专利名称：转录组修饰剂和化学疗法或放射疗法对抗癌症的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及将转录组修饰剂(transcriptome-modifying agents)用于辅 助治疗恶性肿瘤，其通过阻止恶性肿瘤细胞识别这样的基因改变而进行， 所述基因改变是对抗细胞刺激和经受化学疗法或放射疗法仍旧存活所必 需的，更具体地本发明涉及抑制DNA甲基化和组蛋白脱乙酰作用的机制 的转录组修饰剂的组合使用，更具体地本发明涉及通过包括肼屈嗪和丙戊 酸或其任一种盐如丙戊酸镁的治疗试剂盒的方式以与化学治疗或放射治 疗联合辅助癌症治疗的组合应用。
背景技术：
癌症或恶性肿瘤可以被分类为实体瘤的或造血系统瘤。第一种的实例 特别包括癌症如乳腺癌，头颈癌，结肠和直肠癌。造血类型的实例包括白 血病和淋巴瘤。在细胞核内的DNA排列在染色质上，并且具有一些等级 顺序。染色质的组成单元是核小体，其由已知为组蛋白的八聚体核蛋白组 成，并且在其上缠绕着DNA。 DNA在核小体内的排列和包装对于基因调 节起重要作用。组蛋白的共价修饰，如乙酰化，对于染色质调节和基因表 达起基石出作用(C7zo 五/z'zoA7cfo ZJ， 5oeWtoe/ CF: ^cfwmces c/ rawa"" 謂o赫"g朋d /z訓朋^'酒se依染色i重餅〃乂类疾疯^游遂展」.C醉 Op/"Ge"dDev (遗传发育学的现代观点)2M《WJ朋-")。
目前，癌症仍旧是世界范围的严重健康问题，根据国际癌症研究协会 (International Cancer Research Agency)和世界卫生组织(World Health Organization),该疾病的发病率正在急剧增加，估计在2000年有一千万的 新病例，在接下来的20多年里将达到1500万(Mg"og"a MA FeA/e Amsso ZX. T7 e恥r/cf Ca"cer i epoW 6wrcfe" o/or"/ cawcer f^"i^;^",
艰if^7/7^^虜i^游力资;).五^/Ca"cwiVev.(欧洲癌症预防杂志)2WM; "P-W).。另一个方面，在最近数年中，患有最常见癌症如肺癌，前列腺 癌和乳腺癌的患者的存活已经在稳步增加。在1974年，达到5年的存活
是50°/。，而在992-999年间，这一数字增加到63% (Jewa/4 7; ￡， S識we/51」，！H而n. AC, G/z—or ￡乂 7Tmw M/
尽管在治疗方式上的进展已经取得了在存活上的较小程度的成功，但 是该结果仍旧是远远不够的。目前，化学疗法和外科手术和放射疗法仍旧 是基本的治疗基础，因为绝大多数癌症患者需要这种形式的治疗。
近年来，在癌症的分子基础上产生的大量知识容许设计新形式的治疗 方法，其通常涉及阻止癌基因的功能或重新激活抑制基因的表达。这些尝 试的实例是使用针对一些癌基因受体，如EGFR， HER2等的单克隆抗体。 在抑制基因的情形中， 一些治疗上的尝试是使用具有针对p53的功能产物 的编码基因的重组腺病毒(//^w/Wo" 7T^ D//. Ge"Wca//_y ZjosW
^scOTeo^"d^ve/o; me"t Oi"i^游遗传基鄉游治^V与传统^"激发观浙发 ,游浙欽丝*差_#^ M / 7Tz^f分^治劝.M05，' ":W6-507)。
一般说来，我们可以将这种新形式的癌症称为单基因产物或单基因治 疗方法。然而，这种方法具有一些缺陷，因为恶性肿瘤细胞基因组具有极 大的适应性并且因为癌症的发展涉及多个步骤，因此不存在导致恶性肿瘤 表型发展的单基因改变。这意味着，尽管阻止或恢复基因或其产物可以产 生重要的抗肿瘤效果，所述效果却是无法支持的，因为恶性肿瘤细胞最终 一定会发展针对所述疗法的抗性，其原因在于所述恶性肿瘤细胞将增加或 减少基因的表达，这可以适应由所述疗法产生的影响(i ow 5t&"k/"
尸Ze&wsk(尺M丄/"e"e (7《乂 5"tog/z'a"o iVE， GVm6wg GS1，
