专利名称：带有保护基的7－聚氨基烷基(氧)亚氨基甲基喜树碱的制作方法
本文公开的发明涉及用作药物的化合物，具体涉及含聚胺残基的在C-7位具有取代基的喜树碱衍生物，其中该胺残基受保护基如Boc保护。本发明涉及它们的制备方法，它们作为具有拓朴异构酶I抑制活性的活性剂的应用和包含它们作为活性成分的药物组合物。
发明
背景技术：
喜树碱是由Wall等人，[J.Am.Chem.Soc.，1966，88，3888-3890]首次从中国土产的属于蓝果树科的树木喜树(Camptotheca acuminata)中分离的生物碱。
该分子由在E环中具有内酯的五环结构组成，它是细胞毒性所必需的。
关于喜树碱和涉及它们用作药物的问题以及这些问题的解决的综述，读者参考以本申请人名义申请的EP 1 044 977。
目前聚胺作为医药化学中非常令人感兴趣的主题已有一些时间。
腐胺、精脒和精胺是最深入研究的聚胺，因为它们天然存在于原核和真核细胞。它们在细胞生理学中的作用似乎是多重的，且在某些方面仍是未知的[J.Med.Chem.，2001，44，1-261。在生理学pH下，这些化合物作为聚阳离子存在，能够与相当多种细胞组分，例如RNA、DNA、核苷酸、蛋白质和其它酸性生物物质相互作用[J.CellBiochem.，1991，46，37-47]。
在肿瘤学中，聚胺成为研究对象是有许多原因的，即它们在生理学pH下的聚阳离子性质、它们对细胞膜离子通道的影响和它们与多种重要的人肿瘤形式的转录因子的相互作用[Biochemistry 1999，38，14765-74]。
还已经描述了聚胺与细胞毒性药物，例如与苯丁酸氮芥的缀合[Cancer Res.，1992，52，4190-5]，其中已经观察到治疗指数明显改善，还作为一种形式的化学预防与3-吲哚基甲醇联合[BMC-Cancer 2003，32，1471-2407]。
对受保护形式的聚胺衍生物的研究不那么频繁，例如N-苄基-衍生物[J.Med.Chem.，2001，44，3653-64]。
聚胺可以与细胞毒性分子结合，以影响它们的细胞转运例如精胺已与吖啶缀合[J.Med.Chem.，2002，45，5098-111]以促进在肿瘤细胞水平选择性释放后者。
还已将聚胺残基插入喜树碱(CPT)的7位，例如亚氨基甲基衍生物[Bioorganic & Medicina1 Chemistry Letters，2001，11，291-4]，具体而言，已在以本申请人的名义提交的国际专利申请WO 0053607中描述了由精胺衍生的化合物。
发明概述现已令人惊奇地发现，在7位通过亚氨基甲基或氧亚氨基甲基键被取代的喜树碱(其中亚胺和肟基衍生自含有聚氨基烷基残基的胺或羟胺(例如精胺、精脒、腐胺)，在以受保护的形式存在时表现出显著的抗癌活性，明显优于未受保护形式的相同衍生物。
这种抗癌效力与目前用于肿瘤学临床实践的化合物相当，因此作为本发明主题的衍生物的主要贡献在于丰富可获得用于抗击癌症的物质。
作为本发明主题的化合物具有以下通式(I)
其中 m为数字0或1；Z和Z′可以相同或不同，为0-2的整数；Y和Y′可以相同或不同，为(CH2)n1、(CH2)n2-CH[NRVII(CH2)n4-NHRI]-(CH2)n3、CH2-CH[CH2-CH2]2-或(CH2)n2-N[(CH2)n4-NHRIV]-(CH2)n3；Y”选自H、环烷基C3-C7、(CH2)n5-N[CH2-CH2]2N-(CH2)n6NHRV、(CH2)n7-CH[CH2-CH2]2NRV；X为O或简单的键；n-n8可以相同或不同，为0-5的整数；RI、RII、RIII、RIV和RV可以相同或不同，为它们所结合的氮的保护基、CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)；RVI为直链或支链(C1-C6)烷基；RVII为H或RI-RV；Ar为C6-C12芳族残基，例如苯基，任选被一个或多个选自以下的基团取代卤素、羟基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，为氢、直链或支链(C1-C5)烷基；或者Ar为杂环基，该杂环基含有至少一个选自任选被(C1-C5)烷基取代的氮原子和/或氧和/或硫的杂原子；该杂环可以被一个或多个选自以下的基团取代卤素、羟基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，为氢、直链或支链(C1-C5)烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的单独的对映异构体、它们的单独的非对映异构体、E和Z型、它们的混合物和药学上可接受的盐。
