专利名称：具有组蛋白脱乙酰基酶抑制活性的新颖的吡咯衍生物的制作方法
具有组蛋白脱乙酰基酶抑制活性的新颖的吡咯衍生物 发明领域
本发明涉及衍生自吡咯的新颖的化合物及其制备方法，还涉及该 化合物由于其对某些组蛋白脱乙酰基酶的抑制作用而以药物组合物形 式作为治疗癌症的药物的用途。
背景技术：
三取代和四取代的吡咯环的化学合成能够使用线性或汇集合成工
艺方法以多种方式进4亍(Sundberg, Compre/rews/ve i/deracycZ/c C7ie鹿's^y (杂环化学大全)；Katrizki, A. and Rees， C. W. Eds.; Pergamon: Oxford, 1984; Vol. 4, p. 313)。 一个非常常用的制备方法包括取代的吡咯烷的芳构化 (Fejes等人，r咖編廳2000， 56, 8545; Gupta等人，分w仇O mm柳.1998, 2S,3151)。因此，能够4吏用烯烃和甲亚胺叶立德之间的环加成、以汇集形 式制备四取代的吡咯环的杂环化合物(Ayerbe等人， / Org. O em. 1998, (53, 1795; Vivanco等人，^肌CAem. 2000, 〃2, 6078)。还已知羧酸 衍生物与羟胺的偶联反应导致异羟肝酸的形成(Reddy等人，7^ra/^/raw 丄加.2000, W, 6285),还导致取代的胺与光气和碌u光气衍生物之间的反 应，其通过形成异氰酸酯和硫氰酸酯中间体产生相应的N-羟基脲、N-羟 基硫脲、N-(烷基)氨基脲和N-(烷基)氨基硫脲(Jain等人，MM. C7ze附.丄故.2003， "， 4223)。
另一方面，已知组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂代表通过阻断某些 肿瘤生长机制来治疗癌症的有前途的方法(McLaughin等人，历oc/^肌 P/wrw. 2004, 6S, 1139. Kramer等人，7>^"&五"itocn'". 2001, ", 294. Archer等人，Cwr (9/ /". Z)ev. 1999,9, 171)。虽然前述抑制剂治疗
作用的详细机理还不是众所周知的，但普遍的意见认为对HDAC活性中 心的抑制促进特定基因通过组蛋白的乙酰化与转录因子结合，所述组蛋 白位于编码细胞周期控制蛋白(如p21细胞周期素依赖性蛋白激酶)的DNA的特定区域(Archer等人，A^/. 1998, 95， 6791)。
该治疗耙标的另一优势在于，据估计仅有约2%的DNA至mRNA的转录 是由HDAC抑制剂调整的(McLaughi等人，历ocAem.尸Awm. 2004， 65, 1139),这对这些抑制剂的低毒性肯定有影响，并已在临床试验中观察到 (Van Lint等人，G饥五x/ mw 1996, 5, 245; Glaser等人，Mo/. C朋cer 7%er. 2003,2,151)。同样地，据估计，通过改善使其不易发展为耐药性的基因 转录模式，HDAC抑制剂的临床应用能够增强与其它治疗的协同联合 (Keen等人，C朋cer/ es. 7re^ 2003, W， 177. Egger等人，7V^mw 2004， 4": 457)。
已知不同类的HDAC抑制剂，可在不同综述中找到其通性 (Villar-Garea and Esteller/"L / CVmcer 2004, 7/2， 171和Cwr. A/e^z6. 2003,《11; Grozinger等人，CAem.历o/. 2002， 9， 3; McLaughlin等人， Z)n/gD&cov. 7&&少2003, & 793; Mo皿eret五w 乂 A/ed CT em. 2005, 40， 1; Biel等人，CZ em. ￡d 2005, W， 3186)。大体上，最有活性的抑 制剂的结构特征为具有通过石友间隔基链与能够和所述HDAC活性中心的 金属离子配位的单元结合的显著疏水性的环状或多环部分。具体地，3-(4-芳酰基-l-曱基-lH-2-吡咯基)-N-羟基-2-丙烯酰胺的合成已作为HDAC的 抑制剂而被描述(cf. Mai等人，</ CAem. 2004, 47， 1098)。在这种情况 下，间隔基链是不饱和的并且吡咯环的3位和5位是未取代的，得到线 性分子几何结构。
无论由合成获得的抑制剂的质量如何，其治疗应用均会存在问题， 其中必须提到的是对不同HDAC的抑制选脊性，其中某些HDAC不能在 肿瘤学、毒性和化学不稳定性中构成有用的治疗靶标。在本文中，本发 明描述了合成新的HDAC抑制剂的通用方法，该方法带来了产生很多种 类官能团的可能性，其导致在化学上稳定的分子，并且具有不同的多环 体系、间隔基大小和对要抑制的酶的金属原子的配位单元。
因此本发明所提出的问题在于提供对与肿瘤形成过程的出现和发展 有关的不同HDAC的抑制具有高选择性的化合物和组合物，该化合物和 组合物具有高化学稳定性和低毒性。本发明所提出的溶液包括使用通式I 的吡咯衍生物。这些化合物在3位和5位具有芳基或杂芳基取代基，还
在4位具有诸如硝酸才艮基团的吸电子基团，以及在2位具有由不同性质 的间隔基组成的不同种类的基团，并且使用7V-羟基脲、7V-烷基氨基(芳基) 脲、7V-羟基硫脲和7V-烷基氨基(芳基)硫脲基团与HDAC的金属离子配位。 这些吡咯衍生物表现出很强的抑制细胞增殖和肿瘤生长的能力。
简言之，本发明旨在解决当前对具有以下优点的组蛋白脱乙酰基酶 抑制剂的需求如良好的药理学性能、固相和溶液中的稳定性、简单且 高效的化学合成以及起始化合物的可达性与可变性。
附图的简要说明
图1表示与用作正控制的TSA(曲古抑菌素A 07'co^加'"v4)的首字母 缩写)与SAHA (辛二酰苯胺异羟肟酸的首字母缩写)相比较，本发明的某 些化合物对HCT116细胞系(人结肠癌)的组蛋白的脱乙酰基酶活性的体外 测试结果。
图2表示与用作正控制的TSA与SAHA相比较，本发明的化合物的 典型实例对MOLT4细胞系(人纤维型白血病)的组蛋白的脱乙酰基酶活性 的体外测试结果。
图3表示使用HPCE(高效毛细管电泳法)、用本发明的某些化合物以 10 jiiM的浓度处理的Jurkat人早幼粒细胞白血病细胞系的H3和H4组蛋 白的乙酰化水平的量化。
图4表示在不同浓度的SAHA和本发明的两种抑制剂存在下测量凋 亡细胞和坏死细胞的百分比。该图还包含在对照样本上和用DMSO处理 的样本上得到的数据。所示数据对应于人结肠癌模型HCT116。
图5表示在不同浓度的SAHA和本发明的两种抑制剂存在下测量凋 亡细月包和坏死细月包的百分比。该图还包含在对照样本上和用DMSO处理 的样本上得到的数据。所示数据对应于人急性髓细胞白血病模型HL60。
图6表示在无胸腺的棵鼠中对人结肠癌HCT116的肺瘤生长的抑制 作用，所述抑制作用是通过本发明的某些化合物的腹膜内给药引起的。 根据实施例18详述的方法，在脾脏内进行外来植入(xeno-implants)并在 腹膜内注射所述抑制剂。
图7表示在人纤维型白血病模型MOLT4中本发明的某些化合物在无
胸腺的棵鼠中的体内抗肿瘤活性。根据实施例17详述的方法在脾脏内进 行外来纟直入。
发明目的
本发明的目的在于通式I的吡咯^f汙生物
同样地，本发明的另 一 目的在于制备通式I的这些化合物的方法。 本发明的另 一 目的在于这些衍生物在治疗不同形式的癌症中的用
途，所述治疗是通过抑制某些组蛋白脱乙酰基酶的作用来限制肿瘤生长的。
最后，本发明的目的在于可以包括通式I的任一吡咯衍生物和至少一 药物可接受的赋形剂的药物组合物的制备。
发明详述
首先，本发明提供具有以下通式I的、衍生自吡咯的某些化合物
^巾
R1和R3独立表示苯基自由基；环上不同位置的单取代或多取代的 苯基；或含有O、 N或S中至少一个杂原子的C5-C10杂芳基基团； R"表示氢原子或吸电子基团，例如硝基基团；或者胺或酰胺基团； R"表示氢原子或线性、支链或环状的Cl-C6烷基基团； n表示亚曱基基团的数目为1至8,包含端点； X表示仲胺基团、氧原子或硫离子；
Y表示选自亚曱基、取代的亚曱基或仲胺的基团； Z表示氧原子或碌u原子；以及
W表示选自羟基、幾基胺、肼、烷基肼、芳基肼或杂芳基肼的基
在一优选的实施方案中，通式I的化合物为
*具有以下结构式的6-(3，5-二苯基-1//-吡咯-2-酰胺)己酸:
*具有以下结构式的6-(4-硝基-3，5-二苯基-l/f-吡咯-2-酰胺)己酸:
*具有以下结构式的iV-(5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-曱 氧羰基)-1//-吡咯-2-酰胺
