、微球理化性质及释药性能之间广泛深入的理论支持，导致了负载蛋白、多肽类药物的PLGA微球科研效率低、周期长，成功率低。
[0005]许多研究表明微球结构的改变会影响药物的释放，如在复乳化溶剂挥发法的基础上，加入致孔剂可使制得微球内部结构疏松，突释现象明显，释放增快。此类研究包括在内水相加入渗透剂，发泡剂；或在有机相加入油酯，成球后溶剂洗涤除去。而在连续相(即外水相)中加入渗透剂，得到的微球内部结构致密，药物不易突释，相应缓释时间延长。其采用不同方法的目的是使微球表面的多孔结构愈合，阻碍原本经孔道释放的药物，降低药物突释。总之，如微球结构变得疏松，则药物突释增加、释放增快；如微球结构变得致密，则突释减少，缓释周期延长。另外，改变微球的制备方法可以使蛋白分布更为均匀，能够成功避免微球的药物突释。且大量研究表明微球的结构和微球的降解、药物的释放之间关系极为密切。因此，研究微球骨架及药物在空间上的三维分布，对药物释放数学模型建立及发展，建立高效的筛选平台，缩短微球研发周期，提高研发效率有极为重大的意义及研究前景。
[0006]而常规的表征微球空隙结构的方法具有一定局限性，难以分析微球内部的结构参数。如:水银或气体孔隙度测定法，氮气脱附吸附法用于测定微球内部孔隙的分布，但无法测量密闭的孔隙，且过高的压力可能会破坏微球的原有的结构；而扫描电子显微镜(SEM)可用于定性分析微球结构，其分辨率较高，但仅能观察到微球表面，无法对微球的内部整体结构进行分析；另有共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和傅里叶变换红外光谱可用于定性或半定量观察微球内的药物分布，但分辨率较低，不能满足定量分析微球内药物分布的详细信息。
[0007]Nano-CT (Nano computed tomography,纳米计算机断层扫描技术)，属于无损检测的技术范畴。Nano-CT主要由X射线成像系统和计算机系统两部分组成。Nano-CT扫描时，由X射线成像系统中的微焦点X光机产生X射线并垂直透过被测试物体，衰减后的X射线被探测器所采集，通过模数转换，在监视器上显示扫描后所获得的图像；由计算机系统对扫描得到的图像进行重建，生成高密度分辨率的横截面图像。具有高空间和时间分辨率(可达纳米级)、高穿透性、丰富的衬度机制、友好的成像环境以及线性吸收等特点。在微电子产业、生命科学、能源和环境科学、材料科学等各种领域有着非常广阔的应用。
【发明内容】
[0008]基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，采用该方法，能够得到微球的立体形态空间分布等立体结构信息。
[0009]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0010]一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，包括以下步骤:
[0011]I)样品准备
[0012]将微球置于容器中，加入固定液，静置，使固定液完全渗透微球；弃去固定液，以磷酸盐缓冲液清洗微球，弃去磷酸盐缓冲液；加入乙醇清洗，脱去微球中的水；然后加入含染色剂的乙醇溶液，静置，确保染色剂完全浸透微球，并与微球中负载的蛋白、多肽类药物结合，再以磷酸盐缓冲液将未与蛋白、多肽类药物结合的染色剂清洗去除，得到待测微球样品;
[0013]2)Nano_CT 断层扫描
[0014]将待测微球样品置于Nano-CT断层扫描设备中，调节光子能量为5_12keV，采用大视场模式扫描，设置单幅曝光时间为15-25秒，并以0.2° -0.8°的步长在-90° -+90°的角度内采集微球二维投影图像；
[0015]3)数据分割
[0016]对上述得到的微球二维投影图像进行重建，得到微球的不同截面图像，以预设的灰度阈值，将微球分割为蛋白、多肽类药物部分和微球骨架部分；
[0017]4)三维结构构建
[0018]以微球的截面图像进行三维重构，得到负载蛋白、多肽类药物微球的三维结构，并计算出微球的结构参数。
[0019]本发明的一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，运用纳米计算机断层扫描技术(Nano-CT)对完整的负载蛋白、多肽类药物微球个体进行无损的扫描。
[0020]得到数百张连续的微球二维投影图像，进而可对得到的二维投影图像数据进行重建，如采用滤波反投影法、反投影法、傅里叶变换或卷积反投影法，得到反映微球不同层面的截面图像。并利用染色剂与微球中的蛋白质结合后，能显著增加蛋白质对X射线的吸收和相移能力的特性，从而增强蛋白质的相位衬度，因此可以分辨出蛋白质部分与微球骨架载体的分布。并进行三维重构，得到微球内外结构的三维结构参数，以及其三维立体结构图。
