抑制Na_v1.8的短干扰核酸组合物和方法

专利名称：：抑制Na_v1.8的短干扰核酸组合物和方法
技术领域：
：本发明提供单链或双链短干扰核酸，所述干扰核酸可导致Nav1.8钠通道基因的mRNA发生RNAi诱导的降解；本发明还提供含这种短干扰核酸的药物组合物；含这种短干扰核酸的重组载体；抑制mRNA翻译的方法；抑制多肽表达的方法；阻断细胞膜电位的方法；阻断细胞钠电流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。
背景技术：
：慢性疼痛是由AIDS、癌症化疗、糖尿病或外周神经的直接物理损伤所诱导的外周神经病的主要症状。这种神经性疼痛通常会使人高度衰弱，而且耐受治疗干预。神经疼痛的动物模式表明，神经状态维持中的突出特征是外周神经中的感觉传入神经元在损伤后异常的、持续的超兴奋性。此外，一个常见的临床发现是诸如利多卡因这样的广谱钠通道阻断剂，可强烈地抑制神经性疼痛。但仍不清楚各种钠通道亚型在神经性疼痛方面的相对贡献。电压门控钠通道对在神经元中起始和传播动作电位非常关键。另外，这些通道也参与神经兴奋性的调控。因此，电压门控钠通道在外周和中枢神经系统间传递疼痛信息方面具有重要作用。外周神经损伤可引起钠通道积累在损伤位点周围的初级传入膜上。这导致受损传入及其周围未受损神经元的重复放电以及兴奋性增加。兴奋性的增加在表达神经性疼痛方面是非常关键的。在脑、神经元和横紋肌中至少鉴定出10种不同的钠通道异构体。钠通道的主要成分是形成通道孔的260kDa的a-亚基。a-亚基由4个同源结构域DI、DII、DIII和DIV组成，每种又含有6个跨膜部分S1-S6。绝大多数钠通道均与辅助型p-亚基Pl-P4相连，其平均分子量为30kDa。P-亚基可调控这些通道的表达水平及开关。在PNS中主要表达3种钠通道异构体，即Nav1.7、Nav1.8和Navl.9。其中Nav1.7广泛存在于外周神经系统中，从而在Schwann细胞和神经内分泌细胞中存在于所有类型的背根神经节神经元中。Nav1.7对纳摩尔量的河豚毒素敏感。Nav1.8仅存在于感觉传入神经和背根神经节及三叉神经节的神经元中。Navl.8通道对河豚毒素高度耐受，IC50高于50^M。Nav1.9也在背根神经节和三叉神经节的小纤维中表达，而且也耐受纳摩尔浓度的河豚毒素，但半数最大阻断量是约40pM河豚毒素。最近对寻找治疗疼痛的治疗性靶点的研究集中在在成熟的背根神经节的神经元中所发现的抗河豚毒素的钠通道。已知其一个重要部分是疼痛敏感的"伤害性感受器"。这种钠通道的一种是Nav1.8，以前被认为是PN3或外周神经钠通道类型3。已发现该通道在慢性疼痛疾病中，在背根神经节中是上调的。另外，Nav1.8的理化特性使该通道成为在损伤后维持外周神经持续地重复放电的一种可能候选物。另外，Nav1.8的表达被限制在背根神经节的感觉神经元外周，这表明阻断该通道可能以最小副作用减轻神经性疼痛。但由于目前可获得的钠通道阻断剂不能区分钠通道亚型，因此这种可能性没有进行药理学检测。已在神经性疼痛的动物模型中使用针对Nav1.8表达的反义脱氧寡核苦酸来检测该通道的选择性衰减表达是否可减轻神经性疼痛。参见Porreca等"Acomparisonofthepotentialroleofthetetrodotoxin-insensitivesodiumchannels,PN3/SNSandNaN/SNS2，inratmodelsofchronicpain"，Proc.Nat.Acad.ScL,vol.96，pp.7640-7644(1999)。已发现通过反义脱氧寡核苷酸抑制Nav1.8的表达可在其他动物疼痛模型中抑制慢性疼痛。参见Yoshimura等"Theinvolvementofthetetrodotoxin國resistantsodiumchannelNav1.8(PN3/SNS)inaratmodelofvisceralpain"，J.Neuroscience，vol.21,pp.8690-8696(2001》和Khasar等"Atetrodotoxin-resistantsodiumcurrentmediatesinflammatorypainintherat",NeuroscienceLetters,vol.256，no.1，pp.17-20(1998)。进一步的数据表明通过针对Nav1.8的特异反义寡核苷酸选择性敲减背根神经节中的Nav1.8蛋白抑制了由脊髓神经连接损伤所引起的痛觉过敏和痛觉超敏。参见Kim等"Anexperimentalmodelforperipheralneuopathyproducedbysegmentalspinalnerveligationintherat",Pain,vol.50，pp.355-363(1992)。以上数据表明Nav1.8在几种外周神经性和发炎性疾病中的病理生理作用。但反义寡核苷酸在治疗上的用途由于其体内的不稳定性、有限的效率和可能产生"脱靶"效应而受到限制。由于没有确定可特异阻断Nav1.8的小分子，因此在治疗疼痛时仍然需要调控Nav1.8的替代途径。本发明通过提供特异敲减Nav1.8表达的短干扰核酸和siRNAs而满足上述需求。siRNA由于高效的靶特异性、降低的脱靶可能性，其用途备受瞩目，可进行高效的抑制作用。代表短干扰RNA或小干扰RNA的siRNA是一种RNA干扰(RNAi)方式。RNAi是一种通过降解细胞中特异的mRNA耙标、从而敲减或下调编码的蛋白的水平来研究基因功能的技术。siRNA的作用机制包括多步骤过程。首先，双链RNA(dsRNA)被RNaseHI家族成员识别，并被切割为21到23个核苷酸的siRNAs。然后，siRNAs整合到称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的RNAi耙复合物中。RISC是一种可识别靶mRNA的双功能螺旋酶和RNase。在识别耙mRNA后，RISC与mRNA结合，并松开siRNA，这可使siRNA的反义链通过互补碱基配对(Watson-Crick碱基配对)而与耙mRNA结合。这可引起mRNA的水解和破坏，导致蛋白表达降低。另外，siRNA显然可进行再循环，从而使一种siRNA分子可诱导切割约1000个mRNA分子。因此，siRNA介导的RNAi比目前已有的抑制靶基因表达的技术更有效。本文所包括的所有参考文献、出版物、专利申请和专利均作为参考并入本文中。发明概述本发明涉及特异针对并引起Nav1.8钠通道基因的mRNA发生RNAi诱导的降解的短干扰核酸以及使用这种干扰核酸的方法。本发明的一个技术方案提供了一种包含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸。该分离或重组短干扰核酸可进一步包括3'突出端。还提供了一种含上述任何一种或多种短干扰核酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。本发明一个选择性的技术方案提供了一种包含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列、并进一步包含其互补核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸，。该分离或重组短干扰核酸可进一步包括3'突出端。还提供了一种含上述任何一种或多种短干扰核酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。另一个技术方案提供了一种包含选自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸、进一步包含其互补核苷酸序列，其中核苷酸序列和互补核苷酸序列可杂交形成双链体。核苷酸序列和互补核苷酸序列各自均可进一步含有3'突出端。还提供了一种含上述任何一种或多种短干扰核酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。另外一个技术方案提供了一种包含有义链和反义链的分离或重组短干扰核酸，其中有义链和反义链可杂交形成双链体，其中有义链含与靶序列基本同一的核苷酸序列，其中靶序列选自SEQIDNOs:12-577。