专利名称：用于促进血管生成的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于促进血管生成的药物组合物。
背景技术：
血管生成是一个从胚胎阶段开始的系统血管网的形成过程，且与通过复杂过程的增殖有关，该过程不仅包括血管内皮细胞的增殖，也包括内皮细胞的迁移或管的形成、基底膜的形成等。
近来，已对调节血管生成的因子进行了研究，并且尝试了其治疗的应用。肿瘤等的发生与血管生成的不良调节紧密相关。其治疗需要抑制血管生成，但是，相反，也广泛需要对促进血管生成的治疗。
例如，已发现促进血管生成的因子，血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFBF)、肝细胞生长因子(HGF)等，且通过利用这些因子和其基因，已经尝试和验证了对本质上需要改进血液循环的疾病的治疗方法，例如闭塞性动脉硬化、缺血性心脏病等。
但是，由于这些生长因子都是蛋白质，所以存在很多问题，例如难以口服给药、重复给药引起的过敏反应、使用病毒载体的基因治疗的情况下的病毒安全性和例如水肿的副作用，因此需要新开发治疗剂。
生理性血管生成在成熟组织的微脉管形成是公认的，且公知通过象血管内压的变化这样的物理因素而形成。例如，已报道长期给予具有血管舒张活性的哌唑嗪或环磷腺苷(adenosine)，可增加微循环中对血管的物理剪切应力，因而促进血管生成(Dawson，J.M.，Cardiovasc.Res.23，913～920，1989；和Ziada，A.M.，C ardiovasc.Res.18，724～732，1984)，但是这些化合物没有直接血管生成促进功能。
发明内容
本发明的目的是为克服上述问题而提供具有直接血管生成促进功能的药物。
本发明人进行广泛研究而发现具有直接血管生成促进功能的新型药物。结果，我们发现由下面通式(1)表示的哌啶化合物或其盐具有直接血管生成促进功能，并且即使在认为不反映血管舒张功能的主动脉环培养分析中也能促进血管内皮细胞的迁移和管的形成。本发明根据这一认知而完成。
1、本发明提供一种用于促进血管生成的药物组合物，包含选自包括由通式(1)所示的哌啶化合物或其盐的组的至少一种化合物 其中R表示苯甲酰基基团，其可以具有选自包括氨基基团的组的1～3个基团作为苯环上的取代基，该氨基基团可具有低级烷酰基基团和低级烷基基团；R1表示氢原子或低级烷基基团；和R2表示苯基低级烷基基团。
2、如上所述，本发明提供一种用于促进血管生成的药物组合物，其中哌啶化合物为4-[N-甲基-N-(2-苯乙基)氨基]-1-(3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰)哌啶。
3、如上所述，本发明提供一种用于促进血管生成的药物组合物，其中用于促进血管生成的药物组合物是用于血管的不充分发育和再生的疾病，以及由暂时缺血引起的各种疾病的预防性或治疗性药物。
4、如上所述，本发明提供一种用于促进血管生成的药物组合物，其中血管的不充分发育和再生的疾病，以及由暂时缺血引起的各种疾病为心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、老年痴呆症和伴随糖尿病的多种器官损伤。
包含在本发明的用于促进血管生成的药物组合物中的通式(1)的哌啶化合物或其盐是公知的化合物，例如在日本A-6-340627(1994)中有其描述。
在本发明中，上文通式(1)中所示的各基团将在下文更具体地进行描述。
对于低级烷基基团，其例子包括具有1～6个碳原子的直链或支链烷基基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、正己基、异己基、3-甲基戊基等。
对于可具有低级烷酰基的氨基基团，其例子包括具有1～6个碳原子直链或支链烷酰基基团的氨基基团，例如氨基、甲酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、异丁酰氨基、戊酰氨基、叔丁碳酰基氨基(tert-butylcarbonylamino)、己酰氨基等。
