专利名称：抗sars冠状病毒细胞疫苗及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和治疗由SARS冠状病毒引起的非典型性肺炎疫苗的领域，尤其涉及表达SARS冠状病毒S及5个特异性蛋白的细胞疫苗。还涉及该疫苗在抗SARS冠状病毒中的用途。
背景技术：
严重急性呼吸综合征(SARS)作为新兴的烈性传染病在国内蔓延，有效的预防、治疗SARS是目前国家最重要的任务，而目前尚未发现十分有效的治疗药物，因此，有效的预防和治疗SARS已迫在眉睫。
在预防以及治疗方面，疫苗制备是最具前景的方法之一，该方法包括如下几种技术减毒或灭活病毒体、基因工程重组疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗等。治疗性疫苗除了诱导机体产生特异性抗体之外，还能促进T细胞对病毒的杀灭作用。因此在SARS相关冠病毒序列明确之后，可以针对性选取各方案设计预防性疫苗和治疗性疫苗。
国内外对SARS病毒疫苗研制所采用的方法大致分为减毒或灭活活疫苗、基因工程蛋白质或多肽疫苗和DNA疫苗。虽然减毒或灭活活疫苗的制备是经典的制备疫苗的方法，但由于其所需条件高，周期长，而且有毒力恢复的潜在可能性，具有非常大的危险性；基因工程蛋白质或多肽疫苗是将SARS冠状病毒的部分抗原基因在酵母、大肠杆菌等细胞内表达，得到的蛋白质经过纯化后作为疫苗。但由于得不到正确的翻译后加工和半衰期短的缺点，使用该蛋白质制成的疫苗抗原性往往较差，不能使机体产生良好的保护性免疫反应；而DNA疫苗制备简单，周期短，随着SARS病毒基因组全序列的公布，使制备DNA疫苗成为可能，上海对外宣称的不久将问世的SARS疫苗就是DNA疫苗，虽然DNA疫苗有很多的优点，但其安全性仍然是公认的隐患，尤其对有高度变异倾向的SARS病毒，其安全性更值得考虑。
本发明的细胞疫苗是通过分子生物学的方法，将SARS冠状病毒基因组中S及5个特有的cDNA序列克隆到真核表达载体上，将制备好的含不同cDNA序列的重组真核表达载体在体外分别感染靶细胞，将感染后的靶细胞培养2～3天，以便让靶细胞表达SARS冠状病毒所特有的各相应蛋白，并通过这些靶细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对SARS冠状病毒所特有的各相应蛋白进行处理，使其能够被T细胞直接识别，并递呈到细胞膜表面。再灭活细胞并保持其完全的抗原性。与其他方法比较，抗SARS细胞疫苗同时具备快速、安全、有效诱导宿主免疫保护反应的优点。
所述5个特有的cDNA序列均来源于Genebank中，ACCESSIONAY278489GI31416290，具有唯一性和权威性。其中a.原始序列信息见Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其编码的蛋白为BGI-PUP1蛋白idAAP51228.1，cDNA片段为1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt
421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.原始序列信息见Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其编码的蛋白为BGI-PUP2蛋白idAAP51229.1，cDNA片段为1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.原始序列信息见Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其编码的蛋白为BGI-PUP3蛋白idAAP51232.1，cDNA片段为1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.原始序列信息见Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290，其编码的蛋白为BGI-PUP4蛋白idAAP51233.1，cDNA片段为
1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.原始序列信息见Genebank中ACCESSIONAY278489 GI31416290其编码的蛋白为BGI-PUP7蛋白idAAP51235.1，cDNA片段为1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga发明内容本发明的目的在于提供一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，该疫苗安全稳定，能够方便地运输储存，可同时引起人体对SARS冠状病毒体液免疫和细胞免疫。
本发明的另一个目的在于提供一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗在预防和治疗非典型性肺炎中的应用。