本发明包括使用具有上述通式(I)的化合物作为药物，特别是用作拓朴异构酶I抑制剂的药物的活性成分。在源自拓朴异构酶抑制活性的治疗应用中，我们应该提及肿瘤以及病毒和寄生虫感染。
本发明包括含有作为活性成分的式(I)化合物与药学上可接受的载体和赋形剂相混合的药物组合物。
发明详述当提及各个RI、RII、RIII、RIV和RV时保护基意指有利于分子被细胞捕获的基团。本发明的基础是发现胺氮上的保护基对分子赋予有力的抗癌活性，且由于本发明者不愿拘泥于任何特定的理论考虑，认为该保护基应该是亲脂性大基团。优选的保护基的实例为CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2-(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、(CH2)n5-NHCO2-CH2Ar、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)，其中的可变基团如以上定义。
第一组特别优选的化合物包括具有6元(term)内酯环(m＝0)的式(I)化合物，且其中具体为-20S-(4-{[3-(7-喜树碱亚基(camptothecinylidene)-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基-氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-(4-{[3-(7-喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-[3-(7-喜树碱亚基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亚氨基-甲基]-喜树碱。
第二组优选的化合物包括具有7-元内酯环的式(I)化合物，其合成在[J.Med.Chem.1998，41，5410]中作了描述，且其中具体为-20RS-(4-{[3-(7-高喜树碱亚基(homocamptothecinylidene)-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-(4-{[3-(7-高喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-[3-(7-高喜树碱亚基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20R，S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亚氨基-甲基]-高喜树碱。
本发明公开的化合物为拓朴异构酶I抑制剂，并因此用作药物，特别用于治疗受益于对该拓朴异构酶的抑制的疾病。具体而言，根据本发明的化合物表现出抗增殖活性，因此因它们的治疗活性而被使用，并具有使它们适于药物组合物制剂的物理化学性质。
该药物组合物包含至少一种式(I)化合物作为活性成分，其量用于产生明显治疗效果。本发明涵盖的组合物完全是常规的，并通过使用在制药工业中通常实践的方法来获得。根据选择的给药途径，该组合物可以是固体或液体剂型，适于口、肠胃外或静脉内给药。根据本发明的组合物包含活性成分和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。这些可以为特别有用的助剂，例如增溶剂、分散剂、助悬剂或乳化剂。
式(I)化合物还可以与其它活性成分，例如抗癌药或其它具有抗寄生虫或抗病毒活性的药物联合使用，既可作为分开的剂型又可以是单一的剂型。
根据本发明的化合物用作具有抗癌活性的药物，例如对肺癌如非小细胞(non-microcytoma)肺癌，或结肠直肠和前列腺癌以及神经胶质瘤。
以下实施例进一步例示本发明。
制备17-甲酰基-喜树碱往冷却至0℃的在18mL CH2Cl2中的2.0g(4.73mmol)7-二甲基缩醛-喜树碱的溶液加入12mL TFA和数滴H2O。室温下一夜后反应完全，并形成Rf＝0.42(CH2Cl2/MeOH 92∶8)的产物。在SiO2上用CH2Cl2/MeOH(从98∶2至92∶8)将反应混合物色谱纯化得到1.4g(3.72mmol；产率79％)预期产物，为一种黄色固体。
制备2N′，N″，N-三Boc-精胺根据在文献[Tetrahedron Letters 1998，39，439-42]中所述的方法制备N′，N″，N-三Boc-精胺。
制备3N′，N″-二Boc-精脒用等同于关于精胺所公开的方法制备该化合物。
制备4N′-Boc-腐胺此化合物可商购得到。
实施例17-[(N′，N″，N-叔丁氧羰基)-精胺-亚氨基-甲基]-20S-喜树碱[ST2544].
