专利名称：抑制PCNA基因表达的siRNA序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药领域，尤其涉及一种高效抑制PCNA基因表达的siRNA序列及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作为DNA聚合酶δ、ε的辅助蛋白，是细胞DNA复制及修复必须的辅助因子之一，并通过与各种蛋白相互作用，对细胞周期控制、染色体有丝分裂等多种事件进行协同调控，许多细胞内外增殖信号都必须经过PCNA的参与，才能引发细胞DNA合成及分裂增殖。经研究发现PCNA在多种肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤的大小、组织学分级、核分裂相计数、转移及预后密切正相关，而在静止期细胞表达量很少或不表达。PCNA的表达量常常作为临床肿瘤组织的增殖指标，辅助判断肿瘤分级与预后。理论上，抑制PCNA的表达，可以阻断肿瘤细胞的增殖通路，在肿瘤的基因治疗中具有十分诱人的应用前景。国内外实验研究表明，将PCNA反义寡核苷酸导入细胞，降解PCNA mRNA，抑制PCNA表达，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。但反义寡核苷酸效果较差，限制了其应用。最近发展起来的小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)技术可以比以往的任何手段更高效、特异、方便的沉默靶基因的表达，极低量的siRNA就可以得到良好的基因抑制效果。通过RNAi技术，可较方便地获得与基因敲除类似的表型，近年来受到极为广泛的关注。恶性肿瘤的发生发展常与一些关键基因的过高表达或突变有关，应用siRNA沉默致病基因在恶性肿瘤基因治疗中具有良好的发展前景。
siRNA和传统的反义寡核苷酸(ASODN)均在mRNA水平特异性关闭靶基因表达。ASODN与靶mRNA结合后，通过激活RNase H特异性降解RNA-DNA复合物，或与靶基因的双链DNA结合形成三链复合物，阻碍基因的转录。但ASODN稳定性较差，能非特异性结合细胞内源性蛋白而具有细胞毒性，修饰后的ASODN稳定性有所增加但毒性更甚。而且，抑制靶基因表达需高浓度ASODN才能起作用，这使细其胞毒性进一步加重。十多年来，ASODN应用于基因治疗的研究进展缓慢。RNA干扰(RNAi)是近几年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，双链RNA(dsRNA)导入细胞后，在Dicer酶的作用下，降解为21-23bp，3’端带有2个突出碱基的siRNA(small interference RNA)，并与细胞内核酸内外切酶、解链酶、Argonaute蛋白等结合，形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物——RISC(RNA-inducing silencing complex)，高效递进式介导细胞内源性的同源mRNA的降解。哺乳动物细胞内，导入长双链RNA可导致基因表达广泛抑制，直接应用短双链的siRNA同样高效介导RNAi，并避免非特异性基因抑制效应。与ASODN作用效果相比较，siRNA具有显著优势。首先，siRNA作用特异性更高；其次，少量的siRNA即可发挥显著的同源mRNA降解作用，siRNA抑制细胞增殖的IC50值比针对相同基因的效果最佳的或同靶点ASODN的IC50低100～1000倍，降解效率明显高于ASODN；另外，siRNA导入细胞后，能高效迅速的结合到RISC中，大大减少非特异结合细胞内源性蛋白的几率，使siRNA稳定性增强而细胞毒性减弱。
但是，作用于相同靶基因不同位点的siRNA的作用效果差异很大，可能与siRNA的碱基分布，两端自由能大小及靶mRNA的二级结构等有关。在siRNA沉默特定基因的实验中，为保证siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要针对靶基因设计合成多条不同序列的siRNA，在从中筛选出有效序列。有效siRNA序列的设计筛选是siRNA介导RNAi实验的关键点之一。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一组能高效抑制人PCNA基因表达的siRNA序列。
根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列(LOCUSNM_002592)，采用RNA strcture分析软件对PCNA mRNA序列的二级结构进行预测，总结以往提出的siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等，在siRNA在线设计软件设计结果的基础上，进一步寻找合适的siRNA靶序列，初步选择出四条符合要求的siRNA序列。采用NCBI GenBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，四条序列的碱基序列及作用位点如表1所示表1 靶向PCNA mRNA设计的一组siRNA