M似.爿w C7/"尸"Ao/,(美国临床病理学杂志)2M4;
目前，众所周知的是恶性肿瘤细胞具有多种缺陷，即突变，缺失，重 复，扩增以及外遗传改变，后者主要由于染色质修饰而成为稳定的功能改 变，两种更重要的改变是DNA申基化和组蛋白乙酰化。外遗传改变必须 在某一特定状态并且以完美的功能平衡作用以维持"恶性动态平衡"。这
一概念是非常重要的，因为恶性细胞所有的缺陷不是简单的综合，其与这 样的事实是一致的，即由所述基因编码的蛋白在复合物的网络和表现出对 正反馈和负反馈的控制的相互作用功能中具有多重作用。此外，尽管在肿 瘤发生中存在的多个步骤的过程，细胞应该维持在皆来自致癌途径和抑制 基因的阳性信号和阴性信号之间的稳态，以确保增殖和细胞死亡的过程根
据恶性状态动力学发生Z6. C"w匿」必/Wo" to owcoge腦-Ae JcMfe to/ o/謹匿 对蘑基茵游瞢,蘑,游爿cMfes治劝-
5"c/e"c (科学)2M々297f557S」.'W-0。
除了恶性细胞的总的基因表达的固有的复杂性，当试图作为外源刺激 的结果，特别是来自化学疗法或放射疗法的影响而调节基因表达时，描述 要复杂得多。化学疗法和放射疗法在基因转录中产生立即的改变，并且这 些改变不仅发生在主要与致癌过程相关的那些基因中，还发生在不直接参 与的基因中，如参与代谢、转运等的那些基因中。(J/aoMz'-/ama/ZM4,
f謂sc丰z'o"a/ 戸feowz'c //"g ("遞过存录/〃歪^#,式,#^* ^游药激敎减丝浙^"笏拔&). Drag C/^^.(药物抗性更新)
M似;7:M5-55)。然而，最重要的方面，是只有能够对有害刺激具有充足的 转录反应的那些细胞是将在所述刺激下存活下来的唯一的细胞。明显地， 为了使该反应"适应于"存活发生，不可缺少的是调节转录的外遗传机制 是完整的。因此，如果恶性细胞在转录组-修饰剂的影响下，存活所必需的 转录反应将不会发生，并且所述细胞可能具有功能不可逆的改变或遭受细 胞程序性死亡。真核细胞的转录可以被定义为所述细胞表达生物活性蛋白 的能力。因此，转录是高度受调节的现象。所述过程在基因水平上起始并 且在蛋白水平上终止并且包括多个事件；因此转录具有数个调节水平，其 中它们是下列各项1)染色质结构，其是DNA的物理结构，其包括染色 质包装的水平，所述染色质包装的水平确定调节蛋白与基因调节或启动子 区结合的能力，2)转录起始的控制，3)转录物转运，4)转录物加工和修 饰，5)转录物稳定性，6)翻译起始，7)翻译后改变，和8)蛋白的转运和 禾急定'l"生。(/4rc/wm6aw/f /' jpn.ese" JD. (7e"e0.cs o/ewAarjof/c 7 jV/4 pofymerasej /, //,朋c//// r真提生激/ A^ ^合艨/，//浙///游遗传;> .Mcra^o/i evf微生
^C^"^^). /^^57:703-^0。毋庸置疑，作用在越高的转录调节水平上，转 录效果将越重要。因此，转录组修饰剂，通过作用在最高的调节水平上， 对大量的总的基因表达具有作用。
组蛋白的共价修饰，如乙酰化作用，和DNA甲基化作用，在确定染 色质包装的级别和最终确定总的基因表达上具有关键的作用；因为该原 因，抑制DNA甲基化和组蛋白脱乙酰作用的药剂已经证实具有明显改变 表达的性质。甲基化作用的损失可能减少在某个基因座结合甲基化结构域 的蛋白复合物的量，导致将必须被组蛋白脱乙酰酶-抑制剂抑制的组蛋白脱 乙酰酶活性的减少。此外，转录抑制复合物的损失可以有利于基因启动子 和具有组蛋白乙酰酶活性的转录激活复合物的再次缔合。已知DNA甲基 转移酶(DNMT1)的最丰富的形式可以直接结合于组蛋白脱乙酰酶，并且氨 基端还具有结合协阻抑物的能力(M^卯M五p/ge"efz'": /"&rac"o" o/i)A^ me^y/加'o"aw/c/zraw如'"(^遗传,Z)A^伊基众浙染经^^游裙互/^^).
