应用EphrinB2抑制新血管形成的方法

专利名称：：应用EphrinB2抑制新血管形成的方法
技术领域：
：本发明涉及血管发生和新血管形成，更具体地说，涉及埃甫蛋白(ephrin)B2在其中的应用。参考文献Adams，R.H.等(2001),配体埃甫蛋白B2的胞质域是血管形态发生所必需的，但不是颅神经嵴迁移所必需的(ThecytoplasmicdomainoftheHgandephrinB2isrequiredforvascularmorphogenesisbutnotcranialneuralcrestmigration)，Cell104(l):57-69。Adams,R.H.等(1999),埃甫蛋白B配体和EphB受体在心血管发育中的作用动脉/静脉域的划界、血管形态发生和芽生式血管发生(RolesofephrinBligandsandEphBreceptorsincardiovasculardevelopment:demarcationofarterial/venousdomains，vascularmorphogenesis，andsproutingangiogenesis),GenesDev13(3):295-306。Gale，N.W.等(2001),埃甫蛋白B2选才奪性标记成人中的动脉血管和新血管形成部位，在内皮和平滑肌细胞中均有表达(EphrinB2selectivelymarksarterialvesselsandneovascularizationsitesintheadult,withexpressioninbothendothelialandsmooth-musclecells),DevBiol230(2):151-160。Gerety,S.S.等(1999)，受体EphB4及其特异性跨膜配体埃甫蛋白B2在心血管发育中的对称突变表型(SymmetricalmutantphenotypesofthereceptorEphB4anditsspecifictransmembraneligandephrinB2incardiovasculardevelopment),MolCell4(3):403-414。Kenyon,B.M.等(1996)，一种小鼠角膜血管发生模型(Amodelofangiogenesisinthemousecornea),InvestOphthalmolVisSci.37(8):1625-1632。Shin,D.等(2001)，埃甫蛋白B2的表达标识了动脉和静脉血管平滑肌以及内皮细胞之间的稳定的遗传差异，并且标记了成年新血管形成部位的樣i血管亚组(ExpressionofephrinB2identifiesastablegeneticdifferencebetweenarterialandvenousvascularsmoothmuscleaswellasendothelialcells,andmarkssubsetsofmicrovesselsatsitesofadultneovascularization)，DevBiol230(2):139-150。Wang，H.U.等(1998)，埃甫蛋白B2及其受体Eph-B4揭示的胚胎动脉和静脉之间的分子差异和生血管相互作用(MoleculardistinctionandangiogenicinteractionbetweenembryonicarteriesandveinsrevealedbyephrinB2anditsreceptorEph-B4)，Cell93(5):741-753。以上引用的或者本申请其他部分引用的所有出版物、专利和专利申请均在此全文引入作为参考，如同每个单独出版物、专利申请或专利具体且分别地全文引入作为参考。
背景技术：