*具有以下结构式的AK5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-5-苯基-3-(4-曱 氧羰基)-1//-吡咯-2-酰胺
<formula>formula see original document page 15</formula>具有以下结构式的7V-(5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-曱 氧羰基)_4-硝基-1//-吡咯-2-酰胺
<formula>formula see original document page 15</formula>具有以下结构式的l-(4-(3,5-双(3，: 酰胺)丁基)-3-羟基脲
<formula>formula see original document page 15</formula>:-二曱氧基苯基)-1//-吡咯-2-
具有以下结构式的1-(4-(5-(4-曱氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1//-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(2-曱氨基)脲
<formula>formula see original document page 15</formula>
本发明的另一方面提到获得通式I的化合物的不同方法。正如我
们下面将看到的，以下方法A至方法E描述了获得通式(Ia)、 (Ib)、 (Ic) 和(Id)的化合物的方法。(Ia)至(Id)的这些化合物的通式落在通式I内。方法A
方法A表示通式(Ia)的化合物的制备方法:
其中R。 R2、 R3、 R4、 X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由以 下物质组成的混合物的反应
a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，
<formula>formula see original document page 16</formula>
(II)
b) 通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中RS是烷氧羰基，
c) 活化所述羧基基团的试剂，以及
d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
以及使所获得的产物与氢氧化锂或氢氧化钠、二曱氧基乙烷和水的 混合物发生反应。
出于本发明的目的，由a)至d)阶—险的四类化合物组成的反应混合 物能够通过在-85。C至+25。C、优选接近0。C的温度下，在其它三种组 分加入有才几溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其》文置一 段时间至达到环境温度以完成反应。该偶合反应一旦完成，将按照通常
方法所获得的酯与氢氧化锂或氢氧化钠、二曱氧基乙烷和水的混合物反
应，由此在相应的处理后得到通式(Ia)的化合物。 方法B
方法B表示通式(Ib)的化合物的制备方法
(Ib)
其中，R。 R2、 R3、 R4、 X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由 以下物质组成的混合物的反应
a)通式II的lH-p比咯-2-羧酸，
R4
(II)
b) 通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5
(III)
其中RS是烷氧羰基，
c) 活化所述羧基基团的试剂，以及
d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
以及在曱醇中过量曱醇钠的存在下，将所得产物加入盐酸羟胺与 酚酞的混合物中。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物组成的反应混合 物能够通过在-85。C至+25。C、优选接近0。C的温度下，在其它三种组
分加入有才几溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一 段时间至达到环境温度以完成反应。该偶合反应一旦完成，在曱醇中过 量曱醇钠的存在下，将获得的酯加入盐酸羟胺与酚酞的混合物中。 一旦
反应完成，在相应处理以后可获得通式(Ib)的化合物。 方法C
方法C表示通式(Ic)的化合物的制备方法
R4 O
(Ic)
其中，R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，所述方法包括 由以下物质组成的混合物的反应 a)通式II的lH-吡咯-2-羧酸，
i
R4
(II)
b)通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R'
(III)
其中R5是叔丁氧基氨基曱酰基(NHBoc)或千氧基氨基曱酰基 (NHCBz),
c) 活化所述羧基基团的试剂，以及
d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
用酸处理或水解的方式对所得产物脱保护以及使其与光气或其类似物(例
如双光气、三光气或硫光气)进行反应，获得异氰酸酯或疏代异氰酸酯， 所述异氰酸酯或硫代异氰酸酯用羟胺处理。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物形成的反应混合 物能够通过在-85。C至+25。C、优选接近0。C的温度下，在其它三种组 分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一 段时间至达到环境温度以完成反应。取决于Rs在化合物III中所代表的 含义，即取决于R5是表示叔丁氧基氨基曱酰基(NHBoc)还是千氧基氨 基曱酰基(NHCBz),随后的处理将是不同的。在Rs表示NHBoc的情况 下，所得产物必须经过酸处理，优选在环境温度下与卣化溶剂中的三氟 乙酸反应。当Rs表示NHCBz时，所得产物进行氢解，优选通过在钯多 相催化剂存在下、与氢气或短链醇作为溶剂的甲酸铵反应。在两种情况 下，脱保护后获得伯胺，其用光气或其衍生物之一进行处理，所述光气 书f生物例如双光气或三光气或石克光气。当与光气、双光气或三光气反应 时，最终化合物(Ic)在Z处具有氧原子。另一方面，如果是用硫光气处理， Z将是硫原子。
与光气(双光气、三光气)或硫光气反应后，获得相应的异氰酸酯或硫 代异氰酸酯，用羟胺对其进行原位处理以获得通式(Ic)的化合物。
方法D
方法D表示通式(Id)的化合物的制备方法:
<formula>formula see original document page 19</formula> ，
(Id)
其中，R。 R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，并且Rg是H、 Cl-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、 N或S的杂原子的5元或6 元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应 a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，<formula>formula see original document page 20</formula> (II)
b) 通式in的化合物，
HX-(CH2)n-R5 则
其中R5是叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)或千氧基氨基曱酰基 (NHCBz)，
c) 活化所述羧基基团的试剂，以及
d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
用酸处理或水解的方式对所得产物脱保护以及使其与光气或其类似物(例 如双光气、三光气或硫光气)进行反应，获得异氰酸酯或硫代异氰酸酯， 所述异氰酸酯或硫代异氰酸酯用肼或烷基肼、芳基肼或杂芳基肼处理。
出于本发明的目的，由a)至d)阶段的四类化合物形成的反应混合 物能够通过在-85。C至+25。C、优选接近0。C的温度下，在其它三种组 分加入有机溶剂前先将一组分加入混合物中而制成。然后将其放置一 段时间至达到环境温度以完成反应。取决于Rs在化合物III中所代表的 含义，即取决于R5是表示叔丁氧基氨基甲酰基(NHBoc)还是千氧基氨 基曱酰基(NHCBz)，随后的处理将是不同的。在Rs表示NHBoc的情况 下，所得产物必须经过酸处理，优选在环境温度下与卣化溶剂中的三氟 乙酸反应。当Rs表示NHCBz时，所得产物进行氢解，优选通过在4巴多 相催化剂存在下、与氢气或短链醇作为溶剂的曱酸铵反应。在两种情况 下，脱保护后获得伯胺，其用光气或其衍生物之一进行处理，所述光气 书亍生物例如双光气或三光气或辟L光气。当与光气、双光气或三光气反应 时，最终化合物(Ic)在Z处具有氧原子。另一方面，如果是用硫光气处理， Z将是硫原子。