本发明中的细胞疫苗是通过分子生物学的方法，将SARS冠状病毒基因组中S及5个特有的cDNA序列克隆到真核表达载体上，将制备好的含不同cDNA序列的重组真核表达载体在体外分别感染异种抗原递呈靶细胞，将感染后的靶细胞培养2～3天，以便让异种抗原递呈靶细胞表达SARS冠状病毒所特有的各相应蛋白，并通过这些靶细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对SARS冠状病毒所特有的各相应蛋白进行处理，使其能够被T细胞直接识别，并递呈到细胞膜表面。再灭活细胞并保持其完全的抗原性。
与其他方法比较，抗SARS细胞疫苗同时具备快速、安全、有效诱导宿主免疫保护反应的优点。
本发明提供的技术方案实施步骤为1.根据SARS冠状病毒的基因组序列分析结果，找到SARS基因组中所特有的5个cDNA序列，它们是冠状病毒所特有的，可能也是SARS发病机制和传染能力异于其他冠状病毒的物质基础之一。因此，首先进行全基因合成这些cDNA序列。
根据其他冠状病毒的研究结果，位于病毒表面的辐条样蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣壳蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以诱导免疫效应，因此S蛋白及M、N蛋白均可应用于抗SARS冠状病毒疫苗研究。因此，也可使用编码SARS冠状病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA制备本发明的抗SARS冠状病毒细胞疫苗。
2.构建SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的真核表达载体。
a、用腺病毒表达载体b、使用逆转录病毒载体c、使用真核表达质粒3.将构建好的SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的真核表达载体导入异种抗原递呈靶细胞中，使异种抗原递呈靶细胞表达相应SARS冠状病毒蛋白。
a、导入方式
i.病毒载体通过感染方式使靶细胞表达相应SARS冠状病毒蛋白。
ii.真核表达质粒通过电转或脂质体转染靶细胞，使其表达相应SARS冠状病毒蛋白。
b、靶细胞的选择B细胞具有强大的抗原处理递呈功能和能大规模培养，是抗SARS冠状病毒的细胞疫苗理想的靶细胞。
4.灭活表达相应SARS冠状病毒蛋白的靶细胞，并保持其抗原性。
i.物理方法 通过γ射线灭活固定靶细胞。
ii.化学方法 通过多聚甲醛或福尔马林液固定灭活靶细胞。
5.将d步所得到的灭活靶细胞充分洗涤去除其他抗原成分后，加入到合适的制剂中，如生理盐水，调节细胞浓度，范围为105～107细胞/ml，即可得到抗SARS冠状病毒的细胞疫苗。
与其他方法制备的抗SARS冠状病毒疫苗相比，本发明中的细胞疫苗具有以下优点①简单快速随着SARS病毒基因组全序列的公布，以及SARS冠状病毒基因组中5个特有的cDNA序列的确认，使制备相应细胞疫苗成为可能，而细胞疫苗的制备所需的全过程不超过1个月，因此，在目前这种紧迫的环境下，细胞疫苗有其优势；而目前认为SARS冠状病毒是一类容易产生变异的病毒，快速有效的针对变异病毒制备疫苗也是细胞疫苗的优势之一；在对SARS冠状病毒了解不多的前提下，将其基因组中5个特有的cDNA序列制备细胞疫苗而不必分析是其中那一段是引起免疫反应的主要因素，这样减少了筛选过程，加速了疫苗的制备过程。
②更加安全在对SARS冠状病毒了解不多的前提下，疫苗的安全性是极其重要的。细胞疫苗的制备只需要知道病毒基因组，而不必直接接触病毒，减少了由实验室途径传播病毒的危险性；通过甲醛灭活后，细胞疫苗不带有活性蛋白和活性核酸物质，以及不带有全长的病毒基因组，从而极大地避免促使病毒变异、病毒回复的危险，增加了细胞疫苗的可靠性；③更加有效B细胞是专业的抗原递呈细胞，有强大的抗原处理递呈能力，重组腺病毒载体在B细胞内大量表达SARS冠状病毒所特有的各相应蛋白，由于T细胞不能够识别这些蛋白，必须通过B细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对这些蛋白进行处理并表达在膜上，才能使其能够被T细胞识别，这样，经甲醛灭活细胞并保持完全的抗原性细胞疫苗不但可以诱导机体产生特异性抗体，还能促进T细胞对细胞内病毒的杀灭作用。因此，该细胞疫苗不但作为预防性疫苗有效，还可作为治疗性疫苗。
由于B细胞是专业的抗原递呈细胞，其本身高表达的免疫共刺激分子能够加强机体对疫苗的免疫反应，使疫苗更加有效。
本发明由如下附图附图1为细胞疫苗直接刺激T淋巴细胞增值的比较柱状图；附图2为免疫后小鼠T淋巴细胞对表达PUP1-5基因片段的正常血管内皮细胞杀伤活性(％)柱状图；
附图3为流式细胞仪检测抗体结果图。
具体实施例1.全基因合成SARS基因组中所特有的5个cDNA序列，它们是冠状病毒所特有的，可能也是SARS发病机制和传染能力异于其他冠状病毒的物质基础之一。
a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca
121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc
121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga根据其他冠状病毒的研究结果，位于病毒表面的辐条样蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和性抗原，核衣壳蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)也可以诱导免疫效应，因此S蛋白及M、N蛋白均可应用于抗SARS冠状病毒疫苗研究。因此，编码SARS冠状病毒S蛋白及M、N蛋白的cDNA制备也可应用于本发明的抗SARS冠状病毒细胞疫苗。
全基因合成SARS基因组cDNA序列整合于pUC18质粒的SmaI位点上。
2.构建SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的真核表达载体。
本发明中的真核表达载体主要作用是能够使上述步骤1目标基因稳定地导入靶细胞中并稳定表达蛋白。本发明的抗SARS冠状病毒细胞疫苗可以使用腺病毒表达载体、逆转录病毒载体、和一般的真核表达质粒来制备。
(1)、使用腺病毒表达载体含有目标基因的pUC18质粒和腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV经Kpn I及Xho I双酶切，0.8％琼脂糖电泳胶回收获得约9.2kb的载体DNA和相应长度的目标基因。目的基因与载体DNA在16℃下经DNA快速连接酶连接17h，连接产物转化新鲜感受态大肠杆菌DH5α，接种卡那霉素LB平板培养16h，挑取阳性克隆扩增培养，用小量质粒提取试剂盒按说明书提取并纯化pAdTrack-sCD40LIg质粒，获得重组穿梭质粒。
分别对重组穿梭质粒酶切鉴定正确后，将正确重组的穿梭质粒用Pme I酶切线性化，转化含腺病毒骨架质粒的感受态pAdEasy-1-BJ5183细菌。卡那霉素选择培养基和PCR筛选阳性克隆，扩增培养，提纯质粒。用Pac I酶切重组质粒，0.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切后产生约30kb和4.5kb左右的两条带。鉴定成功的重组子转化超感受态XL10-Gold菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到重组腺病毒基因组质粒。
重组腺病毒基因组质粒转染293细胞重组腺病毒基因组质粒用Pac I酶切线性化，回收约30kb的大片段8μg，以无抗生素无血清的L-DMEM稀释为250μL；取LipofectamineTM2000脂质体10μL，无抗生素无血清的L-DMEM稀释为250μL，室温下放置5min后同前回收稀释的DNA混合，室温下放置20min，加入6孔培养板中的293包装细胞，轻轻混匀，37℃，5％CO2培养箱中孵育，13天后便可观察到细胞病变效应(cytopathiceffectCPE)。收集完全病变培养孔中的细胞及培养液，-20℃和37℃反复冻融3次，上清加入293细胞中继续感染。收集病变的293细胞及培养液，按上述方法反复冻融3次，离心，上清加入1mg蛋白酶K、2mL1％SDS、10mmol/L EDTA和20mmol/LTris-HCl消化2h。离心取上清，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，获得病毒的DNA，以此为模板进行PCR鉴定。
鉴定正确后获得含有SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的腺病毒表达载体(2)使用逆转录病毒表达载体分别提取酶切含有目标基因的pUC18质粒和pLXSN表达载体质粒DNA，经XhoI、StuI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分别回收5.7Kb pLXSN载体片段和相应长度的目标基因片段，以载体∶插入片段为1∶3的摩尔比按DNA快速连接试剂盒说明连接，转化冷冻保存的JM109感受态菌，挑选阳性转化克隆，扩增，提取质粒，XhoI、StuI双酶切鉴定重组子。
PA317细胞培养于含10％NCS的DMEM培养基中，37℃，5％CO2培养，胰酶/EDTA消化传代。取生长状态良好、增殖活跃的PA317细胞胰酶/EDTA常规消化，计数，以1×105细胞/孔接种6孔塑料培养板，37℃，5％CO2培养24h后(约70％汇合)，无血清DMEM洗3次去除残余血清，然后加入无血清DMEM，37℃，5％CO2 20min；另取DNA/脂质体比例为1ug/1μl的DOSPER和pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP DNA加入HBS中，以100μl/孔的量制备DNA-DOSPER混合液，室温放置15min，缓慢滴加至细胞中，培养6h，DMEM彻底洗去DOSPER，继续培养24h后，常规消化传代，以不同稀释比例接种于9cm培养皿或培养瓶中，加入G418(500ug/ml)，隔天换液，洗去死细胞，12-14天后待抗性克隆长出，在显微镜下标记出生长良好的G418抗性克隆，以克隆环蘸取少许凡士林分隔细胞克隆，向克隆环中加入消化液消化细胞，转入24孔板内培养，然后转入培养瓶中扩增。