：血管发生是许多眼病理性疾病如与年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病和早产儿视网膜病的标志。血管发生级联由大量介质和趋化因子引发。例如，与多级血管发生过程有关的内皮细胞受体酪氨酸激酶(RTK)已经被公认是血管发生的关键介质。第一代生血管细胞因子，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)，完全符合芽生的毛细血管的概念。最近，血管生成素(angiopoietin)/Tie2系统已经被确定为介导血管组装和成熟的配体-受体系统。VEGF/VEGF受体和血管生成素/Tie2受体家族也属于RTK。Eph受体，即埃甫蛋白的受体，是最大的酪氨酸激酶受体家族，由8种EphA和6种EphB受体组成。尽管Eph受体酪氨酸激酶家族代表一个新的RTK类别，但是它在血管发生中的作用仍不清楚。最初被确定为神经元寻路(pathfinding)分子，敲除小鼠和成年埃甫蛋白B2-lacZ转基因小鼠实验已经确定EphB受体和埃甫蛋白B配体为血管组装、协调动静脉分化和边界形成的关键调节因子(Adams等，1999;Gale等，2001;Shin等，2001)。基因靶向实验揭示，埃甫蛋白B2是脊推动物胚胎中动脉内皮细胞的早期标记，而相反地其受体EphB4标记静脉内皮细胞(Wang等，1998;Adams等，1999;Gerety等，1999;Adams等，2001)。而且，成体中的内皮细胞保持其不对称的动静脉表达模式，提示埃甫蛋白B/EphB系统在控制成体的血管内平衡方面起作用，并且具有控制病理性血管发生的可能性(Gale等，2001;Shin等，2001)。因此，希望确定埃甫蛋白的作用模式，以及如何能够应用这些分子操作血管系统，特别是在病理性疾病中。
发明内容我们研究了埃甫蛋白B2抑制血管发生的机制。我们发现，埃甫蛋白B2抑制内皮细胞(EC)的DNA合成和VEGF诱导的及bFGF诱导的p44/p42MAP激酶活化。特别地，这些效果既作用于静脉EC也作用于动脉EC,尽管已知动脉EC不具有埃甫蛋白B2的受体。埃甫蛋白B2也抑制EC的管腔形成(tubeformation)，并且抑制bFGF诱导的角膜血管发生。我们的结果表明，靶向埃甫蛋白B2/EphB4及其抗血管发生信号传导途径可能有益于依赖血管发生的疾病的治疗。因此，本发明的一个实施方案提供一种抑制内皮细胞中DNA合成的方法，包括使动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。该内皮细胞中的DNA合成优选由VEGF、bFGF或PDGF诱导，该内皮细胞优选是动脉内皮细胞。还提供了一种抑制内皮细胞中p44/p42MAP激酶活化的方法，包括使动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。该内皮细胞中的p44/p42MAP激酶活化优选由VEGF、bFGF或PDGF诱导，该内皮细胞优选是动脉内皮细胞。另一实施方案提供一种抑制内皮细胞的管腔形成的方法，包括使动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。该内皮细胞的管腔形成优选由VEGF、bFGF或PDGF诱导，该内皮细胞优选是动脉内皮细胞。所有这些实施方案都可以在体外或在体内进行。当在体内进行时，可以通过本领域已知的任何方法将埃甫蛋白B2施用于包含内皮细月包的哺乳动物。还提供了一种抑制哺乳动物中的血管发生的方法，包括将有效量的埃甫蛋白B2施用于该哺乳动物。该埃甫蛋白B2优选是全长埃甫蛋白B2。再另外一个实施方案提供一种抑制哺乳动物中的新血管形成的方法，包括将有效量的埃甫蛋白B2施用于该哺乳动物。该埃甫蛋白B2优选是全长埃甫蛋白B2。又另外一个实施方案提供一种治疗哺乳动物中与异常新血管形成有关的疾病或病症的方法，包括将有效量的埃甫蛋白B2施用于该哺乳动物。所述疾病或病症优选地选自与年龄相关的黄斑变性、缺血性视网膜病、眼内新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性视网膜水肿、糖尿病性视网膜病、癌症、类风湿性关节炎和子宫内膜异位症。图1埃甫蛋白B2抑制VEGF、bFGF和PDGF-BB诱导的EC增殖和管腔形成。