金属离子螯合剂及其医疗用途的制作方法

专利名称：金属离子螯合剂及其医疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够螯合金属离子的化合物。特别地，本发明涉及能够螯合包括铁离子在内的金属离子的(硫代)缩氨基脲化合物和(硫代)腙化合物。本发明还涉及该化合物和/或其金属离子络合物的医疗用途，包括治疗与细胞增殖相关的疾病的方法。
背景技术：
铁(Fe)主要参与许多重要的细胞过程。例如，含铁蛋白能催化能量代谢、呼吸作用和DNA合成中所涉及的关键反应。细胞铁缺失会导致G1/S停滞和凋亡1，2。与正常细胞相比，肿瘤细胞对铁缺失更敏感，这可能是由于其增加的增殖速率导致的。肿瘤细胞对铁需求的增加反映在转铁蛋白受体1的表达增加，该受体结合血清铁运输蛋白-转铁蛋白(Tf)。赘生性细胞也表达出较高水平的含铁酶核糖核酸还原酶，其是DNA合成中关键的限速步骤。因此，细胞铁库代表了一种重要的治疗靶点，能够螯合铁的化合物可能是治疗与铁相关的疾病和紊乱的有用治疗剂，也是潜在的抗肿瘤剂。
去铁胺(DFO)是目前用于治疗铁过载疾病的铁螯合剂。然而，DFO作为抗癌剂的应用受其中性的抗增殖活性的限制。
目前存在着对医疗上可以接受的包括铁螯合剂在内的金属离子螯合剂的需求，这些螯合剂能够透过细胞膜并与细胞内铁螯合。目前也需要临床上有用的具有抗增殖活性的铁螯合剂。
发明概述本发明的第一方面是提供一种具有通式1的化合物
通式1其中，E是O或S；A是 其中，Z′、Y′、X′和W′独立地选自CR4、NR8、S、O，其中A中的杂原子的总数量为1、2或3，m是0或1，B是 其中，Z、Y、X、W和V独立地选自CR4、NR8、S、O；其中B中的杂原子的总数量为0、1、2或3；q是0或1；每一R4独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基和-C(O)-烯基、苄基、氨基甲酸苄酯；R′为氢或不阻碍金属离子螯合的基团；-G为NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之间的键可以是单键、双键或三键；其中当C和R5之间的键是双键时，R2和R3中的一个不存在，当C和R5之间的键是三键时，R2和R3都不存在；R5选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分别选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基、或非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的环烷基或非必要取代的杂环烷基；其限制条件是(i)当E是O，且A和B每一个是 则-G不是-NH2、-CH2Cl、 且(ii)当E是S，而A和B每一个是 则-G不是-NH2、
关于本发明的第一方面，A和B可以相同或不同。在一个实施方案中，A和B相同。在另一个实施方案中，A和B不同。
在一些实施方案中，A可以选自非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基或非必要取代的吡咯基。
在另一个实施方案中，B可以选自非必要取代的5-或6-元芳环或非必要取代的5-或6-元杂芳环。例如，B可以选自非必要取代的苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、噁唑基、吡咯基或呋喃基。非必要的取代基可以包括吸电子基和供电子基。非必要的取代基的例子包括烷基、烯基、炔基、C6-10芳基、卤素、氨基、羟基、O-烷基、S-烷基、硝基、氰基、C(O)-烷基、C(O)-O-烷基、C(O)-NH(烷基)、和C(O)-N(烷基)2。
在一个实施方案中，R′是氢。
在另一个实施方案中，当E是O时，-G选自非必要取代的-C1-8烷基、-C1-8烯基、芳基、杂芳基、-CH2(芳基)、或-CH(芳基)2。在另一个施实方案中，当E是S时，-G选自非必要取代的-C1-8烷基、-C1-8烯基、-CH2(芳基)、-CH(芳基)2、芳基或杂芳基。在另一个实施方案中，当E是S时，-G选自非必要取代的-NH(C1-6-烯基)或-N(芳基)2。
本发明的第二方面是提供具有通式2的化合物 通式2其中A选自 和 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
在一个实施方案中，A是 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4。
在一个实施方案中，B选自 和 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，和p是0-7的一个整数，其中A、E和G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
在一个实施方案中，p为0、1、2、3或4。
在一个实施方案中，B是 本发明的第三方面是提供具有通式3的化合物 通式3其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，和-G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
本发明的第四方面是提供具有通式4的化合物 通式4其中E是O或S；和
-G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
在本发明的一个实施方案中，当E是O时，具有通式4的化合物为二-2-吡啶基酮4，4-二苯基缩氨基脲(缩写为PK44pH)。在另一个实施方案中，当E是O时，具有通式4的化合物为二-2-吡啶基酮辛酸基腙(缩写为PKoctH)。
在本发明的另一个实施方案中，当E是S时，具有通式4的化合物为二-2-吡啶基酮4-乙基-3-硫代缩氨基脲(缩写为Dp4eH)。在另一个实施方案中，当E是S时，具有通式4的化合物为二-2-吡啶基酮4-烯丙基-3-硫代缩氨基脲(缩写为Dp4aT)。
具有通式1、2、3或4的化合物能够螯合金属离子。因此，本发明的另一方面是提供在本发明的第一至第四方面中的任一个所定义的具有通式1、2、3或4的化合物的金属离子络合物，包括或不包括限制条件(i)和(ii)。
在一个实施方案中，具有通式1、2、3或4的化合物的金属离子络合物可以是过渡金属离子络合物，例如铜、铁、锌、钯、铂、或镓离子络合物。在一个实施方案中，金属离子是铁(II)。在另一个实施方案中，金属离子是铁(III)。
在一个实施方案中，具有通式1、2、3或4的化合物可以用作三齿配体。在一个实施方案中，具有通式1、2、3或4的两个化合物可以与金属离子如铁(II)或铁(III)形成六配位络合物。
本发明的第五方面是提供药物组合物，其包含药学上可以接受的稀释剂、辅药或载体和至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)、具有此处定义的通式1、2、3或4的化合物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物至少包含一种根据本发明的第一至第四方面任一所述的具有通式1、2、3或4的化合物，包括限制条件(i)和(ii)。
在本发明的一些实施方案中，药物组合物可以包含一种或多种具有通式1、2、3或4的化合物的金属离子络合物。合适的金属离子包括过渡金属离子。例如，金属离子可以是铁(II)、铁(III)、铜(II)、锌(II)、钯(II)、铂(II)或镓(III)。
带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物可以用于体外或体内金属离子螯合。在一个实施方案中，带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物可以用于铁螯合。因此，带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物可以适用于铁螯合治疗或治疗铁过载失调。带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物也可以通过螯合包括铁在内的细胞金属离子来修饰细胞功能。例如，带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物可以用于抑制细胞增殖和/或诱发凋亡。带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物及其组合物也可以用于修饰对铁浓度敏感的基因表达。此类基因的例子包括WAF1、GADD45和Ndrg1。
可以将本发明的药物组合物配制成用于皮下或静脉注射、口服给药、吸入、经皮肤施用或直肠给药。在本发明的一个实施方案中，将组合物配制成用于静脉给药。在另一个实施方案中，将组合物配制成用于口服给药。
本发明的第六方面是提供在哺乳动物中的铁螯合治疗方法，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物的药学组合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂以治疗有效量给药到所述哺乳动物。
本发明的第七方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物在制备用于铁螯合治疗的药剂中的用途。
本发明的第八方面是提供治疗哺乳动物铁过载紊乱的方法，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物的药物组合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂以有效治疗量给药到所述哺乳动物。
本发明的第九方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物在制备用于铁过载失调的药剂中的用途。
关于本发明的第八和第九方面，在一个实施方案中，铁过载失调是β-地中海贫血。
本发明的第十方面是提供抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞暴露在有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物中，或暴露在至少包含一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物与药学上可以接受的稀释剂、辅药、或赋形剂的药物组合物中。
关于本发明的第十方面，在一个实施方案中，具有通式1、2、3和4的化合物、其金属离子络合物或包含所述化合物或金属离子络合物的组合物可以用于体外抑制细胞增殖。在另一个实施方案中，具有通式1、2、3和4的化合物、其金属离子络合物或包含所述化合物或金属离子络合物的组合物可以用于体内抑制细胞增殖，例如哺乳动物的细胞增殖。
本发明的第十一方面是提供治疗哺乳动物增殖性紊乱的方法，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物与药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物以治疗有效量给药到所述哺乳动物。
本发明的第十二方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物在制备用于抑制细胞增殖的药剂中的用途。
本发明的第十三方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物、或其金属离子络合物在制备用于治疗增殖性紊乱的药剂中的用途。
根据本发明的第十一或十三方面，所述增殖性紊乱可以选自血管形成依赖性疾病、细胞增殖性疾病(例如牛皮癣、IBD、恶性肿瘤、再狭窄)、发炎性紊乱、自动免疫性疾病、血管疾病、血栓症、癌症。增殖性疾病可以是关节炎。癌症可以是恶性肿瘤或良性肿瘤。恶性肿瘤可以是转移性的。癌症可以是固体肿瘤或非固体肿瘤。例如，癌症可以是白血病或淋巴瘤。
在一个实施方案中，当本发明的化合物或组合物作为唯一的活性剂给药时，哺乳动物中生成的白细胞数量发生变化，特别是在施用化合物或组合物后数量减少了不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。相似地，在一个实施方案中，当本发明的化合物或组合物作为唯一的活性剂给药后，哺乳动物中生成的红细胞数量发生变化，特别是在施用化合物或组合物后数量减少了不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。
本发明的第十四方面是提供在细胞中诱发凋亡的方法，所述方法包括将所述细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或包含带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物接触。
本发明的第十五方面是提供抑制细胞增殖和在细胞中诱发凋亡的方法，所述方法包括将所述细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物接触，或与包含带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物接触。
本发明的第十六方面是提供在哺乳动物中诱发凋亡的方法，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物以治疗有效量给药到所述哺乳动物。
本发明的第十七方面是提供在哺乳动物中诱发凋亡和抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物以治疗有效量给药到所述哺乳动物。
本发明的第十八方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物在制备用于诱发凋亡的药剂中的用途。
本发明的第十九方面是提供至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物、或其金属离子络合物在制备用于诱发凋亡和抑制细胞增殖的药剂中的用途。
本发明的第二十方面是提供用于抑制细胞增殖、治疗增殖性紊乱、治疗癌症、诱发凋亡、铁螯合治疗或治疗铁过载失调中的一种或多种疾病的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或包含带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
本发明的第二十一方面是提供一种治疗或抑制下列疾病的方法细胞增殖性紊乱、癌症、哺乳动物中的铁过载失调、或在哺乳动物中诱发凋亡、或在哺乳动物中诱发凋亡和抑制细胞增殖，所述方法包括将至少一种带有或不带有限制条件(i)或(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其铁络合物，或包含所述化合物或络合物和药学上可以接受的辅药、稀释剂或赋形剂的组合物以治疗有效量给药到所述哺乳动物，其中哺乳动物中生成的白和/或红细胞数量发生变化，特别是在对所述哺乳动物给药化合物或组合物后数量分布分别减少了不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。
关于本发明的第五、第十至第二十一方面的任何一个，金属离子可以是过渡金属离子。例如，金属离子可以选自铁、铜、锌、钯、铂或镓离子。在一个实施方案中，金属离子是铁(II)。在另一个实施方案中，金属离子是铁(III)。
关于本发明的第六、八、十、十一、十六、十七和二十一方面中的任何一个，哺乳动物可以是人类、非人类的灵长类动物、鼠科动物、牛科动物、绵羊科动物、马科动物、山羊类动物、野兔、鸟类、猫科动物、猪或犬科动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。