分别收获转基因PA317细胞和对照细胞，按107/ml加入异硫氰酸胍变性液，匀浆，转移至15ml离心管中，加入1∶10体积10mol/L乙酸钠溶液，充分混匀，再加1.2倍体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，颠倒充分混合，振荡10sec，于冰上静置15min，离心12000rpm/10min(4℃)取上清入另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，于-20℃放置1hr以上，离心12000rpm/20min(4℃)沉淀RNA，加入原体积的1/10变性液，旋转摇动充分溶解，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置1hr以上，离心12000rpm/20min(4℃)所得RNA沉淀用75％冷乙醇洗涤两次(注意勿打散沉淀物)，同上离心，真空抽干，溶于适量无RNase的去离子水中，紫外分光光度计测RNA含量和纯度。
RNA浓度(ug/μl)＝OD260×核酸稀释倍数×40/1000RNA纯度OD260/OD280不小于1.8-2.0，低于此值则重新抽提，-20℃短期保存。反转录合成DNA反应条件；25℃×10min→42℃×60min→99℃×5min→4℃×5min以反转录产物为模板进行PCR鉴定。
鉴定正确后获得含有SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的逆转录病毒表达载体(3)一般的真核表达质粒分别提取酶切含有目标基因的pUC18质粒和真核表达载体质粒pDNA3.1，经EcoRI、BamHI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分别回收pDNA3.1载体片段和相应长度的目标基因片段后，以载体∶插入片段为1∶3的摩尔比按DNA快速连接试剂盒说明连接，转化冷冻保存的JM109感受态菌，挑选阳性转化克隆，扩增，提取质粒，EcoRI、BamHI双酶切鉴定重组子。
鉴定正确后获得含有SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的真核表达载体3.将构建好的SARS冠状病毒所特有的cDNA序列的真核表达载体导入猪B细胞中，使猪B细胞表达相应SARS冠状病毒蛋白。
(1)、一般的真核表达质粒提取含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1并经酶切鉴定、DNA浓度和纯度鉴定后备用。将猪B细胞于10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基培养。在DOTAP转染前1天传代于6孔板中，接种密度为1.5×105/ml。
①脂质体转染方法取6μg含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1入无菌EP管①中，HBS液稀释至60μl(DNA浓度为0.1μg/μl)；取36μl DOTAP液入另一EP管②中，HBS液稀释至120μl；将①和②轻柔混合后室温孵育15min；然后与6ml培养基混合备用。离心去除所有培养基，每孔中加入1ml转染液进行转染，6h后更换培养基继续培养。
②NucleofectorTM转染方法离心收集猪B细胞，细胞数为106，选择针对B细胞的转染液100μl重悬细胞，加入2μg含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1混合后移入Amaxa特制小杯；然后将小杯放入NucleofectorTM转染仪中，选择B细胞转染程序电转3s，取出小杯用500μl培养基冲洗后移入6孔板的一孔中培养。
通过RT-PCR鉴定目的基因在猪B细胞中的表达。
(2)、腺病毒表达载体步骤2所述重组腺病毒经293细胞大量扩增和氯化铯梯度离心浓缩纯化后，病毒滴度可达到1010-1011pfu，通过空斑形成实验检测确切的病毒滴度后，以MOI 50的浓度感染猪B细胞，感染率大于80％。继续培养3天后，可通过RT-PCR鉴定目的基因在猪B细胞中的表达。
(3)、逆转录病毒表达载体步骤2所述重组腺病毒经PA317细胞大量扩增，将多聚赖氨酸加入过滤后的病毒上清后离心2h以浓缩病毒，病毒滴度可达到106-107pfu，通过空斑形成实验检测确切的病毒滴度后，将猪B细胞接种于培养瓶，加入浓缩病毒100μl、polybrene(聚凝胺)1.6μl，培养3h后续加培养液，继续培养24h后加入G418培养液选择培养，3天后纯化猪B细胞，可通过RT-PCR鉴定目的基因在猪B细胞中的表达。
4.灭活表达相应SARS冠状病毒蛋白的异种抗原递呈靶细胞(猪B细胞)，并保持其抗原性。