上述正义链和反义链3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰。
本发明的另一个目的在于提供上述PCNA siRNA在制备抗肿瘤药物中及基因功能研究中的应用。
本发明针对人PCNA的mRNA序列设计合成了一组siRNA，筛选出三条PCNA siRNA(PCNA siRNA2、PCNA siRNA3、PCNA siRNA4)能明显抑制肿瘤细胞增殖，其中以PCNA siRNA2、PCNA siRNA4效果最好。经RT-PCR及免疫细胞化学方法检测，发现PCNA siRNA2、PCNA siRNA4可显著成功下调PCNA mRNA及蛋白水平的表达，并在三种不同的肿瘤细胞上验证了设计合成的PCNA siRNA对肿瘤细胞增殖等生物学特性的影响，为PCNA siRNA应用于恶性肿瘤的临床治疗奠定基础。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果首先，PCNA是肿瘤基因治疗的良好靶点，应用siRNA介导的RNAi技术可以比以往的任何手段更高效、特异、方便的抑制靶基因的表达。本发明筛选出能高效抑制PCNA基因表达的siRNA序列，并作用于肿瘤细胞，检测微量PCNA siRNA抑制PCNA表达后肿瘤细胞在增殖、细胞周期及凋亡方面的变化，为PCNA siRNA应用于恶性肿瘤的临床治疗奠定重要基础。
其次，由于PCNA基因在胚胎发育中的重要作用，PCNA基因敲除的动物模型至今仍无法获得，限制了PCNA基因功能的进一步研究。siRNA介导的RNAi可以高效特异抑制PCNA基因的表达，可达到近似基因敲除的效果。本发明筛选除出能高效抑制PCNA基因表达的siRNA序列，为PCNA基因功能的进一步研究奠定重要基础。
图1为RT-PCR结果图；图2为免疫细胞化学结果图；图3为克隆形成抑制实验部分结果图(吉姆萨染色，×100)；图4为细胞周期分析结果图；图5为annexinV-PI双染流式细胞仪检测细胞的凋亡情况图；图6为Hchest33258染色细胞形态学变化图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
实施例1根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列(LOCUSNM 002592)，采用RNA strcture分析软件对PCNA mRNA序列的二级结构进行预测，总结以往提出的siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等，在siRNA在线设计软件设计结果的基础上，进一步寻找合适的siRNA靶序列。初步选择出四条符合要求的siRNA序列。采用NCBI GenBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，四条序列的碱基序列及作用位点如表1所示(正义链及反义链3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰)。
实施例2改良MTT法筛选有效抑制癌细胞增殖的序列将人肝癌SMMC7721细胞、人结肠癌Caco2细胞、人胃癌SCG7901细胞分别调至5×104/mL浓度，接种于96孔板，100μL/孔，24h后吸尽培养液上清，更换为60μL无血清OPTI-MEM培养液(Gibico CO.)，用无血清OPTI-MEM培养液分别稀释4条转录得到的siRNA(PCNA siRNA1、PCNA siRNA2、PCNAsiRNA3、PCNA siRNA4)和脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogen)，室温孵育5min后，再将siRNA与脂质体混合，室温孵育30min后，逐滴加入孔板，每孔终体积100μL，每种细胞的siRNA作用浓度分别设为25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L，放置孵箱孵育6h后，每孔加入100μL含血清培养液继续培养。设已经证明有较好效果的PCNA反义寡核苷酸组(序列为5’-GAC CAG GCGCGC CTC GAA-3’，全硫代修饰，浓度设为20μmol/L)作为阳性对照，另设空白对照组及单纯脂质体组，脂质体0.2μL/孔。CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测细胞增殖抑制情况。转染时间分别达到24h、48h、72h后，每孔加入MST试剂10μL，室温孵育60min，酶标仪(Bio-Rid)检测每孔吸光度，计算细胞的增殖抑制率。
表2 四对PCNA siRNAs(50nmol/L)转染不同肿瘤细胞48小时后细胞增殖抑制率(％).