与光气(双光气、三光气)或硫光气反应后，获得相应的异氰酸酯或硫
代异氰酸酯，用肼或烷基肼对其进行原位处理以获得通式(Id)的化合物。 方法E
方法E表示通式(Id)的化合物另 一的制备方法
(Id)
其中，R。 R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，并且Re是H、 Cl-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、 N或S的杂原子的5元或6 元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应 a)通式II的lH-吡咯-2-羧酸，
<formula>formula see original document page 21</formula>
(II)
b) 通式III的化合物，
HX-(CH2)n-R5 (HI)
其中115是3-卡氧基脲或3-烷基脲、3-芳基脲或3-杂芳基脲，
c) 活化所述羧基基团的试剂，以及
d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，
如果前述偶合反应是由N-卡氧基脲或硫脲进行的，则仅需要在合适 的催化剂存在下通过氢解的方式释出相应的N-羟基脲或硫脲。在N-烷基 (芳基、杂芳基)氨基脲或硫脲的情况下，如果所述自由基已被引入相应的
<formula>formula see original document page 21</formula> 前体(III)，则所述偶合反应直接产生期望的最终分子。
作为方法A至方法E的共同成分，羧基基团活化试剂优选二氯磷酸 苯酉旨、氰代膦酸二乙酯(DEPC)或由l-羟基苯并三唑和N-(3-二甲基氨基丙 基)-N，-乙基碳二亚胺形成的体系。
就叔胺而言，其是方法A和方法B中共同的试剂，选自具有C3-C10 碳的环状或非环状脂肪族化合物或具有C9-C15碳的烷基芳香族化合 物。所述叔胺优选选自N-曱基吡咯烷或N-曱基吗啡啉。
还优选使用樣i波照射进行方法A至方法E中各自成分a)至成分d)之 间的反应。
前述通式II的化合物的制备在有机溶剂中进行或者在不存在有机溶 剂时使用微波照射进行，使包含以下物质的混合物首先发生反应
a) 具有以下通式IV的(^)构型或(Z)构型的硝基烯，
。2N-CH=CH-R3
(IV)
其中
RS具有以上给出的含义；
b) 具有以下通式V的(五)构型或(Z)构型的亚胺，
R、CH:N-CH2-COOR6
(V)
其中
R/具有以上给出的含义，以及 R6表示C1-C6烷基或芳基基团；
c) 金属盐，优选选自高氯酸锂、高氯酸银或醋S吏银，以及
d) 有机叔碱(tertiary organic base),选自C3-C10碳的环状或非环状的 脂肪族化合物或C9-C15碳的烷基芳香族化合物。
出于本发明的目的，由以上所示的四种组分构成的反应混合物能
够使用^t波照射或在-25。C至+25。C、优选接近+25。C的温度下，通过
将一组分先于其它三种组分加入有才几溶剂中而制成。 一旦该环加成反
应结束，便可得到与为每个具体反应选择的取代基相应的2-烷氧羰基 吡咯烷的混合物。将该混合物溶解在环醚(如四氬呋喃)中或高沸点的 非环状醚(如双(2-曱氧基乙基)醚，还称为"二甘醇二曱醚，，)中，并且 加入氧化剂，例如二氧化锰、过氧化氢或2,3-二氯-5，6-二氰-l,4-苯醌。一 定时间后，于+60。C至+250。C的温度下获得由2-烷氧羰基-7V/Z-吡咯和相 应的2-烷氧羰基-4-硝基-NH-吡咯组成的混合物，其组分能够通过分级 结晶法或色谱法分离。通式II的酸是通过对前述酯的加碱水解而获得， 优选通过用在水和二曱氧基乙烷的混合物中的氢氧化锂或氢氧化钠对其 进行处理。
本发明的另 一方面涉及通式I的这些化合物在治疗癌症中的用途。这 些化合物的作用机理在于其对组蛋白脱乙酰基酶的抗性，该抗性包括阻 断负责调节诸如细胞凋亡或生长以及细胞增殖等过程的蛋白的合成。这 些性能预防或阻断所述脱乙酰基酶以及相关酶配合物结合至其天然基质 上，例如组蛋白的末端赖氨酸的e位上的N-乙酰化的赖氨酸的残基，因 此这些保留了单乙酰化或多乙酰化的状态。
本发明最后一方面涉及由至少一种通式I的化合物与一种或多种药 物可接受的赋形剂组成的组合物。虽然本发明通式I的化合物能够作为纯 物质(pure substance)给药，也可以药物制剂的形式给药，但是优选该化合 物以联合形式给药。所述药物的联合优选以下的制剂形式
i) 4叉包含通式I的4b合物；
ii) 包含一种或多种赋形剂和/或载体物质(transporter substances);以 及 '
iii) 可包含任一额外的治疗活性物质。
所述赋形剂、载体物质和辅助物质必须是药物和药理可接受的，这 样的方式使得其可与制剂(formulation)或制剂(preparation)的其它组分联 合并且在待治疗的有机体中不产生不良反应。
所述制剂包括适于口服给药或胃肠外给药的那些制剂(包括皮下给 药、皮内给药、肌内给药和静脉内给药)，尽管如此，最佳的给药途径将 取决于患者的状态。
所述制剂可以是简单剂型并且可根据药理学领域中的公知方法制 备。活性物质的给药量可依据治疗特点而变化，尽管如此， 一剂量或多
剂量的活性物质的给药量通常在每天1 mg至500 mg间变化。
为了帮助更好地理解前述的方法，以下描述了本发明的某些具体实 施例。这些实施例^f又为示例性的。
实施例1
<formula>formula see original document page 24</formula>
将三乙胺(12 ml， 80.0 mmol)，醋酸银(1.98 g, 11.9腿ol)和(五)-2-(4-甲氧基苯基)-1-硝基乙烯(14.33 g， 80.0 mmol)接连加入乙腈(800 ml)中的 7V-苯亚曱基甘氨酸曱酯(14.17g， 80.0mmol)的混合物中。通过薄层色语监 测反应进程。 一旦反应完成，将该混合物通过硅藻土床(Celitebed)过滤并 用饱和NH4C1溶液(2 x 150 ml)和水(2 x 150 ml)洗涤。经MgS04干燥后， 减压蒸发该溶液，得到26.5 g的5-苯基-3-(4-甲氧基苯基)-2-甲氧羰基-4-硝基吡咯烷的非对映异构体的混合物。使12.22 g (34.27 mmol)该混合物 在惰性气氛下溶解在双(2-曱氧基乙基)醚(343 ml)中并加入二氧化锰(29.8 g, 343mmo1)。该反应混合物在搅拌下回流48 h。然后^f吏其回到环境温度 并经硅藻土床过滤。将所得溶液减压浓缩，得到7.93g由5-苯基-3-(4-甲
氧基苯基)-2-曱氧羰基-4-硝基-lH-吡咯和5-苯基-3-(4-曱氧基苯基)-2-曱氧 羰基-lH-吡咯组成的混合物。使用快速柱色谱分离该产物，每一产物分 别水解，如下所示。将10% NaOH (40 ml,水溶液)逐滴加入相应酯(4.0 mmol)的乙醇(100 ml)溶液中，然后在回流下搅拌该混合物。通过薄层色 谱监测该反应进程。 一旦反应完成，将该混合物冷却至0。C,用IN HC1 中和并用二氯曱烷(3 x 50ml)萃取。合并的有机组分经MgS04干燥并且 减压蒸发，得到相应的羧酸。
5-苯基-3-(4-曱氧基苯基)-2-曱氧羰基-lH-吡咯-2-羧酸
收率，41%; m.p. 198。C (分解)；IR 3467， 1643 cm"; iH-NMR(Sppm， DMSO-d6) 11.72 (s, 1H), 7.88 (d, 2H， J=7.7 Hz)， 7.51 (d, 2H， J=8.4 Hz), 7.38 (t, 2H， J=7.6 Hz), 7.26 (t， 1H， J=7.2 Hz)， 6.91 (d， 2H， J= 8.4 Hz), 6.69 (s, 1H), 3.78 (s, 3H)， 3.34 (b s， 1H); 13C-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 162.5, 157.9， 134.4: 131.3， 131.2， 130.3, 128.6， 127.9， 127.0， 125.1, 119.8, 113.0， 112.9， 109.3, 55.0， 54.9;d8H!5N03的分析计算值C， 73.71; H,5.15; N， 4.78。实测 C, 73.56; H, 5.08; N,4.81%。
