专利名称：与Rnase P核酶联用的外部引导基因C6及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与医学领域，具体涉及与RNase P核酶联用的外部引导序列及其在制备抗HCMV药物中的应用。
背景技术：
20世纪80年代，Sidney Altman等发现埃希氏杆菌核糖核酸酶P(RNase P)的RNA组分M1 RNA能独立对前体tRNA(ptRNA)进行剪切加工。人们把具有催化切割活性的RNA称为“核酶”(ribozyme)。核酶的发现拓宽了基因治疗的视野。核酶的互补切割特性和循环特性在哺乳动物细胞基因治疗中具有显而易见的优越性。近年来的实验结果表明，核酶作为基因治疗的一种工具有着广阔的应用前景和极大的临床实用价值。
RNase P是一种核蛋白复合物，广泛存在于细菌、酵母和动植物中，是细胞自身具备的天然核酶，无显著细胞毒性。它是目前发现的活性最高的核酶之一，催化所有tRNA 5’末端的成熟。RNase P的特点是其识别底物的二级结构而不是核苷酸序列，因此它可以在体内和体外水解各种碱基序列完全不同的底物。大肠杆菌来源RNase P包括一个RNA催化活性单位M1 RNA和一个碱性蛋白C5，二者均为RNase P体内活性所必需。在缺乏C5蛋白的体外环境下，M1 RNA可在高盐溶液中对底物RNA进行催化切割。研究发现，底物的二级结构在M1 RNA对底物的识别中起决定作用。
由于RNase P或M1 RNA具有识别底物二级结构而非识别底物核苷酸序列这一特点，只要两个RNA分子形成类似于ptRNA分子结构的复合物，即可被RNase P或M1 RNA识别并切割。能够指导RNase P或M1 RNA识别靶mRNA上的切割位点的RNA分子被称为外部引导序列(External Guide Sequences，EGSs)。理论上说，只要靶mRNA上存在RNase P潜在的切割位点，那么使用适合的EGS与靶mRNA上潜在的切割位点互补，即可指导RNase P对复合物中靶mRNA进行特异性切割。实际上，由于细胞内许多的mRNA均是与蛋白质结合并以一种高度组织化、高度折叠化的空间结构存在，在目前尚无法进行精确的底物RNA二级结构区域分析的实验室条件下，在底物RNA上选择一个易与EGS结合的靶位极为困难。即使选择在M1GS实验结果中切割活性较高的靶位，在其他因素的影响下，也可能在EGS实验中不能实现高效引导切割。
以RNA为基础的EGS(RNA-based EGS)已经通过转基因方法在细菌和哺乳类细胞中得到内源性表达，并且在抑制疱疹病毒和流感病毒表达及阻断流感病毒在人类细胞中复制的应用中被证明是非常有效的。在引导RNase P切割靶mRNA时，以DNA为基础的EGS(DNA-based EGS)与RNA-based EGS同样有效。DNA-based EGS无论从成本还是稳定性方面都比RNA-based EGS具有更大优势。
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一种在全世界不同种族人群中广泛传播且感染率很高的病原体。目前研究发现，HCMV感染造成的主要危害是引发移植感染、宫内感染，导致胎儿流产、骨髓发育不良、畸形、智力低下等，因此是围产医学和优生学以及骨髓移植研究中的重大课题。
编码HCMV DNA复制相关蛋白的ORF中，UL54基因的功能是编码140kD的DNA多聚酶，为病毒DNA复制所必需，是研究病毒感染机制的重要基因，同时也是作为抗病毒治疗中的良好药靶。
针对HCMV这种严重危害人类健康的感染性疾病的病原体，研制一种有效的抗病毒药物对于控制HCMV感染以及预防HCMV相关并发症是至关重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供与RNase P联用的外部引导基因(EGS)，是用于引导RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的EGS，包括以RNA为基础的EGS与以DNA为基础的EGS。
本发明的另一目的在于提供包含所述EGS的重组表达载体，以及用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。表达载体可采用pUC19等含Ecoli复制位点的载体。宿主细胞可采用JM109或DH5α等基因工程菌。JM109、DH-5α、pUC19均为商业化产品，JM109、DH-5α可购自华美公司，pUC19可购自TaKaRa公司(大连宝生公司)。
本发明的进一目的在于提供上述EGS在制备抗HCMV病毒药物中的应用。