""rave/Z"g Ae to"g/W wAfDA^伊基众/〃染色^^-^^^^"^"游鄉.O"coge"e
尽管已经测试了数百个潜在的抗肿瘤剂，治疗人类癌症仍然是具有挑 战性的，其中许多抗肿瘤治疗仅是部分有效的，并且具有对实际上所有的 系统导致附属作用的可能性。因此，存在这样的需要，即不仅具有更有效 的治疗选择，还以在基因转录上更具有选择性的方式攻击恶性细胞的更具 特异性的一些治疗方法。为此原因，本发明的一个目的是提供基于改变转 录组而辅助癌症治疗的组合物，其通过使用转录修饰剂如肼屈嗪和丙戊酸 镁的方式进行，使用其细胞将不能在由化学疗法或放射疗法诱导的有害刺 激下存活。
抗高血压药肼屈嗪是DNA甲基化抑制剂，其用于在实验系统中使T 细胞DNA甲基化不足，这使这些细胞具有自反应性(r""g凡C/7""g S
诱导的狼疫的机制).Com/ "nSo" o/praco^am^e /^<ira/az/"e 朋a/op & W的/" Wvo^体/A浙沐/^比莰普誊卡汲俊浙,腐驥与其类叙 激/y^/zn'to朋e謂.(类风湿关节炎)/卯7,'W:/W6-W)。最近，己经证实，
在体外和体内模型中，肼屈嗪使来自抑制性抑制基因的启动子区去甲基化
并且诱导其再激活；并且此外，再激活的基因产物是功能性的(&gwraJB， 7>e)o-Becem7 C' /￥/'e2C7zavez ^， Sa/azar爿M' Zizawo M' Dwe/to-Gowzd/ez
,药激#腐繞，普睿卡历嚴对#蘑#劍基尿游厚激活,&//:/在蘑症治#
C7/" Omce/^&s.(临床癌症研究)2卯H "96-603)。 肼屈嗪对DNA甲基转移酶具有直接抑制作用，并且在体外模式中， 已经证实在该分子上的两个氮原子与酶活性位点的氨基酸Lysl62和 Arg240相互作用，所述酶活性位点的氨基酸Lysl62和Arg240构成抑制 基因的功能的去甲基化作用和再活化性质G4"ge/a Fa^i^-]^tofez, 附'^s《Mez-歸^fez Q J^/oz《wez-(S""c/ze2爿M i^z附/rez A Mar""ez丄，
tw"weo/ /as/c age"f. Z)och'"g WW& cw weMy/f,'""映mye (l-肼基氮杂萘(胼 屈嗪)作为抗肿瘤药剂的计算机研究.关于甲基转移酶的评价研究^ .丄e/few />"《￡>鄉"￡>/謂^ (",欽没絲发遞#7厕5,'《'U(5)。
丙戊酸或其盐，如在已知作为VPA的丙戊酸镁情形中，2-丙基戊酸是 已经在许多年以来用作抗惊厥药并具有充分证实的安全模式的药物。
a/ er 35 years o/c/z'm.ca/ ex/ en'e"ce f^"/^"^^^^^"^^ 7^^;^7^廣.' 35年游游尿经验游,总錄).CA^Dn^fOVS,熟2002, /6:卯5-7/4)。最近 己经证实这种药物是组蛋白脱乙酰酶的抑制剂。被抑制的酶是I族和II族 种类的那些，不包括组蛋白脱乙酰酶6和10。在体外和体内观察到的组蛋 白H3和H4的高度乙酰化伴随其对该酶家族的酶促抑制作用。这种对组 蛋白的作用对诱导分化、诱导细胞程序性死亡和抑制细胞增殖产生重要作
/j " torge/ o/va// ra/c aczW-膨血fed ce歸ar (i晚re""'a"o"像蛋占應乙激藤 ;f/^/f麽分导效-智應分众必教标义Ca"cw i e^蘑,砑究J
出于这种原因，本发明的另一个目的是提供由肼屈嗪和丙戊酸或其任 一种盐如丙戊酸镁组成的治疗试剂盒，其有助于针对癌症使用的通常疗 法。
附图简述