图1A和图1B分别显示埃甫蛋白B2对HAoEC(1A)和HUVEC(1B)中VEGF、bFGF或PDGF-BB诱导的DNA合成的影响。HAoEC或HUVEC在含有10%DMEM的基础培养基中在低汇合程度下培养，并且在存在或不存在VEGF、bFGF或PDGF-BB(各为10ng/mL)的情况下用200|ug/mL埃甫蛋白B2或EphB4处理24小时。这些实验重复3次，所示数据(平均值土SD)来自于代表性实验。C:对照(仅载体)。B2:埃甫蛋白B2。B4:EphB4。图1C显示对照、埃甫蛋白B2和EphB4处理组的上皮细胞在第7天时应答VEGF的管腔形成的结果。图2埃甫蛋白B2对EC中的ERK磷酸化和受体自磷酸化的影响。图2A显示埃甫蛋白B2对VEGF和bFGF刺激的HAoEC中ERK磷酸化的抑制作用。p44/p42:总ERK。pp44/pp42:磷酸化的ERK。图2B显示埃甫蛋白B2对VEGF刺激的HAoEC中VEGF-受体2的自磷酸化没有显著影响。受体(KDR)从细胞裂解液中免疫沉淀(IP),并且用抗磷酸酪氨酸抗体(PY20)进行印迹分析。图3施用埃甫蛋白B2明显阻断了bFGF诱导的新血管形成。在bFGF存在下具有新血管形成的面积设为100%。具体实施方式埃甫蛋白B2/EphB4系统在血管形成和血管发生中起重要作用。我们研究了埃甫蛋白B2抑制血管发生的机制。我们发现，埃甫蛋白B2抑制EC的DNA合成和VEGF诱导的及FGF2诱导的p44/p42MAP激酶活化。埃甫蛋白B2也抑制EC的管腔形成。我们还在小鼠中进行了角膜微嚢(micropocket)试验以及角膜新血管形成的定量。埃甫蛋白B2抑制bFGF诱导的角膜血管发生。我们的结果提示，靶向埃甫蛋白B2/EphB4及其抗血管发生信号传导途径可能有益于依赖血管发生的疾病的治疗。在进一步详细描述本发明之前，如下定义本申请中使用的术语，除非另有说明。定义术语"埃甫蛋白B2",除非另有说明，是指这样的多肽其(l)与天然埃甫蛋白B2或其胞外域，优选天然人埃甫蛋白B2,具有基本序列相似性；并且(2)具有天然埃甫蛋白B2或胞外域的生物活性。与天然分子具有"基本序列相似性"的多肽与该天然分子在氨基酸水平上至少约30%相同。该多肽与该天然分子在氨基酸水平上优选至少约40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、最优选至少约98%相同。术语类似物或变体与天然分子的"百分同一性"或"％同一性"是指当两个序列进行比对时，该天然分子中含有的、在该类似物或变体中也发现的氨基酸序列的百分比。百分同一性可以用本领域中建立的任何方法或算法来确定，如LALIGN、ClustalW或BLAST。如果一种多肽能够与天然埃甫蛋白B2的受体结合，或者抑制EC的DNA合成、EC中的ERK磷酸化、EC的管腔形成、血管发生或新血管形成，则该多肽具有天然埃甫蛋白B2的"生物活性"。抑制EC的DNA合成、EC中的ERK磷酸化、EC的管腔形成、血管发生或新血管形成的活性可以用本领域已知的，特别是如本申请所述的任何方法来测定。"天然，，分子，如天然埃甫蛋白B2,是未经人工干预而存在的分子。但是，天然埃甫蛋白B2也可以是未经人工千预而存在的埃甫蛋白B2的胞外域。"全长"埃甫蛋白B2是既包含胞外域也包含胞内域的埃甫蛋白B2。全长埃甫蛋白B2可以是天然的，或者可以是天然埃甫蛋白B2的类似物或变体。"有效量"是足以实现预期目的的物质的量。例如，抑制DNA合成的埃甫蛋白B2的有效量是在体内或在体外(视情况而定)足以导致DNA合成量减少的量。治疗疾病或病症的埃甫蛋白B2的有效量是足以减少或消除该疾病或病症的症状的埃甫蛋白B2的量。特定物质的有效量将随不同因素而变化，如该物质的性质、给药途径、接受该物质的动物的大小和物种、以及给予该物质的目的。每个情况中的有效量可以由本领域技术人员按照本领域建立的方法凭经验确定。术语"治疗"疾病或病症是指减少或者完全消除疾病或病症的症状。埃甫蛋白B2对上皮细胞的影响众所周知，内皮细胞可以响应生长因子如VEGF、bFGF或PDGF-BB而被诱导增殖。