人神经营养素-3受体基因重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用的制作方法

专利名称：：人神经营养素-3受体基因重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用的制作方法人神经营养素-3受体基因重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用[
技术领域：
]本发明涉及一种重组腺病毒表达载体的生物活性作用，尤其是一种用人神经营养素-3受体基因(人TrkC基因)重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用。神经营养因子是能够支持机体神经元存活，促进其生长、分化,及维持其功能的一类化学因子。神经神经营养因子对其耙细胞起细胞学作用之前，首先要与靶细胞上的受体结合。目前已知神经营养因子有两种受体酪氨酸蛋白激酶受体(高亲和力受体)和p75受体(低亲和力受体)。酪氨酸蛋白激酶受体是由原癌基因Trk编码的一种受体，因此，也称为Trk受体。Trk受体又可分为TrkA、TrkB和TrkC3种。神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)和神经营养素-4/5(NT-4/5)等，它们分别与不同的神经营养因子受体结合。神经生长因子与TrkA结合可引起细胞学反应包括增强靶细胞的存活和生长。脑源性神经营养因子、神经营养素-4/5和神经营养素-3均能结合和激活TrkB，但祌经营养素-3的作用较弱。神经营养素-3主要结合和激活TrkC。所以，Trk受体(Ti"kA、TrkB和TrkC)是神经营养因子的功能性受体。Trk受体与神经营养因子结合后形成二聚体并被初歩激活，使其"活化圈"内的酪氨酸被磷酸化，继而整个Trk被激活，引起"活化圈"外的酪氨酸自动磷酸化并与信号传导分子连接，使信号传导分子活化，信号被传播。在没有神经营养因子的情况下，高密度表达的Trk还可通过Trk-Trk间的相互作用，引发Trk非神经营养因子依赖性的磷酸化，并激活其后的信号传导，这是Trk受体具有神经营养作用的原因之一。应用神经营养因子治疗中枢神经损伤是目前研究的热点之一，在促进脊髓损伤修复方面，所使用的多是神经营养素-3、神经生长因子和脑源性神经营养因子。现已证明，神经生长因子主要作用于感觉神经元，对运动神经元作用不明显，而脑源性神经营养因子作用的神经元类型范围较窄小。许多研究认为，神经营养素-3对神经元的发育和分化及对损伤的中枢神经元存活及其轴突再生有重要作用。还有研究证实，神经营养素-3对脊髓损伤处皮质脊髓束神经纤维的再生有明显的促进作用。已知神经营养素-3可以特异结合和激活其分布在神经元细胞膜上的神经营养素-3受体-一TrkC，发挥其生物效应作用。有研究结果表明，神经营养素-3对神经干细胞的分化也有作用。Takahashi等(1999年)和Castellanos等(2002年)研究发现，神经营养因子能使带有TrkC的神经干细胞更多地分化为神经元。因此，我们设计将人TrkC基因转染到神经干细胞后移植到脊髓损伤处,让神经干细胞带有神经营养素-3受体；同时一起移植神经营养素-3基因修饰的雪旺细胞,让转基因雪旺细胞过表达神经营养素-3，更好地促进带有神经营养素-3受体的神经干细胞分化为神经元,生长出轴突,在脊髓损伤处形成神经元网络,起上、下行传导神经通路桥梁作用,修复受损伤脊髓的自主运动功能。我们认为这种治疗策略,可能会更有效地促进受损伤脊髓结构和功能的修复，为临床治疗脊髓创伤性疾病乃至大脑创伤性疾病提供新方法。关于TrkC的构建，可参阅专利申请号为200510033569.9的中国专利申请文件。目前,在国内、外尚未见有文献资料报道人神经营养素-3受体基因(人TrkC基因)重组腺病毒表达载体的的生物活性作用及其在神经损伤修复中的应用。本发明的目的是想克服现有临床治疗中枢神经创伤性疾病的方法上的不足，应用我们自行构建的人TrkC基因重组的腺病毒表达载体治疗中枢神经创伤性疾病,为将来临床应用人TrkC基因重组的腺病毒表达载体促进受损伤的中枢神经结构和功能修复提供实验依据和指导。本发明的基本方案包括1.