图1A, 1B， 1C, 1D， 1E， 1F，和1G，显示用本发明的转录组修饰组合物处
理的不同的恶性细胞系中的细胞毒性作用。
图2 A, 2B和2C显示本发明的转录组修饰组合物在恶性细胞系中产生
代表性化疗剂(顺铂，多柔比星和吉西他滨)的细胞毒性作用的增强。 图3A显示根据本发明的每种基因的甲基化频率。 图3B,显示根据本发明的甲基化频率的代表性情形。 图3C，显示根据本发明，在甲基化百分比和肼屈嗪剂量之间的相关性。
图4A, 4B和4C显示在治疗前和治疗后活组织检查中的信使的基因表
达的示范性情形。
图5, 6和7显示根据本发明的组蛋白脱乙酰酶活性数据。
图8显示本发明的组合物的组蛋白脱乙酰酶抑制作用的数据。
图9显示用根据本发明的组合物处理和不用其处理的动物中的肿瘤生
长阻滞作用。
发明详述
本发明提供应用组合物和治疗试剂盒以辅助治疗恶性肿瘤，其通过使 用补充用化学疗法或放射疗法进行的治疗的转录组修饰化合物进行。
转录组修饰剂的组合物是肼屈嗪和丙戊酸或其任一种盐如丙戊酸镁 的组合，其辅助化学疗法，其可以是但不限于这些化合物苯丁酸氮芥，
环磷酰胺，异环磷酰胺(iphosphamide)，氮芥，美法仑塞替派，卡莫司 汀，洛莫司汀，六甲蜜胺，达卡巴嗪，和丙卡巴肼，顺铂，卡铂和奥沙利 铂，多柔比星，柔红霉素，表柔比星，伊达比星，丝裂霉素C，博来霉素， 放线菌素D，类视黄醇，激素药剂，长春新碱，长春碱，长春地辛，长春 瑞滨，伊立替康，托泊替康，依托泊苷，替尼泊苷，紫杉醇，多西他赛，
5-氟尿嘧啶，吉西他滨，甲氨蝶呤，白介素，干扰素，单克隆抗体如曲妥
单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗(rituxan)、抗CD-33单抗(myelotarg)， 和抑制性小分子如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、和伊马替尼。
本发明的组合物和治疗试剂盒可以用于对抗一些类型的肿瘤，其包 括，但不限于，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，皮肤癌，骨癌，前列腺癌，肝 癌，肾癌，肺癌，脑癌，头颈癌，胆囊癌，胰腺癌，结肠和直肠癌，甲状 旁腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，胃癌，肾癌，嗜铬细胞瘤，韦尔姆斯瘤， 睾丸癌，成神经细胞瘤，肉瘤，急性和慢性白血病，淋巴瘤和脊髓发育不 良综合征。
本发明的组合物可以通过口服途径施用或通过任何其它施用途径施 用，如果所述个体表现出缓慢的乙酰化作用，其以包含83mg的肼屈嗪加 丙戊酸或其盐如丙戊酸镁的制剂，以30 mg/Kg体重的剂量进行施用，或 如果所述个体表现出快速的乙酰化作用，其以182 mg的肼屈嗪加丙戊酸 或其盐如丙戊酸镁的剂量，以30mg/Kg体重的剂量进行施用，。在其实施 方案的任一种中的两种药剂应该以控释制剂的形式进行施用，其在化学治 疗的第一次给药前7天或在第一次放射治疗阶段前7天开始施用，以容许 在这些治疗的细胞毒性刺激前对转录组进行修饰。
实施例 应用实施例1
