专利名称：对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗皮肤黏膜病毒性感染药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗皮肤黏膜感染药物中的应用。更确切地说，涉及对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗人和动物皮肤黏膜人乳头瘤病毒、疱疹病毒感染药物中的应用。
背景技术：
2-羟基苯甲酸(水杨酸)已被用于治疗皮肤黏膜的细菌和真菌感染性疾病。对羟基苯甲酸及其酯用作食品、药品的防腐剂。没食子酸(即3，4，5-三羟基苯甲酸)常常用于抗氧化剂，并且，已被证明对乙型肝炎HBV病毒有抑制作用(解放军广州医学高等专科学校学报，1998，26(2)5-7)。但至今尚无有关文献记载羟基苯甲酸及其类似物(水杨酸除外)，包括3，4，5-三羟基苯甲酸用于制备治疗皮肤黏膜病毒感染的药物。虽然，有实验证明没食子酸对某些病毒有抑制作用，但并不代表对所有病毒有效，就如已知的许多抗病毒药物一样。在研究确认药物是否对某种类型病毒有效和药理学基础之前，并不能预测其的效果。
中国专利CN1411339、美国专利US6294186的发明描述了抗微生物组合物，其包含安全有效量的苯甲酸类似物包括具有下述结构(II)的那些其中R1、R2、R4和R5独立地选自H、OH、F、I、Br、Cl、SH、NH2、CN、烷基、烷氧基、NR2、OR、NO2、COR、CONR2、CO2R、SO3R；其中R独立地选自H、烷基和烷氧基。R3独立地选自H、OH、F、I、Br、Cl、SH、CN、烷基、烷氧基、OR、NO2、COR、CONR2、CO2R、SO3R；其中R独立地选自H、烷基和烷氧基。该专利还提出最优选选自自水杨酸(即2-羟基苯甲酸)、苯甲酸和它们的组合。
病毒虽然是最小的病原微生物，但病毒的传播最广，目前世界上近3/4的传染病是由病毒引起，在临床上较多的疾病与病毒感染有关。
尖锐湿疣又称生殖器疣或性病疣，是由人乳头瘤病毒(HPV)引起的皮肤黏膜良性新生物，为目前最常见的性传播病之一，与生殖器的炎症和癌的发生有密切关系。目前，治疗尖锐湿疣的药物有鬼臼毒素d，优点是疗程短，但存在刺激性、毒副作用大的问题。具体表现是疼痛、水肿、糜烂等。外用药治疗尖锐湿疣的重组人干扰素α-2β凝胶是目前公认有效果的药物。
近年研究结果表明(陈富强等，肿瘤防治杂志，2001，8(4)342-344；徐成康，中山医科大学学报，1998，19(3)223-226)，29.3％的宫颈糜烂患者呈现HPV阳性，而正常宫颈阳性率只为11.1％。据报道(Ahn ws et al，J CellBiochem Suppl，1997；28-29133-139)，慢性宫颈炎中高危HPV(人乳头瘤病毒)16、18型表达率为69％，高危型HPV16、18检出率随宫颈糜烂程度的增加呈现递增趋势，颗粒型或乳突型糜烂HPV16、18检出率与正常宫颈比较差异显著。用PCR可测得宫颈癌中HPV16、18阳性率达83.33％，高危型HPVDNA整合到宿主细胞染色体，可产生E6、E7肿瘤蛋白，它们分别抑制抑癌基因p53和Rb，使细胞逃脱p53和Rb的控制，导致细胞周期控制失常，使通常处于静止状态的细胞增生活跃、肿瘤生长。若HPV16持续存在，就可使宫颈病变进展。宫颈HPV感染与外阴感染不同，宫中以HPV16/18型为主，常不发生湿疣改变，而是以隐性感染长期存在，先引起不典型增生，当有其他因子参与时而导致癌变。
单纯疱疹病毒(HSV)是双股DNA病毒，其经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等多种途径侵入机体。人感染非常普遍，感染率达80～90％，常见的临床表现是粘膜或皮肤局部集聚的疱疹，偶而也可发生严重的全身性疾病，累及内脏。研究表明HSV-1和HSV-2可能分别与唇癌、外阴癌及子宫颈癌有关，曾受到人们重视(孙荷等，中国实用妇科与产科杂志，2001，17(7)407-409)。目前治疗药物有疱疹净、阿糖胞苷、阿糖腺苷、溴乙烯尿苷和无环鸟苷等，但治疗时间较长，需要5至7天。