有义链和反义链可进一步含有3'突出端。还提供了一种含上述任何一种或多种短干扰核酸以及药学上可接受的栽体的药物组合物。本发明的一个技术方案提供了一种含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物中一种或多种核苷酸序列的重组载体。另一个技术方案提供了一种抑制mRNA翻译为多肽的方法，包括将能够表达Nav1.8mRNA的细胞与一个或多个含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸相接触。一个选择性技术方案提供了一种抑制多肽表达的方法，包括将能够表达Na丄8多肽的细胞与一个或多个含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸接触。另一个选择性技术方案提供了一种阻断细胞中Nav1.8来源的膜电位的方法，包括将表达Nav1.8多肽的细胞与一个或多个含选自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸接触。另外一个技术方案提供了一种阻断细胞中Nav1.8来源的钠离子流的方法，包括将表达Nav1.8多肽的细胞与一个或多个含选自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苦酸序列的分离或重组短干扰核酸接触。进一步的技术方案提供了一种抑制慢性疼痛的方法，包括对患者给药有效剂量的药物组合物，所述药物组合物含有一种或多种含选自SEQIDNOs:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11或其类似物的核苷酸序列的分离或重组短干扰核酸以及药学上可接受的载体。上述分离或重组短干扰核酸可进一步包含3'突出端。发明的详细描述本文所有引用的出版物均作为参考并入本文中。定义本申请所用的术语"反义链，，是指与有义链互补的核酸序列。本申请所用的术语"慢性疼痛"定义为持续很长时间的疼痛。本申请所用的术语"互补"是指与另一个核苷酸序列进行Watson-Crick碱基配对的核苷酸序列，即噤呤与嘧啶结合。例如，一个核苷酸序列可代表有义链，而其互补的核苷酸序列则表示反义链。本文所用术语"双链体"是指两个可杂交的互补核酸序列，例如有义链和反义链。本文所用术语"表达，，、"表达"和"表达"是指核酸通过转录和翻译而产生多肽的分子生物学过程，即在该过程中，遗传信息从基因传到蛋白质，使基因的作用表现出来。术语"同源性，，和"同源的"是指两个核酸序列间的比较，当序列进行比对和比较时，它们具有相似性。两个核酸序列间的同源性可通过序列比较或基于杂交的条件进行测定。当考虑到核苷酸插入或缺失而进行优化比对时，如果两个序列(或其互补链)的核苷酸残基一样，说明具有核苷酸序列同源性。当一个核苷酸序列可与另一个序列在选择的杂交条件下进行杂交时，则也存在同源性。在用来确定同源性的杂交中所用条件的严谨度依赖于诸如盐浓度、温度、是否存在有机溶剂及其他参数这样的因素。本申请所用术语"敲减"是指降低mRNA表达水平，从而减少mRNA到蛋白质的翻译。本申请所用术语"敲除"是指抑制mRNA表达，从而使mRNA不能翻译为蛋白质。本文所用术语"mRNA，，是指信使RNA。本文所用术语"膜电位"是指细胞膜两侧电荷的差异。本申请所用术语"疼痛"是指身体的疼痛，例如身体不舒服的感觉，从轻微的不适到极度难受或痛苦，通常是由疾病、损伤或胁迫造成的结果；或神经上的疼痛，例如头脑不适、精神沮悲痛、痛苦、焦虑或忧伤。本申请所用术语"RNAi"是指RNA干扰，是一种通过降解细胞或生物中特异的mRNA靶标、从而敲除或敲减所编码蛋白的水平来研究基因功能的技术。也称为RNA沉默。本申请所用术语"有义链"是指核酸的编码链。本申请所用术语"siRNA"是指短或小干扰核糖核酸，是RNA干扰中RNA沉默机制的一种类型。本申请中所定义的"短干扰核酸"是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或二者联合的短干扰段。该术语也包括核酸的修饰和非常规碱基。优选地，短干扰核酸是siRNA。本文所用术语"钠电流"是指一部分由钠离子作用产生的细胞膜电位。术语"患者"是指人和非人动物。本申请所用术语"转染"是指通过诸如使用病毒来向细胞中导入核酸。本申请所用术语"转录，，是指由双链DNA合成单链RNA的分子生物学过程。本申请所用术语"翻译"是指由mRNA合成多肽的分子生物学过程。本文所用术语"治疗"是指疾病或紊乱的治疗、预防或抑制方法，可产生任何临床所要的或有益的效果，包括但不限定于，减轻一个或多个症状，降低、减緩或停止疾病或紊乱的发展。Nav1.8特征Nav1.8钠通道含一个a亚基和至少一个p亚基。Nav1.8完整的开放阅读框的核苷酸序列及相应的氨基酸序列在本领域是已知的。例如，鼠Nav1.8的核酸序列和氨基酸序列分别为美国专利No.6，451，554中的SEQIDNOs:1和2。Nav1.8及其亚基的核酸序列和氨基酸序列也可在GenBanl^数据库中找到，如以下表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>人Navl.8基因与鼠Navl.8基因具有较高的同源性，约为82%。因此，与可敲减鼠Nav1.8钠通道的鼠Nav1.8短干扰核酸相对应的人Nav1.8短干扰核酸可能会有效敲减人Nav1.8钠通道。核酸含针对Nav1.8mRNA的短干扰核酸的组合物和方法可用于敲减或敲除Nav1.8钠通道的表达，从而治疗慢性疼痛。具体地，本发明的短干扰核酸可引起Nav1.8mRNARNAi介导的破坏。在慢性疼痛疾病中，背根神经节中的Nayl.8钠通道是上调的。因此，能够敲减或敲除Nav1.8mRNA表达以及Nav1.8功能的短干扰核酸序列可用于阻止或治疗慢性疼痛。因此，本发明提供了分离的或重组的短干扰核酸。本文所用术语"分离的"是指基本上是从通常在细胞或重组表达系统中所发现的其他成分中分离出来的核酸，例如RNA或DNA分子或混合的多聚体。这些成分包括，但不限定于，核糖体、聚合酶、血清成分及旁侧基因组序列。因此该术语包括从天然环境中分离出来的短干扰核酸，包括重组或克隆的短干扰核酸分离物及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。充分纯化的分子包括分子的分离形式。分离的核酸通常是分子的同源成分，但在某些技术方案中，也含有较小的异源性。这种异源性典型地存在于核酸编码序列的末端或对所需生物功能或活性不关键的区域。"重组的"短干扰核酸通过其生产方法或结构来定义。因此某些重组核酸是通过使用涉及人工干预——例如操作或筛选的重组DNA技术制备的。其他是通过将两个天然不相邻的片段融合而制备的。包括载体和含使用任何合成寡核苷酸过程获得的序列的核酸。短干扰核酸可以是单链或双链的。单链短干扰核酸含有义链，而双链短干扰核酸含有义链和反义链。优选地，双链短干扰核酸中的有义和反义链可通过标准的Watson-Crick碱基配对作用杂交而形成双链体或通过单链发卡区连接。已知第二种形式的siRNA分子的发卡区可被"Dicer"蛋白或其等价物进行细胞内切割，从而形成两个独立的碱基配对的RNA分子的siRNA。短干扰核酸的长度为17到29个核苷酸，优选地为19到25个核苷酸，更优选地为21到23个核苷酸，最优选地为21个核苷酸。优选地，短干扰核酸是siRNA。即，所有核苷酸在序列上是核糖核苷酸碱基。但本发明也包括小干扰核酸的类似物。短干扰核酸的类似物包含一个或多个核苷酸碱基的增加、缺失、变换、替代或修饰。例如，短千扰核酸可被变换、替代或修饰以含一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或非常规碱基或这些任意组合。优选地，本发明的短干扰核酸的一条或两条链含有3'突出端。本文所用"3'突出端"是指从短干扰核酸链的3'端延伸出来的至少一个未匹配的核苷酸。3'突出端可以从1到6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，优选地为1到5个核苷酸，更优选地为1到4个核苷酸，特别优选地为2到4个核苷酸，最优选地为2个核苷酸。