为了证实所述转录组修饰组合物，肼屈嗪和丙戊酸或丙戊酸镁具有抗 肿瘤作用，使用来自子宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、上呼吸道和消化道癌和 肉瘤的多种恶性肿瘤细胞系。将细胞以1.5-2.5 x103细胞/孔的密度，接种 在96孔平板(Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中的0.1 ml的完 全培养基中。次日，将细胞用10pM的肼屈嗪和lmM的丙戊酸镁处理4 天。次日，使用MTT测定测量细胞存活力。简而言之，将在磷酸盐缓冲 溶液中的50 ^ MTT试剂加入每个孔中。具有活性线粒体的存活细胞将 MTT还原为可沉淀的紫色化合物-甲賸-其用加入每个孔中的150 pi DMSO 溶解。其后，在ELISA读数器上以分光光度法进行读数。所有的测定一式
三份地进行。将每次处理的细胞毒性作用表示为相对于未处理的对照的细 胞存活力的百分数(％对照)，将其定义为[(As7()nm处理的细胞)/A57C)細未处
理的细胞)]x100。
图1A， 1B， 1C, 1D, 1E, 1F，和1G，显示在所有的处理细胞系HeLa，子 宫颈癌细胞系；来自肉瘤的HT1080;来自乳腺癌的MCF-7中，分别来自 喉咙和口腔的KB和HEP2表皮样瘤；来自结肠癌的SW480， KB 口腔表 皮样瘤，HEP2喉(larinx)表皮样瘤；D54中，所述转录组修饰组合物产 生明显的细胞毒性，存活力在12.7%到43.4%的减少范围内变化。
应用实施例2
一旦证实所述转录组修饰组合物对恶性肿瘤细胞系的生长具有抑制 作用，便研究所述组合物是否增加化学治疗剂的细胞毒性作用。为此目的， 选择三种药物，其是该种类的代表垸化剂如顺铂，抗生素如多柔比星
(doxorubicin)，抗代谢药如吉西他滨。将所述细胞以1.5-2.5 x 103细胞/ 孑L的密度，接种在96-孔平板(Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 中的0.1ml的完全培养基中，。次日，将细胞用所述化学治疗剂以在图2A, 2B和2C中显示的浓度，加10 的肼屈嗪和1 mM的丙戊酸或丙戊酸镁 进行处理。在次日，将包含所述药物的培养基去除，并且加入相同的浓度 的新鲜的肼屈嗪和丙戊酸镁，再处理48小时。在次日(在第4天)，使用 MTT测定测量细胞存活力。简而言之，将50^的在磷酸盐缓冲溶液中的 MTT试剂加入每个孔中。具有活性线粒体的存活细胞将MTT还原为可沉 淀的紫色化合物-甲腊-其用加入每个孔中的150WDMSO溶解。随后，在 ELISA读数器上以分光光度法读数。所有的测定一式三份地进行。将每次 处理的细胞毒性作用表示为相对于未处理的对照的细胞存活力的百分数 (%对照)，将其定义为[(A，m处理的细胞)/A5，m未处理的细胞)]x100。 图2A， 2B，和2C显示在所有的情形中，转录组修饰组合物加化疗剂的细 胞毒性更大。在该条件下，作为抑制浓度50(IC50)的12pM顺铂的浓度， 在用转录组修饰组合物处理时，在HeLa细胞中导致37%的存活力减少。 关于阿霉素和吉西他滨也证实了类似的效果，分别减少27%和37%。
应用实施例3
为了证实可以在临床获得由抑制基因的转录导致的去甲基化和再活 化作用，进行了I期临床研究以证实在癌症患者中，肼屈嗪以哪种剂量可 具有对转录的去甲基化和再活化作用。为此目的，将肼屈嗪施用于每组4 名患者的组，每组的剂量为1) 50 mg/天，2) 75 mg/天，3) 100 mg/天，禾口 4) 150 mg/天，施用10天。在开始治疗前和在第11天进行活组织检查并 采集外周血样品。关于下列基因的启动子:」尸C, MGM7;五/ , OSTP7， A4尸《 /Mi A FF/r//7pM分析处理前和处理后的甲基化作用的状态，以及通过 RT-PCR分析它们信使的表达状态。此外，评估进行过母体失活(parental unactivation) H19的基因的甲基化状态以及在通常情况下发现其被甲基化 的基因组克隆，以及在所述基因组中的甲基化细胞因子(citokine)的总含 量。使用来自美国国家癌症研究所(U.S. National Cancer Institute (CTC NCI)) 的标准评估肼屈嗪的毒性。肼屈嗪被良好耐受，仅记录了下列不理想的作