为了测定埃甫蛋白B2对这一现象的影响，将埃甫蛋白B2与VEGF、bFGF或PDGF-BB—起加至动脉或静脉上皮细胞(实施例1)。结果显示，埃甫蛋白B2抑制所有这些刺激物诱导的DNA合成，而无论是EphB4还是埃甫蛋白B2与EphB4的组合都不抑制。如图1A所示，10ng/mLVEGF、bFGF或PDGF-BB诱导的DNA合成的增加分别被200pg/mL埃甫蛋白B2抑制40%、30%和90%。使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获得几乎相同的结果(图1B)。埃甫蛋白B2对DNA合成的这种抑制作用不是由凋亡引起的，因为没有观察到明显的凋亡。因此，埃甫蛋白B2能够抑制由包括VEGF、bFGF和PDGF在内的多种刺激物诱导的EC的DNA合成。令人惊讶的是静脉上皮细胞和动脉内皮细胞中的DNA合成均被抑制，因为埃甫蛋白B2的受体(EphB4)是静脉上皮细胞的标记，而已知动脉内皮细胞不具有这种受体。此外，在第7天时，埃甫蛋白B2处理组中VEGF诱导的管腔形成比对照组减少(图1C)。相反，VEGF诱导的管腔形成不受EphB4处理的影响。为了研究埃甫蛋白B2抑制生长因子诱导的促有丝分裂应答的机制，我们检测了埃甫蛋白B2对VEGF或bFGF刺激的ERK(p42/44)磷酸化的影响(实施例2)。结果表明，埃甫蛋白B2抑制动脉和静脉内皮细胞中VEGF和bFGF诱导的ERK磷酸化。但是，埃甫蛋白B2不抑制VEGF-受体2的自磷酸化(图2B),表明埃甫蛋白B2不干扰VEGF与VEGF-受体2之间的信号转导作为抑制VEGF功能的机制。因此，埃甫蛋白B2可以用于抑制动脉或静脉上皮细胞中VEGF或bFGF诱导的ERK磷酸化。已知bFGF是一种有效的生血管因子。由于埃甫蛋白B2能够抑制bFGF诱导的EC细胞增殖，我们检查了埃甫蛋白B2是否也能够抑制血管发生(实施例3)。实际上，施用埃甫蛋白B2明显阻断了bFGF诱导的血管发生，但是施用EphB4显示没有影响。因此，埃甫蛋白B2可以用于抑制血管发生和新血管形成。特别是，这些结果表明埃甫蛋白B2可用于治疗与血管发生或新血管形成有关的疾病或病症，如与年龄相关的黄斑变性、缺血性一见网膜病、眼内新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、糖尿病性黄斑水肺、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性—见网膜水肿、糖尿病性视网膜病、癌症、类风湿性关节炎和子宫内膜异位症。在本发明中有用的埃甫蛋白B2可以是具有所需活性的任何埃甫蛋白B2，包括类似物和变体。埃甫蛋白B2可以是全长的，或者可以含有胞外域而不含胞内域。埃甫蛋白B2的给药制备含有埃甫蛋白B2的药物组合物的方法在本领域中众所周知。埃甫蛋白B2可以与适合给药途径的药物可接受的载体混合在一起全身给药，例如口服或者通过肌肉内(IM)或静脉内(IV)注射。可以用多种生理学可接受的载体来施用埃甫蛋白B2,其制剂是本领域技术人员所知的，并且在例如Remington'sPharmaceuticalScience(第18版)A.Gennaro编,1990,MackPublishingCompany,Easton,PA和Pollock等中描述。埃甫蛋白B2优选通过非肠胃途径给药(例如通过肌肉内、腹膜内、静脉内、眼内、玻璃体内或皮下注射或植入)。用于非肠胃给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂。可以使用多种水性载体，例如水、緩冲水、盐水等。其他合适的载体的例子包括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、氢化的萘和可注射的有机酯，如油酸乙酯。这样的制剂也可以含有辅助物质，如防腐剂、湿润剂、緩冲剂、乳化剂和/或分散剂。生物相容的、生物可降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用来控制活性成分的释放。