在本发明的另一个技术方案中，双链体的有义和反义链含3'突出端。双链体每条链的突出端长度可以相同或不同。更优选地，3'突出端存在于双链体的两条链中，每条链的突出端长度为2个核苷酸。例如，双链体的每条链可含二胸腺嘧啶酸("tt")或二尿嘧啶酸("uu")的3'突出端。为了增强短干扰核酸的稳定性，3'突出端也是抗降解而稳定的。在一个技术方案中，3'突出端通过含有诸如腺嘌呤或鸟嘌呤核苷酸这样的嘌呤核苷酸来稳定。选择性地，通过修饰的类似物替代嘧咬核苷酸，例如用2'-脱氧胸腺嘧啶替代在3'突出端的尿嘧啶核苦酸，可耐受且不影响RNAi降解的效率。特别是，2'-脱氧胸腺嘧啶中的2'羟基显著地增强3'突出端在组织培养基中对核酸酶的抗性。短干扰核酸作用于Navl.8靶mRNA。本文所用的"作用于Nav1.8靶mRNA"的短干扰核酸是指其有义链的核苦酸序列与耙mRNA相同或基本相同，并可诱导RNAi介导的mRNA降解的单链或双链短干扰核酸。当然，双链siRNA的反义链的序列与siRNA有义链和靶mRNA互补。本文所用与靶序列"基本同一"的短干扰核酸是指与靶序列有1-4个核普酸差异的核酸序列。例如，短干扰核酸可含有与靶序列有一个、两个、三个或四个核苷酸差异的有义链——只要RNAi介导的靶mRNA降解是由短干扰核酸诱导的即可。本文所用的"靶mRNA"或"靶序列"是指人Nav1.8mRNA、Nav1.8mRNA的突变体或选择的拼接形式，或关联的(cognate)Na4.8基因的mRNA。本文所用术语"突变体，，是指与靶mRNA有核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸替代或核苷酸修饰这些差异的短干扰核酸。这种改变可包括例如诸如在短干扰核酸的末端或短干扰核酸一个或多个内部核苷酸中增加非核苷酸材料；使短干扰核酸抗核酸酶消化的修饰；或用脱氧核糖核普酸对短干扰核酸的一个或多个核苷酸进行替代。本文所用术语"关联的"是指来源于其他哺乳动物种的核酸。应理解人Nav1.8mRNA可含有与其关联物或突变体共有的靶序列。因此，含这种共有靶序列的单个短干扰核酸可诱导含共有靶序列的不同种类RNA的RNAi介导的降解。本发明的短干扰核酸可作用于任何靶mRNA序列中约19-25个连续核苦酸片段。筛选短干扰核酸的靶序列的技术是本领域已知的。另外，耙mRNA上的耙序列可选自对应于靶mRNA的给定cDNA序列，优选地从起始密码子50到100个核苷酸下游——即以3'方向开始。不过靶序列可以位于5'或3'非翻译区，或在临近起始密码子的区域。Nav1.8cDNA序列中合适的靶序列如实施例1所示。本发明的短干扰核酸可含有部分纯化的核酸，基本纯化的核酸，合成的核酸或重组产生的核酸。本文术语"基本纯化的，，是指短干扰核酸不含其他污染蛋白、核酸及其它来源于初级原料生物或重组DNA表达系统的生物物质。可通过标准方法测定纯度，典型地至少要高于50%、优选地至少高于75%，更优选地至少高于90%,最优选地至少约95%的纯度。可基于质量或摩尔量估计纯度。本发明的短干扰核酸可使用本领域技术人员已知的多种技术来获得。另外，短干扰核酸也可通过两个独立的、互补的核酸分子，或具有两个互补区域的单个核酸分子来合成。例如，本发明的短干扰核酸可通过使用合适的保护性核糖核苷亚磷酰胺和传统的DNA/RNA合成仪或其他已知的方法进行化学合成。另外，短干扰核酸可由商品供应商，例如Proligo(Hamburg,Germany)、DharmaconResearch(Lafayette,CO,USA)、PierceChemical(partofPerbioScience,Rockford，IL，USA)、GlenResearch(Sterling,VA，USA)、ChemGenes(Ashland,MA，USA)和Cruachem(Glasgow,UK)来产生。选择性地，短干扰核酸可通过诸如环状或线性DNA质粒这样的重组表达载体、使用任何合适的启动子来表达。重组表达载体典型地是含有编码某种短干扰核酸的核酸的自我复制的DNA或RNA构建体，通常与可在兼容的宿主细胞中调控核酸表达的合适的遗传控制元件可操作连接在一起。遗传控制元件包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，典型地包括转录启动子、可选的用来控制转录开始的操作子、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合位点的序列、翻译起始位点、多聚腺苷酸位点、及终止转录和翻译的序列。表达栽体也含有可使载体在宿主细胞中独立复制的复制原点，或诸如可提供抗生素抗性的选择基因。本发明所用的载体包括微生物质粒、病毒、噬菌体、整合的DNA片段及其他利于核酸整合到宿主基因组中的工具。质粒是常用的载体形式，但所有具有相同功能的其他形式的栽体一一它们在本领域是已知的--均适用于本文中。参见例如，Pouwelsetal"CloningVectors:ALaboratoryManual,1985andSupplements,Elsevier,N.Y"andRodriguezetal，(eds.)，Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,1988，Buttersworth,Boston,MA。从质粒中表达本发明短干扰核酸的合适的启动子包括，例如U6启动子、HlRNApolIII启动子和巨细胞病毒启动子。筛选其他合适的启动子属于本领域的技术范畴。本发明的重组质粒也含有在特定组织或特定的细胞内环境表达短干扰核酸的诱导型或调控型启动子。从重组质粒表达的短干扰核酸可通过标准技术从所培养的细胞表达系统中进行分离，或在细胞内表达。本发明的短干扰核酸可以以两个独立的、互补的RNA分子，或具有两个互补区的单个RNA分子从重组质粒中表达。适于表达本发明的短干扰核酸的质粒的筛选、向质粒中插入表达短干扰核酸的核酸序列的方法及将重组质粒递送到目标细胞中的方法均属于本领域的技术范畴。例如参见，Tuschl，Nat.Biotechnol,vol.20,pp.446-448(2002);Brummelkampetal"Science,vol.296，pp.550-553(2002);Miyagishietal"Nat.Biotechnol"vol.20，ppl.497-500(2002);Paddisonetal"GenesDev.，vol.16，pp.948-958(2002);Leeetal"Nat.Biotechnol"vol.20,pp.500-505(2002);Pauletal，Nat.Biotechnol"vol.20，pp.505-508(2002)和Suietal"Proc.Natl.Acad.ScLvol99，2002，PP5515-5520).如实施例所示，质粒可含有在人U6RNA启动子控制下、与polyT终止序列可操作连接的有义RNA链编码序列，及在人U6RNA启动子控制下、与polyT终止序列可操作连接的反义RNA链编码序列。本文所用的"可操作连接"是指编码有义和反义链的核酸序列与另一个序列相邻。优选地，编码有义和反义链的序列以S'方向与多聚T终止信号紧密相邻。因此，在有义或反义序列从质粒中转录时，多聚T终止信号起到终止转录的作用。本文所用"在启动子控制下，，是指编码有义和反义链的核酸序列位于启动子3'端，从而可使启动子起始有义或反义编码序列的转录。短干扰核酸的表达可通过传统的方法在原核或真核细胞中进行。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。高等真核生物包括来自动物细胞一一包括非哺乳动物来源，例如昆虫细胞和鸟类，以及哺乳动物来源，例如人、灵长类和啮齿类——的已建立的组织培养细胞系。多种合适的宿主细胞是本领域已知的。优选的宿主细胞是HEK293细胞和神经母细胞瘤/DRG细胞系ND7/23。本发明的短干扰核酸也可从重组的病毒载体表达。本发明的重组病毒载体含有编码本发明的短干扰核酸的序列和任何适于表达短干扰核酸序列的启动子。从病毒载体中表达短干扰核酸的合适启动子包括，例如U6启动子、HIRNApolIII启动子和细胞巨病毒启动子。