1)ASODN终浓度20μmol/L； LipolipofectamineTM2000，0.2μL/孔2)PCNA siRNA2与.PCNA siRNA4对不同细胞的增殖抑制作用显著强于其他各组，P＜0.01表3 PCNA siRNA2在不同剂量及作用时间下对Caco2的增殖抑制率(％)
1)与相同浓度的其他各组比较差别有统计学意义，P＜0.052)与相同作用时间的其他各组比较差别有统计学意义，P＜0.05表4 PCNA siRNA4在不同剂量及作用时间下对Caco2的增殖抑制率(％)
1)与相同浓度的其他各组比较差别有统计学意义，P＜0.052)与相同作用时间的其他各组比较差别有统计学意义，P＜0.05再选择抑制肿瘤细胞效果最好的PCNA siRNA2、PCNA siRNA4转染结肠癌Caco2细胞，检测转染后PCNA mRNA及蛋白表达水平变化，siRNA浓度均为50nmol/L，转染48h后检测。
实施例3RT-PCR检测PCNAmRNA表达取人结肠癌Caco2细胞，细胞处理及转染方法如上述，PCNA siRNA2、PCNA siRNA4浓度均为50nmol/L，以20μmol/L的PCNAASODN作阳性对照。转染48h后，TRIZOL(Invitrogen)法常规提取细胞总RNA，ReverTra Dash TMRT-PCR试剂盒(Toyobo Co.Japan code no.PCR400美津生物公司)反转录为cDNA，PCR条件设置为94℃预变性5min后，94℃持续30s，56℃持续30s，72℃持续1min，共30个循环，72℃后延伸5min。引物序列参照文献合成，PCNA扩增引物序列为P1 5’aaa cca gct aga ctt tcc tc 3’；P2 5’tca cgc cca tgg cca ggt tg3’，同时扩增β-actin作为内参，引物序列为P1’ 5’atc tgg cac cac acc ttc ta 3’，P2’ 5’ctt ctt aat gtc acg cac ga 3’，扩增产物经琼脂糖电泳后拍照，gene tool软件分析计算PCNAmRNA表达抑制率。如图1所示，泳道1Marker(依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp)；泳道2PCNA siRNA2-50nmol/L组；泳道3PCNA siRNA2-100nmol/L组；泳道4PCNA siRNA4-50nmol/L组；泳道5PCNA siRNA4-100nmol/L组；泳道6ASODN 20μmol/L组；泳道7对照组。PCNA siRNA显著下调靶基因mRNA水平，基因表达抑制效果明显强于ASODN。50nmol/L与100nmol/L两组间差异不明显。RT-PCR电泳结果经genetool软件分析，50nM PCNA siRNA2与100nM PCNA siRNA2抑制率分别为70.5％、82.4％，50nM PCNA siRNA4与100nM PCNA siRNA4的抑制率分别为73.5％、79.4％。
实施例4免疫细胞化学法检测PCNA蛋白表达将经过处理的盖玻片置入24孔板，每孔加入1mL 5×104/mL浓度的细胞，24h后按上述方法进行转染，48h取出玻片，中性缓冲福尔马林固定，0.3％的Triton-X-100透膜处理，3％甲醇双氧水(A液)阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加入鼠抗人PCNA单克隆抗体，37℃孵育2h后，依次加入生物素标记的二抗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物的三抗，DAB(二氨基联苯胺)显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PCNA为核内蛋白，当显色结果阴性时，为显示细胞核位置，用苏木素轻度染核。有阳性显色结果则不复染。如图2所示，A正常对照Caco2细胞，PCNA阳性表达于细胞核(棕黄色)；B50nmol/L siRNA转染后48h Caco2细胞，几乎见不到阳性着色细胞，苏木素极轻度复染以便核定位。