5-苯基-3《4-曱氧基苯基)-4-硝基-lH-吡咯-2-羧酸
收率，28°/。； m.p. 190。C; IR 3437, 1663, 1493 cm"; ^-NMR (S ppm, DMSO-d6) 7.57-7.52 (m, 2H), 7.48-7.43 (m, 3H), 7.24 (d, 2H, J=8.4 Hz), 6.90 (d, 2H, J=8.4 Hz), 3.79 (s, 3H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 13C-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 161.6, 158.3, 133.5, 132.5， 131.1, 129.3, 129.0, 128.0, 124.5， 124.2, 121.1, 112.7, 54.9; C18H14N205的分析计算值:C， 63.90; H, 4.17; N, 8.28。实测C， 63.85; H， 4.20; N， 8.27 %。
实施例2
浙务类才以7"蓉沟式的3-多差-f真差眾4Hi/-^^2-^凝<formula>formula see original document page 25</formula> 和舆有"7"潜沟M:的5-r^差多差)一-4U//-戎^:
使用与实施例1基本上相似的方法制备这些物质，得到呈黄色固体 的标题化合物。
3-苯基-5-(4-曱氧基苯基)-lH-吡咯-2-羧酸收率，52%; m.p.251。C; IR 3457， 3316， 1618 cm-1; !H-NMR (S卯m, DMSO-d6) 10.67 (b s, 1H), 7.88 (d， 2H, J=7.5 Hz)， 7.70 (d, 2H， J=8.5 Hz), 7.23 (t, 2H, J=7.5 Hz)， 7.11 (t, 1H, J=7.3 Hz), 6.87 (d, 2H， J=8.5 Hz)， 6.52 (s, IH), 3.74 (s, 3H)， 3.38 (b s, IH); 13C-NMR (S ppm， DMSO-d6) 166.1, 157.5, 137.1, 129.7， 128.9, 127.9, 126.9, 125.3, 125.2， 124.7, 113.9, 106.4， 54.9; C18H15N03的分析计算值C， 73.71; H, 5.15; N， 4.78。实测C, 73.48; H, 5.11; N， 4.79 %。
3-苯基-5-(4-曱氧基苯基)-4-硝基-lH-吡咯-2-羧酸收率，35%; m.p. 106-107。C; IR 3407, 1668, 1507 , 1351 cm"; ^-NMR (5 ppm， CDC13) 9.32 (s， IH), 7.54 (d， 2H, J=8.6 Hz), 7.42-7.38 (m, 5H)， 7.01 (d， 2H, J=8.6 Hz), 3.88 (s, 3H); 13C-NMR (5 ppm， CDC13) 163.4, 161.1, 135.2, 133.2, 130.8， 130.3, 129.7， 128.7, 128.2, 127.8, 127.6， 120.6, 114.3, 114.2， 55.4; C18H14N205的分析计算值C， 63.90; H, 4.17; N, 8.28。实测C, 63.77; H, 4.19; N, 8.30%。
T"潜沟式的f真差笨4)-3Y遽努、-2-^^2-
实施例3 <formula>formula see original document page 26</formula>
和^^"以r潜沟式W 5-~- f真差苯4)羊^^-3-(^:吻"-^^2-
使用与实施例1基本上相似的方法制备这些物质，得到呈黄色固体 的标题化合物。
5-(4-曱氧基苯基)-3-(噻吩-2-基)-1//-吡咯-2-羧酸收率，54%; m.p. 153-154。C; IR 3424， 3112, 2964, 1610 cm"; 'H-NMR (S ppm, CDC13) 8.29 (b s, 1H), 7.41 (d, 2H， J=8.6 Hz), 7.10 (d， 1H, J=5.0 Hz)， 7.07 (d， 1H, J=3.1 Hz), 7.02-6.98 (m, 2H), 6.92 (d, 2H， J=8.6 Hz)， 6.58 0， 1H)， 3.82 0, 3H); 13C-NMR (5 ppm, CDC13) 158.6， 139.2， 133.0, 127.4, 125.3, 121.8, 121.2， 120.4, 114.9, 114.4, 103.5, 71.9, 70.5, 59.0, 55.3; C16H13N03S的分析计算 值C， 64.20; H， 4.38; N, 4.68。实测C， 64.11; H,4,35; N,4.70%。
5-(4-曱氧基苯基)-4-硝基-3-(p塞吩-2-基)-lH-吡咯-2-羧酸收率，28%; m.p. 180-181。C; IR 3408, 3120, 1610, 1511 cm"; 'H-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 7.54 (da， IH, J=3.4 Hz), 7.49 (d, 2H, J=8.3 Hz), 7.03 (b s, 2H), 7.00 (d, 2H, J=8.2 Hz), 3.81 (s， 3H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 13C-NMR (S ppm， DMSO-d6) 161.1， 135.1, 133.7, 130.1, 129.3, 127.3, 126.8, 120.1， 114.3, 65.9， 55.4, 15.2; C16H12N205S的分析计算值C， 55.81; H, 3.51; N, 8.14。实测C, 56.09; H, 3.49; N, 8.14%。
实施例4
T潜沟式的6Y3，5-二哀差"H-^^^-凝展」己^:
<formula>formula see original document page 27</formula>
将DMF (7.5 ml)中的3,5-二苯基-lH-吡咯-2-羧酸(0.39 g, 1.5腿ol)和 6-氨基己酸的曱基酯的氢氯酸盐(0.25 g, 1.5 mmol)的溶液冷却至0°C。接 连加入三乙胺(U5 ml, 8.25 mol)、 1-羟基苯并三唑(0.22 g, 1.65 mmol)、 AH3-二曱基氨基丙基)W-乙基碳二亚胺的氢氯酸盐(0.32 g, 1.65 mmol)以 及AA-曱基吗啡啉(0.165ml， 1.5mmo1),将该混合物在0。C下搅拌2 h，并 在环境温度下再搅拌96小时。然后加入乙酸乙酯(300ml),用水(90ml)、 lNNa2S2O3(90ml,水溶液)、水(90 ml)、 NaHCO3(90ml，饱和水溶液) 以及NaCl(90ml，饱和水溶液)洗涤所得溶液，MgS04干燥并减压蒸发， 获得0.47 g (1.2 mmol)的酯。
将所得曱基酯溶解在乙二醇二曱醚中(6 ml)并将该溶液冷却至0°C。 接着，逐滴加入1 N LiOH (3.6 ml)并于0。C下搅拌所得混合物。通过薄层 色谱法监测反应进程。 一旦反应完成，加入3.6ml、 10%柠檬酸的水溶液 (pHa6)。用二氯曱烷萃取该溶液(3 x 5 ml),用MgS04干燥合并的有机组 分，减压蒸发。在二乙醚中研磨粗制的反应产物，得到0.42g的白色固 体。
收率，74%; m.p. 228-229。C; IR 3427, 3246, 1608 cm"; !H画NMR (5 ppm， DMSO-d6) 13.05 (s, 1H)， 8.73 (s, 1H), 7.99 (d， 2H, J=7.7 Hz), 7.52 (d， 2H， J=7.5 Hz), 7.36-7.29 (m, 4H)， 7.21 (dd, 2H, J=12.5 Hz, J，=7.0 Hz)， 6.65 (s, 1H), 3.21 (dd， 2H, J=11.3 Hz， J，=5.6 Hz), 2.05 (t, 2H, J=6.6 Hz), 1.54-1.44 (m, 4H), 1.36-1.30 (m, 2H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 177.5, 160.8, 136.1: 132.7, 131.8, 129.0, 128.5， 128.3， 127.6， 126.5, 125.9, 124.6 123.3， 108.3, 37.3， 28.8, 26.6， 25.5; C23H24N203的分析计算值C， 73.38; H, 6.43; N, 7.44。 实测C, 73.45; H， 6.41; N, 7.44%。