本发明的第二十二方面是提供用于识别抗增殖性化合物的方法，所述方法包括将具有为一个或多个细胞周期抑制因子编码的基因的细胞或细胞提取物与能够螯合铁的化合物接触，测定所述基因的表达水平，测定所述基因的表达水平是否不同于不存在所述化合物时所述基因的表达；从而测定所述化合物是否具有抗增殖活性。
本发明的第二十三方面是提供通过筛选多种化合物来识别一种或多种抗增殖化合物的方法，所述方法包括将具有为一个或多个细胞周期抑制因子编码的基因的细胞或细胞提取物与多种能够螯合铁的化合物接触，测定所述化合物中的任何一个是否能修饰所述核酸的表达水平，如果其能修饰，分别对每一化合物测定所述基因的表达水平，测定所述表达水平是否不同于该化合物不存在时的表达水平；从而测定每一所述化合物是否具有抗增殖活性。
关于本发明的第二十二和二十三方面，在一个实施方案中，基因的表达为向上调节。在另一个实施方案中，基因的表达为向下调节。在一个实施方案中，表达细胞周期抑制因子的基因可以是WAF1。在另一个实施方案中，表达细胞周期抑制因子的基因可以是GADD45。在另一个实施方案中，该基因是Ndrg1。
关于本发明的第二十二和二十三方面，不存在所述化合物时的基因表达(例如mRNA、蛋白)的测定可以分别在测定存在所述化合物时的所述基因的表达之前或之后进行。
关于本发明的第二十二和二十三方面，在一个实施方案中，所述一个化合物或多个化合物能够螯合金属离子。在另一个实施方案中，所述一个化合物或多个化合物能够螯合铁。在另一个实施方案中，化合物为具有此处所定义的通式1、2、3或4的化合物，包括或不包括限制条件(i)和(ii)。
根据本发明的第一至第二十三方面的任何一个，在一个实施方案中，具有通式1、2、3或4的任一所述化合物为包括限制条件(i)和(ii)的本发明的第一至第四方面中的任何一个所定义的化合物。
本发明在其范围内包括具有通式1、2、3或4的化合物的所有异构形式，及它们的金属离子络合物。例如，如果适当，本发明包括化合物所有可能的对映体、非对映异构体、外消旋物、顺式异构体、反式异构体、(R)、(S)、(+)、(-)、Δ和Λ异构体和/或它们的金属络合物。定义下列的一些定义可能有助于理解本发明的描述。该定义为一般定义，决不能将本发明的范围仅仅限制在这些术语中，它们是为了更好的理解下述描述。
除非本文另有要求或专门作有相反声明，本发明此处所引用的作为单数的整数、步骤和元素很明显地包括所引用的整数、步骤和元素的单数和复数形式。
除非另有要求，在本说明书中的单词“包含”或其变体例如“包括”或“含有”应理解为暗示着还包括声明的步骤、元素或整数或多个步骤、元素或整数，而不是排除任何其他的步骤、元素或整数或多个步骤、元素或整数。因此，在本说明书的文本中，术语“包含”意思是“主要包括，但不是必要的唯一”。
本领域技术人员能理解，除了专门描述的那些，对此处所描述的本发明的变化和修改是可以接受的。同样可以理解的是本发明包括所有的变化和修改。本发明还包括本说明书所涉及或说明的所有步骤、特征、组合物和化合物，单独的或共同的，以及包括任何一个和所有的结合或包括任何两个或多个所述步骤或特征。
本申请所有引用的参考通过参考在此作为整体专门引入。
如此处所使用的，术语“烷基”在它的含义内包括具有1到10个碳原子的直链或支链饱和脂肪族基团，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，或具有3到8个碳原子的环状饱和脂肪族基团，例如3、4、5、6、7或8个碳原子，或具有7、8、9或10个碳原子的双环饱和脂肪族基团。例如，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、叔-丁基、戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基丙基、戊烷基、异戊烷基、己基、4-甲基戊烷基、1-甲基戊烷基、2-甲基戊烷基、3-甲基戊烷基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2，2-三甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、2-乙基戍基、3-乙基戍基、庚基、1-甲基己基、2，2-二甲基戊烷基、3，3-二甲基戊烷基、4，4-二甲基戊烷基、1，2-二甲基戊烷基、1，3-二甲基戊烷基、1，4-二甲基戊烷基、1，2，3-三甲基丁基、1，1，2-三甲基丁基、1，1，3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基、环丙基、2-甲基环丙基、环丁基、环戊烷基、2-甲基环戊烷基、3-甲基环戊烷基、环己基等。
术语“烯基”在其含义内包括具有2到8个碳原子的直链或支链不饱和脂肪族烃基基团，例如2、3、4、5、6、7或8个碳原子，或具有3到8个碳原子的环状不饱和脂肪族烃基基团，例如3、4、5、6、7或8个碳原子，或它们的结合，这些基团中具有至少一个双键，立体化学E或Z中任何一个都是适用的。烯基的例子包括但不限于次乙基(ethenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1，3-戊二烯基、2，4-戊二烯基、1，4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基等。
此处所使用的术语“炔基”在其含义内包括具有2到8个碳原子的直链或支链不饱和脂肪族烃基基团，例如2、3、4、5、6、7或8个碳原子，且其具有至少一个三键。炔基的例子包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基等。
此处所使用的术语“杂原子”指的是除碳或氢以外的任何原子，包括例如氧、氮和硫。
此处所使用的术语“卤化物”或“卤素原子”指的是氟、氯、溴和碘。
此处所使用的术语“氨基基团”或其变体、例如“氨基”指的是形式为-NR6R7的基团，其中R6和R7分别选自但不限于氢、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基或非必要取代的芳基。
此处所使用的术语“芳族基团”或其变体如“芳基”指的是具有6到14个碳原子的芳烃的单个、多环、共轭和稠环残基，例如6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子。这样基团的例子包括苯基、甲苯基、二苯基、萘基、菲基等。
此处所使用的术语“杂芳族基团”或其变体、例如“杂芳基”在其含义内包括任何具有1、2、3或4个杂原子的5-16元、例如5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、或16-元单环、双环或三环芳族基团。例子包括但不限于吡咯基、吡啶基、菲基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、苯硫基、呋喃基、嘌呤基、吲哚基、异吲哚基、菲啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、吡唑基、惡唑基、异惡唑基、噻唑基、苯并呋喃基等。
此处所使用的术语“杂环烷基基团”的意思包括任何具有1、2或3个杂原子的3-10元饱和或非饱和、单环或双环环状系统。例子包括但不限于哌啶基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡咯基、吗啉基、四氢噻吩基等。
此处所使用的术语“非必要取代”指的是本术语所指的基团可以是非取代的、或被一个或多个独立地选自下列的基团取代卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-O-烷基、-S-烷基、硝基、氨基、-C(O)NH2、-C(O)NH(烷基)、-C(O)N(烷基)2、和-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基。
术语“治疗有效量”在其含义内旨在包括无毒但足够量的本发明的化合物或组合物以提供所期望的治疗效果。确切的该化合物或组合物治疗有效量根据如下因素如动物病的类型、年龄、性别和动物体重、给药方式、以及细胞中化合物或组合物渗透细胞膜的能力和金属离子如铁的鳌和的能力而变化。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。例如每日可以以数个分开的剂量形式给药，或剂量可以根据治疗的紧急情况成比例减少。
如此处所使用，术语“治疗”指的是以任何方式治疗疾病状态或症状、防止疾病生成、或防止、阻碍、延迟或逆转疾病恶化或其他不希望的症状的任何和所有应用。
缩写DFO—去铁胺EDTA—乙二胺四乙酸MTT—[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑]Tf—转铁蛋白“311”—2-羟基-1-萘基醛异烟酰腙“311m”2-羟基-1-萘基醛烟酰腙DPT—二-2-吡啶基酮-3-缩氨基硫脲Dp2mT—二-2-吡啶基酮-2-甲基-3-缩氨基硫脲Dp4mT—二-2-吡啶基酮-4-甲基-3-缩氨基硫脲Dp44mT—二-2-吡啶基酮-4，4-二甲基3-缩氨基硫脲Dp4eT—二-2-吡啶基酮-4-乙基-3-缩氨基硫脲Dp4aT—二-2-吡啶基酮-4-烷基-3-缩氨基硫脲Dp4pT—二-2-吡啶基酮-4-苯基-3-缩氨基硫脲PCBH—2-吡啶基酮苯甲酰腙PCBBH—2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙PCAH—2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙PCHH—2-吡啶基酮4-羟基苯甲酰腙PCIH—2-吡啶基酮异烟酰腙PCTH—2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙PKIH—二-2-吡啶基酮异烟酰腙PKBH—二-2-吡啶基酮苯甲酰腙PKHH—二-2-吡啶基酮4-羟基苯甲酰腙PKBBH—二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙PKAH—二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙PKTH—二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙PK44pH—二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛缩氨基硫脲PKoctH—二-2-吡啶基酮辛酸基腙QCIH—2-喹啉羧基醛异烟酰腙
QCTH—2-喹啉羧基醛2-噻吩羟基醛腙QCBH—2-喹啉羧基醛苯甲酰腙QCBBH—2-喹啉羧基醛3-溴苯甲酰腙QCAH—2-喹啉羧基醛4-氨基苯甲酰腙QCHH—2-喹啉羧基醛4-羟基苯甲酰腙附图简要说明

图1.(A)用以显示所用编号体系的一般化合物结构。(B)DFO、311和Triapine的结构；(C)对比用化合物PCIH和QCIH的一般结构。
图2.(A)代表性DpT类似物的结构，包括DpT、Dp2mT、Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT。(B)代表性PKIH类似物的结构，包括PKIH、PKTH、PKPH、PKAH、PKHH、PKBH、PK44pH和PKoctH。
图3.螯合剂对59Fe从预标记的SK-N-MC神经上皮瘤细胞中转移的影响的柱状图。(A)PKIH和PCIH类似物的对比；(B)QCIH和PCIH类似物的对比。结果表示为进行的2个实验中的典型实验的3次重复结果的平均值±SD。
图4.螯合剂对由SK-N-MC神经上皮瘤细胞从59Fe-转铁蛋白(59Fe-Tf)中进行59Fe吸收的影响的柱状图。(A)PKIH和PCIH类似物的对比；(B)QCIH和PCIH类似物的对比。结果表示为进行的2个实验中的典型实验的3次重复结果的平均值±SD。
图5.与PCTH相比，PKIH类似物的浓度对下列影响的线图(A)细胞59Fe转移和(B)从59Fe-转铁蛋白(59Fe-Tf)中的内在59Fe吸收。结果表示为进行的2个实验中的典型实验的3次重复结果的平均值±SD。
图6.与MRC-5纤维原细胞(F)相比，代表性的PKIH类似物、去铁胺(DFO)和2-羟基-1-萘基醛异烟酰腙(311)对SK-N-MC神经上皮瘤细胞(N)增殖的影响的线图。每一数据点代表实验中3个独立实验的平均值，每一个实验采用双重测定。
图7.铁螯合剂的PKIH系列的成员能显著地提高SK-N-MC神经上皮瘤细胞中WAF1和GADD43mRNA的表达。PKIH类似物的影响与DFO、311和PCIH系列的一些螯合剂相比较。(A)(i)被溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶；(ii)GADD45；(iii)WAF1和(iv)β-肌动蛋白mRNA水平；(B)标准化为β-肌动蛋白负载对照的(A)中结果的密度分析。在37℃，只用介质(对照)或含有DFO(100μM)或其他螯合剂(25μM)的介质培育20小时后将全部RNA从细胞中提取出。RNA印迹用标准方法完成(参见实施例6)。图所说明的结果为来自进行的三个实验中的典型实验。
图8.PKIH类似物提高了SK-N-MC神经上皮瘤细胞中铁-调节蛋白(IRP)-RNA-结合活性。(A)有效的IRP-RNA-结合活性；(B)(A)中结果的密度分析。与作为内部对照的数个螯合剂(即DFO、311、PCBBH和PCAH)和Fe供体柠檬酸铁铵(FAC)相比较，PKIH类似物的影响。细胞用DFO(100μM)、FAC(100μg/ml)和其他螯合剂(25μM)在37℃培育20小时。然后使用标准技术通过凝胶-延迟分析来评估(IRP)-RNA-结合活性。图所说明的结果为来自进行的三个实验中的典型实验。
图9.通过X-射线结晶法测定的PKAH的晶体结构，显示为30％的热椭圆体和水溶剂化。
图10.与会死亡的MRC-5纤维原细胞(F)相比，DpT和311(内部对照)显示出对无限生长分化的SK-N-MC神经上皮瘤细胞(S)的选择性抗增殖活性。细胞在存在或不存在化合物(0-25μM)下在37℃培育20小时。培育期后，用MTT分析测量细胞密度。每一数据点代表至少进行3-5实验中的典型实验的2次重复测定的平均值。
图11.与DFO和311相比，DpT类似物对59Fe转移和在SK-N-MC神经上皮瘤细胞和M109细胞中从59Fe-转铁蛋白(59Fe-Tf)中细胞59Fe的吸收的影响。(A)螯合剂对从预标记的SK-N-MC神经上皮瘤细胞中的59Fe转移的影响。(B)螯合剂对防止从预标记的SK-N-MC神经上皮瘤细胞中的59Fe吸收的影响。(C)作为螯合剂浓度的函数，螯合剂对从预标记的M109细胞中的59Fe转移的影响。(D)作为螯合剂浓度的函数，螯合剂对防止由预标记的M109细胞对59Fe-Tf中的59Fe吸收的影响。结果表示为进行的3个实验中的典型实验的3次重复结果的平均值±SD。
图12.(A)5天的治疗方案后，Dp44mT和在更大程度上，Triapine显著降低了小鼠中M109肺癌的生长，(B)注射(i)赋形剂对照或(ii)Dp44mT后在肿瘤中所诱导的凋亡，由TUNEL试验判定。
图13.作为(A)螯合剂浓度和(B)培育时间的函数，Dp44mT对M109细胞凋亡或坏死/晚期凋亡的影响。(A)M109细胞用0-250μM的Dp44mT在37℃培育24小时。分别用Annexin V-FITC和PI染色测量细胞凋亡或坏死/晚期凋亡(具体参见Materials and Methods)。(B)在不同培育时间(0-48小时)下，M109细胞用Dp44mT(1μM)处理。细胞凋亡和坏死/完全凋亡如(A)中所述进行测量。数据点为三个独立实验的平均值±SEM。
图14.Dp44mT(1μM)对(A，B)活性胱冬酶(caspase)-3、-8和-9的蛋白水平和(C，D)在不存在(C)和存在(D)细胞可渗透胱冬酶抑制因子下对培养的M109细胞中胱冬酶-3、-8和-9的活性的影响。(A)Dp44mT处理后在指定时间时胱冬酶-3、-8和-9的水平，由蛋白印迹杂交(western blotting)测定(上部板)。(B)作为时间的函数，标准化为β-肌动蛋白的胱冬酶-3、-8和-9的表达的密度分析。(C)由Dp44mT(1μM)在0-48小时诱发的胱冬酶活性，表示为零时数值的百分数。(D)当用Dp44mT(1μM)培育48小时后，1μM胱冬酶-3、-8和-9的细胞可渗透抑制因子防止了这些酶的活化。结果为三个独立实验的平均值±SEM。