(1)、物理方法大量收集步骤3获得的表达相应SARS冠状病毒蛋白的猪B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀通过6000radγ射线灭活固定表达相应SARS冠状病毒蛋白的猪B细胞。用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为2×106/ml。既制备出抗SARS冠状病毒的细胞疫苗。
ii.化学方法大量收集步骤3获得的表达相应SARS冠状病毒蛋白的猪B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，于4℃冰箱内作用24小时，用PBS洗涤后，加入PBS液制成细胞悬液，于4℃冰箱内放置24小时，再用PBS液洗涤，以除去固定液，用血细胞记数板记数细胞后，用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为5×106/ml。既制备出抗SARS冠状病毒的细胞疫苗。
实例2混合淋巴细胞培养实验检测抗SARS冠状病毒的细胞疫苗直接激活人T淋巴细胞抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，无菌下将血置于50ml的塑料离心管中，加入等体积的0.01MPBS稀释，另外于两个50ml的塑料管中加入20ml淋巴细胞分离液，轻轻将上述20ml稀释全血加入淋巴细胞分离液上，保持淋巴细胞分离液与血样品之间界面清晰，2500rpm离心30min，取出离心管，轻轻吸出界限清晰的白膜层于另一塑料管中，予以0.01MPBS，1500rpm离心7min洗涤淋巴细胞，反复洗涤4次，至洗涤液清亮为至，再加入Hanks液悬浮细胞，1000rpm，离心5min，洗涤细胞2次，即获得单个核细胞。把单个核细胞加入培养瓶，37℃，5％CO2孵箱培养3小时，然后轻轻冲吸培养基(含非贴壁细胞)1000rpm，离心5min，以含10％小牛血清的RPMI1640培养基悬浮并调整细胞浓度为1×107/ml。取1ml细胞悬液装入经预处理后尼龙毛柱，关闭阀门；37℃、5％CO2孵育1小时。然后用20ml预温37℃的含20％小牛血清的RPMI1640培养基洗柱，流速1滴/秒(洗脱液中富含T淋巴细胞)。收集最初流出的5ml洗脱液即为富含T淋巴细胞的悬液。以a-醋酸萘酯酶染色法鉴定分离T淋巴细胞悬液纯度。常规台盼蓝染色法检测分离T淋巴细胞存活率。
用RPMI 1640完全培养基悬浮抗SARS冠状病毒的细胞疫苗、人T淋巴细胞，并调整两种细胞浓度为1×107/ml。在96孔板上，抗SARS冠状病毒的细胞疫苗和人T淋巴细胞分别以1×105/孔，5×105/孔加入，每实验组3个复孔。另设阴性对照组，加5×105人T淋巴细胞和1×105猪血管内皮细胞；空白对照组，加5×105人T淋巴细胞。终体积为200μl，不足者以培养基补足。37℃，5％CO2、饱和湿度条件，培养96小时。培养结束前18小时加0.5uCi/孔3H-TdR。用细胞收集器将细胞收集于玻璃纤微滤纸上，蒸馏水反复冲洗，80℃烘干。液闪计数CPM值，结果用3孔平均值表示。
结果见图1结果表明抗SARS冠状病毒的细胞疫苗能够直接激活人T淋巴细胞。
实例3免疫后小鼠T淋巴细胞对表达SARS基因片段的正常细胞杀伤活性检测将6～8周龄、雄性BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组(每组十只)，实验组小鼠每只腹腔内注射200ul(含有1×106)抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，同时对照组小鼠每只腹腔内注射200ul0.9％的生理盐水，每周一次，共4次。收集抗SARS冠状病毒的细胞疫苗免疫后的小鼠T淋巴细胞作为效应细胞，用1640培养液洗涤2遍，计数，调整细胞浓度为1×106/ml。SARS基因片段重组腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1×105/ml。效应细胞做3个复孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，并按照效靶比10∶1加入靶细胞，200ul/孔，每组3个复孔，离心250g 4分钟，37℃、5％CO2孵箱培养6小时，设仅有淋巴细胞和仅有SARS基因片段重组腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞为对照孔。培养4小时后加10ul噻唑蓝(MTT，5mg/ml)，置37℃、5％CO2孵箱中培养4小时。半小时后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100ul溶解紫兰色颗粒。半小时后用酶标仪(Bio-RadModel3550-UV)测量595nm的光密度值(OD595nm)，并计算细胞毒百分率。
结果见图2结果显示免疫组小鼠脾细胞对SARS基因片段重组腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞有很强的杀伤活性。