用恶性，呕吐，疲劳，头痛和心悸。与所述基因相关，发现在治疗前的
活组织检查中有70%的分析样品(128个中的89个)具有至少一个甲基化基 因，16个活组织检查-患者的每个中有8个基因，并且所有的患者在他们 的肿瘤中具有至少一个甲基化基因。每个基因的个体分析证实了下列甲基 化频率APC 94%, 25%, FF/r 88%, GS7P7 88%, MGMT 81%, pM 19%， 和iX4尸尺100。/。.。在处理前活组织检查中，发现在每个基因中 的可变的去甲基化存活频率，从对于MGMT的13个样品中的2个即15% 变化到对于基因p7(5的3个样品中的2个即67%。图3A。代表性实例显 示在图3B中。去甲基化的百分数和肼屈嗪的剂量之间的相关性如下50 mg 40%, 75 mg 52%， 100 mg 43%, 150 mg 32% ，如可在图3C中看出。 基因表达分析显示90%(128中的116)的肿瘤样品在处理前和处理后的
活组织检查中不依赖于基因的甲基化状态而表达信使，因此它们不是提供 信息的(infomiative)。在12个提供信息的情形中，发现它们中有9个没有 表达处理前被甲基化的基因，但是在处理后，他们被去甲基化并且他们重 新表达了所述基因。代表性实例显示在图4A，4B,和4C中，并且基因重 新表达的全部频率总结在图4D中。
上述结果证实在50和150 mg之间的剂量范围内的肼屈嗪有效改变癌
症患者中的基因表达(ZamZvYwo f Segz/ra匿尸ac/zeco万，尸e/^z-Cflrafe"os五, 丄，i eW〃a-)^z《Mez ^， r^/a-C7za;;e6丄'CTzavez- 5/awco」，j"ge/ej ￡， Cabrera G <SW"<iora/ & r^/o-^cem7 C, Cte"ora-版to Z)Me"as-
A爿—aye /她办o//7j^/ra/"z/"e to cfe附e鄉/flte朋(i reacf/v她 expmwz'o" o/fwmor swp/ m 5w gewasf肼屈嗪对月中瘤抑制基因的去甲基化禾口 表达的再活化的I期临床研究J.^WCOwcer (BMC癌症)2M》5.'")。
应用实施例4
为了证实丙戊酸或其盐如丙戊酸镁在癌症患者的肿瘤中诱导组蛋白 的高度乙酰化并且抑制组蛋白脱乙酰酶的活性，进行了另一项临床研究， 其中将不同剂量的丙戊酸或其盐如丙戊酸镁施用于患有子宫颈癌的患者。 12名最近被诊断患有该种癌症并且以前没有接受治疗的患者以每组4名 患者接受了下列剂量的丙戊酸镁。组l,20mg/Kg，组2，30mg/kg,组3，40 mg/Kg。由于将丙戊酸或其盐如丙戊酸镁以分剂量每8小时施用5天，在 处理前和在接下来的日子(第6天)进行肿瘤的活组织检查并且采集血样。 通过蛋白质印迹法分析样品中的组蛋白H3的高度乙酰化和肿瘤中的组蛋 白H4的高度乙酰化，并且使用比色测定法分析肿瘤的核提取物中组蛋白 脱乙酰酶的活性，以及在血清中的丙戊酸水平。还在处理后活组织检査中 分析基因p"和C4i 的表达水平。在周期结束时，记录处理的毒性。所 有的患者都完成了治疗；平均剂量是1890mg/天，其中平均值分别对应于 20， 30和40 mg/kg剂量的1245, 2000和2425 mg。在12名患者的9名中 观察到了2度睡意。治疗后，分别在9名和7名患者中发现H3和H4的