在100mL火焰烧瓶中将272mg(0.72mmol)7-甲酰基喜树碱溶于20mL无水CH2Cl2。将44mg Yb(OTf)3(0.07mmol；0.1当量)加到该溶液，然后将700mg(1.4mmol；2当量)的三-Boc-精胺溶于12mL无水CH2Cl2和分子筛，将该反应烧瓶避光保存。室温下16小时后，加入1.9g(4.2mmol；相对于精胺为3当量)的用异氰酸酯基官能化的树脂(装载2.2mmol/g)作为过量胺的清除剂。
将该反应混合物在室温下再放置16小时，然后用C盐过滤以除去分子筛和清除剂树脂；在真空下除去溶剂，并用制备HPLC色谱法(CH3CN/MeOH＝90∶10；8mL/分；RP-18，250×25mm，7μm)纯化粗反应产物，得到500mg(0.58mmol；产率81％)的产物，为一种黄色固体。
MS(IS)[MH]+＝860.8[M-1]-＝858.71H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.0(m，35H，3xtBu+4xCH2)，2.0-2.1(q，2H，CH2)，3.0-3.3(m，10H，5xCH2)，3.85-3.95(d，2H，CH2)，5.3-5.4(d，IH，CH)，2.55(s，2H，CH2)，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；28.6；28.7；31.8；47.0；52.7；66.6；72.9；79.5；97.8；118.9；126.2；127.6；128.5；139.3；130.8；146.2；149.9；150.0；152.9；155.7；157.6；174.0。
实施例27-[(N′，N ″-叔丁氧羰基)-精脒-亚氨基-甲基]-20S-喜树碱[ST2598]。
用实施例1所公开的相同方法得到标题产物。
产率＝22％MS(IS)[MH]+＝704.6[M+Na]+＝726.61H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.1(m，26H，2xtBu+4xCH2)，3.0-3.4(m，4H，2xCH2)，3.75-3.95(m，4H，2xCH2)，5.25-5.35(d，1H，CH)，5.55(s，2H，CH2)，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；28.6；28.7；32.1；47.4；51.7；52.9；53.6；66.7；69.7；72.9；79.7；98.0；98.4；119.0；122.5；123.1；126.4；127.7；128.6；130.2；130.4；131.0；131.3；146.4；150.1；153.1；156.0；156.4；157.9；174.2。
实施例37-[3-(N-叔丁氧羰基)-氨基-1-丙氧基亚氨基甲基]-20S-喜树碱(ST2664)往在5ml无水THF中的-7-(3-氨基丙氧基亚氨基甲基)-20S-喜树碱(20mg，0.045mmol)的悬浮液加入10mg(Boc)2O(1当量)和7μlEt3N(1当量)；使该混合物在室温下反应30小时，在该段时间结束时反应几乎完全。用TLC监测反应，用CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1洗脱。
蒸发THF，并用CH2Cl2萃取固体；用水(二次)和盐水(一次)洗涤有机相。用Na2SO4使溶液脱水，过滤，并将其干燥。得到16mg由E和Z异构体的混合物组成的产物(产率64％)。
Rf0.38，在CH2Cl2∶CH3OH＝98∶2中。
M.p.141-142℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δ)0.87(t，H3-18E+H3-18Z)，1.37(s，H9叔丁基E)，1.30(s，H9叔丁基Z)，1.67(m，H2-19Z+-CH2CH2CH2-Z)，1.87(m，H2-19E+-CH2CH2CH2-E)，2-83(t，CH2-N-Z)，3.07(t，CH2-N-E)，4.12(t，CH2-O-Z)，4.35(t，CH2-O-E)，5.17(s，H-17-Z)，5.32(s，H-17-E)，5.40(s，H-5-E)，6.50(s，OH-E+OH-Z)，6.75(t，NH-Z)，6.90(t，NH-E)，7.25(s，H-14-Z)，7.32(s，H-14-E)，7.75(m，H-11-E+H-11-Z)，7.90(m，H-10-E+H-10-Z)，8.02(d，H-12-Z)，8.20(d，H-12-E+H-9-Z)，8.40(s，-CH＝N-Z)，8.6(d，H-9-E)，9.32(s，-CH＝N-E)。