本发明所述的与RNase P联用的外部引导序列，是以RNA为基础的外部引导序列，具有SEQ ID NO1所列的序列；还包括以DNA为基础的外部引导序列，具有SEQ ID NO2所列的序列，均具有引导RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的特异引导切割活性，其靶位点均在UL54基因的1760-1776。SEQ ID NO1的序列5’-GCACUCGUGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCAGCAGCACCA-3’SEQ ID NO2的序列5’-GCACTCGTGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’能转录出如SEQ ID NO1所示序列的外部引导序列的DNA序列，其优选序列为上游含有T7启动子。
本发明所述的EGS分子可用于与RNase P联用靶定切割HCMV聚合酶基因，具有以下有益效果(1)所构建的EGS分子将切割位点设计在靶mRNA复杂二级结构的外围，避免了二者的结合受靶mRNA高级结构的限制，更方面人为操作并控制；(2)所构建的EGS可在体外循环利用且在体内积累，因此EGS/靶RNA要比反义RNA/靶RNA的化学剂量比小得多，大大提高了EGS的使用效率；(3)所构建的EGS与RNase P联用的过程产生的是一种以催化方式进行的不可逆切割；(4)利用了细胞内源性且含量丰富的RNase P，保证了该酶在细胞环境中的稳定性和高效性；(5)由于对靶mRNA上切割位点的选择不受特异核苷酸序列的限制，因此对靶位内部的单碱基突变相对不敏感。有研究显示[Plehn-Dujowich D，Altman S.Effective inhibition of influenza virus production in cultured cells by external guidesequences and ribonuclease P.PNAS.1998，957327-7332.]，EGS上单个核苷酸的改变并不足以影响EGS/靶RNA复合物的稳定性，从而也不会影响RNase P的切割效率。
图1为UL54基因C片段克隆到pGEM3z质粒得到PU54-C质粒的示意图；图2为PU54-C质粒酶切分析的凝胶电泳图；图3为pUC19-EGS质粒酶切分析的凝胶电泳图；图4为pUC19-M1 RNA质粒酶切分析的凝胶电泳图；图5为底物RNA体外转录片段聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图6为M1 RNA核酶体外转录产物聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图7为EGS-C6体外转录产物聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图8为rEGS-C6引导M1 RNA对底物C片段的切割的电泳分析图；图9为dEGS-C6引导M1 RNA对底物C片段的切割的电泳分析图。
其中，图2中，泳道1为Wide Range DNA Ladder Marker，泳道2为PU54-C质粒，泳道3为PU54-C质粒的EcoR I+Hind III双酶切产物；图3中，泳道1为Wide Range DNA Ladder Marker，泳道2为pUC19-C6EGS，泳道3为pUC19-C6EGS质粒的EcoR I+Hind III双酶切产物，泳道4为EGS-C6寡核苷酸片段退火产物；图4中，泳道1为Wide Range DNA Ladder Marker，泳道2为pUC19-M1 RNA克隆质粒，泳道3为pUC19-M1 RNA质粒的Kpn I+Xba I双酶切产物，泳道4为M1 RNA PCR产物；图5中，泳道1为RNA Marker，泳道2为C片段转录产物；图6中，泳道1为RNA Marker，泳道2为M1 RNA核酶体外转录产物；图7中，泳道1为RNA Marker，泳道2为EGS-C6体外转录产物；图8中，泳道1为RNA Marker，泳道2为底物C片段空白对照，泳道3为底物C片段+M1 RNA+rEGS-C6；图9中，泳道1为RNA Marker，泳道2为底物C片段空白对照，泳道3为底物C片段+M1 RNA+dEGS-C6。
具体实施例方式
实施例1质粒和菌种的来源载体质粒pGEM3z、pUC19，以及宿主大肠杆菌JM109、DH-5a均购自基因公司，为本领域的常用载体质粒和宿主菌。
主要试剂见表1
表1
其他主要试剂的配方见表2表2
本实施例所涉及的所有引物合成由上海博亚公司以及北京奥康公司完成，所涉及的所有测序工作由上海博亚公司以及上海生工公司完成。