对于在苯环上可具有选自包括可具有低级烷酰基和低级烷基的氨基的组的1～3个取代基的苯甲酰基基团，其例子包括在苯环上具有1～3个取代基的苯甲酰基基团，其中该取代基选自包括具有1～6个碳原子的直链或支链烷酰基和具有1～6个碳原子的直链或支链烷基的氨基的组，例如苯甲酰基、2-甲基苯甲酰基、3-乙基苯甲酰基、4-正丙基苯甲酰基、2-异丙基苯甲酰基、3-正丁基苯甲酰基、4-异丁基苯甲酰基、2-叔丁基苯甲酰基、3-仲丁基苯甲酰基、4-正戊基苯甲酰基、2-新戊基苯甲酰基、3-正己基苯甲酰基、4-异己基苯甲酰基、2-(3-甲基戊基)苯甲酰基、2，3-二甲基苯甲酰基、2，4，6-三甲基苯甲酰基、2-氨基苯甲酰基、3-甲酰氨基苯甲酰基、4-乙酰氨基苯甲酰基、2-丙酰氨基苯甲酰基、3-丁酰氨基苯甲酰基、4-异丁酰氨基苯甲酰基、2-戊酰氨基苯甲酰基、3-叔丁碳酰基氨基苯甲酰基、4-己酰氨基苯甲酰基、2，4-二乙酰氨基苯甲酰基、2，3，4-三乙酰氨基苯甲酰基、3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰基等。
对于苯基低级烷基基团，其例子包括烷基部分是具有1～6个碳原子的直链或支链烷基的苯基烷基基团，例如苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、3-苯丙基、4-苯丁基、5-苯戊基、6-苯己基、1，1-二甲基-2-苯乙基、2-甲基-3苯丙基等。
在本发明的通式(1)代表的哌啶化合物中，具有碱性基团的化合物可与通常药理学上可接受的酸易于形成盐。这样的酸包括，例如无机酸，如硫酸、硝酸、盐酸、磷酸、氢溴酸等；和有机酸，如乙酸、对甲苯磺酸、乙烷磺酸、草酸、马来酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、安息香酸等。
在本发明的通式(1)代表的哌啶化合物中，具有酸性基团的化合物容易通过与药学上可接受的碱性化合物反应形成盐。该碱性化合物的例子包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等。
本发明的哌啶化合物包括光学异构体。
通式(1)的哌啶化合物或其盐通常以普通的药物制剂的形式使用。该制剂通过通常使用的稀释剂或赋形剂制备，例如填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等。根据治疗目的，可选择药物制剂的多种形式，且代表性的例子包括片剂、丸剂、散剂、溶液剂(liquids and solutions)、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂(溶液、混悬剂等)、软膏剂等。
为成型为片剂剂型，可使用这样的载体，例如赋形剂，如乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸盐等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉、昆布多糖粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂硫酸钠、硬脂酸单酸甘油酯、淀粉、乳糖等；崩解抑制剂，如蔗糖、硬脂酸甘油酯(stearin)、可可油脂、氢化油等；吸收促进剂，如季胺碱、月桂硫酸钠等；润湿剂(moisturizing agent)，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶态硅酸盐等；润滑剂，如精制滑石粉、硬脂酸盐、硼酸盐粉末、聚乙二醇等。此外，片剂可以以包覆常规包衣的片剂形式被制备，例如糖衣片剂、明胶包胶片剂、肠衣片剂和膜衣片剂、或双层片剂和多层片剂。
为成型为丸剂剂型，可使用这样的载体，例如，赋形剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可油脂、氢化植物油、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉、黄芪胶粉、明胶、乙醇等；崩解剂，如昆布多糖、琼脂等。
为成型为栓剂剂型，可使用这样的载体，例如，聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。
胶囊剂可通过与上述列举的多种载体混合，根据常规的装胶囊方法将本发明的化合物填充到硬明胶胶囊或软胶囊中而制备。
为了制备注射剂，将溶液剂，乳剂和混悬剂灭菌，并优选与血液等张。为成型为该剂型，可使用这样的稀释剂，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化异硬酯醇、聚烃氧基化异硬酯醇(polyoxylatedisostearyl alcohol)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯等。
