专利名称：一种治疗慢性肝病的复方中药及制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗肝病的中药领域，具体为一种治疗慢性肝病的复方中药及制剂。
背景技术：
慢性肝病是严重危害人们健康的常见病，常用的治疗药物有护肝片、乙肝灵、利肝隆、金牡蛎、板兰根冲剂等多种中成药，还有各种专利治肝中药、偏方等，由于肝病是一种顽固的疾病，各种药物的效果不一，目前常用的治肝药物还是以西药为主，但许多治肝西药存在副作用较大、效果不稳定且成本较高的不足。
阻断和延缓肝纤维化的发展，是治疗慢性肝病的重要方式，是国际肝病研究领域的一大热点。目前，肝纤维化中医基本病机属血瘀、正虚两方面的理论已基本达成共识。因此，抗肝纤维化的中医药研究主要在基本病机认识基础上针对中药复方(经验方，古典方)、单味中药、探寻有效组分或单体成分展开。大量的研究结果虽然研究深度不一，但不同程度地证实了中药抗肝纤维化的有效性。现阶段抗肝纤维化方药的立法组方主要集中在活血和补益两大类的结合。少见将清热解毒、舒肝解郁与活血补益相结合的组方。
见诸报道的有效方药，除临床使用的汤药外，大部分的剂型为片剂和胶囊剂，该类剂型在治则上符合中医治疗慢性疾病的用药习惯，但存在每次单剂量服用的生药量不足的弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清热解毒、舒肝解郁与活血补益相结合的组方治肝病药物，包含叶下珠、马鞭草在内的12味肝病复方药剂，单次服用剂量相当于生药5g以上，其对治疗肝纤维化、慢性肝损伤有很好疗效。
本发明的技术方案是这样实现的一种治疗慢性肝病的复方中药及制剂，所述复方中药及制剂所用的原料包括叶下珠、马鞭草、苦参、白花蛇舌草、三七、丹参、桃仁、柴胡、熟地、人参、茯苓、甘草等12味中药(药材、炮制品、提取物)；其中12味中药配比在1％-99％范围按一定比例搭配，各味中药所占比例在总量的2％-15％之间。复方中药及制剂加工先将述12味荮材切段后，置于热回流提取浓缩器中，提取至回流液无色，得浓缩液，过滤至澄清，超滤，喷雾干燥，干法制粒成每颗粒含生药量10g的颗粒，包装即得。
所述12味药材或是炮制品、药材提取物、中药材与炮制品、中药材与药材提取物、药材炮制品与药材提取物等任意组合，其各种药材的使用量在总药物量的1％-99％间任意搭配，一般为2％-15％。
该复方中药制作经过提取、浓缩、干燥步骤，也可是不经干燥步骤制备的固体或液体提取物，添加或不添加辅料，经必要的制剂步骤制成不同的剂型。
所述提取步骤可采用常规的热回流技术、微波提取技术、超声波提取技术、二氧化碳超临界萃取技术和低温超微提取技术，一般常用低温超微提取技术；提取时使用的溶媒可以是乙醇、水、丙酮等化学溶剂，常用一定浓度的乙醇水溶液或水，以尽量使中药材中的有效成分被完整地提取出来，并保持与药材物理化学性质的同一性。
所述浓缩步骤可以采用蒸发浓缩、冷冻浓缩及膜浓缩，一般采用膜浓缩方式，同时在比较小的范围内控制提取液和浓缩液的温度，温度可控制在45℃以下，一般为15±5℃，以尽量保持提取液的物理、化学性质，使浓缩液与药材的物理、化学性质具有同一性。
浓缩前或浓缩后的精制方法，可采用各种沉淀法、酶解法、树脂吸附法及多级膜过滤法，一般采用树脂吸附法与多级膜过滤法的集成，使浓缩液中的有效成分高度富集，其浓度应达到与生药比的为1∶(1～25)，一般为1∶8与1∶12间。
浓缩液可直接使用，如直接无菌灌封、制成合剂或糖浆剂、凝胶剂、注射液、大输液等液体制剂或半固体制剂；也可干燥后使用，如制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉针剂等固体制剂。
所述干燥步骤可采用烘干法、冷冻干燥法和各种喷雾干燥法，一般采用二流体或压力式喷雾干燥法。
制剂加工过程中添加必要的辅料，辅料可以是各种淀粉类赋形剂如药用淀粉、预胶化淀粉、糊精和麦芽糊精等，也可以是各种不含蔗糖的甜味剂如三氯蔗糖、罗汉果甜素、甜菊素、阿斯巴甜等。
该制剂常用的剂型是口服使用的合剂、糖浆剂和颗粒剂，最佳的剂型是口服颗粒剂，可以一次或分次溶于水中饮用或直接咀嚼吞服，以适应不同类型肝纤维化的临床治疗方案。
本发明所述的治疗慢性肝病的复方中药及制剂，其在试验小鼠、大鼠肝损伤模型应用中效果显著，对治疗人体肝病同样具有很好的开发应用价值。
图1为Con A急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察(×200)图2为D-GalN急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察(×200)图3为大鼠肝组织学，V.G染色，(×200)
具体实施例方式下面结合列表和附图具体说明实施例1按下列配比选取中草药，叶下珠 12％ 马鞭草 12％ 苦 参 10％ 白花蛇舌草 12％三 七 6％ 丹 参 12％ 桃 仁 10％ 柴 胡 6％熟 地 10％ 人 参 4％ 茯 苓 4％ 甘 草 2％