(一)EGS靶位的确定高引导活性的EGS序列具备一定的特性，其识别的底物RNA在剪切位点-1、+1和+2位点处分别是嘧啶U/C、G和C的话，可能有利于切割位点双螺旋二级结构的稳定；此外，底物RNA的-2位点不能与EGS上的碱基配对(NCCA-3’必须游离)[Kufel J，Kirsebom LA.Different cleavage sites are aligneddifferently in the active site of M1 RNA，the catalytic subunit of Escherichia coliRNase P.PNAS.1996(93)6085-6090.]，否则NCCA-3’这一引导M1 RNA切割的重要游离信号有可能失去功能。根据上述资料，利用Genetool软件搜索UL54全基因(GENEBANK登录号为LOCUS 9625671)，得到具备这些特征的若干靶位点。针对EGS靶位在UL54基因中的分布情况，将UL54基因划分为若干小片段，分别进行克隆，选择自身含有T7启动子的pGEM3z作为克隆载体。从中选出4个基因片段，命名为A、B、C、D四个片段。在研究M1GS核酶切割UL54基因片段的实验(Su YZ，Li HJ，Li YQ，Chen HJ，Tang DS，Zhang X，Jiang H，ZhouTH.In Vitro Construction of Effective M1GS Ribozymes Targeting HCMV UL54RNA Segments.Acta Biochim Biophys Sin.2005 Mar；37(3)210-4)中发现，上述底物小片段中，C片段的C6位点被M1GS核酶特异性切割的效率较高。因此，本发明选择了长度为510bp的C片段作为底物。
本发明选取的靶位点在UL54基因中的具体位置及序列如表3表3
1、C片段的克隆C片段的全序列UL54基因的1367-1876序列1367 acgc cgccgccttt1381 ccctcggctt ctcacaacaa tccggccagc acggccgcca ccaaggtgta tattgcgggt1441 tcggtggtta tcgacatgta ccccgtatgc atggccaaga ctaactcgcc taactataag1501 ctcaacacta tggccgagct ttacctgcgg caacgcaagg atgacctgtc ctacaaggac1561 atcccgcgtt gtttcgtggc taatgccgag ggccgcgccc aggtaggccg ttactgtctg1621 caggacgccg tattggtgcg cgatctgttc aacaccatta attttcacta cgaggccggg1681 gccatcgcgc ggctggctaa aattccgttg cggcgtgtca tctttgacgg acagcagatc1741 cgtatctaca cctcgctgct ggacgagtgc gcctgccgcg attttatcct gcccaaccac1801 tacagcaaag gtacgacggt gcccgaaacg aatagcgttg ccgtgtcacc taacgccgct1861 atcatctcta ccgccg
C片段克隆到pGEM3z载体中的方案见图1。
2、PU54-C质粒的鉴定对PU54-C重组质粒进行双酶切验证，结果显示双酶切产物大小在500bp左右(图2中第3泳道)，此带与C片段的理论大小(510bp，双酶切片段实际长度520bp)相符。
(二)RNA-based EGS的获得1、EGS DNA的合成针对EGS-C6合成了4条短的DNA寡核苷酸片段如下a.5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGCACTCGTGTGCG-3’(35nt)b.5’-GTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(37nt)c.5’-AACCTGCGCGCGGAGACCGCACACGAGTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’(48nt)d.5’-AGCTTGGTGCTGCTGCAGGATTTG-3’(24nt)在设计时已将T7启动子设计在EGS-C6上游，因此，4种寡核苷酸片段以等摩尔数混合后退火生成含有T7启动子的EGS-C6 DNA片段，具体反应体系如表4表4
此外，由于在设计时已经将退火产物两端用来克隆的酶切位点(EcoR I和Hind III)留出，故退火产物经电泳检测大小合适后无须酶切即可直接用于和载体质粒pUC19连接反应。
2、包含所述EGS的重组表达载体的制备对EGS-C6产物和pUC19载体双酶切、连接，试剂、用量及反应条件见表5
表5
酶切完毕，用苯酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀干燥后，溶解于10μl灭菌三蒸水，-20℃存放。为了获得更高的阳性克隆筛选率，对pUC19质粒载体双酶切产物进行去磷酸化处理，见表6表6
反应完毕，苯酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀干燥后，溶解于10μl灭菌三蒸水，-20℃存放。
然后将含有T7启动子的EGS DNA片段的双酶切产物和经去磷酸化处理的pUC19质粒载体双酶切产物进行连接(克隆片段摩尔数∶载体摩尔数＞5∶1)，连接反应的标准反应体系如表7表7