发明内容
本发明的主要目的在于提供对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗皮肤黏膜病毒性感染药物中的应用，其中对羟基苯甲酸及其类似物选自下述通式(I)所表示的化合物中的一种或几种，其中R1、R2、R3、R4独立地选自OH或H，优选对羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、2，3，4-三羟基苯甲酸、3，4，5-三羟基苯甲酸、2，4，5-三羟基苯甲酸；更优选对羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、3，4，5-三羟基苯甲酸；最优选3，4，5-三羟基苯甲酸即没食子酸。
上述化合物和/或含有上述化合物的组合物作为活性成分的有效剂量，可用在制备治疗人和动物皮肤黏膜病毒性疾病药物的用途，特别是治疗人和动物皮肤黏膜HPV病毒性疾病药物的用途，包括尖锐湿疣、阴道、宫颈炎及宫颈糜烂和辅助治疗子宫颈癌。
本发明通过荧光定量PCR检测HPV病毒的量的改变来观察活性成分和产品效果，该方法已在数篇公开发表的文献中应用(蔡有龄等，中国性病艾滋病防治，2002，82，108；吴元胜、范瑞强等，实用中西医结合临床，2003，32，1)。
结果表明，尖锐湿疣的组织匀浆在加入没食子酸后24小时，FQ-POVR不能再检出病毒，加入对羟基苯甲酸、2，3-二羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸后，HPV16/18减少约一半，3，4-二羟基苯甲酸略有减少，而空白对照管及对照样品苯甲酸、水杨酸、苯甲酸与水杨酸组合物管却具有很高浓度的HPV病毒量，说明本发明的化合物在体外具有能快速有效地灭尖锐疣病毒的能力。而中国专利CN1411339、美国专利US6294186的发明优选的苯甲酸、水杨酸及苯甲酸与水杨酸组合物不能杀灭HPV病毒，加入苯甲酸、水杨酸及苯甲酸与水杨酸组合物后，病毒量与空白组接近。
上述化合物和/或含有其作为活性成分有效量的组合物，与皮肤黏膜用药的各种辅料配伍制备各种制剂，可以是膏剂、凝胶剂、洗剂、片剂、栓剂、膜剂、喷剂和其他药学上可以接受的制剂。
上述化合物和/或含有其作为活性成分有效量的组合物，作为抗微生物产品，其中所述产品选自个人护理产品，所述个人护理产品是洗手皂、卫生洗手剂、洗浴剂、沐浴胶、洗浴液、个人护理擦试物、擦面纸、鼻内喷雾剂和它们的组合。
本发明的化合物活性成分多是已知化合物，一些已用于制备食品添加剂、一些是药用辅料，还有一些是药用中间体，可以在市面上买到，也可以从天然植物中提取。
在制备上述产品时，可以用单一化合物或是其组合物。当用于制备药用制剂时，可以与不同的药物和药学上可接受的载体组合，以利于制剂的形成，这些载体可以是淀粉、糊精、吐温-80、卡波姆、纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、甘油、丙二醇、聚乙二醇、月桂氮唑酮、异丙醇、三乙醇胺、司盘60，但不限于此。
另外，作为活性成分的单一化合物或是其组合物，还可以加入消毒液、洗手皂、卫生洗手剂、洗浴剂、沐浴胶、洗浴液、个人护理擦试物、擦面纸、鼻内喷雾剂中，用于杀灭皮肤黏膜表面的病毒。
具体实施例方式
以下结合实施例，来进一步说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求的保护范围。