图15.在培养的M109细胞中Dp44mT(1μM)对下列的影响(A)在胞质部分和基质线粒体膜(SMM)部分中的全细胞色素c(h-cytc)的水平；(B)Bcl-2和Bax的线粒体蛋白水平；(C)细胞内ROS繁殖。
图16.在25μM测定时，只有具有高抗增殖活性和铁螯合效力的细胞膜可渗透的螯合剂311和Dp44mT提高了Ndrg1的蛋白表达。MCF-7细胞用25μM的DFO、311、青霉胺、dp44mT、dp2mT、二吡啶基、L1或EDTA在37℃培育24小时。Ndrg1的表达和β-肌动蛋白的蛋白水平用蛋白印迹杂交测定。结果为进行的3个实验中的典型实验。
本发明优选实施方案的详述本发明涉及能够螯合金属离子的化合物。特别地，本发明涉及具有通式1、2、3和4的(硫代)缩氨基脲和(硫代)腙化合物 通式1 通式2 通式3和 通式4其中，E、A、Z、Y、X、W、V、Z′、Y′、X′、W′、m、n、p、q和G如上定义，包括限制条件(i)和(ii)。
本发明还涉及包括或不包括限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物的用途。因此，本发明包括具有如下通式1a、2a、3a和4a的化合物的用途 通式1a其中E是O或S；
A是 其中Z′、Y′、X′和W′独立地选自CR4、NR8、S或O，其中A中的杂原子的总数为1、2或3。
m是0或1。
B是 其中Z、Y、X、W和V独立地选自CR4、NR8、S或O，其中B中的杂原子的总数为0、1、2或3。
q是0或1。
每一R4独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、苄基、氨基甲酸苄酯；R′是H或不会阻碍金属离子螯合的基团；-G是NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之间的键可以是单键、双键或三键；其中当C和R5之间的键是双键时，R2和R3中的一个不存在，当C和R5之间的键是三键时，R2和R3都不存在；R5选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分别选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基、非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的环烷基、或非必要取代的杂环烷基； 通式2a其中A选自 和 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1a中定义； 通式3a其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；-G如上述通式1a中所定义；和
通式4其中E是O或S；和-G如上述通式1a中所定义；相应地，“带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物”和“包括或不包括限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物”的表达应理解为包括具有通式1、2、3和4的化合物，也包括具有通式1a、2a、3a和4a的化合物。
如此处所用，专业术语“(硫代)缩氨基脲”在其范围内包括缩氨基脲、缩氨基硫脲及其衍生物或相关类似物。相似地，如此处所用，专业术语“(硫代)腙”在其范围内包括腙、硫代腙及其衍生物或相关类似物。
关于通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a，当E是O时，此处的化合物有时称为“PKIH类似物”或“PKIH系列”；当E是S时，此处的化合物有时称为“DpT类似物”或“DpT系列”。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以螯合金属离子以形成金属离子络合物。能够与具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物形成金属离子络合物的金属离子的例子包括过渡金属离子如铁、铜、锌、钯、铂、或镓离子。在一个实施方案中，金属离子是铁(III)。在另一个实施方案中，金属离子是铁(II)。在另一个实施方案中，金属离子是锌(II)。
本发明还包括药物制剂，其包含至少一种包括限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物和/或每一所述化合物的金属离子络合物。本发明还涉及包括或不包括限制条件(i)和(ii)的具有此处所定义的通式1、2、3和4的化合物或包含该化合物和/或其金属离子络合物的组合物的医疗用途。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物包含(硫代)缩氨基脲或(硫代)腙骨架。A和B基团中至少一个包含能够参与金属离子螯合的杂原子。在一个实施方案中，通式1、2、3和4的化合物用作三齿配体。在一个实施方案中，A和B中至少一个是2-吡啶基团，其中吡啶基氮、亚氨基(C＝N)氮和羰基(C＝O)或硫代羰基(C＝S)基团每一个可以作为供体原子与合适的金属离子配位。本领域技术人员能够理解当A和B不同时，C＝N双键可以会有顺/反立体异构现象。因此，在一个实施方案中，当A和B是不同的非必要取代的杂芳环时，具有通式1的化合物可以能够通过环A或环B的杂原子形成金属离子络合物，这取决于顺/反立体化学。如下图解所示，其中M是合适的金属离子 顺式 反式具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以用作三齿配体，两个该化合物可以与合适的金属离子如能够形成八面络合物的金属离子形成六配位金属离子络合物。
合成具有通式1、2、3和4的化合物的合适的方法是本领域技术人员所公知的，其中一些在例如J.March，Advanced Organic Chemistry，4thEdition(John Wiley & Sons，New York，1992)；和Vogel’s Textbook ofPractical Organic Chemistry，5thEdition(John Wiley & Sons，New York，1989)中有所描述。
根据本发明的具有通式1、2、3和4的化合物可以通过希夫碱(Schiffbase)缩合反应来制备，其中，酮或醛与选择的酸式酰肼或酸式氨基硫脲缩合以制备相应的具有预期取代模式的具有通式1、2、3或4的(硫代)缩氨基脲或(硫代)腙化合物。
例如，(硫代)缩氨基脲和(硫代)腙化合物合适的合成方法己由Bacchi等人(1996)描述过。制备具有通式1、2、3和4的PKIH类似物的一般合成路线的典型例子如以下反应图解所示
如下图解所示为制备具有通式4的PKIH类似物的合成路线的例子，通过合成化合物PK44pH和PKoctH来说明 合适的制备DpT类似物的方法已由例如Johnson等人(1982)描述过。制备具有通式1、2、3和4的DpT类似物的一般合成路线的例子如以下反应图解所示 制备具有此处所定义的通式4的DpT类似物的合成路线的例子通过合成化合物Dp4eT和Dp4aT来说明
上述所代表的缩合反应可以在本领域技术人员已公知的条件下进行。例如，合适的溶剂系统包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水或其他常用有机溶剂如丙酮、苯、甲苯等。具有通式1、2、3和4的化合物可以用标准技术纯化，包括从合适的溶剂中重结晶和柱层析。
在另一个合成方法中，硫代缩氨基脲和硫代腙可通过本领域技术人员所公知的方法，分别从相应的缩氨基脲和腙化合物制备。例如，在标准条件下可以使用Lawesson’s试剂将C＝O键转化成C＝S键。例如，通式1、2、3或4的缩氨基脲或腙化合物可以与拉韦松(Lawesson’s)试剂在合适的溶剂如甲苯或苯中回流加热以制备相应的硫代化合物。制备具有通式4的化合物如下面一般方案所示 本领域的技术人员能理解在合成根据本发明的化合物中，使用保护基是必要或适当的。合适的保护基为本领域技术人员所公知的。例如，常用的N-保护基包括苄基和氨基甲酸酯，例如氨基甲酸叔-丁酯、氨基甲酸苄酯。保护性基团已在Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene & Peter G.M.Wuts，Second Ed.，John Wiley & Sons，Inc.(1991)中描述，在此引入其内容作为参考。
根据本发明，应用的(硫代)缩氨基脲和(硫代)腙的衍生物的例如包括二-2-吡啶基酮异烟酰腙(“PKIH”)；二-2-吡啶基酮苯甲酰腙(“PKBH”)；二-2-吡啶基酮4-羟基苯甲酰腙(“PKHH”)；二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙(“PBBH”)；二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙(“PKAH”)；二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙(“PKTH”)；二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛缩氨基硫脲(“PK44pH”)；二-2-吡啶基酮辛酸基腙(“PKoctH”)；二-2-吡啶基酮-4-甲基-3-缩氨基硫脲(“Dp4mT”)；二-2-吡啶基酮-4，4-二甲基3-缩氨基硫脲(“Dp44mT”)；二-2-吡啶基酮-4-乙基-3-缩氨基硫脲(“Dp4eT”)；二-2-吡啶基酮-4-烷基-3-缩氨基硫脲(“Dp4aT”)；二-2-吡啶基酮-4-苯基-3-缩氨基硫脲(“Dp4pT”)。
此处还公开了结构与PKIH类似物相对应的硫代腙，但其具有C＝S键而不是C＝O键。这种化合物包括二-2-吡啶基酮异烟酰硫代腙(“PKITH”)；二-2-吡啶基酮苯甲酰硫代腙(“PKBTH”)；二-2-吡啶基酮4-羟基苯甲酰硫代腙(“PKHTH”)；二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰硫代腙(“PBBTH”)；二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰硫代腙(“PKATH”)；二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛硫代腙(“PKTTH”)；二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛硫代缩氨基硫脲(“PK44Pth”)；二-2-吡啶基酮辛酸基硫代腙(“PKoctTH”)。
本发明的铁络合物包括Fe[PKIH]2、Fe[PKBH]2、Fe[PKHH]2、Fe[PBBH]2、Fe[PKAH]2、Fe[PKTH]2、Fe[PK44pH]2和Fe[PKoctH]2、Fe[Dp4mT]2、Fe[Dp44mT]2、Fe[Dp4eT]2、Fe[Dp4aT]2和Fe[Dp4pT]2。铁离子可以Fe(II)或Fe(III)。
根据本发明的具有通式1、2、3和4的PKIH和DpT类似物的金属离子络合物可以很容易通过使用本领域公知的技术和试剂进行制备。例如，合适的金属离子盐包括但不限于金属卤化物、硝酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、乙酸盐和三氟甲磺酸盐(triflates)。形成铁络合物的合适的铁盐包括但不限于FeCl3、Fe(NO3)3、FeSO4、Fe(OAc)3和Fe2(ClO4)33。
在通式1中的定义中，R′基团定义为“氢或不会防止化合物螯合金属离子的基团”。当R′是甲基时，Fe螯合受到阻碍。
与1位置不存在两个有机基团的相应化合物相比，具有通式1、2、3和4的化合物的位置1两个有机基团(即芳族和/或杂原子基团A和B)的存在通常能提高化合物的亲脂性。具有通式1、2、3和4的PKIH和DpT类似物能够渗透过细胞膜。
PCIH、QCIH(图1C)、PKIH和DpT系列的化合物的构效关系表明即使这些种类的化合物看起来具有相似的金属键结位置，但各个种类的亲脂性、与金属离子螯合的效率和抗增殖性能也可能有相当大的不同。
根据本发明的具有通式1、2、3和4的(硫代)缩氨基脲和(硫代)腙化合物可以用作能够形成金属离子络合物三齿配体。对于具有通式1的化合物，铁络合物的一般例子如下所示。
其中E是O或S。
作为另一个例子，配体为PKAH的铁络合物如下所示。
还例如配体为Dp4mT的铁络合物如下所示。
根据本发明，DpT或PKIH配体的金属离子络合物可以是中性或带有电荷的。
此处还公开了识别抗增殖用化合物的方法，其中，该方法包括将具有编码一个或多个细胞周期抑制因子的基因的细胞或细胞提取物暴露(例如接触或培育)在能够螯合铁的化合物中，测定基因的表达水平，测定基因的表达水平是否与不存在所述化合物时基因的表达不同；从而测定所述化合物是否具有抗增殖活性。
可以使用相似的方法评估多个化合物以识别一个或多个抗增殖性化合物，该方法包括将具有编码一个或多个细胞周期抑制因子的基因的细胞或细胞提取物暴露(例如接触或培育)在能够螯合铁的多个化合物中，测定所述化合物中的任何一个是否能修饰所述基因的表达水平，如果其能修饰，分别测定每一化合物对所述基因的表达水平，测定所述表达水平是否与不存在该化合物时的基团表达水平不同；从而测定每一化合物是否具有抗增殖活性。
基因可能对细胞铁浓度敏感。相应于铁缺失，基因的表达可以向上调节或向下调节。基因的例子包括WAF1、GADD45和Ndrg1。对不存在所评估的化合物时的基因的表达(例如mRNA、蛋白)的测定可以分别在测定存在所述化合物时的所述基因的表达之前或之后进行。细胞功能的修饰能够螯合细胞铁的化合物可以修饰细胞功能，例如通过酶抑制、基因表达的修饰(包括基因的向上调节和向下调节)、转录抑制(例如蛋白，包括p21)、活性氧(ROS)的产生等，其也治疗性用于抑制细胞增殖和/或诱发凋亡。例如，细胞铁缺失可能修饰铁依赖性酶如核糖核酸还原酶的活性。铁缺失也能诱发G1-S细胞抑制和凋亡。
基因WAF1和GADD45编码细胞周期抑制因子，其对G1-S抑制是必不可少的(包括周期依赖性激酶抑制因子，例如p21CIP/WAF1)30。例如，通过铁缺失向上调节这些基因就可能诱发细胞周期抑制。基因Ndrg1(N-myc向下调节的基因1)对细胞铁浓度敏感。例如对应于细胞铁缺失的Ndrg1的过度表达可能造成G1-S细胞抑制。Ndrg1的过度表达也已显示出能减缓肿瘤生长和抑制肿瘤细胞转移。4-7根据本发明的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物能够螯合包括铁离子在内的细胞金属离子。因此，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物能够通过抑制核糖核酸还原酶来抑制DNA的合成。核糖核酸还原酶是DNA合成中的限速步骤，与正常细胞相比，其在癌细胞中的表达水平更高。具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可能也会造成铁敏感性基因的过度表达，例如WAF1、GADD45和Ndrg1，因此其可用于抑制细胞增殖。铁敏感性基因如WAF1、GADD45和Ndrg1的过度表达可能在mRNA水平发生。监测WAF1、GADD45和Ndrg1的表达可提供对具有抗增殖潜力的化合物的有用的指示剂，该化合物可螯合包括铁在内的金属离子。