3、转化体的制备、筛选、鉴定和测序取5μl连接液加入100μl大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴30min。42℃恒温90s，勿晃动。立即转移到冰水浴。加入400μl LB液体培养基，37℃水浴30-45min。取0.1～0.2mL转化菌液涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基。同时涂布无氨苄青霉素的对照。37℃生化培养箱正置培养15min或更久，待菌液吸收完全后，倒置培养16～20hr。观察转化情况，挑菌落鉴定。平皿倒置保存于4℃冰箱。
从转化菌落中挑单菌落于5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基试管中，高速振荡培养6hr；甘油保存菌种后12000g/30s收集剩余菌体。将细菌沉淀温和重悬于50μl TE中，加入等体积苯酚/氯仿，温和振荡后12000g/5min离心，将上清转移到另一离心管中用于琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒大小。选出克隆成功的质粒后，对余下质粒样品进行苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。获得样品可用于PCR以及酶切验证。M1 RNA亚克隆质粒pUC19-M1 RNA甘油菌送公司测序。
4、EGS克隆质粒的制备、鉴定采用质粒抽提试剂盒与碱裂解法制备。
试剂盒法采用Omega公司的小量质粒抽提试剂盒，具体过程见其说明书。
碱裂解法过程为接种转化有pUC19质粒载体的细菌(1％接种量)至LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。12000g/30s收集菌体(1.5mL培养物)，管口朝下甩净培养基。将菌体沉淀重新悬浮于1mL STE中，12000g/30s收集菌体。甩净STE，将细菌沉淀温和重悬于100μl冰预冷的溶液I中。加200μl新配制的溶液II，温和颠倒eppendorf管数次。加150μl冰预冷的溶液III，温和颠倒数次使试剂充分混合。4℃，12000g/5min，上清转移到另一离心管。等量苯酚/氯仿抽提。加2～2.5倍体积的无水乙醇，混匀后碎冰中沉淀DNA大约15min。4℃，12000g/15min，倾上清。加400μl 70％乙醇，温和旋转eppendorf管，使乙醇充分接触管内表面，4℃，12000g/5min。倾上清。用枪头小心吸走管壁上的液体，室温干燥沉淀30min。用50μl含RNase A(20μg/mL)的TE溶解沉淀。
对pUC19-C6EGS质粒进行双酶切鉴定双酶切结果显示，其产物片段小于100bp(图3第3泳道)，此带与EGS的理论大小(约80bp)相符，也与寡核苷酸片段退火结果相符(图3第4泳道)，电泳结果初步表明克隆成功。
对pUC19-C6EGS质粒进行PCR鉴定测序结果与C片段的序列相同，证实了克隆的正确。
(三)DNA-based EGS的设计DNA-based EGS的设计原则与RNA-based EGS相同，所不同的只是它不需要体外转录生成EGS，直接化学合成即可，其合成序列分别为dEGS-C65’-GCACTCGTGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(50nt)将合成的DNA-based EGS(dEGS-C6)稀释成200pmol/μl，-20℃存放。
(四)M1 RNA的克隆与鉴定采用自身不含T7启动子的pUC19载体，在引物设计时人工加入T7启动子，用于克隆片段的体外转录。
对M1 RNA的克隆质粒pUC19-M1 RNA进行双酶切鉴定双酶切结果显示，产物约在400bp左右(图4第3泳道)，此带与M1 RNA的理论大小(377bp，双酶切片段实际长度386bp)相符；PCR结果显示，产物为一条约400bp左右的高度特异性的带(图4第4泳道)，此特异性条带与M1 RNA的理论大小及双酶切结果均相符，电泳结果初步表明克隆成功。
对M1 RNA的克隆质粒pUC19-M1 RNA进行PCR鉴定测序结果完全证实了克隆的正确(见附录1)。
对pUC19-M1RNA质粒进行PCR鉴定测序结果与M1 RNA的序列(GENEBANK登录号为M17569.1 GI147685)相同，证实了克隆的正确。
