专利名称：：复合脂质体在制备治疗脑缺血药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从动物脑组织中提取的复合脂质体的新用途。
背景技术：
：所说的复合脂质体，指的是从动物脑组织中提取的复合脂质体。目前脑卒中(中风)己成为全世界人口死亡的三大原因之一。根据资料显示，1998年全球脑血管死亡人数达510万，美国每年新增中风人数达5075万，其中16万人死亡，英国每年新增发病人数10~17万，全球每年用于中风一线治疗的费用高达IO亿美元。在我国据保守统计，中风患者有一千五百万到二千万人，且每年新增中风患者120~150万，死亡80100万人，残废率达75%，五年内复发率达41%，脑血管病己成为我国主要的病死原因之一，其发病率、死亡率和致残率均很高，在我国，脑血管病是继恶性肿瘤后的第二位死因。目前，国内外治疗急性缺血性脑卒中药物可分为两大类，即改善脑血流量药物和脑神经保护药。脑缺血是一种以微循环血流量下降和葡萄糖/能量代谢障碍为特征的神经系统疾病。它在我国的发病率高，是致残、致死的重要原因之一。随着老年社会的到来，脑血管病的发病率将继续攀升，构成一个严重的社会问题。缺血性脑病是一类高死亡率和高致残率的常见病，根据世界卫生组织的一项调査，其死亡率占57个国家死亡总人数的11.3%，仅次于癌症和心肌梗塞，在我国其死亡率占第一位或第二位，严重危害人类健康，对国民经济发展同样构成威胁。脑血管意外的患者约有1/3在发病后不久死亡，幸存者则由于偏瘫、失语等后遗症而致残，丧失工作能力甚至生活自理能力。市场上常用的药物以中药为主，如医药市场上销售的络宁氯化钠注射液、二维三七桂利嗪胶囊和瘫复康胶囊等。但是，由于种种原因，其治疗效果都不尽人意，因此，临床治疗需要提供一种更为有效安全的药物。中国专利，专利号CN93112578.2和CN95111569.3公开了一种从动物脑组织中提取复合脂质体的方法，提供了,一个改善中老年记忆的保健营养产品，能否进一歩拓展该方法提取的复合脂质体的新用途，并将其用于治疗脑缺血，是人们所十分关注的课题。
发明内容本发明需要解决的技术问题是公开一种复合脂质体在制备治疗脑缺血药物中的应用。发明人通过大量的试验发现，从动物脑组织中提取的复合脂质体，对于治疗脑缺血，具有十分显著的效果，能够用于制备治疗脑缺血的药物。所说的动物脑最好是哺乳动物的脑。所说的复合脂质体，是采用中国专利，专利号CN93112578.2和CN95111569.3公开的方法进行制备的。所说的复合脂质体，可以以组合物的形式，通过口服的施加于需要进行脑缺血治疗的患者，所说的组合物包括所说的复合脂质体和医药学上可接受的载体，如稀释剂水、甜味剂蔗糖、防腐剂、抗氧化剂等，一般剂量为200400mg/人天，具体可根据患者的病情、年龄等情况由医师决定。试验证明，从动物脑组织中提取复合脂质体，对于脑缺血的治疗，效果十分显著，同时毒性较小，即使大量服用，也不会引起副作用，因此为拓展从动物脑组织中提取的复合脂质体的医药用途，开拓了一个新的领域，也为脑缺血的临床治疗，提供了一个新的治疗方法。具体实施例方式实施例1复合脂质体的提取-将新鲜或冷冻的猪脑1Kg，除去杂物，漂去血污后沥干，加入体积浓度为75%的食用酒精3Kg，在转速1500转/分和室温下，捣碎机捣碎3分钟，再加入3Kg石油醚，搅拌2小时，过滤，滤液用7Kg石油醚提取，有机相经减压浓縮和/或冷冻干燥分别得到复合脂质体浓縮液或粉末的精制品。实施例2口服液实施例1提取的复合脂质体浓縮液1重量份，水3重量份，苯甲酸为总重量的0.3%0。将上述组分混合，即获得口服液。实施例3以下将通过药效试验，对本发明的实质内容做进一步的陈述。试验药物实施例1提取的复合脂质体浓缩液。1、复合脂质体抗大鼠脑缺血的最低有效剂量及半数有效量(ED50)的研究为确定口服复合脂质体后对大鼠脑缺血保护作用的最低有效剂量及ED50，利用线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型，采用剂量3.46，5.38，8.33，12.82和19.87mg/kg的复合脂质体经口灌胃，于脑缺血24h后先行Longa神经功能评分，然后取缺血侧脑组织切成5片用2。/。TTC溶液染色，计算脑梗塞面积、梗塞面积百分比和梗塞重量、梗塞重量百分比。以降低动物神经功能评分、降低梗塞重量百分比和梗塞面积百分比为评价依据，结果表明复合脂质体对线栓法所致大鼠局灶性脑梗塞的最低有效剂量范围在8.3312.82mg/kg之间。以降低脑梗塞重量19.5%为评价依据，结果表明复合脂质体对线栓法所致大鼠局灶性脑梗塞的ED50为8.90mg/kg。具体见表l，表2和表3。表1Longa神经功能评分标准<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2不同剂量复合脂质体对线栓法所致大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注*P<0.05，**P<0.01与模型对照组比较。