实施例5克隆形成抑制实验检测细胞克隆形成能力各组细胞处理方法同上，转染8h后，各组细胞均用胰酶消化，计数3次取均值，再将细胞以300/mL的浓度接种于24孔板，1mL/孔，孵箱内孵育12天后收板，3∶1的甲醇∶冰醋酸固定液固定，吉姆萨染色后，显微镜下观察照相。如图3所示，A正常对照；B20μmol/LPCNAASODN；C50nmol/LPCNAsiRNA2；D50nmol/L PCNA siRNA4。PCNA siRNA使肿瘤细胞克隆形成数量及克隆大小显著降低，比百倍浓度的ASODN的抑制作用更强，差异明显。(注为24孔板稀释培养法，400/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养7天。)实施例6PI单染流式细胞仪检测细胞周期及亚二倍体峰各组细胞按上述方法处理，于转染后48h后胰酶消化收集，预冷的PBS(磷酸缓冲液)反复洗涤后，用体积分数为70％乙醇4℃下固定30min。上机前用含Rnase(RNA酶)及PI(propidium iodide，碘化丙锭)的染色液染色，30min后流式细胞仪(Becton Dickinson公司)测定各组细胞的DNA含量，计算细胞生长周期变化及亚二倍体峰比例，用CELLQUEST软件分析处理结果。如图4所示，A图为正常对照组细胞，未出现M1凋亡峰，M2峰代表G0/G1期细胞，比例为69.73％，M3峰代表S期细胞，比例为16.96％，M4代表G2/M期细胞，比例为13.23％；B图为50nmol/L siRNA转染后48h细胞，检测结果出现明显的M1凋亡峰，S期细胞比例上升到25.39％，G2/M期细胞上升到25.25％。PI单染后流式细胞仪检测细胞周期结果显示，siRNA转染后细胞周期明显阻滞于G2/M期，S期细胞亦明显增加，并出现明显的凋亡峰。以往研究表明，PCNA在细胞由G0/G1期向S期转化及G2/M期转化中均具有十分重要的作用，PCNA表达抑制可以使细胞阻滞于G0/G1期或G2/M期，而以G0/G1期阻滞的报道多见。PCNA基因表达抑制后，细胞周期阻滞点不同的原因待进一步研究。细胞种类特异性或对PCNA表达抑制的程度不同是可能的原因。
实施例7Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例，荧光显微镜观察细胞凋亡形态细胞处理及转染方法同上，转染后48h胰酶消化收集各组细胞，Annexin V-PI双染试剂盒(宝赛，北京)检测细胞凋亡率变化。取适当浓度的细胞经预冷PBS反复洗涤，200ul Binding Buffer(结合反应液)重悬后，分别加入10ulAnnexin V-FITC(异硫氰基荧光素标记的膜连蛋白V)和5ul PI(碘化丙啶)，轻轻混匀，避光室温反应15min，再加入300ul Binding Buffer，立即上机检测。Annexin V-FITC+，PI-的细胞群(即LR细胞群)为早期凋亡细胞。如图5所示，siRNA设为12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L六个梯度。与空白对照组相比，流式细胞仪检测到siRNA转染后细胞出现明显的早期凋亡群，并呈一定的浓度依赖性，当浓度达到50nmol/L后，凋亡的比例不再随浓度增加而明显增加。左下限LL为正常细胞，右下限LR为早期凋亡细胞，右上限UR为晚期凋亡细胞及坏死细胞。空白对照组LR＝4.01％，siRNA 12.5nmol/L组LR＝22.35％，siRNA 25nmol/L组LR＝29.11％，siRNA50nmol/L组LR＝37.46％，siRNA 100nmol/L组LR＝42.77％，siRNA 200nmol/L组LR＝43.20％。
另取一部分细胞，经预冷PBS反复洗涤后，涂片固定，Hochest33258避光染色15min，流水冲洗10min后荧光显微镜观察细胞凋亡形态并照相。如图6所示，Hchest33258染色观察细胞形态学变化。图6A为正常对照组细胞；图6B为50nmol/L siRNA处理后的细胞，出现核固缩、碎裂等典型的凋亡形态学变化。
综上所述，本发明筛选出的PCNA siRNA2、PCNA siRNA4能够通过高效抑制细胞内PCNA基因的表达。转染肿瘤细胞，可阻断肿瘤细胞的增殖途径而显著抑制细胞增殖，明显阻滞细胞周期，并高效诱导肿瘤细胞的凋亡，为PCNAsiRNA应用于恶性肿瘤的基因治疗奠定了重要的实验基础。同时，筛选出的PCNA siRNA序列能高效沉默细胞内PCNA基因的表达，为PCNA基因功能的进一步研究奠定基础。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>抑制PCNA基因表达的siRNA序列及其应用<130>4<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA1正义链<400>1ccucaccagu auguccaaa 19<210>2<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA1反义链<400>2uuuggacaua cuggugagg 19<210>3<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA2正义链