实施例5
使用与实施例4基本上相似的方法制备该物质，得到呈黄色固体的
标题化合物。
收率，71%; m.p. 153-154。C; IR 3417, 3155, 1638, 1492 cm"; 'H-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 7.58 (d, 2H， J=7.2 Hz), 7.36 (t， 2H, J=7.2 Hz), 7.32-7.23 (m, 7H)， 4.87 (b s， 2H), 3.07 (dd, 2H， J=12.9 Hz, J，=6.6 Hz)， 2.09 (t, 2H， J=7.3 Hz), 1.46-1.40 (m， 2H), 1.35-1.29 (m, 2H)， 1,18-1.12 (m， 2H); 13C-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 176.0, 161.9， 136.8， 134.4, 133.4, 131.8, 130.1 129.0， 127.5, 127.4, 127.3， 126.3， 122.8, 71.0, 64.8, 57.9, 38.2， 35.0， 28.8, 26.0， 24.7， 15.1; C23H23N305的分析计算值C， 65.55; H, 5.50; N, 9.97。实 测C， 65.37; H, 5.44; N, 10.01%。
实施例6
斜务^才以7潜沟4;的7v-卩-f身差疯差尸凝4)^:差-3-多差-5-^- f真^
差」-7//-必^"2-應應
在惰性气氛下，将在曱醇中的曱醇钠的等分试样(取自惰性气氛下， 在3.3 ml曱醇中的0.65 g、 12.0 mmol曱醇钠的溶液)逐滴加入在曱醇(1.25 ml)中的羟胺氢氯酸盐(0.26 g, 3.75 mmol)和酚酞(l mg)的溶液中，直到在 该溶液中观察到持久的粉红色。接连加入根据实施例4的方法由3-苯基 _5—(4-曱氧基苯基)-lH-吡咯-2-羧酸与6-氨基己酸的曱基酯的氢氯酸盐制 备的6-(3-苯基-5-(4-曱氧基苯基)-lH-p比咯-2-曱氧羰基)己酸曱酯(0.53 g, 1.25 mmol)和曱醇中的曱醇钠(5.0 mmol, 1.4 ml的预制溶液)。将该混合物 搅拌26h，观察到形成的致密沉淀物。然后，将水(3ml)加入该反应混合 物中。用水醋酸对该溶液进行酸化并用二氯曱烷萃取(3 x 10 ml)。用 MgS04干燥合并的有机组分并减压蒸发，得到0.46 g呈白色固体的标题 产物。
收率，87%; m.p. 157-158。C; IR 3407, 3226, 1663, 1608 cm"; 'H-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 11.44 (s, 1H)， 10.34 (s, 1H), 8.66 (s， 1H), 7.73 (d, 2H， J=7.8 Hz), 7.49 (d, 2H, J=7.7 Hz)， 7.36 (t， 2H， J=7.3 Hz), 7.30 (ta, 1H， J=5.1 Hz), 7.26 (t, 2H， J=7.3 Hz), 6.97 (d， 2H, J=7.9 Hz), 6.56 (s, IH)， 3.78 (s, 3H), 3.16 (dd， 2H， J=12.0 Hz, J，=5.9 Hz)， 1.93 (t， 2H, J=7.2 Hz), 1.51-1.45 (m, 2H), 1.43-1.38 (m, 2H), 1.24-1.17 (m, 2H); I3C-NMR (5 ppm， DMSO-d6) 168.9, 160.9, 158.2, 135.7， 132.8， 128.7, 127.9, 127.3， 126.2, 125.9， 124.3, 122.7, 114.0， 107,1, 55.1, 32.1， 28.7, 26.0， 24.8; C24H27N304的分析计算值: C， 68.39; H, 6.46; N， 9.97。实测C, 68.25; H, 6.42; N, 9.98 %。
实施例7
對务具才以T潜沟式W iV-^凝差9成差-3-苯差-5-~-差」一4漏,膝很—^^L2-應嚴'
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈黄色固体的 标题化合物。
收率，84%; m.p. 126-127。C; IR 3397， 3185, 1668, 1628, 1507， 1356 cm"; ^隱NMR (5 ppm, DMSO-d6) 12.59 (b s, 1H), 10.33 (s, 1H), 8.66 (s, 1H): 7.53 (d， 2H, J=8.5 Hz)， 7.44-7.39 (m， 3H)， 7.35 (d, 2H， J=7.0 Hz), 7,03 (d, 2H: J=8.5 Hz)， 6.71 (ta, 1H, J=4.4 Hz), 3.82 (s, 3H), 3.03 (dd， 2H， J=11.9 Hz, J，=6.0 Hz), 1.88 (t, 2H， J=7.3 Hz), 1.40-1.34 (m, 2H), 1.24-1.18 (m, 2H), 1.03-0.96 (m, 2H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 168.9, 159.9， 159.4, 133.3, 132.0, 131.1， 130.9, 129.9, 128.0, 127.6, 123.3, 121.4, 121.1， 113.5, 55.2,
32.0, 28.4, 25.7， 24.7; C24H26N406的分析计算值C, 61,79; H, 5.62; N,
12.01。 实测C,61.71;H, 5.59; N, 12.04%。
为了使上述这些实施例中表达的内容更易于理解，产生前述实施例 的化合物的不同合成阶段如下述方案1所示，
<formula>formula see original document page 31</formula> 实施例8
浙务^j" T潜游4'的A^5Y詹差疯差f教差J/t'差-3-(^ f處差苯差」-5-哀差-y/f-^^2-教展
<formula>formula see original document page 32</formula>
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈浅黄色固体 的标题化合物。收率，80%; m.p. 142°C; IR3417, 3256， 1663， 1613， 1547， 1306 cm-1; ^-丽R (5 ppm, DMSO-d6) 12.59 (b s, 1H), 10.33 (s， 1H)， 8.66 (s, 1H), 7.53 (d， 2H， J=8.5 Hz), 7.44-7.39 (m, 3H), 7.35 (d, 2H, J=7.0 Hz), 7.03 (d, 2H, J=8.5 Hz)， 6,71 (ta， 1H， J=4.4 Hz), 3.82 (s, 3H), 3,03 (dd, 2H， J=12.43 Hz, J，=6.35 Hz)， 1.94 (t, 2H， J=7.3Hz)， 1.54-1.45 (m， 2H)， 1.45-1.37 (m， 2H)， 1.28-1.16 (m, 2H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 169.0, 161.0, 158.0， 132.6， 131.6, 129.9， 128.6， 127.8, 127.2， 126.6, 124.5, 123.1， 113.4, 108,1, 55.0， 32.2， 28.8， 26.1， 24.9。 C24H27N304的分析计算值:C， 68.39; H, 6.46; N 9.97。实测C, 68.27; H， 6.43; N, 9.99 %。
实施例9