表3复合脂质体降低大鼠脑梗塞重量的ED50<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注组间比较为1:0.652、复合脂质体对线栓法所致大鼠局灶性脑梗塞的保护作用采用线栓法所致大鼠局灶性脑梗塞为动物模型，观察口服复合脂质体对大鼠局灶性脑梗塞的保护作用。结果发现，口服剂量为12.8mg/kg、38.4mg/kg和128mg/kg的复合脂质体后可降低大鼠脑梗塞重量和脑梗塞面积，也可降低脑梗塞重量百分比和脑梗塞面积百分比，还可降低脑梗塞的神经功能评分。低剂量组动物的脑含水量低于模型对照组，不同剂量复合脂质体口服后，还可提高脑组织匀浆液中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低丙二醛(MDA)及乳酸含量，尤以38.4mg/kg组效果最为明显；病理组织学检查亦显示可减轻脑梗塞的病变程度。表明复合脂质体对大鼠局灶性脑梗塞具有一定的保护作用。具体见表4，表5，表6和表7。表4复合脂质体对线栓法所致大鼠脑梗塞后神经功能评分、脑梗塞重量百分比、面积百分比的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。表5复合脂质体对线栓法所致大鼠脑梗塞后脑指数及脑含水量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。表6复合脂质体对线栓法所致大鼠脑梗塞后脑均浆液SOD、MDA及乳酸含量的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组比较。表7复合脂质体对脑缺血大鼠水迷宫平均逃避潜伏期的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注**P<0.01，与模型对照组比较。3、大鼠脑缺血后不同时间给予复合脂质体对脑梗塞的治疗作用为研究于脑缺血后不同时间口服复合脂质体对脑梗塞的治疗作用，利用线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型，分别于脑缺血后l，3，6，12，24h经口灌胃剂量为38.4mg/kg的复合脂质体，其中脑缺血l，3，6，12h后给予复合脂质体组大鼠于脑缺血24h后进行Longa神经功能评分，然后取缺血脑组织切成5片用2。/。TTC溶液染色，计算脑梗塞面积百分比和梗塞重量百分比；脑缺血24h后给予复合脂质体组大鼠于脑缺血48h后进行Longa神经功能评分，并测定脑梗塞面积百分比和梗塞重量百分比。结果表明，分别于脑缺血后l，3，6，12，24h给予复合脂质体均可降低由线栓法所致的大鼠脑梗塞面积百分比、脑梗塞重量百分比，并均降低大鼠脑梗塞后的神经功能评分。显示其在脑梗塞发生后仍有一定的保护作用。具体见表8，表9，表10，表ll，表12，表13。表8:Longa神经功能评分标准<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表9脑缺血lh后给予复合脂质体治疗对大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*P<0.05，与模型对照组比较。表10脑缺血3h后给予复合脂质体治疗对大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*P<0.05，与模型对照组比较表11脑缺血6h后给予复合脂质体治疗对大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*P<0.05，与模型对照组比较。表12脑缺血12h后给予复合脂质体治疗对大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*P<0.05,与模型对照组比较。表13脑缺血24h后给予复合脂质体治疗对大鼠脑梗塞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*P<0.05，与模型对照组比较。4、复合脂质体对不同因素所致大鼠胎鼠皮层神经细胞损伤的影响观察复合脂质体对撤血清和N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)致胎鼠大脑皮层神经细胞损伤的保护作用。采用原代培养胎鼠大脑皮层神经细胞，以撤血清和NMDA造成损伤模型，检测超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活性，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和乳酸(lacticacid，LA)含量，光镜下观察神经细胞形态变化并检测神经细胞活性以及细胞死亡率。结果显示复合脂质体可明显抑制撤血清及NMDA所致神经细胞MDA、乳酸含量的升高以及SOD活性降低，并减少细胞死亡率，提高神经细胞的活性，光镜下观察复合脂质体可抑制神经细胞因撤血清及NMDA而引起的突起断裂、细胞数目的减少，测其IC50分别为0.277和0.787mg/ml。但高浓度复合脂质体的作用有所减弱。结果表明复合脂质体可保护撤血清及NMDA诱导的胎鼠大脑皮层神经细胞损伤，但高浓度复合脂质体显示出毒性和保护双重作用。具体见表14~19。