<400>3gccacuccac ucucuucaa 19<210>4<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA2反义链<400>4uugaagagag uggaguggc 19<210>5<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA3正义链<400>5gaugccuucu ggugaauuu 19<210>6<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA3反义链<400>6aaauucacca gaaggcauc 19<210>7<211>19
<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA4正义链<400>7guugauggau uuagauguu 19<210>8<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根据生物信息学方法在genebank获取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析软件及siRNA在线设计软件设计的PCNA siRNA4反义链<400>8aacaucuaaa uccaucaac 19
权利要求
1.一种抑制人PCNA基因表达的siRNA序列，包括下述序列中的任一条或一条以上PCNA siRNA1 正义链5’CCU CAC CAG UAU GUC CAA A 3’反义链5’UUU GGA CAU ACU GGU GAG G 3’；PCNA siRNA2 正义链5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反义链5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA3 正义链5’GAU GCC UUC UGG UGA AUU U 3’反义链5’AAA UUC ACC AGA AGG CAU C 3’；PCNA siRNA4 正义链5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反义链5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
2.根据权利要求1所述的一种抑制人PCNA基因表达的siRNA序列，包括以下三条序列PCNA siRNA2 正义链5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反义链5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA3 正义链5’GAU GCC UUC UGG UGA AUU U 3’反义链5’AAA UUC ACC AGA AGG CAU C 3’；PCNA siRNA4 正义链5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反义链5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
3.根据权利要求1所述的一种抑制人PCNA基因表达的siRNA序列，包括以下两条序列PCNA siRNA2 正义链5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反义链5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA4 正义链5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反义链5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种抑制人PCNA基因表达的siRNA序列，其特征在于，所述正义链和反义链均以UU或dTdT为悬垂修饰。
5.权利要求1或2或3所述的任一条或一条以上的siRNA序列在制备抗肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学与生物医药领域，公开了一种高效抑制PCNA基因表达的siRNA序列及其在制备抗肿瘤药物中的应用。应用PCNA siRNA可以更高效、特异、方便的抑制靶基因的表达，本发明筛选出能高效抑制PCNA基因表达的siRNA序列，并作用于肿瘤细胞，检测微量PCNA siRNA抑制PCNA表达后肿瘤细胞在增殖、细胞周期及凋亡方面的变化，为PCNA siRNA应用于恶性肿瘤的临床治疗奠定重要基础。
文档编号A61P35/00GK1793360SQ200510100978
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月10日 优先权日2005年11月10日
发明者史金桃, 蒋建伟, 曾慧兰, 曹明溶 申请人:暨南大学