用于制备等张溶液的充足量的氯化钠、葡萄糖或甘油也可以混合在药物制剂中，而且也可以进一步加入其它常规的增溶剂、缓冲剂、安抚剂等。
如果需要，着色剂、防腐剂、芳香剂、香料、增甜剂等和其它药物也可以加到药物制剂中。
为成型为糊剂、乳膏剂(cream)和凝胶剂的剂型，可使用这样的稀释剂，例如白凡士林、石蜡、甘油、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土等。
应该包含在本发明的药物制剂中的本发明的化合物的量没有具体的限制，并可在宽的范围内充分选择，通常为药物制剂重量的约1～70wt％，优选1～30wt％。
上述药物制剂的给药方法不受具体限制，并取决于各种制剂形式、病人年龄、性别和其它条件及疾病的严重程度。例如，可口服给予片剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂和胶囊剂。注射剂可单独或与如葡萄糖、氨基酸等的常规补液混合静脉给药，并且，如果需要，可单独肌肉内、皮内、皮下或腹膜内给药。栓剂可经直肠给药。
上述药物制剂的用量根据使用指导、病人年龄、性别和其它条件及疾病的严重程度而选择，作为活性组分的通式(1)的化合物的量通常大约为0.01～10mg/kg/天。优选以单位剂型中0.1～200mg的量包含活性组分。
本发明的用于促进血管生成的药物组合物用做预防性或治疗性药物，用于血管不充分发育和再生的疾病，和其它由局部缺血引起的多种疾病，例如心急梗塞、心绞痛、脑梗塞、老年痴呆症、伴随糖尿病的多种器官损伤等。
具体实施例方式
通过参考如下的制备实施例和药理试验，将更清晰地解释本发明。
制备实施例1混合4-[N-甲基-N-(2-苯乙基)氨基]-1-(3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰)哌啶(5mg)、淀粉(132mg)、硬脂酸镁(18mg)和乳糖(45mg)，并用常规的方法压片，以制备在片剂中包含上述量的组分的片剂。
制备实施例2在80℃搅拌下，将尼泊金甲酯(0.18g)、尼泊金丙酯(0.02g)、偏亚硫酸氢钠(0.1g)和氯化钠(0.9g)溶于足量的用于注射的蒸馏水中。这样制得的溶液冷却到40℃，然后将4-[N-甲基-N-(2-苯乙基)氨基]-1-(3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰)哌啶(500mg)、聚乙二醇(分子量＝4000，0.3g)和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(0.4g)逐渐溶于其中，然后向该溶液中加入用于注射的蒸馏水，以制备最终的体积(100ml)。通过用适当的过滤纸进行无菌过滤而对溶液进行灭菌，分别分配每1ml到安瓿中，以制备注射剂。
在下文的药理试验中，4-[N-甲基-N-(2-苯乙基)氨基]-1-(3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰)哌啶(在下文该化合物称为“试验化合物A”)用作试验化合物。
药理试验实施例1(试验化合物A的血管生成促进功能)根据Nicosia R.F.等的报告(In Vitro Cell Dev Biol 26，119～128，1990)进行试验。简要地说，在醚麻醉下从鼠身上取出胸主动脉，并以1mm的间隔通过横切(cross-sectioning)获得主动脉环。主动脉环包埋于I型胶原凝胶中(Koken公司)。此外，包含试验化合物A的MCDB131培养基(Gibco BRL公司)加到上层，并且培养基每三天更换一次。从培养开始7天后，用碱性磷酸酶对从主动脉环样品的横截面上新长出的微脉管进行染色，然后，基于数码图像观察的微脉管数目用Scion图像(Scion公司)计数。统计分析如下进行使用具有随机区组设计(randamized block design)的Dunnett测试(Dunnett′s test)分析数据。在P＜0.05时，认为试验化合物组与未处理组之间的差异为统计学显著的。
结果列于表1。如表1所示，与未处理的对照组相比，在鼠的胸主动脉环样品中，试验化合物A以剂量依赖方式显示出显著增长新生微脉管数目。因此，试验化合物A明显证明具有血管生成促进功能。