[0021]在其中一个实施例中，步骤I)样品准备中，所述固定液为中性甲醛溶液、戊二醛溶液、等渗甲醛醋酸溶液或碱性醋酸铝溶液。[0022]在其中一个实施例中，步骤I)样品准备中，所述染色剂为醋酸铀、柠檬酸铅或四氧化锇。上述染色剂能够使蛋白质具有适宜的相位衬度，既能将蛋白质部分完全显示出来，又不干扰微球骨架部分的成像。优选地，所述染色剂为醋酸铀。优选地，所述染色剂的体积百分含量为1.5% -2.5%。使用该染色剂可以对蛋白质进行均匀且浓度适宜的染色。
[0023]在其中一个实施例中，步骤I)样品准备中，所述固定液为体积百分比含量为1.0% -4.0 %的戊二醛水溶液；所述脱去微球中的水的方法为加入体积百分含量为10% -100%的乙醇溶液进行梯度清洗；所述染色剂为百分含量为1.5% -2.5%的醋酸铀，按每克微球0.8-1.2mL醋酸铀的加入量对蛋白质进行染色。选用上述的样品准备方法，为后续纳米计算机断层扫描提供了较好的扫描基础。
[0024]在其中一个实施例中，所述梯度清洗按照下述方法进行:依次加入30%、50%、70%,80%,95%, 100%乙醇溶液，分别将微球重新混悬并静置后，弃去上清液。以梯度洗脱的方式逐步将微球中的水份除去，避免溶剂转换过快导致蛋白质变性。
[0025]在其中一个实施例中，所述微球以聚乳酸类或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物类材料为骨架。
[0026]在其中一个实施例中，步骤2) Nano-CT断层扫描中，所述光子能量为6_10keV，所述单幅曝光时间为18-22秒，所述CT成像投影数据的采集步长为0.4-0.6°。图像采集步长越小，虽然获取的信息越全面，但同时会由于数据过多导致三维重构过程的困难；如果步长太大，则会导致获取二维数据太少，三维重构时信息量不足。步长在上述范围内时，可以兼顾三维重构准确性与三维重构的计算难度。以上述参数对微球进行扫描，能获得清晰度和分辨率最佳的微球骨架以及蛋白分布的CT图像。
[0027]在其中一个实施例中，步骤3)数据分割中，对微球二维投影图像进行重建的方法为滤波反投影算法。能获得更为准确的微球立体结构。同样的，根据具体需求，可视化重建时，也可采用反投影法、傅里叶变换法和卷积反投影法重建。
[0028]在其中一个实施例中，步骤3)数据分割中，所述灰度阈值为35-45，具体分割方法为:如灰度值小于等于该灰度阈值，则分割为蛋白、多肽类药物部分，如灰度值大于该灰度阈值，则分割为微球骨架部分。采用上述灰度阈值，能够更好的将蛋白、多肽类药物部分和微球骨架部分进行分割，使二者的分割更加准确、清晰。
[0029]在其中一个实施例中，步骤4)三维结构构建中，所述微球的结构参数为孔隙、孔隙率、孔隙连通率、蛋白、多肽类药物体积、药物体积占微球总体积的百分率、多肽类药物连通率、平均孔径及分布、平均孔径与微球直径比、闭合连通率、有效表面积中的至少一种。该结构参数还可根据需要灵活调整，以表征微球在不同方面的特性。
[0030]其中，孔隙为蛋白、多肽类药物以及该蛋白、多肽类药物包裹的空隙所占的体积。孔隙率为孔隙所占的体积与微球所占总体积的比值。孔隙连通率为与微球表面相连通的孔隙与总孔隙的比值。蛋白、多肽类药物连通率为与微球表面相连通的蛋白、多肽类药物与蛋白、多肽类药物体积的比值。平均孔径及分布是描述孔隙的平均孔径及其多分散系数。平均孔径与微球直径比是描述孔隙的平均孔径与微球直径的比值。闭合连通率是微球内部与其他孔隙相独立的孔隙所占的体积与总孔隙的比值。有效表面积是微球外表面积以及微球内部与微球表面连通孔隙的内表面积之和。
[0031]在其中一个实施例中，步骤2)纳米计算机断层扫描中，所述微球的二维投影图像通过CXD图像传感器捕获，CXD图像传感器的像素优选1024像素X 1024像素。以CXD图像传感器能够获得分辨率较高的微球二维图像。
[0032]本发明的原理为:当一束X射线穿过被检测的微球时，衰减的射线强度与微球的材料、密度、尺寸等信息有关，特别是当微球中蛋白、多肽类药物经染色后，穿过药物的X射线能量的衰减明显高于穿透周围的射线，采用平板探测器从不同角度采集衰减后的X射线能量，生成二维投影图像，按照一定的图像重构算法即可获得微球截面图像，再通过三维图像重构，即可重建得到微球骨架结构以及其中蛋白、多肽类药物的三维分布以及形貌等信肩、O