或者，埃甫蛋白B2可以通过口服给药。预期用于口服的组合物可以根据药物组合物生产领域所知的任何方法制备为固体或液体的形式。该组合物可以任选地含有甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂，以提供更可口的制剂。用于口服给药的固体剂型包括胶嚢、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。通常，这些药物制剂含有与药物可接受的无毒赋形剂混合在一起的活性成分。这些赋形剂包括，例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、纤维素、淀粉、磷酸钙、磷酸钠、高岭土等。也可以使用粘合剂、緩冲剂和/或润滑剂(例如硬脂酸镁)。片剂和丸剂还可以用肠溶包衣制备。用于口服给药的液体剂型包括药物可接受的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆和软明胶胶嚢。这些剂型含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或油介质，并且也可以含有佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂。埃甫蛋白B2也可以局部给药，例如通过贴剂或者直接涂敷于眼部，或者通过离子电渗法。埃甫蛋白B2可以在持续释放组合物中提供，如美国专利5,672,659和5,595,760中所述的组合物。使用立即释放组合物还是持续释放组合物取决于所治疗的疾病的性质。如果该疾病由急性或超急性疾病组成，则用立即释放形式治疗比延长释放组合物更优选。另夕卜，对于某些预防性的或长期的治疗，持续释放组合物可能是合适的。埃甫蛋白B2也可以用植入物递送。这样的才直入物可以是生物可降解的和/或生物相容的植入物，或者可以是生物不可降解的植入物。该植入物对于活性剂可以是通透的或不通透的。一种眼植入物可以插入眼腔如前房或后房内，或者可以植入巩膜、跨脉络膜间隙或磁二璃体外部的无血管区。在一个优选实施方案中，眼植入物可以置于无血管区上方，如巩膜上，从而使药物透过巩膜扩散到需要的治疗部位，例如眼内间隙和眼黄斑。此外，透过巩月莫扩散的部位优选i也靠近黄斑。用于递送埃甫蛋白B2的植入物的实例包括但不限于以下专利所述的装置4,327,7255,178,6355,476,5115,743,2745,824,0735,916,5846,251,090美国专利3,416,530;3,828,777;4,014,3354,853,2245,300,1145,516,5225,766,2425,830,1736,001,386;4,946,4504,997,6525,147,647;5,322,6915,403,9015,443,505;5,632,9845,679,6665,710,165;5,766,6195,770,5925,773,019;5,836,9355，869，0795，902，598;6，074，6616,110,4856,126,6874,300,5575,164,1885,466,4665,725,4935,824,0725,904,1446,146,366和6,299,895，和WO01/30323和WO01/28474,所有这些专利都在此引入作为参考剂量为了产生单一剂量而与载体材料结合的活性成分的量随所治疗的对象和具体给药方式而变化。通常，应当以足以减少或消除疾病症状的量施用埃甫蛋白B2。每次给药约1pg/kg至100mg/kg体重的剂量水平在新生血管性疾病的治疗中通常是有用的。当直接对眼睛给药时，优选的剂量范围是每只眼约0.3mg至约3mg。该剂量可以单次给药或者分为多次给药。通常，所需剂量应当以设定好的间隔给药延长的一段时间，通常至少几周，尽管可能需要几个月或几个月以上的更长的给药时间。本领域技术人员应当知道，准确的剂量可以根据以下多种因素略微调整给药时间；给药途径；制剂的性质；排泄率；所治疗的具体疾病；疾病的严重程度；以及患者的年龄、体重、健康状况和性别。