E∶Z比率＝88∶22(根据NMR)。
实施例47-[N-(N’-叔丁氧羰基)-腐胺亚氨基-甲基]-20S-喜树碱(ST2615)用与实施例1所述的相同合成方法得到标题产物。
产率＝78％
MS(IS)[MH]+＝547.71H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.45(s，9H，tBu)，1.65-2.0(m，4H，2xCH2)，3.2-3.35(q，2H，CH2)，3.9-4.0(t，2H，CH2)，5.3-5.4(d，1H，CH)，5.55(s，2H，CH2经)，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
实施例57-[4-(N-叔丁氧羰基)-哌啶基-甲基亚氨基甲基-20S-喜树碱(ST2665)往在5ml CH2Cl2中的7-甲酰基喜树碱(60mg，0.159mmol)的悬浮液(在CaCl2上蒸馏并在筛上保存)加入119mg(0.477mmol，3当量)1-Boc-4-氨基甲基哌啶盐酸盐、40μl吡啶和6mg Yb(OTf)3(相对于醛为10wt％)，使该混合物于室温下反应5天(TLCCH2Cl2∶CH3OH＝98∶2)。
用快速色谱法(洗脱剂CH2Cl2∶CH3OH＝99∶1)纯化产物。黄色固体。产率20％。M.p.200℃分解。反应产物的Rf0.37，在CH2Cl2∶CH3OH＝96∶4中。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6；δ)0.87(t，CH2CH3)，1.32(s，叔丁基)，1.67-2.00(m，CH2CH3+2-CH2-pip.+-CH pip.)，2.55-2.85(m，-CH2-pip.)，3.80(m，-CH2-N)，3.97(m，-CH2-pip.)，5.35(s，H-17)，5.42(s，H-5)，6.50(s，OH)，7.35(s，H-14)，7-70-7.80(m，H-11)，7.85-7.95(m，H-10)，8.20(dd，H-12)，8.72(dd，H-9)，9.42(s，-CH＝N)。
实施例67-[(N′，N″-二-苄氧基羰基)-精脒亚氨基甲基]-20S-喜树碱[ST2729]。
用与实施例所述的相同合成方法得到标题产物。
产率＝35％MS(IS)[MH]+＝772.9[M+Na]+＝794.91H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.1(m，8H，4xCH2)，3.2-3.6(m，6H，3xCH2)，3.95(s，2H，CH2)，5.1-5.2(d，4H，2xCH2)，5.4-5.9(m，4H，2xCH2)，7.2-7.45(m，10H，10xCH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.5(m，2H，2xCH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；27.2；31.7；41.0；52.8；66.5；66.6；67.2；72.9；98.0；118.9；122.8；126.2；127.4；127.8；128.0；128.2；128.5；130.3；130.9；136.7；146.0；150.0；152.9；156.3；156.7；157.7；174.0实施例77-[3-(4-叔丁氧羰基)氨基丁基]-叔丁氧羰基氨基-丙氧基亚氨基甲基]-20S-喜树碱[ST2872]由N-Boc-4-氨基丁醇(500mg)，经甲磺酰化，然后与乙醇胺反应，进行游离NH基团的Boc保护，与N-羟基苯邻二甲酰亚胺进行Mitsunobu反应，并进行肼解，制备N″，N-(二叔丁氧羰基)-氨基丁基氨基乙氧基胺(NMR(CDCl3)4.65(NHBoc)，3.9(CH2-O)，3.3-3.6(Boc-N-CH2和-ONH2)，3.05-3.25(CH2NHBoc和CH2N-Boc)，1.45-1.55(CH2-CH2)，1.45(18H，2Boc)(200mg)。