凋亡或预定性细胞死亡在细胞更新中起着不可缺少的作用。细胞铁缺失时可诱发凋亡。胱冬酶是常用的凋亡执行者。8，9己描述了调节凋亡的两个胱冬酶-活化的级联反应，其中一个通过死亡受体(例如CD95)发动，而另一个由线粒体的完整性的变化引发。8，10在前者中，由其配体(例如CD95L)啮合的死亡受体能导致死亡诱发的信号络合物的形成8。激活的死亡受体使胱冬酶-8复原和活化，胱冬酶-8能诱发“执行者”胱冬酶，包括胱冬酶-3。在线粒体依赖性的凋亡中，全细胞色素c释放到细胞溶质中会导致含有全细胞色素c、Apaf-1和前-胱冬酶-9(pro-caspase)的“凋亡体”的形成。8，9在凋亡体中，前胱冬酶-9活化并激发执行者—胱冬酶，该胱冬酶能够引发与死亡受体途径诱导的执行者相重叠的晚期事件8，9。凋亡的线粒体途径的主要调节子包括Bcl-2/Bax基因族8，11，12。Bcl-2蛋白群在线粒体的外膜中找到，对其稳定性起作用8，11。相反，Bax蛋白是细胞溶质分子，其一接收到凋亡信号后就迁移至线粒体中，在那里结合到渗透性转换孔8，12。Bcl-2和Bax之间的失调诱导造成全细胞色素c释放选择性离子渗透性的损失，从而引发了导致凋亡的胱冬酶级联反应8，12。细胞金属离子例如铁和可能是锌，与具有通式1、2、3和4的化合物的螯合可能会引发诱导凋亡的胱冬酶级联反应。
包括细胞铁的缺失在内的细胞金属离子缺失可能导致凋亡。相应于氧化应激也可能诱发凋亡，氧化应激能导致全细胞色素c从线粒体中释放和Bcl-2/Bax表达失调。金属离子络合物，包括具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的铁络合物可通过产生活性氧来诱发凋亡。因此，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物，以及具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的金属离子络合物(包括铁络合物)可能具有治疗性用途，例如作为抗肿瘤剂。
疾病的治疗和/或预防此处所公开的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物中的DpT和PKIH可以用于治疗脊椎动物的各种失调和疾病。失调和疾病的例子可以分成几大类，包括如下血管形成依赖性疾病、细胞增殖性疾病(例如牛皮癣、IBD、恶性肿瘤、器官再狭窄)和癌症。
癌症可以选自但不限于致癌性肿瘤、上皮起源的肿瘤如结肠、直肠癌、乳癌、肺癌、头颈部癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、前列腺癌和尿道/生殖道癌；间叶细胞肿瘤如肉瘤；和造血肿瘤，例如B细胞淋巴瘤。例如，癌症可以是血液病学肿瘤、固体肿瘤和非固体肿瘤(例如白血病、淋巴瘤)。
此处所公开的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的DpT和PKIH类似物可以与其他已知的疗法如外科手术和/或治疗剂结合使用，包括化学疗法和放射疗法。例如，当用于治疗固体肿瘤时，本发明的化合物可以与例如以下的化疗药物一起给药阿霉素、紫杉醇、氟脲嘧啶、左旋溶肉瘤素、顺氯氨铂、α-干扰素、COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨蝶呤和波尼松)、依托泊甙、mBACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、链霉菌、环磷酰胺、长春新碱和地塞米松)、PROMACE/MOPP(波尼松、甲氨蝶呤(w/leucovin rescue)、链霉菌、环磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/二氯甲基二乙胺、长春新碱、波尼松和甲基苄肼)、长春新碱、长春碱、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、戊聚醣聚硫酸酯、血小板因子4、血管阻断素(Angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、撒利多胺剂或SP-PG等。其它化学治疗剂包括烷烃化剂如包括二氯甲基二乙胺、左旋溶肉瘤素、苯丁酸氮芥、环磷酰胺和异环磷酰胺的氮芥；包括卡莫斯汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星的亚硝基脲；包括白消安的烷基磺酸盐；包括decarbazine的三嗪；包括硫替派和六甲基三聚氰胺的乙基烯亚胺(ethyenimine)；包括甲氨蝶呤的叶酸类似物；包括5-氟尿嘧啶、胞核嘧啶阿拉伯糖苷的嘧啶类似物；包括6-颈基嘌呤和6-硫鸟嘌呤的嘌呤类似物；包括抗霉素D的抗肿瘤抗生素；包括链霉菌、博来霉素、丝裂霉素C和methramycin的蒽环类药；包括它莫西芬和cortiosteroids的激素和激素拮抗药、以及包括顺氯氨铂和布喹那的其他试剂。
可以在给药具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的一个或多个化合物之前，将根据本发明待治疗的生理系统(例如肝系统、胰腺系统)通过外科手术或在外科手术期间隔离出来。
药物和/或治疗性制剂根据本发明，当用于治疗疾病时，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以单独给药。另外，该化合物可以作为药物制剂给药，该药物制剂包含至少一种具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物和/或其金属离子络合物。具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物还可以以药学上可以接受的盐的形式存在。
在合理的医学判断的范围内，药学上可以接受的盐是指适用于与人类和低级动物的组织接触而没有不适当的毒性、过敏、变态反应等，且与合理的益处/风险比相称的盐。药学上可以接受的盐为本领域所公知。
例如，根据本发明的PKIH和DpT类似物的合适的药学上可以接受的盐可以通过将药学上可以接受的酸如盐酸、硫酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、硫酸、乙酸、草酸、碳酸、酒石酸或柠檬酸与本发明的化合物接触来制备。因此，本发明化合物的合适的药学上可以接受的盐包括酸加成盐。
例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Science，1977，661-19中详细描述了药学上可以接受的盐。该盐可以在本发明化合物的最后分离和纯化中原位制备，或通过自由碱官能与合适的有机酸反应。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐(aspirate)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑盐(camphorate)、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙基磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙基磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲基磺酸盐、2-萘基磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、pamoate、果胶酯酸盐、过二硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等、以及非毒性铵、季铵、和胺阳离子，其包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
方便的给药模式包括注射(皮下、静脉等)、口服给药、吸入、经皮肤施用或直肠给药。取决于给药路径，类似物可以用物质涂敷以保护类似物不受可能破坏类似物治疗活性的酶、酸和其他中性条件的作用。化合物还可以非肠道或腹膜内给药。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油类中制备。在普通的储存和应用条件下，药物制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射的药物组合物包括用于无菌可注射溶液或分散液临时制备的无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和无菌粉末。理想地，该组合物在制造和储存条件下保持稳定，同时也可以包括防腐剂以稳定组合物不受微生物如细菌和真菌的污染作用。
例如，在一个优选的方案中，化合物与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服给药。化合物和其他成分可以封入硬或软壳的凝胶胶囊中、压制成片或直接加入个人饮食中。对于口服治疗给药，类似物可以与赋形剂结合，以可吸收药片、口腔药片、片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、饼状等的形式应用。适合地，这种组合物和制剂可以含有至少1wt％的活性化合物。药物组合物和制剂中具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的PKIH或DpT类似物的比例当然可以变化，例如，可以很方便地在剂量单位重量的约2％-约90％、约5％-约80％、约10％-约75％、约15％-约65％、约20％-约60％、约25％-约50％、约30％-约45％或约35％-约45％的范围内变化。
术语“药学上可以接受的载体”旨在包括溶剂、分散介质、涂敷层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收缓释剂等。这种药学活性物质的介质和试剂的应用是本领域所公知的。除了与类似物不相容的任何常规介质活试剂外，己考虑在治疗组合物和治疗方法中使用它们。辅助性活性化合物也可以引入本发明的组合物中。为便于给药和剂量的一致，特别有利的是配制剂量单位形式的注射用组合物。此处所用的剂量单位形式指的是用于待治疗个体的、适用于单一剂量的物质上单个的单位；结合所需要的药物载体，并计算含有预计数量的类似物的每一单位以获得所期望的治疗效果。本发明的新型剂量单位形式的规格直接取决于(a)类似物的独特的性质和要取得的特定治疗效果，和(b)现有技术中所固有的化合这种用于治疗个人增殖性疾病、与铁相关的生理情况或铁过载失调的类似物的限制。以能与合适的药学上可以接受的载体一起，以有效量便利和有效地给药为目的化合主要的类似物。对于含有辅助性活性成份的组合物，给药剂量通过参考所述成份的常用剂量和给药方式进行确定。
在一个实施方案中，载体是口服给药的载体。在另一个实施方案中，载体适用于静脉给药。
药物组合物的一个合适的形式是配制为适用于口服给药的肠溶颗粒、片剂，或胶囊的剂量形式。
对于可注射溶液，载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及它们合适的混合物和植物油。例如，可以通过例如使用例如卵磷脂的涂敷层，及通过保持分散液中所要求的粒径和使用表面活性剂来维持合适的流动性。可以通过加入各种抗细菌和/或抗真菌剂来防止微生物的作用。合适的试剂是本领域技术人员所公知的，包括例如苯甲酸酯类(parabens)、氯代丁醇、苯酚、苯甲醇、抗坏血酸、乙汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，其优选在组合物中包括等张试剂，例如糖、多元醇包括甘露醇，山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和凝胶来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的类似物加到带有上述列举的成份中的一个或其组合的合适溶剂中，然后过滤杀菌来制备。通常，分散液是通过将类似物加到含有基本分散介质和其他上述所列举的所需要的成份的无菌赋形剂中来制备。
药片、片剂、丸药、胶囊等还可以含有下列物质粘合剂如树胶gragacanth、阿拉伯树胶、玉米淀粉或凝胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等的；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂如薄荷油、冬青油或樱桃调味料。当剂量单元形式是胶囊时，除了上述类型的物质，其可含有液体载体。其他各种材料可以作为涂敷层形式存在或来改变剂量单位的物理形式。例如，药片、药丸或胶囊可以用虫胶、糖或两者共同涂敷。糖浆或洒剂可含有类似物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的甲基和丙基苯甲酸酯类、染料和例如樱桃或橙味的调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学上纯净的，或其所使用的量上应该是基本无毒的。另外，具有通式1、2、3和4的化合物可以引入到持续释放的制品或制剂中。
药物组合物还可以包括合适的缓冲液以使得酸水解最小化。合适的缓冲试剂是本领域技术人员所公知的，包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐和其混合物。
可以对根据本发明的药物组合物进行单次或多次给药。本领域技术人员能够通过常规实验来确定根据本发明的化合物和/或组合物的有效的无毒性剂量水平以及该化合物和组合物用于治疗失调或疾病的合适的给药模式。
而且，对于本领域技术人员，可通过使用常规的治疗测定实验方案来确定最佳治疗方案，例如对于给定天数每天使用的本发明的化合物或组合物的剂量数，这一点是很显然的。
通常，每24小时的有效剂量可以在每千克体重约0.0001mg-1000mg的范围内；合适地，每千克体重约0.001mg-750mg；每千克体重约0.01mg-500mg；每千克体重约0.1mg-500mg；每千克体重约0.1mg-250mg；或每千克体重约1.0mg-250mg。仍合适地，每24小时的有效剂量可以在每千克体重约1.0mg-200mg的范围内；每千克体重约1.0mg-100mg；每千克体重约1.0mg-50mg；每千克体重约1.0mg-25mg；每千克体重约5.0mg-50mg；每千克体重约5.0mg-20mg；或每千克体重约5.0mg-15mg。
或者，有效剂量最高可达约500mg/m2。通常，有效剂量可以在约25-约500mg/m2的范围内，约25-约350mg/m2，约25-约300mg/m2，约25-约250mg/m2，约50-约250mg/m2或约75-约150mg/m2。
根据示例，根据本发明的合适的剂量形式包括如下药片具有通式1、2、3和4的化合物0.01-20mg，通常为0.1-10mg淀粉 10-20mg乳糖 100-250mg凝胶 0-5mg硬脂酸镁 0-5mg
可注射溶液具有通式1、2、3和4的化合物0.01-20mg，通常为0.1-10mg氯化钠8.5mg氯化钾3mg氯化钙4.8mg用于注射的水，加入到 10ml本领域技术人员应能理解可以对所展示的特定实施方案进行众多改变和/或修改，而不偏离的本发明所广泛描述的精神或范围。因此从各个所有方面来说，现有的实施方案应理解为示例性的而非限制性的描述。
现将根据特定实施例来更具体地描述本发明，这决不能理解为限制本发明的范围。
实施例1—化合物的合成对比性2-吡啶基-和喹啉基-芳酰基腙类似物，此处指的是“PCIH”和“QCIH”类似物，分别通过2-吡啶基羧基醛或2-喹啉基羧基醛与合适的酸酰肼进行希夫碱缩合合成。
对比性化合物吡哆醛异烟酰腙(PIH)和2-羟基-1-萘基醛异烟酰腙(311)通过理查森&伯恩哈特(Richardson & Bernhardt)(1999)方法合成。3PCIH、QCIH芳酰基腙系列的化合物和“311”的代表性结构在图1B和1C中提供。
实施例1a-PKIH类似物的合成代表性PKIH类似物通过2-二-吡啶基酮与合适的酸酰肼按照Bacchi等人(1996)的方法缩合进行合成13。合适的溶剂包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水、丙酮、苯、甲苯。代表性PKIH类似物的结构如图2B所示。