由于各种给药途径具有不同的效率，预期所需的剂量有很大的差异。例如，一般预计口服比静脉内或玻璃体内注射需要更高的剂量水平。这些剂量水平的变化可以用本领域/>知的标准经验优化禾呈序进行调整。精确的治疗有效剂量水平和模式优选地由主治医生考虑上述因素来确定。除了治疗已有的新生血管性疾病以外，埃甫蛋白B2还可以预防性地给药，以预防或减緩这些疾病的发作。在预防性应用中，向易患特定新生血管性疾病或处于该病危险中的对象施用埃甫蛋白B2。精确的给药量取决于多种因素如该对象的健康状态、体重等。实施例在下面的实施例中，下列缩写具有如下含意。未定义的缩写具有其公认的含意。。C=摄氏度hr=小时mhi=分钟sec=秒juM=微摩尔mM=毫摩尔M=摩尔ml=毫升^=微升mg=毫克jug=微克DMEM=Dulbecco改进的Eagle培养基ITS=胰岛素-转铁蛋白-硒FBS=胎牛血清MEM=改进的Eagle培养基PBS=磷酸緩冲盐液VEGF=血管内皮细胞生长因子FGF=成纤维细胞生长因子PDGF-血小板来源的生长因子SDS=十二烷基石克酸钠PAGE=聚丙烯酰胺凝胶电泳EC-上皮细胞HUVEC=人脐静脉内皮细胞HAoEC-人主动脉内皮细胞才才泮+与方法试剂HUVEC购自Clonetics(SanDiego，California,USA),并且保存在添加有10%胎牛血清(FBS)的CloneticsEGM培养基中。内皮细胞生长添加物也由Clonetics提供。I型胶原蛋白包被的培养皿购自Iwaki(日本)。[a-32P]dCTP购自Amersham。兔抗KDR(sc-504)和Fig多克隆抗体购自SantaCmzBiotechnology(SantaCruz,California,USA)。细胞培养HUVEC在1型胶原蛋白包被的培养i(Iwaki,日本)上在内皮生长培养基(CLONETICSCorp.,SanDiego,California,USA)中在37。C和5。/。C02、95%空气的条件下培养，培养基每2-3天更换一次。Northern印迹分析利用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法从细胞中分离总RNA样品，并且进行Northern印迹分析。RNA在含有2.2M甲醛的1%琼脂糖凝胶上分级分离，转移至尼龙膜(NenTMLifeScienceProducts,Inc.)上，以0.2J/cm2进行UV交联。放射性KDR或36B4cDNA探针用AmershamMultiprime标记试剂盒和[oc-32p]dCTP产生。该膜与32P-标记的DNA探针在Hybrisol(Amersham,USA)中42。C杂交16小时，在室温下用2xSSPE(lxSSPE是0.15MNaCl+0.015M柠檬酸钠)十0.1o/o十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤一次，并用0.5xSSPE+0,l%SDS洗涤两次。信使RNA水平用FujixBAS2500生物图像分析仪(FujiPhotoFilmCo)通过光密度法定量。HAoEC和HUBEC的卩H]胸苷掺入-DNA合成HAoEC和HUBEC如上所述保存。实验使用传代4-5次的细胞。在存在或不存在指定含量的埃甫蛋白B2和EphB4的条件下，EC在含有10%FCS的DMEM(Nacalaitesque，日本)中用10ng/mLVEGF、bFGF或PDGF-BB处理18小时。细胞然后在20)LiCi/mL下暴露于[甲基」H]胸香(Amersham)6小时。细胞用胰蛋白酶消化，用自动细胞收集器回收到玻璃纤维滤器上，并且用直接(3计数器测量[曱基-3H]胸苷的摄入。内皮管腔试验胶原蛋白凝胶如下形成将冰冷的明胶溶液(10xM199,H20,0.53MNaHCO3，200mML-谷氨酰胺，I型胶原蛋白，O.lMNaOH,体积比为100:27.2:50:10:750:62.5)与细胞在lx基础培养基(见下文)中混合在一起，细胞浓度为3xl()S细胞/m1,体积比为4份明胶溶液l份细胞。