筛选其他合适启动子的方法属于本领域的技术范畴。本发明的重组病毒载体也含有在特定组织或特定细胞内环境中表达短干扰核酸的诱导型或调控型启动子。在实施例5中详细讨论了将本发明的短干扰核酸递送到体内细胞的重组病毒载体的用途。本发明的短干扰核酸可以以两个独立的、互补的核酸分子，或具有两个互补区的单个核酸分子从重组病毒载体中表达。可使用任何可接受待表达的短干扰核酸的编码序列的病毒载体，例如来源于腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、逆转录病毒、疱渗病毒等的载体。另外，也可通过用外膜蛋白或来源于其他病毒的其他表面抗原假型包装载体来修饰病毒载体的向性。适于本发明的重组病毒载体的筛选、向载体中插入表达短干扰核酸的核酸序列的方法及将病毒载体递送到目标细胞中的方法均属于本领域的技术范畴。例如参见，Domburg，GeneTherap"vol.2，pp.301-310(1995);Eglitis，Biotechniqupsilones，vol.6，pp.608-614(1988);Miller,HumGeneTherap.，vol.1，pp.5-14(1990)和Anderson,Nature,vol.392，pp.25-30(1998)。优选的病毒载体是来源于腺病毒和腺病毒相关病毒的那些栽体。在特别优选的技术方案中，本发明的短干扰核酸可从重组的含U6启动子的腺病毒载体中以单链核酸分子表达。优选的病毒载体也可以是疱渗病毒载体。例如参见Burton,E.A.etal.，(2005)Curr.Opin.Mol.Ther..Aug:7(4):326誦36和YeomansD.D.etal.(2005)-HumGeneTherapFeb:16(2):271-7。以下作为示例而非限定，所表达的单链核酸分子可包含两个通过单链发卡区连接的互补区。单链核酸分子可进一步含有3'突出端。体外和体内方法可通过测定细胞中RNA或蛋白水平的标准4支术来评估短干扰核酸引起RNAi介导的靶mRNA降解的能力。例如，可将短干扰核酸递送到培养的细胞中，通过Northerii印迹、斑点印迹或定量RT-PCR测定耙mRNA的水平。选择性地，培养细胞中Nav1.8蛋白的水平可通过ELISA或Western印迹测定。在下面实施例2中描述了合适的用于测定本短干扰核酸对靶mRNA或蛋白水平的作用的细胞培养系统。如上所述，本发明的短干扰核酸针对并引起Nav1.8mRNA或其选择性拼接形式、突变体或关联体的RNAi介导的降解。由本短干扰核酸引起的靶mRNA降解可降低Nav1.8基因的功能基因产物的产生。因此，本发明提供了一种在患者中抑制Nav1.8表达的方法，一种抑制mRNA翻译的方法，一种抑制多肽表达的方法，一种阻断细胞中Nav1.8来源的膜电位的方法，及一种阻断细胞中Nav1.8来源的钠电流的方法。在本发明的方法中，阻断包括但不限定于消除或降低Nav1.8来源的膜电位或Nav1.8来源的钠电流。虽然这些方法在实施例中进行了更详细的描述，但它们都具有一些共同特征。上述每种方法中的步骤均包括将细胞与短干扰核酸接触。在体内，接触步骤包括对患者给药作为药物组合物的短干扰核酸。在体外，接触步骤包括将细胞与短干扰核酸物理上临近，从而使细胞和短干扰核酸可相互接触。该接触步骤可使短干扰核酸进入细胞，并引起RNAi诱导的Nayl.8钠通道基因mRNA的降解。优选地，接触步骤使用序列为SEQIDNOs:1-11的短干扰核酸。序列为SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的短干扰核酸是优选的。序列为SEQIDNOs:2和5的短干扰核酸是更优选的。序列为SEQIDNOs:1和3的短干扰核酸是最优选的。也可在本发明的方法中使用序列为SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、lO和ll的一个或多个短干扰核酸。以下作为示例而非限定，可在本发明的方法中使用序列为SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的一个或多个短干扰核酸。另外，在本方法的操作中，应理解可对细胞或患者同时或顺序给药本发明的多个短干扰核酸。本发明进一步提供了与一个或多个蛋白和/或靶核酸复合在一起的本发明的短干扰核酸以及含一个或多个本发明的短千扰核酸的细胞。药物组合物本发明的短干扰核酸和siRNAs可用于治疗慢性疼痛。本发明的各种化合物可作为药物组合物。例如，药物组合物可含有单链短干扰核酸、具有3'突出端的单链短干扰核酸、双链短干扰核酸、每条链均具有3'突出端的双链短干扰核酸。优选地，药物组合物含有序列为SEQIDNOs:1-11的短干扰核酸。序列为SEQIDNOs:2和5的短千扰核酸是更优选的。序列为SEQIDNOs:1和3的短干扰核酸是最优选的。可在本发明的药物组合物中使用序列为SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO和11的一个或多个短干扰核酸。以下作为示例而非限定，可在本发明的药物组合物中使用序列为SEQIDNOs:1、2、3、5、10和11的一个或多个短干扰核酸。治疗性给药这种物质的典型流程是本领域已知的。虽然本发明的组合物可以以简单的溶液给药，但更典型地是与其他物质——例如载体，优选地是药学上可接受的载体一一联合给药。术语"药学上可接受的载体，，是指任何适于将本发明的成分递送给患者的相容的、无毒的物质。例如，无菌水、乙醇、脂肪、蜡和惰性固体可包括在载体中。药学上可接受的佐剂，例如緩沖剂和分散剂也可包括在药物组合物中。通常，这种药物用于肠道外给药的成分是已知的；例如Remington'sPharmaceuticalScience,17thEd.(MackPublishingCompany,Easton，PA,1990)。可给药治疗性配方。配方典型地含有至少一种活性成分及一种或多种药学上可接受的载体。配方可包括适于口服、直肠、鼻、透皮或肠道外(包括皮下、肌肉内、静脉和皮内)给药的那些。配方可以单位剂量的形式存在或通过任何制药学领域已知的方法制备。参见例如Gilmanetal.(eds.)(1990)，ThePharmacologicalBasesofTherapeutics,8thEd"PergamonPress;andRemington'sPharmaceuticalSciences,supra，Eastern,Peim.;Avisetal.(eds.)(1993)PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedicationsDekker，NewYork;Liebermanetal.(eds.)(1990)PharmaceuticalDosageForms:TabletsDekker，NewYork;andLiebermanetal.(eds.)(1990)，PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystemsDekker，NewYork。在实施例中，本发明的任何短干扰核酸或载体可通过透皮给药。透皮成分可采用面霜、洗液、气溶胶和/或乳剂形式，可包括在基于此目的的本领域中常用的基质或储液嚢类型的透皮贴剂中。参见例如，Remington'sPharmaceuticalScience,17thEd.(MackPublishingCompany,Easton，PA，1990)。治疗应用中的给药方案可通过参与的医生、考虑各种可能改变治疗性物质作用的因素一—例如患者的症状、体重、性别和饮食，感染的严重性、住院时间及其它临床因素来确定。通常，治疗剂量从低水平逐渐增加，以获得最佳安全性和有效性。通常，日常剂量范围为每千克体重100-500jug。典型地，剂量范围为每千克体重150-250jag。优选地，剂量为每千克体重200pg。在给药后可根据更小的分子大小和可能降低的半衰期(清除时间)对剂量进行调整。本发明的组合物的"有效剂量"是可减轻患者慢性疼痛的量。慢性疼痛包括一个或多个以下特征疼痛持续3个月以上，通过常规药物治疗没有完全消除的疼痛，或超过正常恢复期的疼痛。