PKAH的X-射线晶体结构如图9所示。X-射线结晶数据如下所示。
晶体数据采集CAD-4软件(Enraf-Nonius，1989)；单元细化(cell refinement)CAD-4软件中SET4；数据简化Xtal(Hall等人；1992)；用于解决结构的程序SHELX86(Sheldrick，1990)；用于细化结构的程序SHELX97(Sheldrick，1997)；分子图解PLATON(Spek，1990)；用于创建结晶数据的软件SHELXL97。
在与D.R.Richardson，E.Becker和P.V.Bernhardt.(1999)所描述的相同的常规条件下进行数据采集。
结构测定的晶体数据和详情PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2晶体数据分子式C18H16N5O，O分子量334.36晶体系统三斜晶系空间群P-1(No.2)a，b，c[埃] 8.667(2)9.977(2)11.197(2)α，β，γ[deg] 91.010(10)109.20(2)109.63(2)V[Ang**3]852.2(3)Z 2D(calc)[g/cm**3] 1.303F(000)350Mu(MoKa)[/mm] 0.1对于PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2的最终结构因子计算1.s.参数的总数目＝240最大矢量长度＝511所要求的存储＝2380/22995wR2＝0.1767对于2985数据和0/240参数在周期21前GooF＝S＝0.987；对于0抑制，抑制的GooF＝0.987重量＝1/[δ^2(Fo^2)+(0.10000*P)^2+0.00*P]其中P＝(Max(Fo^2)+2*Fc^2)/3对1497Fo＞4sig(Fo)R1＝0.0503对所有2985数据为0.1265wR2＝0.1767，GooF＝S＝0.987，对于所有数据抑制的GooF＝0.987
C1-距离 键角N1 1.3378(0.0036)C2 1.3775(0.0042) 122.49(0.27)C6 1.4967(0.0038) 116.20(0.26)121.26(0.27)C1- N1 C2C2-距离 键角C3 1.3738(0.0042)C1 1.3775(0.0041) 119.20(0.31)C2- C3C3-距离 键角C4 1.3623(0.0049)C2 1.3738(0.0042) 118.91(0.33)C3- C4C1-距离 键角C3 1.3623(0.0049)C5 1.3668(0.0047) 118.81(0.31)C4- C3距离 键角N1 1.3420(0.0038)C4 1.3668(0.0047) 123.65(0.32)C5- N1C6-距离 键角N3 1.2972(0.0033)C7 1.4777(0.0039) 128.71(0.25)C1 1.4967(0.0038) 111.31(0.24)119.98(0.24)C6- N3 C7C7-距离 键角N2 1.3265(0.0037)C8 1.3871(0.0040) 121.37(0.28)C6 1.4777(0.0039) 117.66(025)120.96(0.27)C7- N2 C8CS-距离 键角C9 1.3698(0.0044)C7 1.3871(0.0040) 119.81(0.31)C8- C9
C9-距离 键角C101.3489(0.0050)C8 1.3698(0.0044) 119.27(0.33)C9- C10C10- 距离 键角C9 1.3489(0.0050)C111.3641(0.0052) 117.97(0.35)C10- C9C11- 距离 键角N2 1.3423(0.0041)C101.3641(0.0052) 124.54(0.36)C11- N2C12- 距离 键角O1 1.2202(0.0032)N4 1.3690(0.0034) 120.54(0.27)C131.4649(0.0039) 122.80(0.26)116.56(0.25)C12- 01 N4C13- 距离 键角C141.3913(0.0038)C181.3927(0.0038) 116.65(0.26)C121.4649(0.0039) 124.91(0.25)118.42(0.26)C13- C14 C18C14- 距离 键角C151.3794(0.0039)C131.3913(0.0038) 121.52(0.26)C14- C15C15- 距离 键角C141.3794(0.0039)C161.3878(0.0040) 120.80(0.28)C15- C14C16- 距离 键角N5 1.3677(0.0035)C151.3878(0.0040) 121.49(0.28)C171.3939(0.0040) 120.60(0.27)117.90(0.27)C16- N5 C15C17- 距离 键角C181.3592(0.0040)C161.3939(0.0040) 120.71(0.27)C17- C18C18- 距离 键角C171.3592(0.0040)C131.3927(0.0038) 122.40(0.27)C18- C17
N1- 距离键角C11.3378(0.0036)C51.3420(0.0038) 116.87(0.28)N1- C1N2- 距离键角C71.265(0.0037)C11 1.3423(0.0042) 117.02(0.28)N2- C7N3- 距离键角C61.2972(0.0033)N41.3639(0.0030) 119.64(0.23)N3- C6N4- 距离键角N31.3639(0.0030)C12 1.3690(0.0034) 118.10(0.23)N4- N3N5- 距离键角C16 1.3677(0.0035)N5-O1- 距离键角C12 1.2202(0.0032)O1-非氢原子的最终配位和相当的各向同性位移参数PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2原子xy z C(cq)[Ang^2]---- --- ------------------O11.047850.751270.333470.0701N10.495280.32443 -0.063960.0535N20.583970.301480.328300.0725N30.809110.499270.213550.0479N40.844960.542220.339160.0501N51.032850.904640.881110.0752C10.659000.354660.017700.0462C20.797350.370320.002257 0.0553C30.768800.36059 -0.151130.0668C40.603650.33400 -023528 0.0672C50.471530.31568 -0.188900.0628
C60.686020.377020.156700.0462C70.576700.266720.211160.0511C80.473170.130760.142860.0639C90.374510.029950.196070.0772C10 0.382490.063720.315680.0877C11 0.487700.199000.377910.0969C12 0.964660.677140.393120.0484C13 0.978350.728800.520830.0444C14 0.886210.648560.592430.0544C15 0.903290.705900.711130.0582C16 1.012580.846890.762760.0541C17 1.104770.927900.691230.0615C18 1.087990.869700.574890.0577O20.853770.765040.058420.0756U(eq)＝正交U张量线迹的1/3实施例1b-DpT类似物的制备使用标准方法(Johnson等人，1982)，DpT类似物通过2-二-吡啶基酮分别和硫代氨基脲或酸酰肼14经希夫碱缩合来合成。用于该反应的合适的溶剂包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水、丙酮、苯、甲苯。
代表性DpT类似物的结构如图2A所示。
实施例1c—铁络合物的制备PKIH类似物的铁络合物使用由理查森&伯恩哈特，19993描述的技术制备。通常，1摩尔当量的Fe(III)盐与2摩尔当量的PKIH类似物在热乙醇中回流1小时。形成暗绿色/黑色络合物固体，通过减压过滤将其从母液中分离出。然后用乙醇洗涤络合物，空气干燥。
DpT类似物的铁络合物用类似的方法制备。
实施例2-PCIH、QCIH和PKIH类似物的亲脂性和活性比较对所有的螯合剂，亲脂性以平均log P的值(正辛醇-水分配系数)进行测量。根据Broto’s方法(Broto等人，1984)15、Crippen’s碎裂方法(Ghose & Crippen，1987)16或使用Chem Draw Pro.(v.4.5，CambridgeSoftware，1997)的Viswanadhan’s碎裂方法(Viswanadhan等人，1987)17估算log P的值(表1)。然后将这些数值的平均值(平均计算的log P的值；表1)对IC50值或螯合剂诱发59Fe转移或防止59Fe吸收的能力作图。这些点线图表明在测试的化合物的亲脂性和抗增殖活性或Fe螯合效力之间没有较强的相关性(所有的相关性r＜0.52)(未显示数据)。
表1计算的正-辛醇分配系数(log Pcalc)
*不能根据Broto’s方法计算**不能计算log Pcalc值使用Chem Draw Pro V4.5程序进行计算。
由于单个喹啉环的存在，对比性QCIH类似物是研究的化合物中亲脂性最强的(表1)。然而，QCIH系列的铁螯合效力和抗增殖活性很低(参见实施例3a、3b和4a)。
体外和体内研究对实施例3-10通用方法学DFO从Novartis(Basel，Switzerland)购得。
311根据标准方法制备3。
Triapine(3-氨基吡啶-2-羧基醛硫代缩氨基脲；图1B)为VionPharmaceuticals，NJ，USA.的赠品。
化合物的展示所有的化合物在即将开始实验之前溶解在二甲基亚砜(DMSO)中作为10mM的储备液，然后在10％胎牛血清(FCS；CommonwealthSerum Laboratories，Melbourne，Australia)中稀释，使得最终DMSO的浓度等于或小于0.5％(v/v)。
细菌培养液的制备人类SK-N-MC神经上皮瘤细胞株、SK-Mel-28黑素瘤细胞和MCF-7乳癌细胞从American Type Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA购得。正常的细胞类型MRC-纤维原细胞和L8大鼠骨骼肌细胞也从American Type Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA购得。细胞在Eagle’s改良的最低必需培养基(MEM；Gibco BRL，Sydney，Australia)中生长，该培养基含有10％FCS(Commonwealth Serum Laboratories，Melbourne，Australia)、1％(v/v)非必需氨基酸(Gibco)、2mM L-谷氨酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)、100μg/ml链霉素(Gibco)、100U/ml青霉素(Gibco)和0.28μg/ml两性霉素B(SquibbPharmaceuticals，Montreal，Canada)。该生长介质随后称之为“完全培养基”。细胞在孵育器(Forma Scientific，OH，USA)中在37℃下在5％CO2/95％空气的潮湿空气中生长和次培养。使用相控制显微镜和台盼蓝染色来仔细评估细胞的生长和活力。
MTT细胞增殖分析通过与前述基本相同的方法18，使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)分析来检查细胞增殖。细胞以15,000个细胞/孔接种到96-孔微滴定板中，该滴定板在0.1mL含有上述2.2部分所描述的所有补充物(完全培养基)和1.25μM人类二铁转铁蛋白的MEM培养基中。该接种密度造成了分析期间细胞的指数式生长。将细胞过夜生长，然后将待测试化合物加入0.1mL含有1.25μM二铁转铁蛋白的完全培养基中。化合物的最终浓度为0.39-50μM。对照样品含有完全培养基和1.25μM二铁转铁蛋白。细胞与化合物在37℃下在含有95％空气和5％CO2的潮湿气氛中培育90小时。培育后，向每个孔中加入0.01mL的MTT，将板在37℃培育2小时。然后通过加入在0.01M HCl中的0.1mL的10％SDS-50％异丁醇溶解细胞，然后将板在扫描多孔分光光度计(Titertek Multiscan；Beckman Instruments Inc.，California)570nm下读数。MTT的颜色形成与存活细胞的数目直接成比例。MTT分析的结果表示为对照值的百分数。
统计使用Student′s配对t检验来比较实验数据。当p＜0.05时，认为结果是有统计学意义的。结果表示为2-5个独立实验的平均值或平均值±标准偏差(SD)。
实施例3—铁转移/吸收实验用59Fe标记转铁蛋白使用Richardson & Baker，1992所描述的标准步骤用59Fe(为0.1MHCl中的氯化铁，Dupong NEN，MA，USA)制备和标记脱铁转铁蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，进而制得59Fe-转铁蛋白(59Fe-Tf)。
实施例3a—PCIH、QCIH和PKIH类似物对从预标记的SK-N-MC神经上皮瘤细胞中的Fe转移的影响的比较方法学铁转移分析使用标准步骤来研究螯合剂对从预标记的细胞中59Fe释放的影响18。细胞用59Fe-转铁蛋白(0.75μM)在37℃预标记3小时。然后将细胞置于冰上，并用冷却的BSS洗涤4次，然后在只存在培养基(对照)或者在含有DFO(100μM)或其他化合物(50μM)的培养基中在37℃再培育3小时。移出上层培养基，并将其置于γ-计数管中。将细胞用塑料刮铲从1ml BSS中的皮氏培养皿中移出，转移到单独一套γ-计数管中。
通过比较其对DFO和相应的PCIH类似物的活性来分析QCIH和PKIH类似物的铁螯合效力。在3小时的标记期后，化合物从SK-N-MC神经上皮瘤细胞中转移59Fe的能力用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃进行分析。然后将细胞洗涤，在存在和不存在内标DFO(100μM)或其他50μM螯合剂下，在37℃再培育3小时(图3和图4)。由于DFO从细胞中转移59Fe和防止从59Fe-Tf吸收铁的效力低，所以使用浓度为100μM的DFO。
通常，与相应的PCIH对照化合物相比，PKIH系列显示出相似或更强的从预标记细胞中转移59Fe的能力(图3A)。PKIH和PCIH组之间活性的最大差别是在比较这些系列(参见表1)即PCAH和PKAH或PCHH和PKHH之间更具亲水性化合物时发现的。
通常，对比QCIH类似物的行为与PCIH或PKIH类似物的方式不相似，前者在诱发59Fe转移方面显示出低活性(图3B)。QCIH系列的最有效的螯合剂是母体化合物QCIH，其显示出与PCIH相当的细胞59Fe转移(图3B)。
分析这三组化合物的59Fe转移数据表明PKIH系列的二吡啶基取代基能赋予螯合剂高的铁螯合活性，而与酰肼取代基无关(图3A)。相反，在化合物的对比QCIH系列中单个喹啉环的存在导致低的铁螯合活性(图3B)。