浙备^才以7"潜沟式的7V-f5-6^差^差f ^差」戎差-3-~- f真差苯 差」-5-「衷差」-4-^U//- ^(2-應发
<formula>formula see original document page 32</formula>
使用与实施例6基本上相似的方法制备该物质，得到呈浅黄色固体 的标题化合物。收率，94%; m.p. 155。C;IR3397， 3155, 1638, 1497, 1356
cm"; 'H-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 11.59 (s, 1H)， 10.34 (s， 1H), 8.68 (s， 1H), 7.63-7.53 (m， 2H，)， 7.52-7.41 (m, 3H), 7.29 (d， 2H, J=8.5 Hz), 6.99(d, 2H, J=8.5 Hz)， 6.72 (ta， 1H, J=4.4 Hz)， 3.80 (s， 3H), 3.05 (dd, 2H, J=12.02 Hz, J，= 6.24 Hz)， 1.89 (t， 2H, J=7.3Hz), 1.50-1.33 (m， 2H), 1.33-1.16 (m, 2H)， 1.14-0.98 (m, 2H); "C匿NMR (5 ppm, DMSO-d6) 168.9, 159.4, 158.8, 133.0, 131.6， 131.2, 129.3， 129.1， 129.0， 128.0， 123.5, 121.0， 113.5， 55.0, 32.0, 28.3, 25.7,24.6。 (:24>126:^06的分析计算值C， 61.79; H, 5.62; N, 12.01。实测 C， 61.40; H，5.77; N， 11.80%。
实施例10
7潜沟4'的7"4H- f差疯差靡
O H H H
将曱醇(30 ml)中的双碳酸二叔丁酯(10.9 g， 51 mmol)的混合物逐滴加 入到1，4-二氨基丁烷(11.12 g， 150匪ol)在三乙胺(30 ml, 215醒ol)和曱 醇(300ml)中所形成的溶液。将所得混合物在环境温度下搅拌16h。然后， 减压蒸发三乙胺和曱醇。将所得的油溶解在二氯曱烷(100ml)中并用10% 石灰酸钠洗涤(2 x 50 ml,水溶液)。用MgS04干燥有机相并减压蒸发。如 此得到单保护的胺(7.8 g, 41.42 mmol)。
在环境温度下，将碳酸氢钠(18.23 g, 63.72 mmol)在水(438 ml)中的溶 液逐滴加入到所述单保护的胺(6g, 31.86 mmol)与三光气(3.48g, 11.72 mmol)在二氯曱烷(438ml)中所形成的溶液。将所得双相体系剧烈搅拌1.5 h。然后，倾出有机相，用MgS04干燥并减压蒸发。将所得油(4.3g， 20 mmol) 溶解在曱醇(6.8 ml)中并于0。C下緩慢地逐滴加入另一预制的曱肼(l.l ml, 20.8 mmol)和水(4.05 ml)的溶液中。将该混合物于0。C下搅拌45分 钟。然后过滤沉淀物并得到3.492 g白色固体，其光语特性鉴定为与4-(4-叔丁氧羰基氨基丁基)-1 -曱基氨基脲一致。
将另一溶液，二氯曱烷(22 ml)中的三氟乙酸(4.96 ml, 44 mmol)，在 0°C下经30分钟緩慢加入到前面所得到的沉淀物(0.500 g， 1.92 mmol)在
二氯曱烷(27.5ml)中形成的溶液。将该混合物搅拌2小时。然后加入曱苯 (50ml)并减压蒸发至原体积的1/2，该过程重复若干次。这样获得标题化 合物的三氟乙酸铵盐(0.720 g， 2.63 mmol)。
收率，68%; IR 3387, 3115, 1673 cm"; ^國NMR (5 ppm, DMSO-d6) 7.88 (s, 3H)， 7.42-7.15 (m, 2H), 3.78-3.64 (m, 1H)， 3.58 (s， 3H)， 3'16曙2.97 (m， 2H)， 2.95-2.73 (m， 2H)， 1.80-1.38 (m, 4H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 159.0, 158.6, 158.1, 157.7, 156.7， 51.1, 26.3, 24.3。
实施例11
舆才以7潜沟^:的(￥-,處差眾4)-4-^^-3<遽势、-2-4)-7//-^^
;凝钩r4Mf2- f差钩嚴.
将5-(4-曱氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-li7-吡咯-2-羧酸(0.434 g， 1.25 mmol)与4-(4-氨基丁基)-l-曱基絲脲的三氟乙酸铵盐(0.345 g, 1.25 mmol)在DMF (6.25 ml)中形成的溶液冷却至0°C。然后接连加入三乙胺 (0.98 ml, 7.04匪ol)、 1-羟基苯并三唑(0.210 g, 1.37匪ol)、 iV-(3-二曱基 氨基丙基)-AT-乙基碳二亚胺氢氯酸盐(0.263 g, 1.37 mmol)以及iV-甲基吗 啡啉(0.14ml， 1.25mmo1)。将所得混合物于0。C下搅拌2 h，并在环境温 度下再搅拌96小时。然后加入乙酸乙酯(250 ml),用水(80 ml)、 1N的 Na2S203 (80 ml,水溶液)、水(80 ml)、 NaHC03 (80 ml,饱和水溶液)及 NaCl(80ml，饱和水溶液)洗涤所得溶液，用MgS04干燥并减压蒸发，得 到0.400 g (0.82 mmol)的标题化合物。
收率，65.6%; m.p. 185-187°C; IR 3408, 3161, 1639， 1511 cm—1; iH-NMR (5 ppm, CDC13): 10.4 (s, 1H)， 7.56 (dd, 1H， J=5,5 Hz， J，=0.8)， 7.54 (d， 2H， J=8.7 Hz)， 7,20-7.15 (m， 3H), 6.98 (d, 2H， J=8.7 Hz), 5.74 (t, 1H， J=5,2 Hz), 4.66 (s， 1H)， 3.86 (s， 4H)， 3.67 (s, 3H)， 3.13-3.04 (m， 4H), 1.31-1.24 (m, 4H); 13C-NMR (5 ppm, CDC13): 160.7, 159.6, 157.0， 134.6，132.9, 131.5, 130.9， 129.5, 128.7， 127.6， 123.2, 121.1, 113.9, 113.7， 55.4， 52.1， 40.5, 38.7, 27.0, 26.2。计算出的C22H26N605S的分子离子(molecular ion): m/z 486.14。实测471.1 (M+-Me)。
实施例12
斜务详有"7"潜沟4'的7-f￥-威差f4^Y苄真差」靡
以千氧基胺代替曱肼，使用与实施例IO基本上相似的方法制备该物 质。在前述的加成-脱保护步骤之后，得到标题化合物相应的三氟乙酸铵 盐
JUL 。
收率，68%; IR 3759, 3356, 1648 cm"; ^-NMR (5 ppm， DMSO-A) 7,82 (s, 3H), 7.52-7.28 (m, 7H), 5.00 (s, 2H)， 3.09-2.92 (m， 2H)， 2.90-2.68 (m， 2H): 1.68-1.32 (m, 4H); 13C-NMR (5 ppm, DMSO-d6) 159.6, 158.2， 157.7, 136.4, 128.5, 128.1， 127.8， 77.2, 38.0， 26.6， 24.3, 24.0。计算的C13H20N3O2的分子 离子m/z 237.32。实测:238.0。
实施例13<formula>formula see original document page 35</formula>
使用与实施例11基本上相似的方法，由3,5-双(3，5-二曱氧基苯 基)-lH-吡咯羧酸和l-(4-氨基曱基)-3-(千氧基)脲的三氟乙酸铵盐制备该 物质。