[0033]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0034]本发明的一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，采用Nano-CT对负载蛋白、多肽类药物微球进行扫描，可以直观的由二维或三维重构图像中观察到微球的结构，并通过染色剂的使用，将蛋白、多肽类药物部分和微球骨架部分进行分割，并通过分析计算，得到微球的各项结构参数及其立体形态结构图。
[0035]该构建方法具有分辨率高、成像直观，且不受微球载体材料种类、微球形状结构影响的优点。
[0036]通过该方法得到微球中蛋白、多肽类药物以及微球骨架的三维形貌、孔径尺寸及空间分布特征，并且能够分辨与表面连通的蛋白、多肽类药物与微球表面连通情况等常规方法难以得到的重要信息，进而可通过微球的结构对其药物释放行为进行准确的预测，特别是对突释等方面的预测具有极其重要的意义。并可根据微球的结构和微球的降解、药物的释放之间的关系，由微球骨架及蛋白、多肽类药物在空间上的三维分布，建立药物释放数学模型，进而建立高效的筛选平台，最终达到缩短微球研发周期，提高研发效率的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为实施例1中测定得到的微球截面图；
[0038]图2为将图1的微球截面图以不同颜色表示不同部分的示意图；
[0039]图3为实施例1中得到的微球中所包载的BSA立体结构示意图；
[0040]图4为实施例1中得到的微球中孔隙的立体结构示意图；
[0041]图5为对比例I中测定得到的微球截面图；
[0042]图6为对比例2中得到的微球截面SEM图；
[0043]图7为对比例4中得到的微球内部孔体积随孔径分布曲线；
[0044]图8为对比例5中得到的微球共聚焦激光扫描显微镜图。
【具体实施方式】
[0045]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0046]实施例1
[0047]一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其中蛋白、多肽类药物为牛血清白蛋白(BSA)，微球骨架为聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)，通过复乳化溶剂挥发制备得到该微球。该测定方法包括以下步骤:
[0048]I)样品准备[0049]①固定:称取20mg微球放置于1.5ml的离心管中，每管加入lml2.5%的戊二醛固定液，静置4小时，确保固定液能完全渗透微球。
[0050]②清洗:吸弃固定液，使用PBS缓冲液将微球清洗3次。
[0051]③乙醇清洗脱水--第3次清洗后，用移液器将上清液吸出，以梯度的乙醇溶液清洗，脱去微球中的水份。首先加入体积百分含量为30%的乙醇溶液，将微球重新混悬后，静置10分钟，吸弃上清液，再加入下一浓度的乙醇溶液，重复以上步骤，具体每次所用乙醇浓度和静置时间如下:
[0052]30%乙醇10分钟
[0053]50%乙醇10分钟
[0054]70%乙醇10分钟
[0055]80%乙醇10分钟
[0056]95%乙醇10分钟
[0057]100%乙醇10分 钟
[0058]④染色:每离心管加入lml2%醋酸铀的乙醇溶液，静置4小时，确保染色液能完全渗透微球，与微球中负载的蛋白、多肽类药物结合。
[0059]⑤清洗:使用PBS缓冲液清洗3次，将未与蛋白、多肽类药物结合的染色剂清洗去除，得到待测微球样品。
[0060]2)纳米计算机断层扫描
[0061]将待测微球样品置于Nano-CT断层扫描设备中，进行预校准后，调节光子能量为8keV，采用大视场模式扫描，设置单幅曝光时间为20秒，对微球进行扫描，使用1024像素X 1024像素的CXD图像传感器捕获微球的二维图像，并以0.5°的步长在-90° -+90°的角度内采集二维投影图像。
[0062]3)数据分割
[0063]对上述得到的微球二维投影图像以滤波反投影算法进行重建，得到微球不同截面的图像，设定灰度阈值为40，具体分割方法为，如灰度值小于等于该灰度阈值，则分割为BSA蛋白药物部分，如灰度值大于该灰度阈值，则分割为PLGA微球骨架部分。将微球分割为BSA、PLGA骨架以及BSA包裹的空隙，如图1_2所示。
[0064]图2中，BSA蛋白以灰色显示，微球骨架以白色显示，蛋白、多肽类药物包裹的空隙以黑色显示。
[0065]4)三维结构构建:
[0066]以微球的截面图像进行三维重构，得到负载蛋白、多肽类药物微球的三维结构，如图3-4所示。图3为微球中所包载的BSA立体结构，图4为微球中的孔隙的立体结构。并通过对同一处方的多个微球的三维结构进行定量分析，获得一系列微球的结构参数，如药物体积、孔隙率、孔隙连通率、药物连通率等。