神经干细胞的培养、纯化及鉴定2.Ad-TrkC感染神经干细胞百分率的测定3.ELISA测定Ad-NT-3转染雪旺细胞后分泌上清中NT-3含量4.Ad-NT-3转染雪旺细胞和Ad-TrkC转染神经干细胞体外联合培养对神经干细胞体外分化影响的实验5.大鼠全横断脊髓损伤模型的建立6.大鼠全横断脊髓损伤后的细胞移植7.行为学检测8.电生理检测9.脊髓损伤处的组织学检测10.脊髓损伤处的电镜标本检测所述的神经营养素-3受体在与神经营养素-3特异性结合后，能促进神经元的发育和分化以及受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生;也能促进神经干细胞分化为神经元。神经干细胞是指神经系统中相对未分化的、具有增殖和分化潜能的细胞。在一定条件下,它可以向神经元和神经胶质细胞分化。它可从发育中甚至成年的中枢神经内能分离出来。本发明选择一种人TrkC基因重组腺病毒表达载体来促进受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生，以及促进神经干细胞更多地分化为神经元，替换受损伤的神经元或死亡的神经元。对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓创伤等进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。本研究集中力量进行系统的工作,在分子和细胞水平上加强对中枢神经创伤后的细胞治疗和细胞替换等方面的研究。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展，都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器实验细胞、病毒载体、实验动物和试剂作详尽的描述1.主要仪器超净工作台(上海整新电子设备厂)、普通离心机(日本久保田制作所)、恒温水浴箱(北京医疗设备厂)、低温高速离心机(美国Eppendorf公司)、5%。02培养箱(美国Queue公司)、倒置荧光显微镜(德国Leica公司)、酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)、显微手术显微镜(镇江光学仪器厂)、立体定位仪(江湾仪器厂)、Biolap-410智能型生物信号显示和处理仪(成都泰盟科技有限公司)、恒冷箱切片机(英国Shandon)、荧光显微镜(德国Leica)和动物爬网格支架(自制)。2.实验细胞、病毒载体和实验动物雪旺细胞(自行分离培养获取)、神经干细胞(自行分离培养获取)、Ad-NT-3(中山大学肿瘤防治中心黄文林实验室或美国Invitrogen公司提供NT-3)、Ad-TrkC(发明专利申请号200510033569.9)、Ad-LacZ(本元正阳基因技术股份有限公司)、293细胞(CRL-1573,ATCC)和成年雌性SD大鼠(由中山大学实验动物中心提供)。3.主要试剂兔抗大鼠NT-3多克隆抗体(北京中山)、兔抗大鼠S-100单克隆抗体(博士德公司)、小鼠nestin单克隆抗体(Sigma公司)、小鼠MAP2单克隆抗体(Sigma公司)、兔GFAP多克隆抗体(博士德公司)、小鼠PSD95单克隆抗体(Sigma公司)、小鼠Synapsin单克隆抗体(Sigma公司)、生物素化羊抗兔IgG(博士德公司)、生物素化羊抗小鼠IgG(博士德公司)、SABC-Cy3免疫组织化学试剂盒(博士德公司)、人NT-3ELISA试剂盒(博士德公司)、Ad-GFP(本元正阳基因技术股份有限公司)、荧光金(Fluorochrome，LLC)、小鼠抗大鼠NF单克隆抗体(博士德公司)、兔抗大鼠ChAT多克隆抗体(Chemicon公司)、兔抗大鼠5-HT多克隆抗体(Sigma)、兔抗大鼠GAP-43多克隆抗体(博士德公司)、小鼠抗大鼠CSPGs单克隆抗体(美国Irwitrogen公司)、兔抗大鼠laminin多克隆抗体(博士德公司)、羊抗兔MBP多克隆抗体(SantaCruz公司)、兔抗大鼠fibronectin多克隆抗体(中杉金桥)、小鼠抗人TrkC单克隆抗体(R&D公司)和bFGF、B27、RPMI1640和DMEM/F12(Gibico公司)。本发明详细的具体操作技术说明如下1.克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定取RT-PCR反应液，0.8%琼脂糖凝胶电泳后，用QLAquik(R)GelExtractionKit试剂盒，割胶纯化目的基因片断。