实施例3b—PCIH、OCIH和PKIH螯合剂对从59Fe标记的转铁蛋白中进行细胞铁吸收的影响的比较方法学铁吸收分析使用标准步骤18来研究PKIH类似物抑制细胞从59Fe-Tf中吸收59Fe的能力。SK-N-MC细胞在含有59Fe-Tf(0.75μM)和或者为DFO(100Mm)或者为PCIH、QCIH或PKIH系列(50μM)的化合物的培养液中在37℃培育3小时。然后将细胞置于冰上，用冰冷汉克斯平衡盐溶液(BSS)洗涤四次以除去非特异性结合的59Fe-Tf。然后在4℃下将细胞与常用的蛋白酶、链霉蛋白酶(1mg/ml)培育30分钟以除去膜结合的59Fe和Tf。
所有的PKIH类似物在抑制从59Fe-Tf中吸收59Fe方面都非常有效(图4A)。特别地，PKAH和PKHH配体显示出显著的活性，而相应的对照PCIH类似物、PCAH和PCHH显示出很小的影响(图4A)。通常，QCIH配体与PCIH和PKIH类似物相比，在防止从59Fe-Tf中吸收59Fe方面效果较差。
实施例3c-PKIH浓度对细胞铁转移和从转铁蛋白中进行铁吸收的影响方法学铁转移分析将PKIH类似物对59Fe转移的效力作为化合物浓度的函数进行评价(图5A)。细胞用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃预标记3小时、洗涤、然后用一定浓度范围内(0.5-50μM)的PKIH化合物在37℃培育3小时。
类似地，通过将PKIH类似物(0.5-50μM)与59Fe-Tf(0.75μM)在37℃培育3小时、然后洗涤细胞来评价螯合剂浓度对从59Fe-Tf中进行59Fe吸收的效力(图5B)。PCTH作为内对照物使用。
在浓度小于10μM时，PKIH、PKTH和PKBH比PCTH在转移细胞59Fe方面更有效(图5A)。例如，在浓度为1μM时，PKTH释放了26％的细胞59Fe，而PCTH只释放了10％(图5A)。类似地，PKIH、PKBH和PKTH比对照的PCTH在防止从59Fe-Tf中吸收59Fe方面有更高的效力(图5B)。更亲水性的配体PKAH和PKHH(表1)在59Fe吸收和59Fe转移分析中显示出较低的效力。
实施例3d-DpT类似物对从预标记的SK-N-MC神经上皮瘤细胞中铁转移的影响方法铁转移分析使用标准步骤用59Fe(Dupong-NEN，MA，USA)标记脱铁转铁蛋白(δ)以制备59Fe转铁蛋白(59Fe-Tf)18。细胞用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃预标记3小时、洗涤、然后与螯合剂(25μM；图11A)在37℃培育3小时。DFO和311作为内标物使用。
分析了DpT类似物从SK-N-MC细胞中直接转移59Fe的能力(图11A)。DpT和Dp2mT造成全部细胞59Fe 6-7％的流出，而只用培养液再培育的对照细胞释放了59Fe的5％(图11A)。由于在硫代缩氨基脲的2-位置存在的甲基基团阻碍了铁的螯合，化合物Dp2mT起阴性对照的作用。DFO只造成11％细胞59Fe的转移(图11A)。其他所研究的DpT化合物比DFO在转移59Fe方面显著增强(p＜0.0001)，会导致37-47％细胞59Fe的释放(图11)。Dp44mT是最有效的，会导致47％59Fe的释放(图11)。DpT类似物在诱发59Fe流出的效力与其抗肿瘤的活性充分相关(实施例4d，表3)。
实施例3e-DpT类似物对由SK-N-MC神经上皮瘤细胞从59Fe标记的转铁蛋白中进行细胞铁吸收的影响方法学铁吸收分析使用标准步骤研究了DpT类似物在抑制从59Fe-Tf中细胞吸收59Fe的能力18。通过与常用的蛋白酶、链霉蛋白酶(1mg/ml)在4℃培育30分钟，再除去膜结合的59Fe和Tf来测定被细胞内在化的59Fe的量。
在不存在或存在一定范围的DpT类似物(25μM)下、在3个小时内和在37℃下研究DpT类似物抑制SK-N-MC细胞从59Fe-Tf(0.75μM)中吸收59Fe的能力(图11B)。与其转移59Fe的低能力一致，DpT和D2mT在防止59Fe吸收方面影响很小。研究的最有效的化合物，包括311和Dp44mT，限制59Fe吸收为对照的5-9％，它们的活性远大于(p＜0.0001)DFO(图11B)。这些结果与这些配体转移细胞59Fe的能力一致(图11A)。测试的所有DpT类似物(除了DpT和Dp2mT)在防止细胞从59Fe-Tf中吸收59Fe方面显示出比DFO大的多的效力。
已表明，DpT类似物抑制肿瘤细胞生长的能力(表3)与其诱发59Fe释放(图11A)和防止59Fe吸收(图11B)的效力相关。Dp44mT、Dp4mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT的Fe螯合活性远大于DFO调节的Fe螯和活性。
实施例3f-Dp44mT对从Tf中进行吸收铁和从M109细胞中进行转移铁的影响评价了化合物Dp44mT抑制小鼠中M109肺癌细胞生长的能力。使用培育的M109肺癌细胞来开展研究，确定Dp44mT对从这些细胞中转移59Fe(图11C)和抑制从59Fe-Tf中吸收59Fe(图11D)的影响。作为内对照，用DFO和311来培育细胞。通过在37℃用59Fe-Tf(0.75μM)标记细胞3小时、随后分别用化合物(0.2-25μM)洗涤、在37℃再培育3小时来研究化合物浓度对提高从M109细胞中的59Fe转移的影响(图11C)。DFO是所研究的化合物中效力最差的，在25μM时仅从细胞中释放出12±1％的59Fe，而对照介质释放了8±1％(图11C)。相反，5μM311将细胞59Fe的释放从8±1％(对照介质)提高到60±1％(图11C)。对于Dp44mT，59Fe的释放在2μM时达到稳定，会导致48±2％的59Fe的流出(图11C)。
在抑制M109细胞从59Fe-Tf(0.75μM)中细胞进行59Fe的吸收方面，化合物311是研究的化合物中最具有活性的(图11D)。在1μM时，311将59Fe的吸收减少到对照的40±4％。相反，DFO几乎没有影响。Dp44mT在浓度为5μM时具有与311类似的活性，这时其将59Fe的吸收减少到对照的30±1％(图11D)。
实施例4—体外细胞增殖的抑制实施例4a-PKIH类似物对SK-N-MC神经上皮瘤细胞增殖的影响方法学细胞增殖分析研究了化合物PCIH、QCIH和PKIH系列对SK-N-MC神经上皮瘤细胞系的增殖的影响(表2)。使用MTT分析(如上所述)研究了化合物对SK-N-MC神经上皮瘤细胞的增殖的影响。MTT颜色形成与台盼蓝染色测量的存活细胞的量直接成比例。在所有的实验中，使用化合物311和DFO作为相关的内对照。
表2使用MTT分析，Fe螯合剂化合物PCIH、QCIH和PKIH系列对SK-N-MC神经上皮瘤细胞的增殖的影响
数据表示为4次实验的平均值±SD。
细胞的形态外观和细胞数量的明显降低表明PKIH类似物的细胞毒性是的很明显。PKIH类似物即使在非常低的螯合剂浓度时也显示出很高的抗增殖活性(表2)。化合物PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH显示出与311非常相似的抗增殖活性(表2)。
与PKIH类似物形成对比，对比的PCIH和QCIH类似物对细胞增殖影响很小(表2)。PCIH和QCIH系列的所有化合物的IC50值为40μM至大于50μM。这些结果与通过相衬显微镜方法和台盼蓝染色方法所得到的细胞形态高度一致，表明PCIH和QCIH系列的化合物显示出很小的细胞毒活性。
实施例4b—PKIH类似物的Fe(III)络合物对SK-N-MC神经上皮瘤细胞增殖的影响进行实验以确定当与Fe(III)络合时PKIH类似物在抑制SK-N-MC细胞增殖方面是否有效。螯合剂与Fe的摩尔比为1∶1和2∶1时，所有的PKIH-Fe络合物显示出与自由配体相似的抗增殖活性水平(数据未显示)。作为同一个研究中的相关对照，也制备和分析了311对Fe络合物比为1∶1和2∶1的化合物。311的Fe络合物在浓度高达50μM时对增殖没有显著的影响(数据未显示)。
实施例4C—PKIH类似物对纤维原细胞和SK-N-MC神经上皮瘤细胞增殖的影响的比较研究了PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH对SK-N-MC神经上皮瘤细胞和MRC-5纤维原细胞的生长的影响(图6)。MRC-5细胞类型是正常的人类肺部纤维原细胞株，其会凋亡并在数次体外传代后开始衰老。SK-N-MC神经上皮瘤细胞类型是无限生长分化的。PKIH类似物抑制增殖的影响在SK-N-MC细胞中比在纤维原细胞中增加了。例如，当PKIH类似物在SK-N-MC细胞中的IC50值为1-3μM时(表2)，PKBBH、PKBH、PKTH和PKIH的IC50值在纤维原细胞中分别为8、11、16和＞25μM。
实施例4d—DpT类似物对SK-N-MC神经上皮瘤细胞增殖的影响评价了DpT类似物(图2A)抑制SK-N-MC神经上皮瘤细胞增殖的能力(图10)。将化合物(0-25μM)与细胞培育72小时，在培育期末时，通过MTT分析来测定细胞密度，如上所述。Dp2mT作为阴性对照。通过使用MTT分析获得的数据与通过光显微镜估计的细胞数量直接相关。
Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT显示出非常高的抗增殖活性(IC50＝0.03-0.06μM；表3)。这些DpT类似物的活性比DFO(IC50＝5μM)大的多(p＜0.0001)，也比其它Fe螯合剂如311具有更大的效力(IC50＝0.3μM；表3)。与已有的在SK-N-MC细胞中的细胞毒性剂-链霉菌的抗增殖活性(IC50＝0.02μM；表3)相比，Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT具有相似的效力。铁螯合剂Triapine(图1B)比上述的DpT类似物的活性低(IC50＝0.26μM；表3)。Dp4mT也显示出对SK-N-MC细胞的相当的活性，与Triapine相当，其IC50值为0.19μM(表3)。
表3Fe螯合剂对瘤形成细胞和正常细胞的细胞增殖的影响
结果为平均值±SD(至少5次实验)。
*没有获得数据也评价了DpT类似物对SK-Mel-28黑素瘤和MCF-7乳癌细胞系的抑制(表3)。由于2-位置的甲基基团阻碍Fe-螯合，将Dp2mT作为阴性对照。化合物Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT中的每一个在抑制SK-Mel-28黑素瘤和MCF-7乳癌细胞的增殖方面比DFO更具有活性(p＜0.0001)(表3)。在对抗这些细胞系方面，Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT的活性最高(IC50＝0.06-0.10μM；表3)，当评价所有的瘤形成细胞类型时，Dp44mT是最有效的抗增殖剂。总之，活性DpT类似物的效力比311和Triapine的效力强，也比针对阿霉菌的好(表3)。显著地，与Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT对无限生长分化的瘤形成细胞的明显的抗增殖活性相比，这些化合物对会凋亡的MRC-5纤维原细胞的增殖表现出令人惊讶的低效力(IC50值＞25μM)(图10和表3)。
实施例4e—对一系列细胞类型的增殖抑制的比较化合物311、DFO、DOX、PKIH、PKTH、Dp44mT、Dp4eT和Dp4pT(0-50μM)与细胞培育72小时。在培育期结束时，通过MTT分析来测定细胞密度(如上所述)。结果如表4所示。
表4— Fe螯合剂对一系列瘤形成细胞如H69AR肺癌、IMR-32神经上皮瘤、HEP G2肝细胞瘤、DU145前列腺癌和NCI h2452间皮瘤细胞系细胞增殖的影响
^1次实验；*2次实验的平均值±SD；#3次实验的平均值±SD分析了更有效的化合物对一系列肿瘤细胞系的抗增殖活性，该肿瘤细胞系衍生自多个迅速蔓延的癌症。在这些实验中，DFO和311用作适当的标准。另外，这些研究包括了细胞毒性剂链霉菌(DOX)，其在目前的临床应用中是最有效的抗肿瘤剂之一。研究的效力最差的螯合剂是内部标准DFO，其是目前临床应用中用于治疗铁过载疾病的药物。研究的最有效的化合物包括3个DpT类似物，即Dp44mT、Dp4eT和Dp4pT。明显地，这些DpT类似物在一些癌细胞系中的活性比DOX的活性更明显。例如，在肝细胞瘤细胞系HepG2中，Dp4eT的IC50为0.02μM，其比DOX的相应值(2.61μM)少10倍多。PKIH类似物PKIH和PKTH的活性也很明显，与311相类似，比DOX的效力稍差。重要的是，DpT和PKIH类似物的作用机理和DOX的差别很大，因此可以用于对抗耐DOX的癌细胞类型。
实施例5—M109肺癌生产的体内剂量依赖型抑制一般方法学测定CD2F1杂交小鼠中的最大可容忍剂量BALB/c和DBA/2小鼠从Animal Resources Centre(Universit ofNew South Wales(UNSW)，Sydney，Australia)获得，杂交获得CD2F1动物(使用的所有步骤由Animal Ethics Committee，UNSW批准)。随意给每组8只雌性CD2F1小鼠(8-10周大)的多个组喂食和饮水，并通过尾静脉注射所研究化合物0.9％无菌生理盐水的30％丙二醇溶液，每天两次，每次间隔6小时，每周5天，注射两周。最大可容忍剂量定义为使30％的实验小鼠死亡或者使体重减小超过10％的剂量。19通过体内铁螯合剂抑制M109肺癌细胞的生长8-10周大的雌性CD2F1小鼠用1×105M109细胞进行sc植入。通过将肿瘤制成糊、并通过sc注射使肿瘤细胞进入CD2F1小鼠中20。Dp44mT溶解在生理盐水的30％(v/v)丙二醇中，在肿瘤植入4天后静脉注射，每天2次，注射5天，随后是不对动物进行注射的为期2天的“休息期”。肿瘤植入后的第12天，用甲氧氟烷和进行心脏穿刺将小鼠处死。使用西森美康血球计数器(Sysmex Blood Couner)(Prince ofWales Hospital，Sydney，Australia)测量血液指数和红血球指数。记录在处理期间小鼠体重的变化。称重并固定肿瘤以进行组织学检查。实验组由8只小鼠组成用于对照和每次处理(表5)。
图12A显示了在从第4天起每天2次静脉注射连续5天后0.15、0.3和0.4mg/kg Dp44mT(MTD＝0.4mg/kg)对肿瘤生长的影响。作为相关的正对照，给动物施用MTD(6mg/kg)的Triapine。在肿瘤细胞植入后的第12天测量肿瘤的重量。
表5.只用赋形剂(对照)、Dp44mT(0.15、0.3和0.4mg/kg)或Triapine(6mg/kg)处理的小鼠体重减轻和血液指数
结果为平均值±SEM(3次独立的实验)。实验组由8只小鼠组成用于对照和每次处理。
以剂量依赖型的方式给药Dp44mT抑制了肿瘤的生长(图12A)，在0.4mg/kg时将肿瘤重量减至对照值的47％(p＜0.01)。与用Dp44mT处理的动物相比，对照组的小鼠体重减轻或白细胞数没有明显的差别(表5)。然而，与对照相比，在用Dp44mT处理的动物中在其MTD(0.4mg/kg)时观察到血红蛋白、血球容积、白细胞和血小板数量的轻微(p＜0.05)降低，但更低剂量时没有观察到(表5)。给药0.15和0.3mg/kg的Dp44mT提高了血小板数(表5)。Triapine比Dp44mT更有效，将肿瘤的重量明显地(p＜0.001)减至对照的10％(图12A)。然而，与Dp44mT相反，在其MTD(6mg/kg)时的Triapine明显和显著地(p＜0.0001)减轻了动物体重、血红蛋白浓度、血球容积、红血球和白血球数(表5)，表明在该条件下，Triapine是全身毒性的。实施例6—PKIH类似物对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-亮氨酸和3H-尿苷结合的影响方法学3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-亮氨酸和3H-尿苷结合分析SK-N-MC细胞用选择的类似物培育20小时后，在37℃加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷嘧啶脱氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿苷2小时。用1mM在Ca(II)/Mg(II)-free PBS中的EDTA将细胞从96孔板中分离出，使用细胞收集器(Tomtec Harvester96，Linbrook，Queensland，Australia)收集并洗涤。在β-闪烁计数器(LKB Wallace，Turku，Finland)上测量放射性。