将7-甲酰基喜树碱(55mg，0.145mmol)溶于2ml乙醇，加入在1ml乙醇中的100mg N″，N-(二叔丁氧羰基)-氨基丁基氨基乙氧基胺，并回流8小时。
蒸发并用二氯甲烷MeOH(97∶3)进行硅胶色谱处理得到51mg(50％)标题化合物，mp 153℃，Rf0.2，在CH2Cl2∶MeOH(97∶3)中，NMR(DMSO-d6)9.4(s，CH＝)，8.851H-NMR(300MHz，CDCl3，δ)0.87(t，H3-18E+H3-18Z)，1.45-1.65(m，BOC E+BOC Z+-CH2CH2-Z+CH2CH2-E)，1.87(m，H2-19E+H2-19Z)，2-80-3.65(m，3CH2-N-Z+3CH2-N-E)，4.25-4.35(m，CH2-O-Z)，4.40-4.52(m，CH2-O-E)，4.60(brs，NH)，5.10(brs，-NH)，5.20-5.45(m，H-17-Z+H-17-E+H-5-z)，5.65-5.75(m，H-5-E)，7.65-7.75(m，H-14-Z+H-14-E+2Ar Z)，7.75-7.85(m，2Ar-E)，7.90(d，lArZ)，8.05(s，-CH＝N-Z)，8.25-8.35(m，2ArE+1 Ar Z)，9.05(s，-CH＝N-E)。
E∶Z比率＝55∶45(根据NMR)。
对NCI-H460细胞的细胞毒性将NCI-H460细胞非小细胞肺癌细胞保存在包含10％FCS和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。如下进行细胞毒性试验以分析分子活性。将250μl体积的细胞接种于96孔平板，并在37℃下与标量浓度的产物一起在含有5％CO2的潮湿气氛下培养2小时。在培养结束时，通过翻转该平板并加入无菌缓冲盐水溶液(PBS)三次来移出分子。将包含10％FCS的RPMI 1640培养基(200μl)加到孔中，并将该平板再培养72小时。在培养结束时，再次翻转该平板，并在纸上干燥，然后加入200μl PBS和50μl 80％TCA。将该平板在冰上再培养至少1小时。通过翻转该平板来移出TCA，并首先在纸上干燥该平板，然后通过浸泡在蒸馏水中并翻转来洗涤三次。首先在纸上干燥该平板，然后在60℃的恒温调节的培养箱中培养10分钟。首先在纸上干燥平板，然后在60℃恒温调节的培养器中干燥10分钟。将200μl在1％乙酸中的4％硫代若丹明(sulforodamine)B加到所有的孔。将该平板在室温下再培养30分钟。通过翻转来移出硫代若丹明B，通过在1％乙酸中浸泡三次来洗涤该平板，然后首先在吸墨纸上干燥，随后在60℃恒温器中干燥10分钟。最后，将200μl Tris碱10mM加到所有的孔，并将该平板搅拌至少20分钟。用Multiskan分光光度计在540nm下测定光学密度。用产物一起培养能够以依赖于浓度的方式抑制增殖。表1显示IC50值(抑制50％细胞存活的产物浓度]。ST2544和ST2598表现出对所用的肺癌细胞系具有类似的、非常强有力的细胞毒性。
结果显示在下表中。
表1喜树碱衍生物的细胞毒性
对酿酒酵母模型的体外和体内效果为鉴定克服在酿酒酵母模型中由拓朴异构酶I DNA上的点突变诱导的对喜树碱的耐药的喜树碱衍生物，平行地使用体外和体内系统。
关于体内系统，用作为对照的YCpGAL1质粒和不同的含有突变体的质粒(YCpGAL1-hT OP1G363C、YCpGAL1-hTOP1K720E、YCpGAL-1hTOP1A653 P)转化酵母株EKY3(top 1Δ)，所述突变体证明对喜树碱耐药。在接近酶的活性位点(酪氨酸723)存在许多突变，其它突变在对应于非常保守的区域的大约363位周围。
在进行酵母转化之前，酵母是未冷冻的，并在含有无菌固体YPDa培养基(每升10g酵母提取物、20g胨、20g右旋糖、0.7g腺嘌呤、20g葡萄糖、20g琼脂)的90-mm平板上用无菌弯曲玻璃棒进行平板接种。在培养箱中在30℃下48-72小时后形成菌落。