[0067]将不同处方制备得到的微球以上述测定方法进行测定，获得一系列结构参数，并将该不同处方制备得到的微球按照药典规定的方法做体外释放度试验，
[0068]结果如下表1所示。
[0069]表1微球结构参数及其与微球释放度之间的关系
[0070]
【权利要求】
1.一种负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)样品准备 将微球置于容器中，加入固定液，静置，使固定液完全渗透微球；弃去固定液，以磷酸盐缓冲液清洗微球，弃去磷酸盐缓冲液；加入乙醇清洗，脱去微球中的水；然后加入含染色剂的乙醇溶液，静置，确保染色剂完全浸透微球，并与微球中负载的蛋白、多肽类药物结合，再以磷酸盐缓冲液将未与蛋白、多肽类药物结合的染色剂清洗去除，得到待测微球样品； 2)Nano-CT断层扫描 将待测微球样品置于Nano-CT断层扫描设备中，调节光子能量为5_12keV，采用大视场模式扫描，设置单幅曝光时间为15-25秒，并以0.2° -0.8°的步长在-90° -+90°的角度内采集微球二维投影图像； 3)数据分割 对上述得到的微球二维投影图像进行重建，得到微球的不同截面图像，以预设的灰度阈值，将微球分割为蛋白、多肽类药物部分和微球骨架部分； 4)三维结构构建 以微球的截面图像进行三维重构，得到负载蛋白、多肽类药物微球的三维结构，并计算出微球的结构参数。
2.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物的微球三维结构的构建方法，其特征在于，步骤I)样品准备中，所述固定液为中性甲醛溶液、戊二醛溶液、等渗甲醛醋酸溶液或碱性醋酸铝溶液。
3.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物的微球三维结构的构建方法，其特征在于，步骤I)样品准备中，所述染色剂为醋酸铀、柠檬酸铅或四氧化锇。
4.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，步骤I)样品准备中，所述固定液为体积百分比含量为1.0% -4.0%的戊二醛水溶液；所述脱去微球中的水的方法为加入体积百分含量为10% -100%的乙醇溶液进行梯度清洗；所述染色剂为百分含量为1.5% -2.5%的醋酸铀，按每克微球0.8-1.2mL醋酸铀的加入量对蛋白质进行染色。
5.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，所述微球以聚乳酸类或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物类材料为骨架。
6.根据权利要求1-5任一项所述的负载蛋白、多肽类药物的微球三维结构的构建方法，其特征在于，步骤2)Nano-CT断层扫描中，所述光子能量为6_10keV，所述单幅曝光时间为18-22秒，所述CT成像投影数据的采集步长为0.4-0.6°。
7.根据权利要求6所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，步骤3)数据分割中，对微球二维投影图像进行重建的方法为滤波反投影算法。
8.根据权利要求7所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，步骤3)数据分割中，所述灰度阈值为35-45，具体分割方法为:如灰度值小于等于该灰度阈值，则分割为蛋白、多肽类药物部分，如灰度值大于该灰度阈值，则分割为微球骨架部分。
9.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，步骤4)三维结构构建中，所述微球的结构参数为孔隙、孔隙率、孔隙连通率、蛋白、多肽类药物体积、药物体积占微球总体积的百分率、多肽类药物连通率、平均孔径及分布、平均孔径与微球直径比、闭合连通率、有效表面积中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的负载蛋白、多肽类药物微球立体形态及分布的测定方法，其特征在于，步骤2)Nano-CT断层扫描中，所述微球的二维投影图像通过CXD图像传感器捕获。
【文档编号】G01N23/04GK104020182SQ201410228503
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】张永明, 罗宇燕, 黎呐, 郭喆霏, 钟晨 申请人:中山大学附属第三医院