表1
数值以平均值±SE的方式表示。
*对于对照组，P＜0.05。
药理试验实施例2(试验化合物A对血管内皮细胞迁移的影响)根据Witzenbichler，B.等的报告(J.Biol.Chem.，273，18514～18521，1998)进行试验。简要地说，在MCDB131培养基上培养人主动脉内皮细胞(Cambrex公司)到融合状态(confluent state)。使用48孔微趋化室(Neuro Probe公司)检测细胞迁移。试验化合物A加入到孔的下层，而细胞以每孔1×104细胞加到上层，并培养4小时。细胞用甲醇固定，过滤器上层的细胞被除去，用Diff Quick(国际试剂公司)对迁移到过滤器上的细胞进行染色，然后从数码图像观察到的迁移内皮细胞数目通使用过Scion图像(Scion公司)进行计数。统计分析如下进行线性回归分析后用Williams′试验分析数据。在P＜0.05时，认为试验化合物组与未处理组之间的差异为统计学显著的。
结果列于表2。从表2的结果，与未处理的对照组相比，试验化合物A以剂量依赖方式明显显示出增加的迁移细胞数量，从而证明了试验化合物A促进血管内片细胞的迁移。
表2
数值以平均值±SE的方式表示。
**对于对照组，P＜0.01。
药理试验实施例3(试验化合物A对血管内皮细胞的内腔化(luminalization)的影响)根据Yasunaga，C.等的报告(Lab Invest，1989；61698～704)进行试验。简要地说，在MCDB131培养基上培养人体主动脉内皮细胞(Cambrex公司)到融合状态。包含试验化合物A的用培养基制备的细胞以5×104细胞/孔的量加入到细胞基质凝胶(Nitta Gelatin公司)上，培养4小时，以粘附细胞。移除培养基后，加入凝胶以包埋细胞，且将含有药物的培养基加入到上层，然后在第三天，基于使用Scion图像(Scion公司)的数码图像测量形成的管的长度。统计分析如下进行线性回归分析后使用Williams′试验进行分析。在P＜0.05时，认为试验化合物组与未处理化合物组之间的差异以为统计学显著的。
结果列于表3。从表3的结果，与未处理的对照组相比，试验化合物A以剂量依赖方式表现出显著增加了形成的管的长度，且证明试验化合物A促进了血管内皮细胞的管形成。
表3
数值以平均值±SE方式表示。
**对于对照组，P＜0.01。
权利要求
1.一种化合物在用于制备促进血管生成的药物组合物中的应用，其中，所述的药物组合物包含选自包括由通式(1)所示的哌啶化合物或其盐的组的至少一种化合物作为活性组分 其中R表示苯甲酰基团，其可以具有选自包括氨基基团的组的1～3个基团作为苯环上的取代基，该氨基基团可具有低级烷酰基基团和低级烷基基团；R1表示氢原子或低级烷基基团；和R2表示苯基低级烷基基团。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述哌啶化合物为4-[N-甲基-N-(2-苯乙基)氨基]-l-(3，5-二甲基-4-丙酰氨基苯甲酰基)哌啶。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述用于促进血管生成的药物组合物是用于具有血管发育和再生不充分的疾病和由暂时缺血引起的各种疾病的预防性或治疗性药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其中具有血管发育和再生不充分的疾病和由暂时缺血引起的各种疾病为心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、老年痴呆和伴随糖尿病的各种器官损伤。
全文摘要
本发明提供一种用于促进血管生成的药物组合物，其即使在没有微血管循环效应的血管培养系统中都具有血管生成促进作用。本发明的用于促进血管生成的药物组合物包含选自包括由通式(1)所示的哌啶化合物或其盐的组的至少一种化合物，(其中R表示苯甲酰基团，其可以具有选自包括氨基基团的组的1～3个基团作为苯环上的取代基，该氨基基团可具有低级烷酰基基团和低级烷基基团；R
文档编号A61P9/00GK1905877SQ20058000165
公开日2007年1月31日 申请日期2005年1月26日 优先权日2004年1月29日
发明者桥本绫子, 今泉隆, 都田悟朗, 森丰树 申请人:大塚制药株式会社