加工制法将以上12味中药材切段，然后置于热回流提取浓缩器中，提取至回流液无色，得浓缩液，过滤至澄清，超滤，喷雾干燥，干法制粒成每g颗粒含生药量10g的颗粒，包装即得。
所述的复方中药及制剂可以是单剂量包装的，也可以是多剂量包装。复方中药及其制剂为固体或半固体状、也可以是液体状态。使用时，复方中药及其制剂可内服、注射，也可以通过皮肤、粘膜渗透。
药效学研究对刀豆蛋白A(Con A)致免疫性肝损伤和D-氨基半乳糖(D-GalN)致化学性肝损伤两种动物模型的保护作用1材料与方法1.1动物NIH小鼠，雌雄各半，体质量18～22g。
1.2药物用时以蒸馏水配成所需浓度；联苯双酯滴丸，每丸含联苯双酯7.5mg，试验时以30g/L的二甲基亚砜溶解，再用蒸馏水稀释至所需浓度；刀豆蛋白A(Con A)为美国华盛顿生物药品公司产品；D-氨基半乳糖(D-GalN)由重庆医科大学生化教研室生产，批号050326。
1.3主要试剂与仪器谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒。分光光度计；台式冷冻离心机；显微镜。
1.4对Con A致小鼠急性肝损伤模型的保护作用60只NIH小鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，本中药复方高、中、低剂量组(分别相当于10倍、5倍和2.5倍临床用药剂量)，联苯双酯(150mg/kg，相当于40倍临床用药剂量)治疗组；除正常对照组外，其他组小鼠于实验首日上午尾静脉注射Con A20mg/kg，各给药组于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃给药1次，末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠再次尾静脉注射Con A20mg/kg，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分离血清待检；断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40％甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。
1.5.对D-GalN致小鼠急性肝损伤模型的保护作用分组和剂量设计同1.4，各治疗组小鼠每日灌胃给药1次，连续4天。末次给药后1h，除正常对照组外，其余组小鼠均以D-GalN 800mg/Kg腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分离血清待检；断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40％甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。
1.6血浆ALT、AST活性检测 采用赖氏法，按试剂盒说明操作，用752型紫外分光光度计于波长505nm处检测吸光值，制定标准曲线，换算成ALT、AST值。
1.7肝组织SOD活性测定 将肝组织制成100g/L匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，按试剂盒说明操作。
1.8病理组织学观察 体积分数为40％甲醛溶液固定肝组织，石蜡包埋切片，常规苏木素伊红(HE)染色，光镜下观察、拍照。
1.9统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行统计分析，多组计量资料分析采用One way ANOVA，多重比较采用LSD。
2.结果2.1对Con A致小鼠急性肝损伤模型的保护作用表1对Con A致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝组织SOD活性的影响(X±S)
**P＜0.01，与正常组比较；△△P＜0.01，与模型组比较(下同)
由表1可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常组明显升高、肝组织SOD活性较正常组明显降低，差异均具有显著性意义(P＜0.01)。中药高、中剂量组ALT、AST活性均明显低于模型组，差异有显著性意义(P＜0.01)，而与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。中药高、中剂量组肝组织中SOD的活性明显高于模型组，差异有显著性意义(P＜0.05)，但中剂量组与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。