在转化前一天，用无菌Gilson管尖(tip)取单一酵母菌落样品，并接种在5ml无菌液体YPDA培养基(不含琼脂的上述培养基)中。该菌落在搅拌和30℃下生长过夜。之后一天，用无菌液体YPDA培养基稀释5ml饱和培养物，并在30℃下生长至在600nm下光密度为1.0。将该细胞在4000xg和室温下离心5分钟，并将沉淀重悬在25ml含有Tris-EDTA(TE)10mM pH 7.5、EDTA 1mM和乙酸锂100mM的(T/E)溶液。将该酵母悬浮液在4000xg和室温下离心5分钟。将该沉淀重悬在相同的前述新鲜溶液(大约500μl)，以具有2×109细胞/ml。为完成转化，将200μg载体DNA、1μg质粒DNA和200μl感受态细胞置于Eppendorf分光光度计。加入1.2ml含有PEG 40％的TE/乙酸锂溶液，并将该酵母悬浮液于30℃下搅拌30分钟。通过以下方法产生热休克将酵母悬浮液在42℃下放置15分钟，然后将其置于选择性平板，即含有完全极限培养基(CM)的不含尿嘧啶的平板(每升1.3g含有多种氨基酸但缺少尿嘧啶的dropout粉末、1.7g不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱、5g硫酸铵、20g葡萄糖和20g琼脂)。在30℃下培养该平板直至转化。
在用喜树碱衍生物处理酵母(体内斑点试验)之前，用Gilson管尖将转化的菌落接种在5ml无菌液体CM培养基中。菌落在搅拌和30℃下生长过夜。在第二天，在600nm下测定菌落的光密度，并稀释菌落以得到0.3的光密度。由此第一稀释液在96孔平板中得到10倍系列稀释(1∶10，1∶100，1∶1000)。吸取5μl的每种稀释液至90-mm含有固体CM培养基的平板。对于对照加入2％葡萄糖和2％半乳糖，而对于用喜树碱衍生物处理的稀释液加入2％半乳糖和45μM浓度的产物。将菌落在30℃下培养48-72小时，并进行肉眼分析。
评价喜树碱衍生物ST2544和ST2598的效果。拓朴异构酶I野生型DNA表现为对ST2544和ST2598敏感的表型，而突变酶G363C和A653P证明对受试衍生物耐药。但是，K720E突变体表现出对ST2544衍生物敏感的表型。
结果表示在下表中。
表2体内喜树碱衍生物存在下酿酒酵母的生长
从左至右各符号表示4份系列酵母稀释液的生长。
+酿酒酵母存活；-酿酒酵母致死。
ST2544抗MKN-28人胃癌的效果在第0天将肿瘤碎片接种在两胁。在肿瘤刚可触及时开始治疗。根据方案q4dx4通过口服途径和静脉内施用分子。在治疗期间，每天检查动物的死亡率。每天观察小鼠的身体外观、行为以及总体和局部临床体征。记录任何由常态的偏离。在整个治疗期间对所有动物称重以计算由治疗导致的体重降低百分率。
在最后治疗之后20天评价经治疗的肿瘤相对于对照肿瘤的肿瘤体积抑制％。为测定药物的抗肿瘤活性，每二周用游标卡尺测定肿瘤直径。使用公式TV(mm3)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2，其中的宽度和长度分别是每个肿瘤的最短和最长的直径。
当肿瘤达到大约2g的重量时，通过颈部脱位处死小鼠。计算LCK(log细胞杀死)作为效力指数，以评价在治疗结束时分子效果的持续。结果在表3中报道。
表3p.o.或i.v.施用的ST2544(q4dx4)在s.c.荷有MKN-28人胃癌的无胸腺裸鼠中的抗肿瘤活性
ST2544通过口服途径递送时在4和2mg/kg(q4dx4)下表现出对肿瘤生长的明显抑制，因为TVI＞50％，而它在静脉内给药时在4mg/kg(q4dx4)下有效(TVI＝66％)。以4mg/kg口服后观察到在治疗结束时所测定的对肿瘤生长的效果的持续(LCK＝1)。
权利要求
1.具有通式(I)的化合物， 其中 