分别用Xbal和Kpnl双酶切目的基因及载体pShuttle用GelExtractionKit试剂盒切胶，按DNALigationKitVer.2试剂盒说明配制连接反应体系，16'C温育过夜。连接纯化TrkC基因和线性化的pShuttle，产物按常规方法转化DH5a菌惑受态，将转化菌涂布于含20mg/ml卡那霉素的LB琼糖平板，37'C培养过夜。挑取存活的菌落，扩增并提取质粒，PCR鉴定及Xbal和Kpnl双酶切鉴定后，再测序鉴定质粒中目的基因的序列。2.神经干细胞的培养、纯化及鉴定选用新生ld2d的大鼠，消毒后在无菌条件下断头取脑，在D-Hank，s液中分离出海马，剪碎置入离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，加入0.25%胰蛋白酶消化10min(37。C)，用FBS终止消化，离心弃上清。加入D-Hank's液吹打成细胞悬液，用200目滤器过滤，离心弃上清。加入DMEM/F12(含20ng/mlbFGF，20pl/mlB27)无血清培养液，细胞计数后制成lxl(yVml单细胞悬液移入培养瓶，于37'C、5%<:02培养箱中进行悬浮培养。每2d进行半量更换培养液，每次换液的同时更换培养瓶。7d9d后将细胞克隆球机械分离并进行传代，第2代培养7d8d后，取少量细胞克隆球进行nestinSABC-Cy3法免疫荧光细胞化学鉴定。3.腺病毒感染神经千细胞和雪旺细胞百分率的测定用MOI为10、20、50、80、100和200的Ad-GFP(含报告基因的腺病毒)在无血清培养液中感染神经干细胞和雪旺细胞3h，弃病毒残液，加入正常培养液继续培养24h，然后用荧光显微镜观察细胞被感染的情况，再用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，流式细胞仪测定发绿色荧光细胞的百分比(感染率)，确定一个感染率较高的病毒剂量。4.ELISA测定Ad-NT-3感染雪旺细胞(NT-3-SCs)后分泌上清中NT-3含量按上述测定的雪旺细胞的腺病毒感染率，将原代培养的第二代雪旺细胞(5xl0S个/孔)接种于6孔板，24h贴壁后加Ad-NT-3病毒液(10MOI)，3h后换液，用D-hank，s液清洗3次，换成含10%FBS的DMEM/F12培养液lml/孔继续培养48h，收集培养上清。同时设立2组对照Ad-LacZ感染雪旺细胞和没有病毒感染的雪旺细胞。每组3个孔。收集的上清用酶联免疫吸附测定方法(enzyme-linkedimmunosorbertassay，ELISA)检测人NT-3蛋白的表达量。各组浓度应用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA)。5.Ad-NT-3感染雪旺细胞(NT-3-SCs)和Ad-TrkC感染神经干细胞(TrkC-NSCs)体外联合培养对神经干细胞体外分化影响的实验(l)试验分组①NT-3-SCs+TrkC-NSCs组②NT-3-SCs+NSCs组③SCs+NSCs组NSCs组⑤LacZ-SCs+LacZ-NSCs组⑥TrkC-NSCs组(2)基因修饰细胞应用上述体外培养的第2代SCs和NSCs，根据测定的感染率，用MOI为10的Ad-NT-3和Ad-LacZ感染SCs，简称NT-3-SCs和LacZ-SCs;同时用MOI为80的Ad-TrkC和Ad-LacZ感染NSCs，简称TrkC-NSCs和LacZ-NSCs。感染3h，弃去病毒悬液，D-hank's液洗3遍。(3)体外共培养0.25%胰酶消化细胞成4><104单细胞悬液，置于96孔板(多聚赖氨酸铺板)内培养，培养液为含10%FBS的DMEM/F12。实验分6组，每组每种染色4个孔，5种染色共120个孔。NT-3-SCs+TrkC-NSCs组每孔加NT-3-SCs和TrkC-NSCs细胞悬液各50^1;NT-3-SCs+NSCs组每孔加NT-3-SCs和不转基因的NSCs各50^1;SCs+NSCs组加不转基因的SCs禾卩NSCs各50pl;NSCs组只加NSCs50jxl;LacZ-SCs+LacZ-NSCs组加LacZ-SCs和LacZ-NSCs各50^1;TrkC-NSCs组只加TrkC-NSCs50nl。37°C、5%C02条件下共培养4d。