在37。C下胶凝30分钟后，在凝胶上覆盖lx基础培养基，该培养基是由添加了1%FBS、lxITS、2mML-谷氨酰胺、50吗/ml抗坏血酸、26.5mMNaHC03、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素并且补充了40ng/mlbFGF、40ng/mlVEGF和80nMPMA的M199组成的。所有药物均在胶凝后立即加入lx基础培养基中。为了对管腔形成进行定量，在加入基础培养基48小时后测量每个高倍(20倍)视野的管腔数目。一个管腔被定义为由一个或多个长度超过lOO]Lim(长轴)的内皮细胞组成的伸长的结构。对于每个孔，评价间隔为100jum光学切面的5个独立的视野，测量每个20倍视野中管腔的平均数。细胞毒性用来自BoehringerMannheim的细月包增殖试剂盒II评价。蛋白质样品的制备和Western印迹分析全细胞裂解液、胞质或核提取物均从上皮细胞中分离。应用以及不应用免疫沉淀进行Western印迹分析。蛋白质样品通过十二烷基碌^酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，随后电泳转移到硝酸纤维素膜上。用脱脂奶封闭后，将印迹与抗磷酸酪氨酸或KDR的抗体(1:500)—起在4。C下温育过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶标记的第二抗体(Bio-Rad,Richmond,California,USA)(1:3000)一起室温温育1小时。用Amersham增强化学发光(ECL)检测系统按照制造商的使用说明进行显色。小鼠角膜微嚢试验我们基本如Kenyon等，1996所述，略加改动，在小鼠中进行了角膜微嚢试验以及角膜新血管形成的定量。简言之，制备含有90ng人bFGF的0.3|_ilHydron丸(IFNSciences,NewBrunswick,NewJersey,USA)，将其植入雄性BALB/c小鼠的角膜中。埃甫蛋白B2或EphB4(100ng/丸)直接加入bFGF/Hydron溶液中。该丸定位于距角膜缘1.0mm处。植入后，对每只眼滴加氧氟沙星/滴眼剂。6天后，杀死动物，对角膜血管照相。用软件包NIHImage进行小鼠角膜中新血管形成的定量分析。统计学分析实验数据表示为平均值土SD。对正态分布群体采用Studentt-检验，当p<0.05时认为具有统计学显著性。实施例1埃甫蛋白B2抑制生长因子刺激的EC增殖和迁移用VEGF、bFGF或PDGF-BB(各为10ng/mL)处理人主动脉上皮细胞(HAoEC)使得DNA合成与未处理的对照相比提高3-10倍。埃甫蛋白B2抑制所有这些刺激物刺激的DNA合成，而无论是EphB4还是埃甫蛋白B2+EphB4均不抑制。如图1A所示，10ng/mLVEGF、bFGF或PDGF-BB诱导的DNA合成的增加分别被200|ig/mL埃甫蛋白B2抑制400/0、30%和90%。使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获得几乎相同的结果(图1B)。在该温育期间未观察到明显的凋亡细胞(数据未示出)。在第7天时，埃甫蛋白B2处理组中VEGFi秀导的管腔形成比对照组减少(图1C)。相反，VEGF诱导的管腔形成不受EphB4处理的影响。因此，埃甫蛋白B2能够抑制包括VEGF、bFGF和PDGF在内的多种刺激物诱导的EC的DNA合成。尽管埃甫蛋白B2的确切机制还不清楚，但是DNA合成的减少不是由凋亡引起的，因为没有观察到明显的凋亡。令人惊讶的是静脉上皮细胞和动脉内皮细胞中的DNA合成均被抑制，因为埃甫蛋白B2的受体(EphB4)是静脉上皮细胞的标记，而已知动脉内皮细胞不具有这种受体。与对DNA合成的影响一致，埃甫蛋白B2也能够抑制VEGF诱导的EC的管腔形成。