慢性疼痛的例子包括，但不限定于，慢性神经性疼痛和慢性发炎性疼痛。慢性神经性和/或慢性发炎性疾病的例子包括，但不限定于疱渗后神经痛、痛性糖尿病神经病、神经根病变、神经压迫性损伤(例如腕管综合征、三叉神经痛、肺瘤相关的神经压迫)、上下腰痛(例如来自推间盘损伤、强直性脊柱炎或未知的病理学疾病)、I型或II型复杂性区域性疼痛综合症、神经损伤性疼痛(例如截肢后幻肢痛、其它截肢后引起的疼痛症状)、神经根性撕脱伤、HIV-相关的疼痛、化疗方案引起的神经病、视网膜病、坐骨神经痛、痛觉过敏、痛觉过敏和进行性灼伤痛(例如伤口相关的疼痛，包括但不限定于手术后疼痛)、关节痛、风湿和骨关节炎痛、纤维肌痛、烧伤痛、神经炎、坐骨神经痛、肌腱炎、骨痛、偏头痛、泌尿生殖器痛、和膀胱反射性亢进引起的神经性疾病。实施例通过下述以本发明的示例提供的非限制性实施例可更好理解本发明。以下实施例是为了用于更详细说明本发明，并非对本发明的范围进行限定。除非特别说明，以下给出的固体混合物中的固体、液体中的液体及液体中的固体的百分比分别基于wt/wt、vol/vol和wt/vol。在细胞培养时通常维持无菌状态。材料和通用方法使用标准的分子生物学方法，如Maniatisetal"MolecularCloning:ALaboratoryManual,1982，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress;Sambrooketal"MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2ded.)，Vols1-3，1989，ColdSpringHarborPress,NY;Ausubeletal"Biology,GreenePublishingAssociates,Brooklyn,NY或Ausubel,etal.(1987andSupplements),CurrentProtocolsinMolecularBiology,Greene/Wiley,NewYork;和lnnisetal.(eds.)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,1990，AcademicPress,N.Y中所述。实施例1本实施例说明针对Nav1.8的siRNAs的设计。针对鼠和人Nav1.8编码序列的推定的siRNA序列通过Tuschl's预测原则进行鉴定。参见Tuschl等"TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedKNAinvitro",GenesDev，vol.13，肌24，pp.3191-3197(Dec.15，1999);和Elbashiretal""Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells",Nature,vol.411，pp.494-498(2001)。表2确定了针对人Navl.8编码序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列、每个靶序列在基因中的位置及靶序列中鸟嘌呤/胞嘧啶的百分比。表3确定了针对鼠Nav1.8编码序列的推定的siRNA序列。也列出靶序列和每个靶序列在基因中的位置。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>AAATTGCTGCCAAGCAGGGAA(SEQIDNO:17)AAGCAGGGAACAAAGAAAGCC(SEQIDNO:18)AACAAAGAAAGCCAGAGAGM(SEQIDNO:19)AAAGAAAGCCAGAGAGAAGCA'(SEQIDNO:20>AAAGCCAGAGAGMGCATAGG<SEQIDNO:21>AAGCATAGGGAGCAGMGGAC邻QIDNO:22)AAGGACCAAGAAGAGMGCCT(SEQIDNO:23)AAGAAGAGAAGCCTCGGCCCC(SEQIDNO:24}AAGAGAAGCCTCGGCCCCAGC(SEQIDNO:25)AAGCCTCGGCCCCAGCTGGAC(SEQIDNO:26)AMGCCTGCAACCAGCTGCCC(SEQIDNO:27)AACCAGCTGCCCAAGTTCTAT(SEOIDNO:28)AAGTTCTATGGTGAGCTCCCA(SEQIDNO:29)AACTGATCGGGGAGCCCCTGG(SEQIDNO:30>AA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GTCGCTATG(SEQIDNO:485)AACGTCGCTATGGGCTACCTC(SEQIDNO:486)AACCTTCAAAGGCTGGATGGA(SEQIDNO:487)AAAGGCTGGATGGACATAATG(SEQ,DNO:顿)AATGTATGCAGCTGTTGATTC<SEQIDNO:489)MCAGTCAGCC丁MCTGGGAG(SEQIDNO:4恥〉AACTGGGAGAACMCTTGTAC(SEQIDNO:491)AACAACTTGTACATGTACCTG(SEQIDNO:492)AACTTGTACATGTACCTGTAC(SEQIDNO:493)AATCTCTTTGTTGGGGTCATA(SEQIDNO:494)AATCGACAACTTCAACCMCA^SEQIDNO:495)AACTTCAACCMCAGAAAAAA(SEQIDNO:496JAACCAACAGAAAAMAAGCTA(SEQIDNO:497)AACAGMAAAAMGCTAGGAG(SEQIDNO:498)AAAAMAAGCTAGGAGGCCAG(SEQIDNO:499)AAAAAAGCTAGGAGGCCAGGA(SEQIDNO:500)AAAAGCTAGGAGGCCAGGACASEQ'DNO:501)MGCTAGGAGGCCAGGACATC(SEQIDNO:502)AAGAGCAGMGMGTACTACA(SEQIDNO:503)MGMGTACTACMTGCCATG(SEQIDNO:504)AAGTACTACAATGCCATGAAG(SEQIDNO:505)AATGCCATGAAGAAGCTGGGC(SEQIDNO:506)AAGAAGCTGGGCTCCAAGAM(SEQIDNO:507;AAGCTGGGCTCCAAGAAACCC^SEQIDNO:508)MGAAACCCCAGMC5CCCATC(S￡QIDNO:509;AAACCCCAGAAGCCCATCCCA(SEQIDNO:510)MGCCCATCCCACGGCCCCTG(SEQIDNO:5")MTMGTACCMGGCTTCGTG(SEQIDNO:512)AAGTACCAAGGCTTCGTGTTT(SEQIDNO:513)AAGGCTTCGTGTTTCSACATCG(SEQIDNO:514)MGCCTTTGACATCATCATCA<SEQIDNO:515)AACATGATCACCATGATGGTG(SEQIDNO:516)MGACGAAGGTTCTGGGCAGA(SEQIDNO:517)AAGG丌CTGGGCAGAATCAAC(SECHONO:518)AATCMCCAG丌CTTTGTGGC(SEQIDNO:519)AACCAGTTCTTTGTGGCCGTC(SEQIDNO:520)AAGATGTTCGCCCTGCGACAG(SEQIDNO:521).AACGGCTGGMCGTGTTCGAC(SEQIDNO:522)AACGTGTTCGACTTCATAGTG<SEQIDNO:523)AATCCTTAAG丁CACTGGMAA(SEQIDNO:524)AAGTCACTGC3AAAACTACTTC(SEQIDNO:525)AAAACTACTTCTCCCCGACGC(SEQ旧NO:528)AACTACTTCTCCCCGACGCTC(SEQIDNO:527)AAGGGGATTCGCACGCTGCTC(SEQIDNO:528)MCATCGGCCTCCTCCTCTTC(SEQIDNO:529)MCGTCGTGGACGAGGCCGGC(SEOIDNO:530)AACTTCMGACCTTTGGCAAC(SEQIDNO:53"AAGACCTTTGGCAACAGCATG(SEQIDNO:532)AACAGCATGCTGTGCCTGTTC(SEQIDNO:533)'AACACGGGGGCTCCCTACTGC(SEQIDNO-534)AACCTGCCCAACAGCAACGGC(SEQIDNO:535;AACAGCMCGGCTCCCGGGGG(SEQIDNO:536)AACGGCTCCCGGGGGMCTGC(SEQIDNO:537;AACTGCGGGAGCCCGGCGGTCS(SEQIDNO:538)AACATGTACATCGCAGTGATT(SEQIDNO:539)AACTTCAACGTGGCCACCGAG<SEQIDNO:540)AACGTGGCCACCGAGGAGAGC(SEQIDNO:541)AAGTTCGACCCGGAGGCCACC(SEQIDNO:542)AAYcCCCAAACCCAACCAGM(SEQIDNO:543)AAACCCAACCAGAATATATTA(SEQIDNO:544)AACCAGMTATATTMTCCAG(SEQ,DNO:545)AATATATTMTCCAGATGGAC(SEQ旧NO:546)MTCCAGATGGACCTGCCGTT(SEQIDNO:547)AAGATCCACTGTCTGGACATC(SEQIDNO:548)AAAGMCGTCTTGGGAGAATC(SEQIDNO:549)MCGTCTTGGGAGAATCCGGG(SEQIDNO:550)AATCCGGGGAGTTGGACTCCC(SEQIDNO:551)AAGACCAATATGGAAGAGAAG(SEQIDNO:552)AATATGGMGAGMGTTTATG(SEQIDNO:553)MGAGMGTTTATC3GCGACCA(SEQIDNO:554)AAGTTTATGGCGACCMTCTC(SEQIDNO:555)MTCTCTCCAAAGCATCCTAT(SEQIDNO:556)MAGCATCCTATGMCCMTA(SEQIDNO:557)AACCMTAGCCACCACCCTCC(SEQIDNO:558)AATAGCCACCACCCTCCGGTG(SEQIDNO:559)AAGCAGGAAGACCTCTCAGCC(SEQIDNO:560)MGACC丁CTCAGCCACAGTCA(SEQIDNO:561)AAAAGGCCTACCGGAGCTACA(SEQIDNO:562)MGGCCTACCGGAGCTACATG(SEQIDNO:563)AACACCCTGCATGTGCCCAGG(SEQIDNO:564)MGGCTACGTTACATTCATGG(SEQIDNO:565)AAACAGTGGACTCCCGGACAA(SEQIDNO:566)AAATCAGAMCTGGGTCTGCT(SEQIDNO:567)222222222222222222222222222222222222222sswsJwwssii;ss^ss3CSSMSC::3sfs:s59..;;M840aJ2713:730509268591680955c^ys6ss明M明ts!35s35SM"SJ559G:477533455923.^-87800002245782t^sM^T^r^TJr,TJ3'444.44444444555555555555555&555_y_J-_^555555JKK5JJJ5JO-5259AAACTGCCTCTGCTACGTCTT(SEQIDNO:568)5726260AACATTMCCCATCTAGCTCA(SEQIDNO:569)5794261AACCCATCTAGCTCAATGCM(SEQIDNO:570)5800262AATGCAAMTGMGATGAGGT(SEQIDN0:57"5814263AAAATGMGATGAG(3TCGCTG(SECMDNO:572)5819264AATGMGATGAGGTCGCTGCT(SEQIDNO:573)5821265MGATGAGGTCGCTGCTMGG(SEQIDNO:574)5825266AAGGMGGAAACAGCCCTGGA(SEQIDNO:575)5842267AAGGAAACAGCCCTGGACCTC<SEQIDNO:576)5846268AAACAGCCCTGGACCTCAGTG(SEQIDNO:577)5850在上述siRNA序列中，选择5个来检测其在体外敲减Nav1.8表达及功能的能力。选择的5个siRNAs覆盖了Navl.8编码序列全部5874个核苷酸的不同区域。这5个siRNA序列，包括每个序列定位在基因组中的核苷酸位置均列在表4中表4<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>实施例2由QiagenInc.,Valencia,CA合成上述5个选择的siRNA序列，序列号为SEQIDNOs:1-5。然后我们将Nav1.8cDNA克隆到pcDNA3.1哺乳动物表达质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，得到cDNA-Nav1.8对照表达质粒。当将对照质粒转染到HEK293细胞(MicrobixBiosystems，Inc.,Ontario,CanadaM8Z3A8)中，细胞可表达高水平的Nav1.8RNA和蛋白。冲艮据说明书通过Taqman⑧定量RT-PCR(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)检测Nav1.8RNA的表达。用Nav1.8特异肽抗体SODl(AnaSpec，SanJose，CA)通过western免疫印迹分析检测HEK293细胞中Nav1.8蛋白的表达。用公开的肽序列制备SODl抗体。参见Novakovic等"Distributionofthetetrodotoxin-resistantsodiumchannelPN3inratsensoryneuronsinnormalandneuropathicconditions,J.Neuroscience，vol.18，no.6，pp.2174-2187(1998)。Nav1.8RNA的敲减将5个化学合成的siRNAs——SEQIDNOs:1-5与pcDNA-Nav1.8对照表达质粒一起，分别共转染HEK293细胞。转染的细胞中siRNA终浓度维持在25nM。在转染24小时后，裂解细胞，从裂解液中通过RNAeasy柱(Qiagen，Valencia,CA)根据说明书纯化总RNA。对从用独立的siRNAs共转染的细胞或对照细胞中纯化的总RNA用大鼠Nayl.8特异的Taqman⑧引物和探针组(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)进行定量RT-PCR分析。在该方案中任何大鼠Nav1.8特异引物均应可工作。PCR引物的设计是本领域已知。将siRNA转染细胞中的Nav1.8RNA表达水平与对照细胞中的RNA表达进行比较。用pcDNA3.1-Navl.8对照表达质粒转染的对照细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为100%。用pcDNA3.1-Nav1.8对照表达质粒和序列为SEQIDNO:1的siRNA共转染的siRNA1细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为20%。用pcDNA3.1-Nav1.8对照表达质粒和序列为SEQIDNO:2的siRNA共转染的siRNA2细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为65%。用pcDNA3.1國Nav1.8对照表达质粒和序列为SEQIDNO:3的siRNA共转染的siRNA3细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为30%。用pcDNA3.1-Nav1.8对照表达质粒和序列为SEQIDNO:4的siRNA共转染的siRNA4细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为115%。