(4)免疫荧光细胞化学染色培养4d后用2.5%多聚甲醛固定，做MAP2(神经元标记物)、GFAP(星形胶质细胞标记物)、nestin(神经干细胞标记物)、Synapsin(突触前膜标记物)及PSD95(突触后膜标记物)的SABC-Cy3免疫荧光细胞化学染色。(5)细胞计数100倍荧光显微镜下用目镜测试网格计数NSCs(绿色)和Cy3免疫标记的阳性细胞(红色)以及双标记细胞(黄色)。每孔随机取3个视野，每组共12个视野。计算NSCs分化为不同类型细胞数占总细胞数的百分率，应用SPSS11.0统计软件作/检验。6.大鼠全横断脊髓损伤模型的建立成年雌性SD大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(25-35mg/kg)进行麻醉，经固定体位、备皮消毒后，在无菌条件下切开皮肤、浅筋膜，用器械沿TVTu)两侧棘突顺腰棘肌群走向钝性分离肌肉和韧带，用自制拉钩固定手术区域，清晰暴露丁9棘突和椎弓，有齿镊轻提T9棘突，用眼科持针钳沿T9-Tu)椎弓间隙轻轻咬开椎弓根部，并逐渐咬下T9椎弓，暴露Th)段脊髓，用尖刃手术刀快速全横断脊髓，为保证完全切断脊髓，用同一手法转换刀刃方向重复切。充分止血后，在脊髓切断处填入约2x2x2mm的医用明胶海绵作为填充支架。明胶海绵填充、细胞移植后，依肌层、皮下组织、皮肤顺序逐层缝合。术后每只动物肌肉注射青霉素16万单位lml/d，硫酸庆大霉素25万单位0.5ml/d，皮下注射生理盐水5ml/d，连续3d，人工排尿，每日2-4次。术后各组实验动物均饲养和观察至67d。7.大鼠全横断脊髓损伤后的细胞移植细胞的处理选用P2代生长状态良好的NSCs和SCs进行移植。基因修饰的细胞事先用重组腺病毒(Ad-NT-3、Ad-TrkC、Ad-LacZ)感染3h，感染滴度分别为NSCs为80MOI;SCs为10MOI。感染后用D-Hank's液选三遍，换成培养液继续培养24h后移植。移植前用核荧光Hoechst33342(10吗/ml)标记NSCs2h，之后D-Hank，s液洗三遍，0.25%胰酶消化，经细胞计数后制备成lxi()S个细胞4il的细胞悬液备用。移植方法用微量注射器吸取lOpl已制备好的细胞悬液，将其注入医用明胶海绵内，并将吸附有细胞悬液的医用明胶海绵轻轻的植入全横断脊髓损伤处，细胞总量1X106个。各组吸附细胞悬液情况如下①NT-3-SCs+TrkC-NSCs组NT-3基因修饰雪旺细胞与TrkC基因修饰神经干细胞悬液各5nl;②NT-3-SCs+NSCs组NT-3基因修饰雪旺细胞与神经干细胞悬液各5|il;③LacZ-SCs+LacZ-NSCs组LacZ基因修饰雪旺细胞与LacZ基因修饰神经干细胞悬液④NSCS组单纯神经干细胞悬液10(11;◎Control组(实验对照组)无血清的DMEM/F12培养液l(Hil。8.行为学检测各组实验动物在术后58-59d进行行为学检测，检测方法分为BBB评分和爬网格测验。BBB评分是参照Basso等[218]提出的脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复的判断标准。评分时将大鼠置于开阔平地，任其爬行，5min内-观察后肢的运动情况。主要观察的内容包括双后肢或单后肢三个关节(髋关节、膝关节和踝关节)运动频率和运动范围；运动的姿势如何；后肢能否偶尔或持续完成支撑身体的动作以及能否具有偶尔或持续的前后肢协调运动等。爬网格测试是参照Ramon-Cueto等Pw]的方法制作大鼠爬网格支架，将大鼠放在45°斜坡的网格上，在5min内观察其爬网格时后肢运动情况，主要包括动物在单位时间内攀越障碍的整体运动能力及前、后肢有无出现协调运动的现象。9.电生理检测各组实验动物均在饲养至67d进行电生理检测。氯胺酮(1.2mg/kg)和1%戊巴比妥钠(25mg/kg)联合腹腔注射麻醉，以脑立体定位仪固定鼠头，剪毛、顶正中切开皮肤1cm,分离软组织，以纱布擦去骨膜，充分暴露颅骨,显露骨缝。在矢状缝左侧冠状缝后缘,牙科钻钻开颅骨,针头挑起脑膜，用虹膜剪剪去,滴]]卩38。C液体石蜡保护皮质。千右侧股骨外侧剪开皮肤，钝性分离肌肉,游离出坐骨神经,安置双极钩状刺激电极于坐骨神经上,两电极间距1cm。将刺激电极与微机系统的刺激输出端相连；银球引导电极置于前述暴露的大脑体感运动区皮层(坐标为A:24mm，L:23mm)，与信号输入端相连，参考电极置于皮肤切口处。