1 gaagctgacc agacagtcgc cgcttcgtcg tcgtcctctt cgggggagac gggcggaggg61 gaggaaagtc cgggctccat agggcagggt gccaggtaac gcctgggggg gaaacccacg121 accagtgcaa cagagagcaa accgccgatg gcccgcgcaa gcgggatcag gtaagggtga181 aagggtgcgg taagagcgca ccgcgcggct ggtaacagtc cgtggcacgg taaactccac241 ccggagcaag gccaaatagg ggttcataag gtacggcccg tactgaaccc gggtaggctg301 cttgagccag tgagcgattg ctggcctaga tgaatgactg tccacgacag aacccggctt361 atcggtcagt ttcacct(五)体外转录1、底物UL54基因小片段的体外转录对C片段进行同位素标记的体外转录底物UL54基因C片段和D片段的体外转录反应体系如下(依表8顺序依次加入，以防止转录缓冲液中的亚精胺使DNA沉淀)
表8
反应完毕，每50μl转录体积加入1μl无RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL)，混合均匀于37℃温育15～30min。加入150μl DEPC的灭菌三蒸水，用等体积苯酚∶氯仿/异戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后冰浴1小时，4℃下12000g离心25min。小心吸走上清，将eppendorf管放置于超净台内吹干(大约15分钟，不用完全干透)。重新用200μl无RNA酶污染的水溶解沉淀(适当指弹管底帮助溶解完全)，加入20μl 3MNaAc；加入3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后在-20℃放置备用。
使用前，取出适量，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清。每管加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清，晾干后使用。底物RNA片段命名为UL54-C。
底物RNA体外转录产物的电泳检测结果底物C片段线性转录模板体外转录后得到实际长度分别为525nt的转录产物，8％PAGE(7M Urea)分离，如图5所示，电泳结果显示条带清晰，两底物片段成分纯净，可用于同位素掺入转录和核酶的体外切割实验。
2、M1 RNA核酶的体外转录M1GS核酶的体外转录反应体系如下(依表9顺序依次加入，以防止转录缓冲液中的亚精胺使DNA沉淀)
表9
反应完毕，每50μl转录体积加入1μl无RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL)，混合均匀于37℃温育15～30min。加入150μl DEPC的灭菌三蒸水，用等体积苯酚∶氯仿/异戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后冰浴1小时，4℃下12000g离心25min。小心吸走上清，将eppendorf管放置于超净台内吹干(大约15分钟，不用完全干透)。重新用200μl无RNA酶污染的水溶解沉淀(适当指弹管底帮助溶解完全)，加入20μl 3MNaAc；加入3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后在-20℃放置备用。
使用前，取出适量，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清。每管加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清，晾干后使用。底物RNA片段即为M1 RNA核酶。
M1 RNA核酶体外转录产物的电泳检测结果M1 RNA核酶的线性转录模板体外转录后，得到实际长度为377nt的转录产物，8％PAGE(7M Urea)分离，如图6所示，电泳结果显示条带清晰，M1 RNA成分纯净，可以用于体外切割实验。
3、RNA-based EGS的体外转录EGS-C6的体外转录反应体系如下(依表10顺序依次加入，以防止转录缓冲液中的亚精胺使DNA沉淀)
表10
反应完毕，每50μl转录体积加入1μl无RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL)，混合均匀于37℃温育15～30min。加入150μl DEPC的灭菌三蒸水，用等体积苯酚∶氯仿/异戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后冰浴1小时，4℃下12000g离心25min。小心吸走上清，将eppendorf管放置于超净台内吹干(大约15分钟，不用完全干透)。重新用200μl无RNA酶污染的水溶解沉淀(适当指弹管底帮助溶解完全)，加入20μl 3MNaAc；加入3倍体积(660μl)的无水乙醇，混匀后在-20℃放置备用。
使用前，取出适量，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清。每管加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清，晾干后使用。底物RNA片段命名为rEGS-C6。