用pcDNA:3.1-Na4.8对照表达质粒和序列为SEQIDNO:5的siRNA共转染的siRNA5细胞其相对的rNav1.8RNA表达水平为70%。用siRNA1或siRNA3共转染的细胞表现出高水平的Nav1.8RNA沉默，而用siRNA2和siRNA5共转染的细胞表现出中等水平的RNA沉默。在用siRNA4转染的细胞中没有观察到Navl.8表达的敲减。Navl.8蛋白的敲减将5个化学合成的siRNAs——SEQIDNOs:1-5与pcDNA-Nav1.8对照表达质粒一起，分别共转染HEK293细胞。转染的细胞中siRNA终浓度维持在25nM。在转染24小时后，在变性裂解緩冲液中裂解细胞，将裂解液在变性12°/。TBE胶(Invitrogen，Carsbad,CA)中进行电泳。将胶印迹在硝酸纤维素膜上，并用Nav1.8特异抗体SOD1(AnaSpec，SanJose,CA)进行检测。pcDNA-Nav1.8对照表达质粒所转染的对照细胞的裂解液表现出高水平Nav1.8蛋白的表达。pcDNA-Nav1.8对照表达质粒和siRNA1或siRNA3所共转染的细胞的裂解液表明Navl.8蛋白的表达几乎完全消失。pcDNA-Nav1.8对照表达质粒和siRNA2或siRNA5所共转染的细胞的裂解液表现出中等水平的Nav1.8蛋白的表达。pcDNA-Nav1.8对照表达质粒和siRNA4所共转染的细胞的裂解液表明Nav1.8蛋白的表达水平没有降低。实施例3然后，我们测定了siRNA是否能有效敲减Nav1.8钠通道。使用FlexStation⑧检测法(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)和电压钳检测法进行该测定法。我们通过反转录病毒的整合，在成神经细胞瘤/DRG融合细胞系ND7/23(EuropeanCollectionofCellCultures,Wiltshire,UK)中稳定表达Nav1.8编码序列。ND7/23细胞系是大鼠成神经细胞瘤和小鼠神经细胞的杂合子，由欧洲细胞培养物保藏中心No.92090卯3鉴定。该ND7/23-Nav1.8细胞系在FlexStation⑧膜电位检测法和全细胞电压钳检测法中均表现出持续的高水平Nav1.8钠电流。FlexStation⑧检测法我们将上述5个选择的siRNA序列——SEQIDNOs:1-5分别转染到ND7/23-Nav1.8细胞系中。根据说明书在FlexStation@上通过膜电位检测法来验证siRNAs对Navl.8功能的敲减。用独立的siRNAs转染1天后在FlexStation⑧上读数。将对照细胞的发光水平与用siRNAsl-5独立转染的细胞的发光水平进行比较。所有细胞均用Nav1.8编码序列转染。对照细胞表现出的发光水平为175,000单位。用序列为SEQIDNO:1的siRNA转染的siRNA1细胞其发光水平为48，000单位。用序列为SEQIDNO:2的siRNA转染的siRNA2细胞其发光水平为70,000单位。用序列为SEQIDNO:3的siRNA转染的siRNA3细胞其发光水平为45,000单位。用序列为SEQIDNO:4的siRNA转染的siRNA4细胞其发光水平为1M，000单位。用序列为SEQIDNO:5的siRNA转染的siRNA5细胞其发光水平为80，000单位。siRNAsl和3阻断Navl.8来源的膜电位，而siRNAs2和5表现出对膜电位中等水平的阻断。siRNA4对膜电位的阻断水平最小或没有。每个siRNAs对膜电位的阻断水平与siRNAs在HEK293系统中的蛋白和RNA沉默水平是相似的。在本实验的另一个实施例中，对照细胞表现出的发光水平为198,698单位。用序列为SEQIDNO:1的siRNA转染的siRNA1细胞其发光水平为46,068单位(相当于对照信号的23%)。用序列为SEQIDNO.'2的siRNA转染的siRNA2细胞其发光水平为71，523单位(相当于对照的36%)。用序列为SEQIDNO:3的siRNA转染的siRNA3细胞其发光水平为42,422单位(相当于对照的21%)。用序列为SEQIDNO:4的siRNA转染的siRNA4细胞其发光水平为151,067单位(相当于对照信号的76%)。用序列为SEQIDNO:5的siRNA转染的siRNA5细胞其发光水平为80,567单位(相当于对照信号的41%)。电压钳测定法为了进一步Navl.8钠电流功能的敲减，我们在用siRNA1转染的ND7/23-Navl.8对照细胞中进行了全细胞电压钳测定。简要来说，用非沉默siRNAs假转染ND7/23-Nav1.8细胞作为对照细胞，或用siRNA1转染细胞得到siRNA1细胞。siRNA1浓度维持在25nM。通过与绿色荧光蛋白(GFP)(CIontech，PaloAlto，CA)共转染所鉴定的成功转染细胞，被用来进行全细胞电压钳测定。测定在转染后24和48小时后进行。在转染24小时后，对照细胞表现出的峰幅值为-900，而siRNA1细胞的峰幅值为-175。在转染48小时后，对照细胞表现出的峰幅值为-775，而siRNA1细胞的峰幅值为-175。因此，我们在siRNAl转染细胞中观察到钠电流几乎完全阻断。实际上，阻断大于85%。另外，可通过在siRNA1处理的ND7/"-Nav1.8细胞中没有发现对河豚毒素敏感的电流的阻断来确定Nav1.8阻断的特异性。在另一个实施例中，在转染24小时后，对照细胞(样品大小=10)表现出的平均峰全细胞Nav1.8电流幅值为力UpA，而siRNAl细胞(样品大小-ll)的平均峰幅值为-l仍pA。因此，在转染24小时后，siRNA1将Nav1.8电流幅值降低到对照的18.5%。另外，可通过在siRNA1处理的ND7/23-Nav1.8细胞中在转染24小时或48小时后没有发现河豚毒素敏感的钠电流幅值的降低来确定siRNA的特异性。实施例4为了鉴定可高水平敲减Nav1.8的备份siRNAs，我们在覆盖siRNA1和siRNA3的Nav1.8编码区设计了另外6条siRNAs,序列为SEQIDNOs:6-ll。这另外6条siRNAs的设计与实施例l使用的程序相同，具有以下序列，如下表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>所有这6条另外的siRNAs——SEQIDNOs:6-11均在ND7/23细胞中筛选其敲减Navl.8来源的膜电位的能力。使用与实施例3相似的程序，将对照细胞的发光水平与分别用siRNAs6-11转染的细胞的发光水平进行比较。对照细胞的发光水平为175,000单位。用序列为SEQIDNO:6的siRNA转染的siRNA6细胞的发光水平为85，000单位。用序列为SEQIDNO:7的siRNA转染的siRNA7细胞的发光水平为50,000单位。用序列为SEQIDNO:8的siRNA转染的siRNA8细胞的发光水平为45,000单位。用序列为SEQIDNO:9的siRNA转染的siRNA9细胞的发光水平为43,000单位。用序列为SEQIDNO:10的siRNA转染的siRNA10细胞的发光水平为10，000单位。用序列为SEQIDNO:11的siRNA转染的siRNA11细胞的发光水平为35,000单位。用与实施例2和3相似的程序，我们确i人了所有6个siRNAs也可阻断Nav1.8的表达和功能，从而获得有效的siRNAs组。在另一个实施例中，对照细胞的发光水平为198,698单位。用序列为SEQIDNO:6的siRNA转染的siRNA6细胞的发光水平为86，105单位(对照细胞的43%)。用序列为SEQIDNO:7的siRNA转染的siRNA7细胞的发光水平为50,237单位(对照细胞的25%)。用序列为SEQIDNO:8的siRNA转染的siRNA8细胞的发光水平为44,038单位(对照细胞的22%)。用序列为SEQIDNO:9的siRNA转染的siRNA9细胞的发光水平为46,917单位(对照细胞的24%)。用序列为SEQIDNO:10的siRNA转染的siRNAIO细胞的发光水平为21,847单位(对照细胞的7%)。