机器及动物接地。打开BL—410生物机能实验系统，进入"实验项目一中枢神经实验一大脑皮层诱发电位"模块。刺激皮质体感诱发电位(corticalsomatosensoryevokedpotential,CSEP)产生，并给予记录。参数设定增益2000，时间常数0.01s，滤波300Hz，延时50ms，电压lmV,波宽O.lrns。输出单脉冲刺激，可见同侧肢体抖动。每只动物每一项测试均分别收集10个的稳定波型，取其均值。然后更换电极连接，即坐骨神经上的电极接记录端口，而大脑皮质上的电极接剌激电源，剌激和记录皮质运动诱发电位(corticalmotorevokedpotential,CMEP)。参数设定增益2000，时间常数0.01s，滤波300Hz，延时50ms，电压3mV，波宽O.lms。记录完一侧的诱发电位后，按同样方法检测另一侧坐骨神经与体感运动区皮质之间的CSEP和CMEP。根据实验记录测算6组所有实验动物的CSEP和CMEP的峰峰值(amplitude),进行统计学分析。10.脊髓损伤处的组织学检测(,染色-选取各组脊髓T8T!2节段纵切片作HE(苏木素一伊红)染色，具体步骤如下①0.01moI/LPBS中漂洗5min，苏木素染液染色15min。②去离子水洗10s，盐酸酒精分色30s。③自来水冲洗30min。④伊红染液染色5min。去离子水洗10s,梯度酒精脱水70%、80%、95%、100%、100%酒精中各3s。⑥二甲苯透明5minx2。⑦中性树胶封片，普通光镜下观察。(2)Nissl染色对大脑、中脑和Ll脊髓横切片做Nissl染色(又称中性红染色)。①0.01mol/LPBS中漂洗5min，iyo中性红染液(100ml中性红染液含中性红lg,0.2mol/LpH4.8醋酸缓冲液2ml，双蒸水98ml)染色10min。②去离子水漂洗10s。③梯度酒精脱水70%、80%、95%、100%、100%酒精中各10s。二甲苯透明5minx2。.⑤中性树胶封片，普通光镜下观察。(3)X-gal酶组织化学染色选取LacZ-SCs+LacZ-NSCs组的脊髓T8T12节段纵切片进行X-gal酶组织化学染色。具体步骤如下①0.01mol/LPBS洗5minx3。②X-gal染色液(X-gal2mg用40^1DMSO溶解后加0.05mol/LK3Fe(CN)660pl，0.05mol/LK4Fe(CN)660nl，0.1mol/LMgCl22(HU,0.01mol/LPBS820^1)37。C孵育4h。③0.01mol/:LPBS洗5minx3。HE染色。⑤梯度酒精脱水70%，80%，95%，100%和100%酒精中各lmin。⑥二甲苯透明5minx2⑦中性树胶封片，普通光镜下观察。(4)SABC-Cy3免疫荧光组织化学染色将各组大鼠TsTu节段脊髓纵切片分别做nestin、NF、MAP2、GFAP、NT-3、TrkC、PSD95、Synapsin、5-HT、ChAT、MBP、laminin禾QCSPGs的免疫荧光组织化学染色。染色步骤参考SABC-cy3免疫组化试剂盒的操作说明进行。①0.01mol/LPBS洗5minx3。②l:10正常血清封闭20min，甩去血清，不洗，加一抗，阴性对照加0.01moI/LPBS代替一抗，4'C过夜。③0.01mol/LPBS洗5minx3，加生物素化二抗，37'C孵育30min。0.01mol/LPBS洗5minx3，力BSABC-Cy3复合液，37。C避光孵育30min。⑤0.01mol/LPBS洗5minx3。⑥荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。(5)SABC免疫组织化学染色将各组大鼠TsTn节段脊髓纵切片分别做S-100和fibronectin的免疫组织化学染色。染色步骤参考SABC免疫组化试剂盒的操作说明进行。①0.01mol/LPBS洗5minx3。②l:10正常血清封闭20min，甩去血清，不洗，加一抗，阴性对照加0.01mol/LPBS代替一抗，4'C过夜。③0.01mol/LPBS洗5minx3，加生物素化二抗，37。C孵育30min。④0.01mol/LPBS洗5minx3，加SABC复合液，37。C孵育30min。⑤0.01mol/LPBS洗5minx3，DAB显色510min。◎双蒸水洗，终止反应。