实施例6a—PCIH、QCIH和PKIH系列化合物对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的影响PKIH系列化合物对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的影响与相应的PCIH和QCIH、以及作为相关对照的DFO和311对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的影响进行比较(表6)。
表6PCIH、QCIH和PKIH系列化合物对SK-N-MC神经上皮瘤细胞的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的影响
数据表示为4次实验的平均值±SD。
根据其抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的能力，PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH是最有效的化合物，显示出与核糖核酸还原酶抑制因子311相类似或略强的活性(表6)。实际上，在用PKIH类似物处理的细胞中，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的水平几乎观察不到。例如，PKBBH将3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合减少至对照的0.02％(表6)。数个更亲水性的PKIH类似物，即PKAH和PKHH(表1)显示出显著低的(p＜0.0001)活性，抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合分别至对照的23％和25％(表6)。然而，这些后述化合物的相对较低的抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的效力不能仅仅归因于其亲水性，因为该系列的大多数亲水性类似物(PKIH；表1)具有非常高的活性(表6)。
与311和PKIH类似物相比，QCIH类似物在抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合方面显示了相当低的活性，其将结合减小为对照的41-83％。
实施例6b—PCIH和PKIH系列化合物对3H-亮氨酸和3H-尿苷结合的影响的比较考虑到PKIH系列类似物对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的显著影响，也分析了这些化合物对3H-亮氨酸(表7)和3H-尿苷(表8)结合的影响。获得的结果与PCIH系列的类似物进行比较，其显示出较高的Fe螯合活性，但是较低的抗增殖影响。
表7PCIH和PKIH配体对SK-N-MC神经上皮瘤细胞的3H-亮氨酸结合的影响
数据表示为4次实验的平均值±SD。
表8PCIH和PKIH配体对SK-N-MC神经上皮瘤细胞的3H-尿苷结合的影响
数据表示为4次实验的平均值±SD。
抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷结合的最有效的PKIH类似物，即PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH，在防止3H-亮氨酸和3H-尿苷分别与蛋白质和RNA结合方面具有显著低(p＜0.0001)的效力(表7和表8)。而且，这些PKIH类似物具有比311显著低的(p＜0.001)对3H-亮氨酸结合的影响(表7)。通常，PKIH类似物比PCIH类似物在防止3H-亮氨酸或3H-赕苷结合方面更有效(表7和8)。PKBBH在抑制3H-亮氨酸或3H-尿苷结合方面具有最强的活性。
实施例7—PKIH类似物对WAF1和GADD45mRNA表达的影响方法学RNA印迹分析(Northern Blot Analysis)通过使用总RNA分离试剂(Advanced Biotechnologies Ltd，Surrey，United Kingdom)将总RNA分离出来进行RNA印迹分析。膜与人类WAF1、GADD45和β-肌动蛋白特异性探针杂交。WAF1探针由来自pSXV的1kb片断组成。GADD45探针由来自克隆入pHu145B2的人类GADD45cDNA(由National Cancer Institute，NIH，Maryland的Dr.AlbertFomace友情供应)的760bp片断组成。β-肌动蛋白探针由来自克隆入pBluescript SK-的人类β-肌动蛋白cDNA的1.4kb片断组成(ATCC；Cat.No.37997)。
分析了PKIH类似物对基因WAF1和GADD45的表达的影响，该基因编码对G1-S停滞必需的细胞循环抑制因子。内在对照DFO、PCBBH和311造成GADD45和WAF1mRNA表达的向上调节，而PCBH和PCIH显示出很小的效果(图7)。与其明显的抗增殖活性具有良好的相关性，PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH具有明确的影响，与对照相比，显著地(p＜0.0001)提高了GADD45和WAF1mRNA的水平。PKIH类似物在诱发WAF1和GADD45mRNA表达方面比311具有显著(p＜0.01)强的效力(图7)。
实施例8—Ndrg1mRNA表达的诱发MCF-7细胞与一系列金属离子螯合剂培育24小时。不能透过细胞膜的螯合剂EDTA(250μM)没有显示出抗增殖影响(IC50＞250μM)，并与更多的分别显示出低和高抗增殖活性的可渗透金属螯合化合物相比较。在MCF-7细胞中具有低抗增殖活性的化合物包括DFO(IC50＝20μM)、L1(去铁酮，IC50＝180μM)和二吡啶基(IC50＞250μM)，在25和250μM时分析了这些化合物。化合物311和dp44mT显示出对MCF-7细胞的高抗肿瘤效力(分别地，IC50＝0.6μM和0.1μM)，在25μM时对其进行了分析(图16)。青霉胺是一种公知的铜螯合剂，分析其用于比较。Dp2mT用作阴性对照。
在浓度为25μM时，DFO、青霉胺(PEN)、dp2mT、EDTA、二吡啶基和L1在向上调节Ndrg1方面没有影响(图16)。相反，311和dp44mT明显地提高了Ndrg1的水平(图16)。
实施例9—PKIH类似物对铁调节蛋白RNA-结合活性的影响方法学凝胶阻滞检测法使用已有技术用凝胶阻滞检测法来测量铁调节蛋白(IRP)和铁效应组件件(IRE)的相互作用。细胞与DFO(100μM)、FAC(100μg/ml)和PKIH类似物(25μM)在37℃培育20小时，制备了细胞溶解产物。然后用凝胶阻滞检测法检测IRP-RNA结合活性。数份含有2μg蛋白的细胞溶解产物与0.1ng(大约1×105cpm)的32P-标记的核糖在室温培育30分钟。使用该方案，加入的RNA水平达到饱和。通过与1U的RNAseT1在室温下培育10分钟来降解未保护的探针。然后加入肝素(5mg/ml)10分钟以除去非特异性结合。在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析IRE-蛋白络合物。在平行实验中，在加入IRE探针之前用氰铁酸盐(FeCN，5mM)和0.5％的β-巯基乙醇(β-ME)处理样品。该过程导致IRP1自发或非自发的转化成活性IRE-结合形式。22IRP-IRE机理是对应于Fe螯合的细胞铁体内平衡的重要调节剂。因此，测定了PKIH类似物对IRP-RNA-结合活性的影响(图8)。SK-N-MC细胞与螯合剂(25μM)在37℃培育20小时。在所有实验中，铁螯合剂DFO(100μM)、311(25μM)或铁供体柠檬酸铁铵(FAC；100μg/ml)用作相应的对照3，23。由于己知其能减少IRP-IRE的结合活性，因此PCAH用作进一步的对照。24在用DFO和311培育的细胞中出现了IRP-RNA结合的显著(p＜0.005)提高，而FAC和PCAH显著(p＜0.001)降低了RNA结合(图8)。与对照相比，细胞用PKIH系列处理后IRP-RNA结合活性显著(p＜0.01)提高(图8)，反应了其结合细胞铁库的能力。将β-巯基乙醇和FeCN加入到细胞溶解产物中显示与所有的螯合剂培育后IRP-RNA结合活性的总量没有变化(数据未显示)。
实施例10—凋亡的诱发实施例10a—小鼠的Dp44mT处理的肿瘤样品中增加的凋亡细胞和与Dp44mT培育后的培养的M109细胞中的凋亡研究使用流式细胞分析进行凋亡分析使用结合到易位血浆膜磷脂酰丝氨酸(PS)上的荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记的Annexin V，通过流式细胞分析(FACSCalibur，BectonDickinson，CA，USA)来检测凋亡的细胞25。加入碘化丙啶(PI)来识别细胞膜完整性的损失，其可指示坏死的细胞。
通过终端脱氧核苷酸转化酶介导的dUTP切口端标记(TUNEL)反应来分析DNA裂解26。使用原位TUNEL分析，用Dp44mT(0.4mg/kg)处理的动物肿瘤样品(图12B(ii))，与赋形剂处理的对照(图12B(i))相比，显示出凋亡细胞死亡增加的明显证据。为进一步研究Dp44mT诱发的凋亡途径，将培养的M109细胞用Dp44mT培育24小时，使用Annexin V-FITC和PI染色分别分析其凋亡和死亡。用Dp44mT处理后，在凋亡和死亡的细胞百分比上存在着剂量依赖型提高(图13A)。将细胞暴露在1μM的Dp44mT下会造成凋亡和死亡细胞的显著(p＜0.05)增加。该增加在Dp44mT的浓度为100μM时达到顶峰，此时产生由40±7％的凋亡细胞和27±3％的死亡细胞组成的群(图13A)。在与250μM的Dp44mT培育后，凋亡细胞数量减少至20±2％，死亡细胞群增加至42±6％，表明剂量依赖型细胞毒性。
由Dp44mT(1μM)诱发凋亡也是时间依赖型的(图13B)。用1μM的Dp44mT培育12小时后，检测到凋亡细胞(12±2％)的显著(p＜0.001)增加。因此，1μM Dp44mT显著促进了59Fe的释放(图11A，C)，抑制了59Fe的吸收(图11B，D)，并诱发了凋亡细胞的死亡(图13B)。
实施例10b—与Dp44mT培育后M109细胞中胱冬酶-3，8和9的蛋白水平和活性一般方法学抗体兔抗活性胱冬酶-3抗体、兔抗活性胱冬酶-8抗体和Annexin V荧光素异硫氰酸盐购自BD PharMingen(San Diego，CA，USA)。抗-全细胞色素c MoAb购自R&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。兔抗活性胱冬酶-9抗体、小鼠抗-Bcl-2和小鼠抗-Bax抗体购自Santa Cruz(SantaCruz，CA，USA)。小鼠抗鼠β-肌动蛋白抗体、辣根过氧化物酶共轭的抗兔和抗鼠IgG购自Sigma Chemical(St.Louis，MO，USA)。
胱冬酶活化和活性分析培养的M109细胞用或不用Dp44mT(1μM)在37℃处理0-48小时。将细胞溶解27，胱冬酶活性用BD ApolertTM胱冬酶分析板(BDBiosciences，San Diego，CA，USA)测定。细胞可渗透的pancaspase-3、-8和-9抑制因子(BD Biosciences)用作抑制对照。
为确定胱冬酶活化在M109细胞中的Dp44mT诱发的凋亡中的作用，测定了活性胱冬酶-3，8和9的蛋白水平及其酶活性(图14C，D)。用Dp44mT(1μM)的2小时的短时间培育将胱冬酶-3和9的蛋白水平分别提高至对照的168和171％，而胱冬酶8没有提高。
M109细胞与Dp44mT(1μM)培育6小时会明显地将胱冬酶-3提高至对照的400％，而胱冬酶9和8的提高没有这么明显，分别提高至对照的280％和150％(图14A，B)。用Dp44mT培育12小时将胱冬酶8的蛋白水平提高至对照的400％，而胱冬酶-3和9的蛋白水平与培育6小时时的基本相同(即，分别为对照的380％和280％)。以Dp44mT培育24小时将所有胱冬酶的蛋白水平提高至对照细胞的大约4倍，而48小时后，胱冬酶-3，8和9的水平是对照细胞的5.5倍、3.4倍和超过10倍(图14A，B)。
胱冬酶-3的活性在6小时后提高最显著，这以时间依赖型的方式出现，48小时后为对照的29倍(图14C)。胱冬酶-8和9的活性用Dp44mT培育12小时后提高的程度低的多，分别是对照的299％和354％(图14C)。后述酶的活性在24小时后稳定在对照的大约400-600％(图14C)。每一胱冬酶的膜可渗透的抑制因子当与Dp44Mt(1μM)培育后逆转其活性，表明观察到的活性的特异性(图14D)。
这些结果表明Dp44mT在2小时内提高了胱冬酶-3和9的蛋白水平，而胱冬酶-8的蛋白水平即使在4小时或6小时后也只是略微地提高(图14A，B)。在胱冬酶-3中观察到酶活性的最显著增加，与对照相比，其在与Dp44mT培育48小时后提高了300倍(图14C)。
实施例10c—与Dp44mT培育后全细胞色素c从线粒体进入细胞溶质的释放由于全细胞色素c从线粒体的释放在凋亡诱发中的重要性8，进一步研究了Dp44mT对该过程的影响(图15A)。使用标准技术制备细胞溶质和线粒体部分，进行蛋白印迹试验27。对照M109细胞的细胞溶质部分中具有很少的全细胞色素c表达(即在0小时时)，而在该时间在线粒体中发现了最大数量的全细胞色素c(图15A)。然而，暴露在Dp44Mt(1μM)2小时之后，在M109细胞的细胞溶质部分中发现了全细胞色素c，而且全细胞色素c的线粒体水平同时下降(图15A)。全细胞色素c释放到细胞溶质在以Dp44mT培育4小时后达到稳定，然后降低至在24和48小时时在对照细胞中发现的水平。细胞溶质的全细胞色素c的提高与线粒体的损失相关联(图15A)。在24和48小时后全细胞色素c从细胞溶质中近乎完全的消失可能是由于其从细胞中释放或其发生降解28(图15A)。
用Dp44mT仅培育2小时导致全细胞色素c从线粒体中的释放(图15A)，这发生在与胱冬酶-3、8和9的活化相同的时间或之前(图14A-C)。尽管倾向于限制在一个特定的行为机理，该观察结果与Dp44mT诱导凋亡的线粒体途径和与至少部分的胱冬酶明显的活化数量相一致。
实施例10d-由Dp44mT培育后M109细胞中Bcl-2和Bax的表达考虑到Bcl-2和Bax在凋亡的线粒体途径中的作用和其在全细胞色素c释放中的作用8，11，12，分析了Dp44mT(1μM)对这些分子的蛋白水平的影响(图15B)。由Dp44mT(1μM)培育后，抗凋亡分子Bcl-2作为时间的函数逐渐降低，在2和48小时的培育后，分别降低至0点时的69％和37％(图15B)。相反地，Bax表达仅在以Dp44mT培育48小时后明显地提高，达到0点时的500％(图15B)。
在2小时内观察到的全细胞色素c释放(图15A)与线粒体的Bcl-2表达的降低一致(图15B)，这关系到防止全细胞色素c从线粒体中的释放8。然而，在全细胞色素c释放和胱冬酶活化8中发挥作用的Bax表达的显著提高仅在48小时后观察到(图15B)8。Bcl-2和Bax之间的失调可能己造成在其它条件下发现的线粒体的全细胞色素c释放8。考虑到全细胞色素c从线粒体中的流出，以前的研究己表明氧化应激是其释放、Bcl-2的向下调节和凋亡前蛋白(如Bax)的向上调节、以及胱冬酶的活化的潜在的诱发剂27。