RNA-based EGS体外转录产物的电泳检测结果EGS-C6的线性转录模板体外转录后，得到实际长度均为50nt的转录产物，8％PAGE(7M Urea)分离，如图7所示，电泳结果显示条带清晰，EGS RNA成分纯净，可以用于引导体外切割实验。
(六)EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割实验1、RNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割P28、42-44将保存于乙醇中的底物转录产物、M1 RNA核酶转录产物及相应的EGS转录产物以1∶2∶5的比例(220μl∶440μl∶1100μl)取样，其中底物与相应EGS以1∶5比例(220μl∶1100μl)在一管中混合，M1 RNA单独作为一管(440μl)。同时取220μl底物转录产物的乙醇保存液为单独一管作对照用。使用前，取出适量，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清。每管加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心25min，小心吸走上清，晾干后使用。每管均用8μl DEPC处理的三蒸水溶解。其后按照表11反应体系进行操作表11
在进行上述酶切反应的同时，设置空白对照反应，空白对照反应体系如表12表12
反应完毕，加入等体积反应终止液(RNA加样缓冲液)终止反应(空白对照也加等体积反应终止液)。立即进行PAGE分离。
体外切割产物的理论预计EGS引导M1 RNA切割C底物产生的产物片段理论大小见下表13表13
体外切割产物电泳检测结果在标准体外切割条件下，将底物(α-32P-UTP标记)、核酶以及相应的RNA-based EGS按照1∶2∶5的摩尔比例混合反应1hr，经8％浓度的7M Urea聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、压屏、扫描，得到如图8所示的切割图片。
对底物C片段的体外切割结果(图8)显示，rEGS-C6能够成功引导M1RNA对底物C片段进行切割，生成一个特异性的产物，片段大小符合理论预计的5’产物大小，而3’产物由于片段过小没有显影出来(图8第3泳道)。
2、DNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割P29、44-47将保存于乙醇中的底物转录产物与M1 RNA核酶转录产物以1∶2的比例(220μl∶440μl)取样，各自一管，同时取220μl底物转录产物的乙醇保存液为单独一管作对照用。各自单独离心、洗涤、晾干，每管均用8μl DEPC处理的三蒸水溶解。DNA-based EGS按200pmol/μl稀释后待用。其后按照如下表14反应体系进行操作表14
在进行上述酶切反应的同时，设置空白对照反应，空白对照反应体系如下表15表15
反应完毕，加入等体积反应终止液(RNA加样缓冲液)终止反应(空白对照也加等体积反应终止液)。立即进行PAGE分离。
在标准体外切割条件下，底物(α-32P-UTP标记)、核酶按照1∶2的摩尔比例，加上200pmol相应的DNA-based EGS，三者混合反应1hr，经8％浓度的7MUrea聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、压屏、扫描，得到如图9所示的切割图片。
对底物C片段的体外切割结果(图9)显示，dEGS-C6能够成功引导M1RNA对底物C片段进行切割，生成一个特异性的产物，片段大小符合理论预计的5’产物大小，而3’产物由于片段过小没有显影出来(图9第3泳道)。
与RNase P核酶联用的外部引导基因及其应用序列表.TXTSEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>与RNase P核酶联用的外部引导基因C6及其应用<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>50<212>RNA<213>人工序列<400>1gcacucgugu gcggucuccg cgcgcagguu caaauccugc agcagcacca 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>2gcactcgtgt gcggtctccg cgcgcaggtt caaatcctgc agcagcacca 50<210>3<211>510<212>DNA<213>UL54基因的1367-1876序列<400>3acgccgccgc ctttccctcg gcttctcaca acaatccggc cagcacggcc gccaccaagg1426tgtatattgc gggttcggtg gttatcgaca tgtaccccgt atgcatggcc