⑦中性树胶封片，普通光镜下观察。(6)细胞计数①大脑体感运动区皮质内锥体层细胞计数中性红染色后的大脑冠状切片，于光镜下找到大脑体感运动区皮质内锥体细胞层，利用显微网格测试系统计数单位面积内锥体神经元密度。每张切片从大脑纵状裂每一侧的隔区界面开始，分别在两侧旁开lmm和2mm的内锥体细胞层区域选定两个网格的部位，将每侧两个方格范围内的含有清晰细胞核的神经元计算在内。每侧脑计数两个视野，一张脑片共计数4个视野，一只动物总计8张切片，共32个视野，计算其均值来代表每只动物大脑体感运动区皮质单位面积内锥体神经元密度。最后进行统计学分析。②中脑红核神经元计数中性红染色后的中脑红核切片，在光镜下找到红核区域，计数两侧红核神经元总数，计数时只将含有清晰细胞核的神经元胞体计算在内。用一只动物所有切片的红核神经元总数除以其总切片数，计算出每只大鼠平均每张切片的红核祌经元数目。最后进行统计学分析。③脊髓L,段背核神经元计数各组每只大鼠脊髓L,段共收集50张切片，中性红染色后在光镜下找到背核区域，计数所有切片中两侧背核内含有清晰细胞核的神经元数目，计算出每张切片中两侧背核存活神经元数目。最后进行统计学分析。_MAP2阳性细胞计数在荧光显微镜下观察被Hoechst33342核荧光标记的移植细胞与MAP2阳性细胞以及其中的双标记细胞情况。每只大鼠取5张切片，在x400的放大倍数下，每张切片在脊髓横断损伤处附近随机取4个视野，计数每只大鼠20个视野中Hoechst33342核荧光标记的移植细胞总数和MAP2阳性双标记细胞总数。计算MAP2阳性双标记细胞数占被Hoechst33342核荧光标记的移植细胞总数的比例，然后进行统计学分析。11.脊髓损伤处的电镜标本检测①动物灌注、取材经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，快速灌注0.9XNaC1200ml以冲去血液，再灌注冰预冷的电镜灌注液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛)400ml，速度先快后慢，时间大约为40min。灌注完后，迅速剥离取出T8-T,2脊髓组织置于灌注液中后固定4h，修块取损伤处2x3mm组织置于0.01mol/LPBS洗5minx3。②1%饿酸4°。避光固定lh。③0.01mol/LPBS洗5minx3。④梯度酒精脱水50%酒精15minxl;70X酒精15minxl;95%酒精15minx2;100%酒精，15minx3;100%丙酮15minx3。50%Epon812(100^Epon812+等量100%丙酮)包埋剂浸透过夜，注意防潮。⑥100^Epon812包埋剂浸透过夜，注意防潮。(配5ml100%Epon812:Epon8122.55ml，廳A1.85ml，DDSA0.6ml，DMP-300.1ml)⑦100XEpon81260。C聚合24h。半薄切片上选取有阳性特征物的部位进行组织包埋块修快，行超薄切片，醋酸铀和柠檬酸双重染色后，电镜下观察。实验结果显示1.克隆载体pShuttle-TrkC鉴定挑取菌落扩增，提取质粒后，用Xbal+Kpnl、Kpnl、Sacl和SalI酶切，琼脂糖凝胶电泳后观察结果。可见6.5kb、6.2kb、4.Okb、2500bp和320bp、的条带。测序结果表明插入的人TrkC基因序列与Genbank登录的cDNA序列只相差2个碱基，翻译后的氨基酸序列完全相同。测序结果如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>ACCCCAATCTACCTGGACATTCTTGGCTAGTGGT-3'2.神经千细胞和雪旺细胞的腺病毒感染率测定结果用荧光显微镜观察不同MOI感染的情况下绿色荧光蛋白在神经干细胞(NSCs)和雪旺细胞(SCs)的表达情况。在荧光显微镜下，绿色荧光蛋白的细胞显影呈绿色。流式细胞仪检测的结果显示绿色荧光细胞占全部细胞的百分比如下表l，随着MOI的逐渐增高，这两种细胞的感染率都逐渐增高。当MOI为80时，NSCs的感染率为78.5%;当MOI为10时，SCs的感染率为88.1%，说明Ad-GFP在NSCs和SCs中获得了高效表达。