实施例10e—用Dp44mT培育后细胞内ROS产生的增加细胞内活性氧物质(ROS)分析使用细胞可渗透的染料2’，7’-二氯荧光素-二乙酸酯(DCF-DA)(Sigma)来分析细胞内ROS的产生。DCF-DA很容易地扩散到细胞中，在被O2-、H2O2或OH-氧化后发出很高的荧光。细胞荧光素强度与细胞内ROS的水平直接成比例29。M109细胞(1×105细胞/孔)用或不用1μMDp44mT培育0-48小时，或用50μM H2O2(正对照)在37℃培育10分钟。然后将细胞以DCF-DA(5μM)在37℃培育20分钟，洗涤两次，然后从培养板中分离出。使用流式细胞分析测量细胞中氧化的DCF的荧光素29。
为测试全细胞色素c从线粒体的释放的诱发(图15A)和Bcl-2/Bax表达的失调是否是由于ROS的存在，通过流式细胞分析使用DCFH-DA探针测量细胞内的ROS，DCFH-DA被O2-、H2O2或OH-氧化后发出荧光。M109细胞与Dp44mT(1μM)培育作为时间函数提高了氧化探针的水平。2小时后，与0点时相比，发现氧化的DCFH-DAD荧光增加了25±10％，其在48小时后增加了486±96％(图15C)。作为比较，H2O2(50μM)由正对照培育10分钟时荧光增加至0点时的1312±46％(图15C)。
在该研究中，在用Dp44mT培育2小时后探测到ROS的增加(图15C)，这与全细胞色素c的释放一致(图15A)。这些观察结果与ROS在诱发全细胞色素c释放的作用一致，然而也不能排除其它机理。
参考文献1.Blatt J，Stitely S.Cancer Res.1978；47；1749-1750；2.Chaston TB，Lovejoy DB，Watts RN，Richardson DR.Clin Cancer Res.2003；9402-414.
3.Richardson，D.R.&Bernhardt，P.(1999)J.Biol.Inorg.Chem.，4，266-273.
4.Salnikow，K.，Su，W.，Blagosklonny，M.B.and Costa，M.(2000).Cancer Res.60，3375-3378.
5.Kurdistani，S.K.，Arizti，P.，Reimer，C.L.，Sugrue，M.M.，Aaronson，S.A.，and Lee，S.W.(1998).Cancer Res.58，4439-4444.
6.Bandyopadhyay S，Pai SK，Gross SC，Hirota S，Hosobe S，Miura K，Saito K，Commes T，Hayashi S，Watabe M，Watabe K.Cancer Res.2003；63.1731-6.
7.Shimono，A.，Okuda，T.，Kondho H.(1999).Mech Devel.83，39-52.
8.Lim MLR，Lum M-G，Hansen TM，Roucou X，Nagley P.J Biomed Sci.2002；9488-506.
9.Cohen GM.Biochem J.1997；3261-16
10.Budihardjo I，Oliver H，Lutter M，Luo X，Wang X.Annu Rev Cell DevBiol.1999；15269-290.
11.Kluck RM，Bossy-Wetzel E，Green DR，Newmeyer DD.Science.1997；2751132-1136.
12.Jurgensmeier JM，Xie Z，Deveraux Q，Ellerby L，Bredesen D，Reed JC.Proc Natl Acad Sci USA.1998；954997-5002.
13.Bacchi，A.，Carcelli，M.，Costa，M.，Pelagatti，P.，Pelizzi，C.&Pellizzi，G.(1996).J.Chem.Soc.Dalton Trans.，22，4239-4244.
14.Johnson，D.K，Murphy，T.B，Rose NJ，Goodwin WH，Pichart L.InorgActa.1982；67159-162.
15.Broto，P.，Moreau，G.&Vandycke，C.(1984).Eur.J.Med.Chem.Chim.Theor.，19，71-78.
16.Ghose，A.K.&Crippen，G.M.(1987).J.Chem.Inf，Comput.Sci.，27，21-35.
17.Viswanadhan，V.N.，Chose，A.K.，Revankar，G.R.&Robins，R.K.(1987)J.Chem.Inf.Comput.Sci.，29，163-172.
18.Richardson，D.R.，Tran，E.&Ponka，P.(1995).Blood，86，4295-4306.
19.Selig RA，White L，Gramacho C，Sterlinglevis K，Fraser IW，Naidoo D.Cancer Res.1998；58473-478.
20.Finch RA，Liu M-C，Grill SP，et al.Biochem Pharmacol.2000；59983-991.
21.Müllner，E.W.，Neupert，.&Kühn，L.C.(1989).Cell，58，373-382.
22.Abboud，S.&Haile，D.J.(2000).J.Biol，Chem.275，199906-19912.
23.Darnell，G.&Richardson，D.R.(1999).J.Blood，94，78-792.
24.Becher，E.&Richardson，D.R.(1999).J.Lab.Clin.Med.，134，510-521.
25.Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，Reutelingsperger C.JImmunol Methods.1995；18439-51.
26.Gavrieli Y，Sherman Y，Ben-Sasson SA.J Cell Biol，1992；119493-501.
27.Yuan J，Murrell GA，Trichett A，Wang MX.Biochim Biophys Acta.2003；164135-41.
28.Jemmerson R，Laplante B，Treerul A.Cell Death Differ.200；9538-548.
29.Wang M，Wei AQ，Yuan J，Trichett A，Knoops B，Murrell GAC.FEBSLett.2002；532359-362.
30.El-Deiry，W.S.，Tokino，Tl，Velculescu，V.E.，Levy，D.B.，Parsons，R.，Trent，J.M.，Lin，D.，Mercer，W.E.，Kinzler，K.W.，&Vogelstein，B.(1993).Cell，75，817-825.
权利要求
1.一种具有通式1的化合物 通式1其中，E是O或S；A是 其中，Z’、Y’、X’和W’独立地选自CR4、NR8、S、O，其中A中的杂原子的总数为1、2或3，m是0或1，B是 其中，Z、Y、X、W和V独立地选自CR4、NR8、S、O；其中B中的杂原子的总数为0、1、2或3；q是0或1；每一R4独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、苄基、氨基甲酸苄酯；R’为氢、或不阻碍金属离子螯合的基团；-G为NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之间的键可以是单键、双键或三键；其中当C和R5之间的键是双键时，R2和R3中的一个不存在，当C和R5之间的键是三键时，R2和R3都不存在；R5选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分别选自氢、卤素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的杂芳基、非必要取代的双环基、非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的环烷基、或非必要取代的杂环烷基；其限制条件是(i)当E是O、而A和B每一个是 则-G不是-NH2、-CH2Cl、 且(ii)当E是S、而A和B每一个是则-G不是-NH2、 或者
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R’是氢。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中A和B相同。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中A和B不同。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中A选自非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基、或非必要取代的吡咯基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中B选自非必要取代的5-或6-元芳环或非必要取代的5-或6-元杂芳环。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中B选自非必要取代的苯基、非必要取代的萘基、非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基、非必要取代的吡咯基或非必要取代的呋喃基。
8.根据权利要求6或7所述的化合物，其中每一所述的非必要的取代基独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、卤素、氨基、羟基、O-烷基、S-烷基、硝基、氰基、C(O)-烷基、C(O)-O-烷基、C(O)NH(烷基)、或C(O)N(烷基)2。
9.一种具有通式2的化合物 通式2其中A选自 和 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中A为 其中R4和n如权利要求9中所定义。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中B选自 和 其中每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，p是0-7的整数，和其中A、E和G如通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中p为0、1、2、3或4。
13.根据权利要求11所述的化合物，其中B是 其中R4如权利要求11中所定义，p为0、1、2、3或4。
14.一种具有通式3的化合物 通式3其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4独立地选自卤素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羟基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，以及-G如权利要求1中的通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
15.一种具有通式4的化合物 通式4其中E是O或S；和-G如权利要求1中的通式1所定义，包括限制条件(i)和(ii)。
16.一种选自下列的化合物 和
17.一种选自下列的化合物 和
18.一种药物组合物，其包含药学上可以接受的稀释剂或载体和至少一种根据权利要求1、9、14、15、16和17中的所述的任一化合物，或其金属离子络合物。
19.一种药物组合物，其包含药学上可以接受的稀释剂或载体和至少一种根据权利要求1、9、14、15、16和17中所述的任一化合物的金属离子络合物，其中所述金属离子选自铁(II)、铁(III)、铜(II)、锌(II)、钯(II)、铂(II)、或镓(III)。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述金属离子选自铁(II)或铁(III)。
21.一种在哺乳动物中铁螯合治疗的方法，其包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
22.一种治疗哺乳动物铁过载失调的方法，其包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述铁过载失调是β-地中海贫血。
24.一种抑制细胞增殖的方法，其包括使细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金属离子络合物接触，或与包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金属离子络合物以及药学上可以接受的稀释剂、辅药、或赋形剂的药物组合物接触。
25.一种抑制哺乳动物细胞增殖的方法，其包括使哺乳动物的细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物接触，或与包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物以及药学上可以接受的稀释剂、辅药、或赋形剂的药物组合物接触。
26.一种治疗哺乳动物增殖性失调的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或施用含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述增殖性失调选自血管形成依赖性疾病、细胞增殖性疾病或癌症。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是恶性肿瘤或良性肿瘤。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是固体肿瘤或非固体肿瘤。
30.一种在细胞中诱发凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物接触，或与包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物接触。
31.一种抑制细胞增殖和在细胞中诱发凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物接触，或与包含至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物接触。
32.一种在哺乳动物中诱发凋亡的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或施用含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
33.一种在哺乳动物中诱发凋亡和抑制细胞增殖的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物，或施用含有至少一种带有或不带有限制条件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金属离子络合物和药学上可以接受的稀释剂、辅药或赋形剂的药物组合物。
34.根据权利要求24-33任一所述的方法，其中所述金属离子是选自铁、铜、锌、钯、铂或镓的过渡金属离子。
35.根据权利要求24-33任一所述的方法，其中金属离子选自铁(II)或铁(III)。
全文摘要
本发明涉及一种能够螯合金属离子的化合物。特别地，本发明涉及能够螯合包括铁离子在内的金属离子的(硫代)缩氨基脲化合物和(硫代)腙化合物。本发明还公开了该化合物和/或其金属离子络合物的医疗用途，包括治疗与细胞增殖相关的疾病的方法。
文档编号A61K31/444GK1764644SQ200480008002
公开日2006年4月26日 申请日期2004年2月5日 优先权日2003年2月5日
发明者D·R·里查森, D·B·洛夫乔伊 申请人:新南创新私人有限公司