本发明所采用的主要材料(含量均大于99％)及其来源材料 来源对羟基苯甲酸 国药集团化学试剂有限公司2，3-二羟基苯甲酸 台州市中大化工有限公司2，4-二羟基苯甲酸 台州市中大化工有限公司3，4-二羟基苯甲酸 台州市中大化工有限公司3，5-二羟基苯甲酸 海门市贝斯特精细化工有限公司2，3，4-三羟基苯甲酸 南京龙源天然多酚合成厂没食子酸 浙江省瓯海化工试剂厂2，4，5-三羟基苯甲酸 南京龙源天然多酚合成厂水杨酸 天津基准化学试剂有限公司苯甲酸 广州市番禺力强化工厂重组人干扰素α-2β凝胶 合肥兆峰科大药业有限公司聚肌胞 广东开平生化制药厂实施例1 抗HPV病毒微乳消毒液的制备取1，2-丙二醇20ml、吐温80 15ml、氮酮5ml混合，加灭菌蒸馏水至总体积为100ml，得外用制剂溶液。取对羟基苯甲酸、没食子酸、2，4-二羟基苯甲酸10g，分别加外用制剂溶液50ml，调节pH至5.5，然后加外用制剂溶液至100ml，得10％对羟基苯甲酸、没食子酸、2，4-二羟基苯甲酸微乳液。
实施例2 复方没食子酸泡腾片的制备取没食子酸0.25g、聚肌胞0.01g、酒石酸0.45g分别过80目筛，以95％乙醇制成软材，过12目筛制湿粒，于50℃干燥，备用。另取碳酸氢钠0.65g、糊精0.02g加无菌蒸馏水制软材，过12目筛制湿粒，于50℃干燥，然后与上述干粒混合，整粒，加适量灭菌蒸馏水，烘片刻，加0.01g PEG6000。混匀，压片，即得。
实施例3 荧光定量PCR检测HPV病毒筛选药物实验药物样品配制各取1，2-丙二醇20ml、吐温80 15ml为溶剂，分别将苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、没食子酸、2，3-二羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸配制成0.01mol/L的溶液，调节pH至5.5。
HPV病毒来源来自多位病人临床标准的尖锐湿疣标本，切取后，用生理盐水洗去血液，在无菌条件下，将标本剪碎，加入3倍体积生理盐水混匀、研磨成匀浆放置-40℃备用。
试验方法按表1所示分组，每组取尖锐湿疣组织匀浆50μl，分别加入供试药品溶液各50μl。37℃温育24小时，然后按达安基因诊断中心提供的HPV6，11和16，18型FQ-PCR诊断试剂盒提供的操作步骤进行检测采用常规碱裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反应管中，同时加入一定浓度的引物、F-PROBE、DNTP、DNA聚合酶及缓冲液等，用ABI PRISMTM7700荧光定量PCR扩增仪，93℃2min予变性后，按93℃45s，55℃120s，反复进行40个循环，定量结果由电脑软件自动分析计算出初始拷贝数的定量结果。数据见表1。
结果显示尖锐湿疣的组织匀浆在加入没食子酸后24小时，FQ-POVR不能再检出病毒，加入对羟基苯甲酸、2，3-二羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸后，HPV16/18减少约一半，3，4-二羟基苯甲酸略有减少，而而空白对照管及对照样品苯甲酸、水杨酸和苯甲酸与水杨酸组合物管却具有很高浓度的HPV病毒量，说明本发明的化合物在体外具有能快速有效地灭尖锐疣病毒的能力。
表1 荧光定量PCR检测HPV病毒筛选药物实验
实施例4 临床外用治疗尖锐湿疣观察诊断标准参照中华人民共和国卫生部卫生防疫司编《性病防治手册》1994年第2版中的有关内容典型的外阴(或肛周)皮肤黏膜部位乳头样、菜花状或其它形状的柔软增生物，5％醋酸白试验阳性。
纳入和排除标准符合上述诊断标准，单个皮损直径≤0.5cm，就诊前2周没有进行过有关治疗的病人纳入临床观察。有外阴生殖器真菌、滴虫、细菌感染或其它合并症者，哺乳期、孕妇或有全身慢性消耗病、严重肝肾疾病者不纳入观察。女病人治疗时避开月经期。
实验方法门诊选择符合观察条件的尖锐湿疣患者40例，随机分组，分为对羟基苯甲酸组、没食子酸组和重组人干扰素α-2β凝胶对照组。
没食子酸和对羟基苯甲酸各10克，两组分别加入1，2-丙二醇20ml、吐温80 15ml、氮酮5ml，混合后各加灭菌蒸馏水至总体积为100ml，得10％外用制剂溶液。