用序列为SEQIDNO:11的siRNA转染的siRNA11细胞的发光水平为30,587单位(对照细胞的15%)。实施例5Nav1.8siRNA的腺病毒给药为了将siRNA长期递送到细胞中并敲减Nav1.8的功能，我们设计了启动siRNA表达的腺病毒载体。简要来说，构建体设计为在U6启动子表达盒调控下表达siRNA3(SEQIDNO:3)。然后将siRNA3表达盒克隆到缺失El的pTG"l3腺病毒载体(TransgeneSA，France)中。用上述siRNA3腺病毒载体构建体以1^颗粒/ml转染实施例3中的ND7/23-Nav1.8细胞。对照细胞用相同浓度的含U6启动子表达盒的对照腺病毒进行感染。将感染的细胞裂解，纯化总RNA，以进行Taqrnan⑧检测或FlexStation⑧检测。对Taqrnan⑧检测而言，感染的细胞在转染6、8和10天后(dpi)进行裂解，从裂解液中纯化RNA，并通过定量RT-PCR分析测定Nav1.8的表达。在感染6天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比表示，Navl.8RNA的表达是18。/。。在感染8天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比来表示，Nav1.8RNA的表达是22%。在感染10天后，以非沉默腺病毒siRNA的百分比来表示，Nav1.8RNA的表达是30%。对FlexStation⑧检测而言，转染2、4、6、8和10天后(dpi)，在FlexStation⑧上测定感染细胞的Nav1.8来源的膜电位。在每个时间点，将在siRNA3腺病毒载体构建体感染的细胞中的膜电位的敲减，与对照腺病毒感染的细胞的膜电位进行比较。在转染2天后，与非沉默腺病毒siRNA相比较，百分比钠电流是4"/。。在转染4天后，与非沉默腺病毒siRNA相比较，百分比钠电流是15%。在转染6天后，与非沉默腺病毒siRNA相比较，百分比钠电流是8%。在转染8天后，与非沉默腺病毒siRNA相比较，百分比钠电流是8%。在转染IO天后，与非沉默腺病毒siRNA相比较，百分比钠电流是4%。为了进一步确定在病毒siRNA构建体中RNA表达的降低就是表示功能性Nav1.8钠通道活性的衰减，我们进行了多个全细胞电压钳实验，以在多个感染后时间点直接测定Navl.8介导的电流。在每个这些实验中，测定已用对照、非沉默siRNA构建体或腺病毒-siRNA3构建体感染的ND7/23-Nav1.8细胞样品的电流幅值。在用非沉默病毒构建体感染4天后，总平均(10个细胞样品)全细胞Nav1.8电流是-821pA，而在siRNA3病毒感染的细胞中测定的为-101pA(相当于对照的12.3%)。在用非沉默病毒构建体感染6天后，总平均(IO个细胞样品)全细胞Navl.8电流是-932pA，而在siRNA3病毒感染的细胞中测定的为-247.7pA(相当于对照的26.6%)。在用非沉默病毒构建体感染10天后，总平均(10个细胞样品)全细胞Nayl.8电流是-976.7pA，而在siRNA3病毒感染的细胞中测定的为-542.7pA(相当于对照的55.6%)。因此，Taqrnan⑧和FlexStation⑧及电压钳检测均表明Nav1.8RNA表达和Nav1.8来源的膜电位的敲减至少可持续8dpi。通过siRNA表达腺病毒的感染可导致至少80%的Navl.8表达和功能的敲减。因此，用病毒载体递送siRNA可高水平对Nav1.8进行持续阻断。实施例6Nav1.8siRNA在大鼠慢性疼痛模型中的作用用siRNA3考察了Navl.8-siRNA在大鼠慢性疼痛模型中的作用。用分级von-Frey微纤丝(gradedvon-Freymicrofilaments)效，J定一群鼠的后爪触觉灵敏性(-基线灵敏性)。然后将同样的大鼠进行外科手术，在股中部暴露其左侧坐骨神经，然后用标准的缝合材料松散地缝合伤口。当伤口愈合后，在进行任何随后的行为评估前，先使动物恢复至少1周。手术造成的神经损伤可导致在左后爪具有触觉超敏感性一一即称为触痛觉超敏的疾病。痛觉超敏的程度可按照与基线测定相同的von-Frey微纤丝(von-Freyfilaments)程序来定量，这种测定在手术后进行13天。为了评估siRNA3(SEQIDNo:3)对痛觉超敏的作用，将siRNA以双链体形式通过永久性内部鞘内导管递送到脊索周围的鞘内空间。在3天的时间里，每天分别注射2次2pgsiRNA3，对照大鼠仅用栽体通过相同的时间程序进行处理。在这些实验中所用的基线后爪灵敏性的范围在13到15克力。在神经损伤13天后，对每只大鼠重新测定其后爪灵敏性，发现在命名为siRNA的组中范围是1.2+-0.4g，在对照组是2.1+-0.4g(组的大小=药物处理组有6只大鼠，对照组有5只大鼠)因此，神经损伤可导致深刻的疼痛触觉超灵敏性(痛觉超敏)，这是在患有慢性神经性疼痛疾病的人类患者中的典型症状。定期评估表明在仅接受栽体注射的对照组中疼痛的痛觉超敏症状持续(典型地〈2.1g)13天到21天。相反，在13天的评估后立即注射3天siRNA3的鼠，表现出疼痛的痛觉超敏(8.1+-2.1g，在第16天评估)的显著逆转。与对照相比较，用siRNA3处理的鼠在进行测定的随后几天中具有持续提高的疼痛分值(例如，改善了实验诱导的慢性疼痛症状)。权利要求1.一种分离的或重组的短干扰核酸或其类似物，其中，所述的短干扰核酸含有选自SEQIDNOs1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的核苷酸序列。2.权利要求1的分离的或重组的短干扰核酸，其包含选自SEQIDNOs:l、2、3、5、9和10的核苦酸序列。3.权利要求1的分离的或重组的短干扰核酸，其进一步包含3'突出"^fi^04.一种药物组合物，其包含权利要求1或3的短干扰核酸以及药学上可接受的栽体。5.权利要求1或3的分离的或重组的短千扰核酸，其进一步包含其互补的核苷酸序列。6.权利要求5的互补核苷酸序列，进一步包含3'突出端。7.—种药物组合物，其包含权利要求5或6的短干扰核酸和其互补核苷酸序列，以及药学上可接受的载体。8.权利要求5的分离的或重组的短干扰核酸，其中所述核苷酸序列和所述互补核苷酸序列可杂交形成双链体。9.权利要求8的双链体，其中所述核苷酸序列进一步包含3，突出端，而且所述互补核苦酸序列进一步包含3，突出端。10.—种药物组合物，其包含权利要求8或权利要求9的双链体以及药学上可接受的载体。11.一种含有义链和反义链的分离的或重组的短干扰核酸，其中所述有义链和所述反义链可杂交形成双链体，其中所述有义链含有与靶序列基本同一的核苷酸序列，其中所述靶序列选自SEQIDNOs:12-577。12.权利要求11的双链体，其中所述有义链进一步包含3，突出端，所述反义链进一步包含3，突出端。13.—种药物组合物，其包含权利要求11或12的双链体以及药学上可接受的载体。14.一种含权利要求1或3的核苷酸序列的重组载体。15.—种抑制mRNA翻译为多肽的方法，包括将可表达Nav1.8mRNA的细胞与权利要求1或3的短干扰核酸相接触。16.—种抑制多肽表达的方法，包括将可表达Nav1.8多肽的细胞与权利要求1或3的短干扰核酸相接触。17.—种阻断细胞中膜电位的方法，包括将表达Nav1.8多肽的细胞与权利要求1或3的短干扰核酸相接触。18.—种阻断细胞中钠电流的方法，包括将表达Nav1.8多肽的细胞与权利要求1或3的短干扰核酸相接触。19.一种抑制慢性疼痛的方法，包括对患者给药有效剂量的权利要求4、7、10或13的药物组合物。20.权利要求1或3的一个或多个短干扰核酸在制备抑制慢性疼痛的药物中的用途。全文摘要本发明提供了可导致Na_v1.8钠通道基因的mRNA发生RNAi诱导降解的单链或双链短干扰核酸，含这种短干扰核酸的药物组合物；含这种短干扰核酸的重组载体；抑制mRNA翻译的方法；抑制多肽表达的方法；阻断细胞膜电位的方法；阻断细胞钠电流的方法；及抑制慢性疼痛的方法。文档编号A61K48/00GK101103112SQ200580045090公开日2008年1月9日申请日期2005年10月26日优先权日2004年10月27日发明者J·C·亨特,S·戈尔高克,T·普里斯特利申请人:先灵公司;坎吉有限公司