肝组织病理学观察光镜下见正常组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦未见异常。模型组全部小鼠肝组织均出现明显病变，小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见凋亡小体、明显的点状坏死和灶性坏死，坏死灶可见大量炎性细胞浸润；汇管区淋巴细胞和单核细胞炎性浸润尤为明显，肝窦内可见红细胞瘀积。该复方高、中剂量组和联苯双酯组部分肝组织可见散在点状坏死和灶性坏死，肝细胞损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润显著减少(图1)。
2.2对D-GalN致小鼠急性肝损伤模型的保护作用表2.对D-GalN所致肝损伤小鼠血清ALT，AST及肝组织SOD活性的影响(X±S)
由表2可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常组明显升高、肝组织SOD活性较正常组明显降低，差异均具有显著性意义(P＜0.01)。中药中剂量组血清ALT、AST活性降低、肝组织SOD活性升高，与模型组比较有显著性差异(均P＜0.05或＜0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P＞0.05)。
肝脏病理组织学观察光镜下见正常组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整，无病理改变。模型组全部小鼠肝组织均出现病变，大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见广泛的肝细胞脂肪变性、点状坏死和灶性坏死，并出现炎性细胞浸润。复方高、中剂量组和联苯双酯治疗组肝细胞变性、坏死程度显著减轻，炎性细胞浸润减少，肝组织病变明显改善(图2)。
对二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化形成的抑制作用1材料与方法1.1实验动物Wistar雄性大鼠，体重150～180g由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号2004A068。
1.2药物 二甲基亚硝胺。复方用时以蒸馏水配成所需浓度。秋水仙碱规格1mg/片，用时以生理盐水溶解。
1.3主要试剂 羟脯胺酸(Hyp)和丙二醛(MDA)检测试剂盒。透明质酸(HA)检测试剂盒。
1.4主要仪器 台式冷冻离心机；放免测量仪；全自动生化检测仪；分光光度计；倒置显微镜。
1.5动物分组及造模给药72只Wistar雄性大鼠，随机分为6组，每组12只，分别为正常组，模型组，中药复方高剂量组、中剂量组和低剂量组(分别相当于10倍、5倍和2.5倍临床用药剂量)，秋水仙碱治疗组(0.2mg/kg)。除正常组外，其余各组动物均进行肝纤维化模型制备以0.5％DMN溶液(1∶199生理盐水稀释)按体重10mg/kg剂量腹腔注射，每周连续3天，每天1次，第1周每次用2/3剂量，以后用全量，共4周，在制备模型的同时，复方高、中、低剂量组和秋水仙碱治疗组均灌胃给药，每天1次，共四周，正常组和模型组均予等量生理盐水灌胃。第四周末处死动物，摘眼球取血，分离血清，待检；取肝左叶组织，一部分制成匀浆待检，一部分用10％甲醛溶液固定，送检。
1.6血清肝功能及HA检测采用全自动生化仪检测血清肝功能，放免法检测血清HA。
1.7肝组织Hyp及MDA测定采用碱水解法检测肝组织Hyp，采用硫代巴比妥酸比色法检测肝组织MDA，按试剂盒说明操作。
1.8病理组织学观察10％甲醛溶液固定肝组织，石蜡包埋切片，常规HE染色和V.G特殊染色，光镜下观察拍照，肝组织纤维化病变按严重程度分为五期(S0-4)①S0无病变。②S1汇管区、汇管区周围纤维化，局限窦周或小叶内纤维化，不影响小叶结构的完整性。③S2汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，但小叶结构大部仍保留。④S3大量纤维间隔，分隔并破坏肝小叶，致小叶结构紊乱，但尚无肝硬化。⑤S4早期肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。
1.9统计学方法采用SPSS10.0软件包进行统计分析，多组计量资料分析采用One way ANOVA，多重比较采用LSD。等级分组资料采用Ridit检验。
2.结果2.1大鼠死亡数全部实验结束后，模型组和秋水仙碱组大鼠各死亡2只，复方低剂量组死亡3只，共死亡7只，死亡多在造模第2周后发生。正常组、复方高、中剂量组均无大鼠死亡。
2.2复方对肝纤维化大鼠肝功能的影响表3.对肝纤维化大鼠肝功能的影响(X±SD)
注#P＜0.05，与正常组比较；*P＜0.05，与模型组比较；△P＜0.05，与秋水仙碱组比较。