m为数字0或1；Z和Z′可以相同或不同，为0-2的整数；Y和Y′可以相同或不同，为(CH2)n1、(CH2)n2-CH[NRVII(CH2)n4-NHRI]-(CH2)n3、CH2-CH[CH2-CH2]2-或(CH2)n2-N[(CH2)n4-NHRIV]-(CH2)n3；Y”选自H、环烷基C3-C7、(CH2)n5-N[CH2-CH2]2N-(CH2)n6NHRV、(CH2)n7-CH[CH2-CH2]2NRV；X为0或简单的键；n-n8可以相同或不同，为0-5的整数；RI、RII、RIII、RIV和RV可以相同或不同，为它们所结合的氮的保护基、CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)；RVI为直链或支链(C1-C6)烷基；RVII为H或RI-RV；Ar为C6-C12芳族残基，例如苯基，任选被一个或多个选自以下的基团取代卤素、羟基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，为氢、直链或支链(C1-C5)烷基；或者Ar为杂环基，该杂环基含有至少一个选自任选被(C1-C5)烷基取代的氮原子和/或氧和/或硫的杂原子；该杂环可以被一个或多个选自以下的基团取代卤素、羟基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，为氢、直链或支链(C1-C5)烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的单独的对映异构体、它们的单独的非对映异构体、E和Z型、它们的混合物和药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1的化合物，其中该保护基为亲脂性大基团。
3.根据权利要求1的化合物，其中该保护基选自CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2-(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)，其中RVI如以上定义。
4.根据权利要求3的化合物，其中该保护基选自叔丁氧羰基、苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基。
5.根据权利要求1-4之任一项的化合物，其中m为0。
6.根据权利要求5的化合物，选自-20S-(4-{[3-(7-喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-(4-{[3-(7-喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-[3-(7-喜树碱亚基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亚氨基-甲基]-喜树碱。
7.根据权利要求1-4之任一项的化合物，其中m为1。
8.根据权利要求7的化合物，选自-20RS-(4-{[3-(7-高喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-(4-{[3-(7-高喜树碱亚基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-[3-(7-高喜树碱亚基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20R，S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亚氨基-甲基]-高喜树碱。
9.含有作为活性成分的至少一种根据权利要求1-8的化合物与至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂相混合的药物组合物。
10.根据权利要求1-8的化合物作为药物的应用。
11.根据权利要求1-8的化合物用于制备具有拓朴异构酶1抑制活性的药物的应用。
12.根据权利要求11的应用，用于制备具有抗癌活性的药物。
13.根据权利要求11的应用，用于制备具有抗寄生虫活性的药物。
14.根据权利要求11的应用，用于制备具有抗病毒活性的药物。
全文摘要
公开具有通式(I)的化合物，其中的基团如在本文以下的描述中定义，其特征在于在亚胺/肟残基上存在聚胺取代基，这种胺基团又受适宜的保护基保护。该化合物被赋予有力的拓扑异构酶I抑制活性，因此用作治疗肿瘤以及病毒和寄生虫感染的药物。
文档编号A61P35/00GK1918170SQ200480019789
公开日2007年2月21日 申请日期2004年7月6日 优先权日2003年7月14日
发明者G·吉安尼尼, S·潘克, M·O·廷缇, C·匹萨诺, L·维茨, L·米尔里尼, F·祖尼诺 申请人:希格马托制药工业公司, 研究和治疗肿瘤国家研究所