aagactaact1486cgcctaacta taagctcaac actatggccg agctttacct gcggcaacgc aaggatgacc1546tgtcctacaa ggacatcccg cgttgtttcg tggctaatgc cgagggccgc gcccaggtag1606gccgttactg tctgcaggac gccgtattgg tgcgcgatct gttcaacacc attaattttc1666actacgaggc cggggccatc gcgcggctgg ctaaaattcc gttgcggcgt gtcatctttg1726acggacagca gatccgtatc tacacctcgc tgctggacga gtgcgcctgc cgcgatttta1786tcctgcccaa ccactacagc aaaggtacga cggtgcccga aacgaatagc gttgccgtgt1846cacctaacgc cgctatcatc tctaccgccg 1876<210>4<211>17<212>DNA<213>UL54基因的1760-1776序列<400>4cctcgctgctagacgag17<210>5<211>
<212>DNA<213>4条短的DNA寡核苷酸序列<400>5a.5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGCACTCGTGTGCG-3’(35nt)b.5’-GTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(37nt)c.5’-AACCTGCGCGCGGAGACCGCACACGAGTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’(48nt)d.5’-AGCTTGGTGCTGCTGCAGGATTTG-3’(24nt)<210>6<211>377<212>DNA<213>pUC19-M1 RNA质粒DNA序列<400>6gaagctgacc agacagtcgc cgcttcgtcg tcgtcctctt cgggggagac gggcggaggg60
与RNase P核酶联用的外部引导基因及其应用序列表.TXTgaggaaagtc cgggctccat agggcagggt gccaggtaac gcctgggggg gaaacccacg120accagtgcaa cagagagcaa accgccgatg gcccgcgcaa gcgggatcag gtaagggtga180aagggtgcgg taagagcgca ccgcgcggct ggtaacagtc cgtggcacgg taaactccac240ccggagcaag gccaaatagg ggttcataag gtacggcccg tactgaaccc gggtaggctg300cttgagccag tgagcgattg ctggcctaga tgaatgactg tccacgacag aacccggctt360atcggtcagt ttcacct 37权利要求
1.与RNase P核酶联用的外部引导基因，其特征在于是以RNA为基础的外部引导序列，如SEQ ID NO1所示，或是以DNA为基础的外部引导序列，如SEQ ID NO2所示。
2.能转录出如SEQ ID NO1所示的外部引导序列的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于其上游含有T7启动子。
4.包含如SEQ ID NO2或权利要求2或权利要求3所示的DNA序列的重组表达载体。
5.用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
6.权利要求1所述的外部引导基因在制备抗HCMV病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了与RNase P核酶联用的外部引导基因及其应用。本发明所述的与RNase P核酶联用的外部引导序列，是以RNA为基础的外部引导序列，具有SEQ ID NO1所列的序列，还包括以DNA为基础的外部引导序列，具有SEQ IDNO2所列的序列，均具有引导RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的特异引导切割活性，其靶位点在UL54基因的1760－1776。本发明所述的EGS是一种用于研究开发治疗HCMV感染疾病及相关并发症的极有应用前景和临床实用价值的基因药物，在基础研究和临床治疗等领域已呈现出广阔的应用前景。
文档编号A61P31/12GK1807619SQ200610032790
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月11日 优先权日2006年1月11日
发明者周天鸿, 李月琴, 吕静竹, 李弘剑 申请人:暨南大学