由表3可知，模型组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)水平较正常组明显升高，差异均具有显著性意义(P＜0.05)。
中药复方高、中、低剂量组AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平均明显低于模型组，差异均有显著性意义(P＜0.05)。
秋水仙碱组AST、GGT、TBIL水平均明显低于模型组，差异有显著性意义(P＜0.05)。
该中药复方中剂量组AST、ALP、TBIL、DBIL水平均明显低于秋水仙碱组，差异有显著性意义(P＜0.05)。
该中药复方中剂量组AST、ALP水平均明显低于低剂量组，差异有显著性意义(P＜0.05)；与高剂量组比较，ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平的差异均无显著性意义(P＞0.05)。
2.对肝纤维化大鼠肝组织Hyp、MDA和血清HA含量的影响表4.对肝纤维化大鼠肝组织Hyp、MDA和血清HA含量的影响(X±SD)
注☆P＜0.01，与正常组比较；*P＜0.05，与模型组比较；△P＜0.01，与秋水仙碱组比较；●P＜0.05，与中剂量组比较；P＜0.01，与中剂量组比较。
由表4可知，模型组大鼠肝组织的Hyp、MDA和血清HA含量较正常组明显升高，差异均具有显著性意义(P＜0.01)。
该复方高、中、低剂量组和秋水仙碱组的Hyp含量均明显低于模型组，差异有显著性意义(P＜0.05)。
该复方中剂量组大鼠肝组织Hyp、MDA和血清HA含量均明显低于模型组和低剂量组，差异均有显著性意义(P＜0.05)；与秋水仙碱组比较，差异均有显著性意义(P＜0.01)。
该复方中剂量组肝组织Hyp和MDA含量均明显低于高剂量组，差异有显著性意义(P＜0.01)。
2.4病理组织学观察肝组织HE和V.G染色显示，正常组大鼠肝细胞束排列整齐，呈单行放射状排列在中央静脉周围，无肝细胞变性、坏死和纤维增生改变，肝窦无扩张出血。模型组大鼠肝索排列紊乱，肝细胞空泡变性，可见大片肝细胞出血性坏死，在门脉区有大量的结缔组织增生，胶原纤维增生明显，有宽大的纤维间隔，向小叶内伸展，形成假小叶，大部分大鼠肝小叶结构破坏，有少量的炎性细胞浸润；中药复方高、中、低剂量组肝细胞变性坏死较模型组明显减轻，肝组织内结缔组织增生程度明显减轻，胶原分布显著减少，纤维间隔变细，尤以中剂量肝组织病变改善效果更为良好，肝小叶结构基本完整，极少假小叶形成，胶原沉积明显减少。
统计结果显示，该复方高、中、低剂量组肝组织纤维化病变明显减轻，与模型组比较，差异均有显著性意义(P＜0.01)。结果见表5，图3(ABCDEF)。
表5.复方对实验大鼠肝组织纤维化病变的影响
ALT与AST均为肝细胞中非特异性细胞功能酶，ALT主要存在于肝细胞的非线粒体中，而80％的AST存在于线粒体中；在中等肝细胞损伤时，ALT漏出率远大于AST，因此ALT反映肝细胞损伤的灵敏度较AST高；但在严重慢性肝损伤时，线粒体破坏增加，可导致AST释放增加，血清中AST活性升高，ALT/AST比值降低；而当肝硬化形成时，ALT可正常或轻度升高[10]。本实验研究模型组大鼠处死后解剖见大鼠肝脏明显缩小，质地变硬，肝脏病变较各给药组严重，且可见大量血性腹水，病理形态学检查显示肝组织纤维化病变程度大部分呈S3、S4，期，基本上已形成早期当肝硬化，或肝硬化病变，表明模型组肝硬化病变的发展速度要较各给药组快，肝实质病理改变较各给药组严重，但其血清ALT水平反而低于各给药组，提示严重的肝组织纤维化病变应以病理形态学诊断为主，并在早期进行药物干预治疗，阻断疾病发展进程。
权利要求
1.一种治疗慢性肝病的复方中药及制剂，其特征在于复方中药及制剂所用的加工原料包括叶下珠、马鞭草、苦参、白花蛇舌草、三七、丹参、桃仁、柴胡、熟地、人参、茯苓、甘草等12味中药(药材、炮制品、提取物)；所述12味中药配比在1％-99％范围按一定比例搭配，各味中药所占比例为总量的2％-15％之间。
2.根据权力要求1所述的复方中药及制剂，其特征在于复方中药及制剂加工过程先将述12味荮材切段后，置于热回流提取浓缩器中，提取至回流液无色，得浓缩液，过滤至澄清，超滤，喷雾干燥，干法制粒成每颗含生药量10g的颗粒，包装即得。
全文摘要
本发明涉及治疗肝病的中药领域，具体为一种治疗慢性肝病的复方中药及制剂。其配料包含叶下珠、马鞭草、苦参、白花蛇舌草、三七、丹参、桃仁、柴胡、熟地、人参、茯苓、甘草等12味中药(药材、炮制品、提取物)；其中12味中药配比在1％－99％范围按一定比例搭配，各味中药所占比例在总量的2％－15％之间。其具有清热解毒、舒肝解郁与活血补益的功效，对治疗肝纤维化、慢性肝损伤有很好疗效。
文档编号A61K9/16GK1814049SQ200510101058
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者李长青, 宋力飞, 刘乡乡 申请人:广州泽力医药科技有限公司