表l各种感染复数的雪旺细胞和神经干细胞的感染率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.Ad-NT-3感染雪旺细胞后NT-3的表达量根据ELISA的结果，浓度(pg/ml)与450nm下吸光值(OD值)的关系的标准曲线的趋势曲线的回归方程式为y=179.05X3-482.21X2+722.8X-21.987根据样品的吸光值算出对应的浓度，结果如下表(表2)。经统计分析，三组之间有显著性差别(F=703,385，PO.001);Ad-NT-3组分泌的NT-3最高，与其它两个组之间均有显著性差别(PO.05);而Ad-LacZ组和单纯SCs组之间无显著性差别(P>0.05)。表23种处理的雪旺细胞分泌的NT-3浓度(ng/L)的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注(Note):1VS3,2VS3，P〈0.05;1VS2，P>0.054.Ad-NT-3转染雪旺细胞和Ad-TrkC转染神经干细胞体外联合培养对神经干细胞体外分化的影响体外分化实验中，各组的神经干细胞加入到预先铺被多聚赖氨酸的培养孔，并改用还10%FBS的DMEM/F12培养液培养后，在lh内细胞基本上都开始贴壁生长并逐渐长出突起。4d后大量细胞从克隆球中迁移出来，突起很长呈分化状态。根据免疫荧光化学染色显示，6组的神经干细胞中均有部分细胞分化为MAP2、GFAP、nestin、PSD95和synapsin阳性细胞。经观察及计数发现(表3)，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的MAP2、PSD95和synapsin阳性细胞百分率明显高于其它各组，而GFAP、nestin阳性细胞百分率明显低于其它各组，且有统计学差异(P^0.05-;SCs+NSCs组和LacZ-SCs+LacZ陽NSCs组、NT-3-SCs+NSCs组和TrkC-NSCs组间无显著性差异(尸〉0.05)。表36组神经干细胞分化为nestin、MAP2、GFAP、PSD95andsynapsin阳性细胞百分率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注(Note):/test1VS2,1VS3，1VS4,1VS5,1VS6，2VS4，2VS5，2VS6,3VS4,3VS5，3VS6,4VS6，5VS6，P<0.05;2VS3，4VS5，P>0.055.BBB评分情况脊髓全横断手术前，所有大鼠都表现为正常的运动功能，BBB评分为21分。脊髓全横断手术后，双后肢随即完全瘫痪，在地面爬行时，其双后肢在身体后方拖行，足背着地，没有后肢各关节的运动，BBB评分为0分。经过60d的自主恢复，实验对照组大鼠在存活期内双后肢运动功能无明显变化，仅个别动物可出现1个或2个关节的轻微运动。各细胞移植组大鼠后肢运动功能都有不同程度的恢复NSCs组表现为l-2个关节的轻微运动或一个关节的广泛活动加上其它关节的轻微活动；LacZ-SCs+LacZ-NSCs组大鼠后肢可发生23个关节的轻微或广泛活动；NT-3-SCs+NSCs组大鼠在无负重的情况下脚掌可着地NT-3-SCs+TrkC-NSCs组有的大鼠可负重步行，但多数前一后肢不协调，偶见前一后肢协调。根据在连续5min空地爬行过程大鼠后肢运动情况，对各组大鼠后肢运动功能进行BBB评分的结果见表4，其中NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的BBB评分值最高，与其它各组比较，均有显著性差异(P<0.05)。表4各组脊髓全横断大鼠后肢运动功能BBB评分值(7±^)的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>单因素方差分析尸=20.20,尸O.001;aVSc，aVSd，aVSe,bVSc,bVSd,bVSe,cVSe,dVSe，尸O.05;aVSb,cVSd,/^>0.056.电生理CSEP和CMEP正常对照组大鼠的皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质体感诱发电位(CSEP)的主反应均是呈先正后负的PN型波，后放是一组弱电位变化，其中后放电位的波形不稳定。当脊髓全横断后立即测量诱发电位CSEP和C^P则所得波形均无明显的主反应，成近水平的规则波浪线。脊髓全横断经各种处理并存活67d后，各组大鼠均能检测到主反应，其中实验对照组的波形低钝，峰峰值减小。