实例4用流式细胞仪检测免疫后小鼠血清中抗SARS基因片段重组腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞抗体免疫组和对照组小鼠于第三次免疫后的第5天经眼眶采血，收集小鼠血清，分别取1×106个SARS基因片段重组腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞、正常人原代培养血管内皮细胞、空腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞移入流式样品管，用PBS液洗涤，每管加入稀释度为1∶500的小鼠治疗组和对照组血清100ul。以PBS液代替小鼠血清作为一抗空白对照。于4℃冰箱内避光作用1小时，用PBS液洗涤，每管又分别加入羊抗鼠GoatF(ab’)2 Fragment mouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，工作浓度1∶50，室温避光作用30分钟，用PBS液洗涤3次，细胞沉淀加PBS液1ml，上流式细胞仪(Coulter Elite ESP)检测，分析其抗Mel526、MCF-7、K562抗体表达水平和平均荧光强度。
流式细胞仪检测抗体结果见图3从图3可以看出，用免疫组血清染色SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞强阳性，而正常人原代培养血管内皮细胞、空腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞染色阳性，说明免疫组小鼠产生了抗SARS基因片段腺病毒感染的正常人原代培养血管内皮细胞抗体。未免疫组小鼠血清染色上述细胞均为阴性。
权利要求
1.一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于①含有SARS冠状病毒S蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段及5个特有的cDNA片段的真核表达载体；②表达上述SARS冠状病毒基因相应蛋白的异种抗原递呈细胞；③将表达SARS冠状病毒相关蛋白的异种抗原递呈细胞灭活。
2.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于含有SARS冠状病毒S蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段及5个特有的cDNA片段，5个特有的cDNA片段为a.1 atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt61 gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca121 ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc181 aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt241 tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt301 atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca361 tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt421 tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat481 aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc541 aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat601 gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact661 acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca721 ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat781 ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaab.1 atgatgccaa ctactttgtt tgctggcaca cacataacta tgactactgt ataccatata61 acagtgtcac agatacaatt gtcgttactg aaggtgacgg catttcaaca ccaaaactca121 aagaagacta ccaaattggt ggttattctg aggataggca ctcaggtgtt aaagactatg181 tcgttgtaca tggctatttc accgaagttt actaccagct tgagtctaca caaattacta241 cagacactgg tattgaaaat gctacattct tcatctttaa