收率，81%; IR 3407, 3216, 1688, 1597 cm"; !H画NMR (S ppm， CDC13) 9.87 (s， 1H), 7.44-7.32 (m, 5H), 7.13 (s， 1H), 6.77 (d， 2H, J=2.0 Hz), 6.62 (d, 2H, J=2.2 Hz)， 6.50 (d， 2H, J=2.6 Hz), 6.43 (t, 1H， J=2.0 Hz)， 6.03 (t, 1H， J=5.5 Hz), 5.62 (t， 1H, J=5.3 Hz)， 4.80 (s， 2H)， 3.85 (s， 6H), 3.82 (s， 6H), 3.28 (dd， 2H， J=11.9 Hz, J，=5.9 Hz)， 3,15 (dd， 2H， J=12.7 Hz, J，=6.5 Hz), 1.41-1.29 (m， 4H); 13C-NMR (S ppm, CDC13) 161.2， 160.0, 137.6， 135.4， 134,1， 133.2， 130.8, 129.2， 128.8, 128.7, 127.7， 122.2, 110.0, 107.4, 103.0， 100.0, 99.8， 78.6， 72.3， 10.1, 68.1, 55.4, 39.1, 38.8, 27.1， 26.6。计算的 (:331138]^407的分子离子m/z602.68。实测603.2。
实施例14
賴务^^"以7"潜沟4'的7-~_卩，5-双0,5-二 f真差,4Hif-必^2-疯厲^ 7"差」-3隱絲嚴'
OCH3
制备1-(4-(3，5-双(3,5-二曱氧基苯基)-1//-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(节氧 基)脲(0.200g, 0.33 mmol)在乙酸乙酯(66 ml)与乙醇(16.5 ml)中形成的溶 液，向其中加入10%的Pd-C (0.116 g， 0.11 mmol)催化剂。将该混合物在 环境温度、氢气流下搅拌5小时。然后用硅藻土过滤所得悬浮液并减压 蒸发滤液。这样获得无色油状的标题化合物。
收率，71%; IR 3416, 3244, 2948, 1598 cm"; ^-NMR (S ppm CDC13) 10.3 (s, 1H), 6.78 (s， 2H), 6.60 (d, 2H, J=1.7 Hz), 6.53-6.44 (m, 2H), 6,39 (s, 1H), 6.17-6.02 (m, 1H), 4.81 (s, 1H), 3.86-3.78 (m, 13H), 3.34-3.16 (m, 4H)， 1.48-1.33 (m, 4H); 13C-NMR (5 ppm， CDC13) 161.2, 137.6, 134.6, 134.5, 133.3, 128.3, 128.2, 122.1, 122.0， 109.7, 107.5, 103.3, 99.9, 99.6, 55.6, 55.5,
方案2
<formula>formula see original document page 37</formula>
39.0， 38.9, 38.7, 27.2, 27.0, 26.8。计算的C26H32N407的分子离子:m/z 512.55。实测513.2 (M+)， 497.1 (M+-OH)。
为了使上述这些实施例中表达的内容更易于理解，在以下方案2中 显示了产生实施例10、 11、 12、 13和14中提及的化合物的不同合成阶
段,
<formula>formula see original document page 37</formula>
方案3.其抑制作用如图1、 2、 3、 4、 5、 6和7所示的化合物的分子式。 实施例15
Jg蛋力應一乙^差齊活^的^伊射^力的谬，/vJ^试
为了更好地说明本实施例和下一实施例所遵循的方法，给出方案3 中所示的化合物(其中包括手性吡咯烷的衍生物)所得的结果，目的是比较 该环状体系的活性与本发明的吡咯的活性。
为了测定合成化合物的组蛋白脱乙酰基酶的抑制能力，通过以不同 浓度的合成化合物孵育细胞系HCT116与MOLT4的细胞核提取物以及氚 标记的乙酰化的组蛋白，然后使用闪烁计数器测量释放出的乙酰基团的 浓度来进行体外研究。
勿應^"炎承參的賴务
将悬浮液中的细胞(8 x 106)以800rpm离心分离5分钟，用PBS洗涤 并重新悬浮在2 ml的缓沖液A (10 mM Tris pH 7.5、 15 mM KC1、 2 mM MgCl2、 0.1 mM EDTA、 2 mM 2-巯基乙醇、每50 ml緩冲液中1片不含
EDTA的蛋白酶抑制剂)中。加入135 pi緩沖液B (50 mM Tris、 1M KC1、 30 mM MgCl2、 0.1 mM EDTA、 2 mM 2-巯基乙醇)，然后将其在4。C下以 2.7 x 103 rpm离心分离5分钟并除去上清液。该粒状沉淀物在2 ml緩冲 液A中重新悬浮并在2 ml的匀化器中搅拌5次。在4。C下以7.8 x 103 rpm 再次离心分离8分钟，该粒状沉淀物在2ml緩冲液A中重新悬浮并在匀 化器中搅拌5次。在其中加入200 pi硫酸铵然后在4°C、回转式混合机 中混合30分钟。在4。C下以12x 1(^rpm将其离心分离IO分钟，然后将 上清液在4。C、 200 ml緩沖液C (20 mM Tris pH 7.5、 10%甘油、1 mM EDTA、 1 mM 2-巯基乙醇、1.5 mM MgCl2、每50 ml緩沖液中1片不含 EDTA的蛋白酶抑制剂)中的MWCO3500膜中渗析2h。然后回收膜中的 内容物并将其用于以下描述的研究中。
化合參/伊斜活^的举#两试
将55 fxl緩沖液C (同上)、5 iul相应的抑制剂溶液和10 (il氚标记的 高度乙酰化的组蛋白加入使用所示方法得到的30 pl细胞核提取物中，然 后将所得混合物在37°C下孵育1 h。
通过加入37.5 (xl的盐酸(最终浓度，1 M)与乙酸(最终浓度，0.4 M) 的溶液而4吏孵育停止。将700 pi的乙酸乙酯加入所得混合物中，以10,000 rpm离心分离5分钟，最后，上层相(包含释放的含氚的乙酸)用于闪烁计 数。通过将500 |ul的上层相与5 ml的闪烁液混合来制备闪烁计数的样本。
根据上述方法获得的最具代表性的数据如图1和图2所示。图1中 的结果对应于细^l包系HCT116而图2的结果对应于细^^系MOLT4。
实施例16
jg蛋冷的,惑A7;^的都J1
使用下述方法量化H3组蛋白和H4组蛋白乙酰化程度。 用不同浓度的本发明的HDAC抑制化合物对Jurkat人细胞系(早幼粒 细胞白血病)处理24 h。然后，通过将含有1%乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet-P40)和蛋白酶抑制剂的RSB緩沖液(Tris 10 mM pH 7.5, 10 mM 氯化钠以及3 mM氯化4J1)加入所述细胞来分离细胞核。将0.25 M盐酸加
入细胞核并将该混合物在4。C下搅拌16h以提取组蛋白。接着，通过加 入8倍体积的丙酮使组蛋白沉淀。使用反相高效液相色谱(HPLC)、用 0.3%三氟乙酸中的具有乙腈梯度(20%至60%)的C18柱分离所得组蛋白 混合物。
使用高效毛细管电泳法(HPCE)并使用石英毛细管(60.2 cm x 75|um, 有效长度50 cm)分离非乙酰化、单乙酰化、二乙酰化、三乙酰化和四乙 酰化的H3组蛋白和H4组蛋白部分。使用的洗脱条件为25。C，电压为 12 kV，在214 nm处吸光4全测，以及110 mM石粦酸盐(pH 2.0)与HPM纤 维素(0.03%重量/体积)的洗脱緩冲液。
每一次注射前，用0.1 M NaOH洗涤体系3分钟，接着用0.5 M H2S04 再洗涤2分钟，然后用洗脱緩冲液平衡3分钟。使用经0.45 |Lim孔径过滤 的超纯水(Milli-Q water)来制备洗涤緩沖液和溶液。在0.3 psi的压力下、3 秒钟内注射该样本。全部样本均被分析两次。
本发明的不同分子获得的某些具有代表性的数据如图3所示。
实施例17
谬导勿/^源亡承y试
通过使用商用的YoPro⑤试剂盒作为染色剂，使用流式细胞分析研究 细胞质膜的渗透率变化来量化凋亡细胞数量。所遵循的方法在以下进行 说明。用不同浓度的本发明的HDAC抑制剂化合物对人细胞系HCT116 和HL60 (每次处理106个细胞)的细胞处理24 h。然后用冷PBS IX对该 细胞洗涤两次，4吏其在1 mlPBS IX中重新悬浮并加入1 |il YoProe和1 |ul 碘化丙啶。在水中使该混合物避光孵育30分钟。使用流式细胞仪测量凋 亡细胞的量。
最具代表性的数据如图4和图5所示。有关人结肠癌HCT116模型 的数据在图4中表示。有关人急性髓性白血病HL60模型的数据在图5 中表示。
实施例18
谬力^:一》;^^^/试
为了观察就体内肿瘤生长所描述的某些化合物的效果，使用6周大