实施例2埃甫蛋白B2对生长因子诱导的p42/44ERK磷酸化和受体自磷酸化的影响为了研究埃甫蛋白B2抑制HAoEC上VEGF或bFGF诱导的促有丝分裂应答的机制，我们通过Western分析4企测了埃甫蛋白B2对VEGF或bFGF刺激的ERK(p42/44)磷酸化的影响。用1Ong/mLVEGF或bFGF刺激增强了ERK磷酸化。埃甫蛋白B2抑制VEGF和bFGF诱导的ERK磷酸化。例如，200jig/mL埃甫蛋白B2使VEGF诱导的ERK磷酸化抑制70%(图2A)。然后，我们研究了VEGF刺激的HUVEC中VEGF-受体2(KDR)的自磷酸化。10ng/mLVEGF使VEGF-受体2自磷酸化提高14倍。埃甫蛋白B2不抑制VEGF-受体2的自磷酸化(图2B)。用HUVEC获得基本相同的结果(数据未示出)。因此这些结果表明，埃甫蛋白B2抑制动脉或静脉上皮细胞中VEGF或bFGF诱导的ERK磷酸化。这种作用可能至少部分解释了埃甫蛋白B2抑制VEGF或bFGF诱导的这些细胞增殖的活性。但是，埃甫蛋白B2不抑制VEGF-受体2的自磷酸化。因此，埃甫蛋白B2不干扰VEGF与VEGF-受体2之间的信号转导作为抑制VEGF功能的才几制。实施例3在小鼠角膜中共施用埃甫蛋白B2抑制bFGF诱导的血管发生已知b.FGF是一种有效的生血管因子。由于埃甫蛋白B2能够抑制bFGF诱导的EC细胞增殖，我们检查了埃甫蛋白B2是否也能够抑制血管发生。我们将已经注入人bFGF的Hydron丸植入小鼠的角膜中。植入6天后，我们检查了新血管的生长物。bFGF明显诱导了小鼠角膜中的血管发生。我们进一步片全查了埃甫蛋白B2和EphB4对bFGFi秀导的角膜新血管形成的影响。施用埃甫蛋白B2明显阻断了bFGF诱导的血管发生，但是施用EphB4显示没有影响。定量分析也证明，埃甫蛋白B2完全抑制了bFGF诱导的角膜新血管形成(图3)。因此，埃甫蛋白B2能够用于抑制血管发生和新血管形成。特别是，这些结果表明埃甫蛋白B2可用于治疗与血管发生或新血管形成有关的疾病或病症，如与年龄相关的黄斑变性、缺血性视网膜病、眼内新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性^L网膜水肿、糖尿病性视网膜病、癌症、类风湿性关节炎和子宫内膜异位症。已经描述了本发明的许多实施方案。但是应当理解，可以进行多种改变而不脱离本发明的精神和范围。权利要求1.一种抑制动脉内皮细胞中DNA合成的方法，包括使该动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。2.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA合成由VEGF、bFGF或PDGF诱导。3.—种抑制动脉内皮细胞中p44/p42MAP激酶活化的方法，包括使该动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。4.如权利要求3所述的方法，其中所述p44/p42MAP激酶活化由VEGF、bFGF或PDGF诱导。5.—种抑制动脉内皮细胞的管腔形成的方法，包括使该动脉内皮细胞接触有效量的埃甫蛋白B2。6.如权利要求5所述的方法，其中所述管腔形成由VEGF、bFGF或PDGF诱导。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述埃甫蛋白B2包含天然埃甫蛋白B2的胞外域，而不包含胞质域。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中对包含动脉内皮细胞的哺乳动物施用埃甫蛋白B2。全文摘要提供了抑制DNA合成、MAP激酶活化和内皮细胞管腔形成的方法。还提供了抑制血管发生和新血管形成的方法，以及可用于此处所述方法的组合物。文档编号A61K38/18GK101151045SQ200580010037公开日2008年3月26日申请日期2005年4月5日优先权日2004年4月5日发明者畑快右,石桥达朗,藤泽公彦,键本忠尚申请人:阿克曼生物制药株式会社