caagcttgtt aaagacccac301 cgaatgtgca aatacacaca atcgacggct cttcaggagt tgctaatcca gcaatggatc361 caatttatga tgagccgacg acgactacta gcgtgccttt gtaagcacaa gaaagtgagt421 acgaacttat gtactcattc gtttcggaag aaacaggtac gttaac.1 atgtttcatc ttgttgactt ccaggttaca atagcagaga tattgattat cattatgagg61 actttcagga ttgctatttg gaatcttgac gttataataa gttcaatagt gagacaatta121 tttaagcctc taactaagaa gaattattcg gagttagatg atgaagaacc tatggagtta181 gattatccat aad.1 atgaaaatta ttctcttcct gacattgatt gtatttacat cttgcgagct atatcactat61 caggagtgtg ttagaggtac gactgtacta ctaaaagaac cttgcccatc aggaacatac121 gagggcaatt caccatttca ccctcttgct gacaataaat ttgcactaac ttgcactagc181 acacactttg cttttgcttg tgctgacggt actcgacata cctatcagct gcgtgcaaga241 tcagtttcac caaaactttt catcagacaa gaggaggttc aacaagagct ctactcgcca301 ctttttctca ttgttgctgc tctagtattt ttaatacttt gcttcaccat taagagaaag361 acagaatgae.1 atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga cccacagatt61 caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag cgccgacccc121 aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat ggcaaggagg181 aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt ccagatgacc241 aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc aaaatga
3.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于含有SARS冠状病毒S蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段及5个特有的cDNA片段的真核表达载体，包括各种病毒表达载体和真核表达质粒。
4.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于采用与宿主不同种属的异种抗原递呈细胞作为细胞疫苗的细胞载体，包括但不限于原代培养和已建系的异种B细胞。
5.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于异种抗原递呈细胞表达上述SARS冠状病毒基因相应蛋白。
6.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗，其特征在于将表达SARS冠状病毒相关蛋白的靶细胞灭活，包括通过多聚甲醛或福尔马林液固定灭活靶细胞，通过γ射线灭活固定靶细胞。
7.根据权利1所述的一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗在预防和治疗非典型肺炎中的应用
全文摘要
本发明公开一种抗SARS冠状病毒的细胞疫苗及应用，所述细胞疫苗①含有SARS冠状病毒S蛋白的全长基因序列的全部或部分基因片段及5个特有的cDNA片段的真核表达载体；②表达上述SARS冠状病毒基因相应蛋白的异种抗原递呈细胞；③将表达SARS冠状病毒相关蛋白的异种抗原递呈细胞灭活。将上述细胞疫苗用于包括人类和啮齿类动物如小鼠在内的宿主进行免疫，使其产生保护性的体液免疫和细胞免疫，以抵抗引起非典型性肺炎传染病的SARS冠状病毒的感染。本发明安全性和稳定性好，生产方便，价格便宜，能诱导机体同时产生针对引起非典的SARS冠状病毒的有效体液免疫和细胞免疫，为治疗和预防非典型性肺炎提供了有效且价廉的疫苗。
文档编号A61K45/00GK1990042SQ20051005709
公开日2007年7月4日 申请日期2005年5月31日 优先权日2005年5月31日
发明者贺伟峰, 吴军 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院