高度乙酰化;他们中的六名在两种组蛋白中具有高度乙酰化(阳性和阴性对 照，分别用或不用tricostatine处理的HeLa细胞)。在8名患者中组蛋白脱
乙酰酶的活性减少，而在两名患者中没有变化，其具有统计学上的显著性 (双尾t检验p <0.0264)。(阳性和阴性对照，用tricostatine处理或不用其处 理的HeLa细胞的核提取物)，图5, 6和7。该数据证实在所用剂量的丙戊 酸镁是有效的，并且作为组蛋白脱乙酰酶的抑制剂被良好耐受，其反应了 增加其表达的这些基因如p27 (图8)的表达的改变。
应用实施例s
一旦评估了肼屈嗪和丙戊酸或其盐如丙戊酸镁改变患者肿瘤中的基
因(g6nica)表达水平的能力，我们便在免疫缺陷小鼠的肉瘤模型中研究这些 转录组修饰剂的组合物是否增加化学治疗的抗肿瘤作用。为此目的，研究 了一组6只雌性无胸腺小鼠的数个组，将其用六百万个肉瘤HT1080细胞 系注射。 一旦形成了肿瘤，便将动物用肼屈嗪和丙戊酸或其盐如丙戊酸镁 以等价于在患者中所用那些的剂量进行系统(sistemically)治疗。治疗的 组如下1)用盐水溶液处理的对照，2)用阿霉素每周治疗一次，3)用肼 屈嗪和丙戊酸盐(valproato)的组合物治疗7天，随后用阿霉素进行相同的 每周一次的治疗。该结果证实在第5周，没有经过治疗的动物的肿瘤达到 2和3 cr^之间的体积，并且用阿霉素进行的治疗在治疗后3周产生了几 乎完全的抗肿瘤效果，但是，从此时，肿瘤再次生长，而在用所述组合物 治疗的动物中，肿瘤的再次生长被阻止，如可从图9中看出。上述结果表 明，转录组修饰组合阻止肿瘤细胞实施恢复生长能力所必需的转录改变。 这种现象通常发生在患者的癌症的治疗中，其中通常发现完全或几乎完全 的抗肿瘤反应在其后复发。因此，本发明的组合物可能诱导肿瘤的延长的 或完全的消退。
本发明的组合物可以结合在治疗试剂盒中以通过口服施用或通过任 何其它施用途径施用，如果所述个体表现出缓慢的乙酰化作用，其以包含 83 mg的肼屈嗪加丙戊酸或其盐如丙戊酸镁的制剂，以30 mg/Kg体重的 剂量施用，并且如果所述个体表现出快速乙酰化作用，其以1S2 mg的肼 屈嗪加丙戊酸或其盐如丙戊酸镁的剂量，以30mg/Kg体重的剂量进行施 用。两种药剂都应该以控释制剂的形式施用，以避免由肼屈嗪和丙戊酸或 其盐如丙戊酸镁产生的血清水平的峰值，并且减少由其快速吸收导致的副 作用。
由于肼屈嗪对甲基化的抑制作用在其施用后的至少48小时起始， 并且在去甲基化的背景上，丙戊酸或其盐如丙戊酸镁对转录的作用可能更 高，用所述组合物进行的治疗优选地必须在化学治疗的第一次给药前7天 或放射治疗前7天开始，以容许在化学治疗或放射治疗的细胞毒性刺激前 对转录组进行修饰。
权利要求
1.一种药物组合物，其包含转录组(transcriptome)修饰剂的组合，以与化学治疗或放射治疗一起辅助治疗癌症。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述转录组修饰组合是肼 屈嗪加丙戊酸或其盐如丙戊酸镁。
3. 根据权利要求1和2所述的药物组合物，其在药用赋形剂中包含 50-100 mg肼屈嗪和20-50 mg/kg的丙戊酸或其盐如丙戊酸镁，以施用于 被认为具有缓慢乙酰化作用的个体。