表14复合脂质体对撤血清诱导的神经细胞MTT实验OD值的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注(1)*P<0.05,**P<0.01，与撤血清模型组比较；(2)##P<0.01，与正常对照组比较表15复合脂质体对撤血清诱导的神经细胞死亡率的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注(1)*P<0.05，**P<0.01，与撤血清模型组比较；(2)##P<0.01,与正常对照组比较表16复合脂质体对撤血清诱导的神经细胞MDA、SOD和乳酸改变的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注(1)*P<0.05,**P<0.01，与撤血清模型组比较；(2)##P<0.01，与正常对照组比较表17复合脂质体对NMDA诱导的神经细胞MTT实验OD值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注(1)**P<0.01，与NMDA模型组比较；(2)##P<0.01，与正常对照培养比较表18复合脂质体对NMDA诱导的神经细胞死亡率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注(1)*P<0.05，**P<0.01，与NMDA模型组比较；(2)##P<0.01，与正常对照组比较表19复合脂质体对NMDA诱导的神经细胞MDA、SOD和乳酸改变的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注(1)**P<0.01与NMDA模型组比较；(2)##P<0.01,与正常对照培养比较5、复合脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤的研究为了研究复合脂质体对脑缺血的保护作用，本研究采用小鼠脑缺血再灌注模型，观察了形态学、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性及MDA含量等指标，结果显示，不同剂量(1.8mg/10g、5.4mg/10g、18mg/10g)的复合脂质体可以显著降低小鼠脑缺血后的脑梗死范围百分比；延长小鼠快速断头张口喘气时间，提高小鼠的存活时间；研究结果还表明不同剂量的复合脂质体(1.8mg/10g、5.4mg/10g、18mg/10g)可提高脑组织SOD、GSH-PX及CAT活性，降低MDA含量；实验结果表明复合脂质体对小鼠急性脑缺血及缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。具体见表20~24。表20复合脂质体对小鼠脑梗死范围百分比的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组比较。表21复合脂质体对缺血再灌小鼠脑SOD活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注(1)*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组比较。表22复合脂质体对缺血再灌小鼠脑MDA含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组比较。表23复合脂质"s对缺血再灌小鼠脑GSH-PX,CAT活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注:(1)*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组比较。表24复合脂质体对断头小鼠喘气持续时间的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注**P<0.01，与模型对照组比较。权利要求1.复合脂质体在制备治疗脑缺血药物中的应用，所说的复合脂质体是从动物脑组织中提取的。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所说的复合脂质体是采用如下的方法提取的采用动物脑为原料，经粉碎、溶剂提取、过滤，滤液经第二次溶剂提取，提取液经浓縮后可获得复合脂质体的精制品。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所说的治疗脑缺血药物包括所说的复合脂质体和医药学上可接受的载体。全文摘要本发明公开了复合脂质体在制备治疗脑缺血药物中的应用。试验证明，从动物脑组织中提取复合脂质体，对于脑缺血的治疗，效果十分显著，同时毒性较小，即使大量服用，也不会引起副作用，因此为拓展从动物脑组织中提取的复合脂质体的医药用途，开拓了一个新的领域，也为脑缺血的临床治疗，提供了一个新的治疗方法。文档编号A61K35/30GK101199549SQ20061011958公开日2008年6月18日申请日期2006年12月13日优先权日2006年12月13日发明者吴同新,杜士明,辰杨,翔高申请人:上海脑力键生物医学有限公司