的雌性无胸腺的棵鼠(HarlamSpragueDawley, Indianapolis, IN, USA)进 4亍研究。对于该研究，将2 x 106HCT116细胞系(人结肠癌)的细胞与107 MOLT4细胞(人T细胞急性淋巴母细胞白血病)以在PBS中重新悬浮的最 终接种体积为200 )Lil/动物的形式进行皮下接种。当肿瘤的平均体积达到 100 mn^时，通过腹膜内注射对每个小鼠给予日剂量为20 |LiM的相应分 子溶液(IO mg/kg重量)，200 pl。给予小鼠的对照组200 |Lil的PBS以模拟 接种的压力。每隔24h对小鼠称重，并使用校准的毫米测量设备测量肿 瘤体积，假定肺瘤为几何学球体(体积=d3 x兀/6)。当胂瘤的体积达到1 cm3 至1.5 cm3 (人道主义伦理人类极限)时，将小鼠处死并将肿瘤取出并称重。 最具代表性的数据如图7和图8所示。有关人结肠癌HCT116模型 的数据如图7所示。有关人纤维型白血病MOLT4模型的数据如图8所示。
权利要求
1.通式I的吡咯衍生物，其中R1和R3独立表示苯基自由基；环上不同位置的单取代或多取代的苯基；或含有O、N或S中至少一个杂原子的C5-C10杂芳基基团；R2表示氢原子或吸电子基团，例如硝基基团；或者氨基或酰胺基团；R4表示氢原子或线性、支链或环状的C1-C6的烷基基团；n表示亚甲基基团的数目为1至8，包含端点；X表示仲胺基团或氧原子或硫原子；Y表示选自亚甲基、取代的亚甲基、仲胺的基团；Z表示氧原子或硫原子；以及W表示选自羟基、羟基胺、肼、烷基肼、芳基肼或杂芳基肼的基团。
2.如权利要求1所述的通式I的吡咯衍生物，其选自 [1]具有以下结构式的6-(3,5-二苯基-liZ-吡咯-2-酰胺)己酸:[2]具有以下结构式的6-(4-硝基-3,5-二苯基-1//-吡咯-2-酰胺)己酸: [3]具有以下结构式的AK5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-5-苯基-3-(4-曱 氧羰基)-1//-吡咯-2-酰胺[4]具有以下结构式的AK5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-曱 氧羰基)-1//-吡咯-2-酰胺[5]具有以下结构式的AK5-(羟基氨基曱酰基)戊基)-3-苯基-5-(4-曱 氧羰基)-4-硝基-1//-吡咯-2-酰胺[6]具有以下结构式的1-(4-(3，5-双(3,5-二曱氧基苯基)-1//-吡咯-2-酰胺)丁基)-3-羟基脲 <formula>formula see original document page 4</formula>[7]具有以下结构式的1-(4-(5_(4-甲氧基苯基)-4-硝基-3-(噻吩-2-基)-1仏吡咯-2-酰胺)丁基)-3-(2-曱胺)脲<formula>formula see original document page 4</formula>
3.通式(Ia)的化合物的制备方法:<formula>formula see original document page 4</formula>其中，R2、 R3、 R4、 X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由 以下物质组成的混合物的反应a)通式II的lH-吡咯-2-羧酸，<formula>formula see original document page 4</formula>(II)b)通式III的化合物，<formula>formula see original document page 4</formula>其中RS是烷氧羰基，c) 活化羧基基团的试剂，以及d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，以及使所获得的产物与氢氧化锂或氢氧化钠、二曱氧基乙烷和水的混合 物发生反应。
4.通式(Ib)的化合物的制备方法<formula>formula see original document page 5</formula>其中R。 R2、 R3、 R4、 X和n具有以上给出的含义，所述方法包括由以 下物质组成的混合物的反应a)通式II的lH-吡咯-2-羧酸，其中RS是烷氧羰基，c) 活化所述羧基基团的试剂，以及d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，b)通式III的化合物，<formula>formula see original document page 5</formula>以及在曱醇中过量曱醇钠的存在下，将所得产物加入盐酸羟胺与酚酞的 混合物中。
5.通式(Ic)的化合物的制备方法<formula>formula see original document page 6</formula> (Ic)其中R!、 R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，所述方法包括 由以下物质《且成的混合物的反应 a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，<formula>formula see original document page 6</formula> (II)to通式in的化合物，<formula>formula see original document page 6</formula> (HI)其中R5是叔丁氧基氨基曱酰基(NHBoc)或千氧基氨基曱酰基 (NHCBz),c) 活化所述羧基基团的试剂，以及d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，例如双光气、三光气或硫光气，进行反应，获得异氰酸酯，用羟胺处理 所述异氰酸酯。
6.通式(Id)的化合物的制备方法:其中，R，、 R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，并且R6是H、 Cl-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、 N或S的杂原子的5元或6 元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应 a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，其中R5是叔丁氧基氨基曱酰基(NHBoc)或千氧基氨基曱酰基 (NHCBz)，c) 活化所述羧基基团的试剂，以及d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物，用酸处理或水解的方式对所得产物脱保护以及使其与光气或其类似物， 例如双光气、三光气或硫光气，进行反应，获得异氰酸酯或硫代异氰酸 酯，用肼或烷基肼、芳基肼或杂芳基肼处理所述异氰酸酯或硫代异氰酸b)通式III的化合物，HX-(CH2)n-R (III)
7.通式(Id)的化合物的制备方法:<formula>formula see original document page 8</formula>其中，Ri、 R2、 R3、 R4、 X、 Z和n具有以上给出的含义，以及Re是H、 Cl-C6烷基、芳基或具有一个或多个选自O、 N或S的杂原子的5元或6 元的杂芳基，所述方法包括由以下物质组成的混合物的反应 a)通式II的1H-吡咯-2-羧酸，其中115是3-节氧基脲或3-烷基脲、3-芳基脲或3-杂芳基脲，c) 活化所述羧基基团的试剂，以及d) 叔胺，其选自具有C3-C10碳的环状或非环状脂肪族化合物或 具有C9-C15碳的烷基芳香族化合物。
8. 用于治疗癌症的权利要求1所述的吡咯衍生物。
9. 用于治疗癌症的权利要求2所述的吡咯衍生物。
10. 权利要求1所述的吡咯衍生物在生产用于治疗癌症的药物中的 用途。b)通式III的化合物，HX-(CH2)n-R (HI)
11. 如权利要求2所述的吡咯衍生物在生产用于治疗癌症的药物中的用途。
12. 药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物与至少一药物可接 受的赋形剂。
13. 药物组合物，其包含权利要求2所述的化合物与至少一药物可接 受的赋形剂。
全文摘要
本发明描述了衍生自通式I的吡咯的新颖的化合物、获得它们的方法以及因其对某些组蛋白脱乙酰基酶的抑制作用而以药物组合物的形式作为治疗癌症的药物的应用。
文档编号A61K31/40GK101351444SQ200580052452
公开日2009年1月21日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者多尔塔·奥特谷伊安萨, 艾兹皮·祖比亚奥拉斯考加, 费尔南多·皮德罗·卡西欧莫拉, 马奈尔·埃斯特勒巴多萨 申请人:巴斯克国家大学;国家癌症研究中心