病人用没食子酸或羟基苯甲酸溶液或重组人干扰素α-2β凝胶涂抹患处，每日3次，分早、中、晚局部施药，以能遮盖疣体为宜，上药后暴露患处并限制活动20min。
疗效判定标准观察时间8天，未脱落者继续用，随访12周。
观察指标治疗前仔细清点并描述疣体的部位、形态、大小和数目。
痊愈所有皮损全部消失；显效70％以上皮损消失；进步30％以上皮损消失；无效皮损消退不足30％，原皮损无变化或增大。观察结果见表2。
结果显示外用药治疗尖锐湿疣的重组人干扰素α-2β凝胶是目前公认效果的药物，但最短疗程也要4周。经统计学处理，对羟基苯甲酸和没食子酸效果明显比重组人干扰素α-2β凝胶要好，有显著差异。而且，本发明化合物对皮肤黏膜无明显刺激性，副作用仅有个别人感觉灼热感。
表2 临床外用治疗尖锐湿疣观察结果
实施例5 临床外用治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染取实施例1制备没食子酸微乳消毒液，选经临床诊断单纯疱疹病毒(HSV)感染者22人，随机分为没食子酸微乳消毒液组和无环鸟苷软膏组，每组11人次，每日用药三次，外用涂抹患处。结果显示没食子酸消毒液组平均痊愈天数为3天，而无环鸟苷软膏组平均痊愈天数为5.5天，两者有显著差异。没食子酸消毒液组效果优于无环鸟苷软膏组。
实施例6 液体洗手皂的制备按照表4中所列各成分及其用量比例，往混合罐中加入约5％的水和除对羟基苯甲酸、NaOH或HCl以外的物料，加热到80℃并搅拌直至溶解。冷却到室温，加入没食子酸，搅拌直至物料溶解。用NaOH或HCl调整pH值至5.0，加入余量的水制成产品。
表3 液体洗手皂的制备
权利要求
1.对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗皮肤黏膜病毒性感染药物中的应用，其中对羟基苯甲酸及其类似物选自下述通式(I)所表示的化合物中的一种或几种 其中R1、R2、R3、R4独立地选自OH或H。
2.如权利要求1所述的应用，其中对羟基苯甲酸及其类似物选自以下化合物之一对羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、2，3，4-三羟基苯甲酸、3，4，5-三羟基苯甲酸、2，4，5-三羟基苯甲酸。
3.如权利要求1所述的应用，其中对羟基苯甲酸及其类似物选自以下化合物之一对羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、3，4，5-三羟基苯甲酸。
4.如权利要求1所述的应用，其中对羟基苯甲酸及其类似物是3，4，5-三羟基苯甲酸。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，是将对羟基苯甲酸及其类似物与皮肤用药的各种辅料配伍制备成膏剂、凝胶剂、洗剂、片剂、栓剂、膜剂或喷剂以及药学上可以接受的其他制剂。
6.如权利要求1-4任一项所述的应用，是将对羟基苯甲酸及其类似物与皮肤用药的各种辅料配伍制备成个人护理产品如消毒液、洗手皂、卫生洗手剂、洗浴剂、沐浴胶、洗浴液、个人护理擦试物、擦面纸、鼻内喷雾剂和它们的组合。
7.如权利要求1-4任一所述所述的应用，其中皮肤黏膜病毒性感染是指人和动物皮肤黏膜人乳头瘤病毒、疱疹病毒感染。
8.如权利要求1-4任一所述所述的应用，其中皮肤黏膜病毒性感染是指尖锐湿疣、阴道和宫颈炎及宫颈糜烂。
全文摘要
本发明涉及对羟基苯甲酸及其类似物在制备预防和治疗皮肤黏膜病毒性感染药物中的应用。尤其是在制备预防和治疗人乳头瘤病毒、疱疹病毒感染药物中的应用，该类病毒感染包括尖锐湿疣、阴道和宫颈炎及官颈糜烂。所述应用是将对羟基苯甲酸及其类似物与皮肤用药的各种辅料配伍制备成不同药剂或个人护理产品。
文档编号A61P31/00GK1907275SQ200510012288
公开日2007年2月7日 申请日期2005年8月2日 优先权日2005年8月2日
发明者张庆民, 秦卫华 申请人:盛华(广州)医药科技有限公司