4. 根据权利要求1和2所述的药物组合物，其在药用赋形剂中包含 150-200 mg肼屈嗪和20-50 mg/kg丙戊酸或其盐如丙戊酸镁，以施用于被 认为具有快速乙酰化作用的个体。
5. 根据权利要求l-4所述的药物组合物，其中所述丙戊酸的盐是丙戊酸镁。
6. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述化疗剂包括，但不限 于苯丁酸氮芥，环磷酰胺，异环磷酰胺(iphosphamide)，氮芥，美法 仑塞替派，卡莫司汀，洛莫司汀，六甲蜜胺，达卡巴嗪，和丙卡巴肼，顺 铂，卡铂和奥沙利铂，多柔比星，柔红霉素，表柔比星，伊达比星，丝裂 霉素C，博来霉素，放线菌素D，类视黄醇，激素药剂，长春新碱，长春 碱，长春地辛，长春瑞滨，伊立替康，托泊替康，依托泊苷，替尼泊苷， 紫杉醇，多西他赛，5-氟尿嘧啶，吉西他滨，甲氨蝶呤，白介素，干扰素， 单克隆抗体如曲妥单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗(rituxan)、抗CD-33 单抗(mydotarg)，和抑制性小分子如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、和伊马替尼。
7. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌症是包括但不限于 下列各项的任一种实体瘤乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，皮肤癌，骨癌，前 列腺癌，肝癌，肾癌，肺癌，脑癌，头颈癌，胆囊癌，胰腺癌，结肠和直 肠癌，甲状旁腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，胃癌，肾癌，嗜铬细胞瘤，韦 尔姆斯瘤，睾丸癌，成神经细胞瘤，肉瘤，急性和慢性白血病，淋巴瘤和脊髓发育不良综合征。
8. —种治疗试剂盒，其包括转录组修饰剂的药物组合物，以与化学治 疗或放射治疗一起辅助治疗癌症。
9. 权利要求8的治疗试剂盒，其中所述药物组合物是肼屈嗪加丙戊酸 或其盐如丙戊酸镁的组合。
10. 权利要求8和9的治疗试剂盒，其中如果所述个体表现出缓慢乙 酰化作用，所述药物组合物以50-100 mg的肼屈嗪和超过20-50mg/kg的 丙戊酸或其盐如丙戊酸镁的每日剂量口服施用。
11. 权利要求8和9的治疗试剂盒，其中如果所述个体表现出快速乙 酰化作用，所述药物组合物以150-200 mg的肼屈嗪和超过20 -50 mg/kg的丙戊酸或其盐如丙戊酸镁的每日剂量口服施用。
12. 权利要求8-11的治疗试剂盒，其中所述丙戊酸盐是丙戊酸镁。
13. 权利要求8的治疗试剂盒，其中所述药物组合物在用化学治疗或 放射治疗开始进行治疗前7天幵始施用。
全文摘要
本发明涉及使用转录组修饰剂以阻止恶性肿瘤细胞经历必要的遗传改变从而对抗细胞刺激并且从化学治疗或放射治疗后存活下来。所述转录组修饰剂的组合包括抑制DNA甲基化机制的药剂和抑制组蛋白脱乙酰化的物质。本发明涉及治疗试剂盒，其包括施用有效剂量的肼屈嗪和丙戊酸或其盐如丙戊酸镁，其倾向于与放射治疗或化学治疗一起用于治疗患者的癌症。
文档编号A61P35/00GK101355934SQ200580052494
公开日2009年1月28日 申请日期2005年11月18日 优先权日2005年11月16日
发明者路易斯·埃斯特拉德·弗洛雷斯, 阿尔索·杜埃尼亚斯·冈萨雷斯 申请人:墨西哥国立自治大学