各细胞移植组的波形较明显，峰峰值有不同程度的恢复(表5)。经统计学分析，NSCs组和LacZ-SCs+LacZ-NSCs组、NT-3-SCs+NSCs组和NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的CSEP无显著性差异，其它各组之间均有显著性差异；CMEP的统计结果显示，各组之间均有显著性差异。表5正常大鼠和各组脊髓全横断大鼠皮质体感诱发电位和皮质运动诱发电位峰峰值(±^)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>单因素方差分析(one-wayANOVA)CSEP:尸=29.19，f<0.001;aVSb，aVSc，aVSd，aVSe,aVSf,bVSc'bVSd，bVSe,bVSf,cVSe，cVSf'dVSe,dVSf，尸<0.05;cVSd，eVSf,尸>0.05CMEP:F=92.21，尸〈0.001;aVSb,aVSc，aVSd，aVSe，aVSf,bVSc，bVSd，bVSe，bVSf，cVSd，cVSe,cVSf,dVSe，dVSf,eVSf,尸<0.05.7.移植的神经干细胞在宿主内的存活、迁移及分化脊髓T8Tu节段纵切片在荧光显微镜下观察，可见各细胞移植组的脊髓损伤处有大量被核荧光Hoechst33342丰示记的移植细胞。有些移植的细胞沿着白质向脊髓两端迁移较远，呈串珠样走行。免疫荧光组织化学染色结果显示，4个细胞移植组的脊髓横断处损伤区，在Hoechst33342阳性标记的神经干细胞中均发现有同时呈nestin、GFAP、MAP2、NF、PSD95、synapsin禾口GAP-43染色阳性的细胞，胞浆红染，有的呈单个圆形，有的聚集在一起，胞体相互连接呈网状。各细胞移植组nestin阳性细胞均较多，NSCs组最多，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组最少；GFAP阳性细胞胞桨红染，并从胞体周围伸出较长的突起，呈不规则形；各细胞移植组的MAP2阳性细胞较多，胞浆红染，胞体呈圆形或不规则形，有的胞体发出细长的突起并相互交织成网；NF阳性细胞呈圆形或椭圆形。PSD95、synapsin和GAP-43阳性细胞胞体呈圆形或椭圆形，有些GAP-43阳性细胞胞体发出较短的突起。经计数各细胞移植组中MAP2阳性双标记细胞占被Hoechst33342标记细胞的百分率见表6。统计学分析表明，4个细胞移植组脊髓横断处损伤区的MAP2阳性细胞百分率，NT-3-SCs十TrkC-NSCs组最高，NSCs组最低，4组之间两两相比均有统计学意义。表64个细胞移植组大鼠脊髓横断处MAP2阳性双标记细胞的百分率(％，3f±"组别MAP2阳性率(％)神经干细胞移植组LacZ基因转染雪旺细胞和神经干细胞移植组NT-3基因转染雪旺细胞和神经干细胞移植组1712.24±0.84a16.17±4.04b20.40±3.06cNT-3基因转染雪旺细胞和TrkC基因d转染神经干细胞移植组__单因素方差分析(one-wayANOVA)F=20.97,户<0.001;aVSb，aVSc,aVSd，bVSc，cVSd,尸<0.058.外源基因在大鼠脊髓内的表达细胞移植术后67天，经X-gal酶组织化学显示LacZ-SCs+LacZ-NSCs组的脊髓横断处及附近有大量P-半乳糖苷酶阳性细胞，这些细胞在脊髓TsT,2节段内均有分布。其中在远离横断处大部分阳性细胞分布在白质，而灰质内也可见阳性细胞。经NT-3和TrkC免疫组织化学显示NT-3-SCS+NSCs组和NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的脊髓横断处及其附近脊髓内有大量NT-3阳性细胞；NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的脊髓损伤区及附近有大量TrkC阳性细胞，并可向脊髓两端迁移，分布情况与(3-半乳糖苷酶阳性细胞相似。而且TrkC阳性细胞同时双标记有Hoechst33342。9.脊髓再生的下行传导束神经纤维检测在脊髓横断处下方相隔大约1个节段的部位进行荧光余逆行标记7天后，在荧光显微镜下可见正常组大脑体感运动区皮质内锥体细胞层及中脑红核内有大量神经元被荧光金标记。脊髓全横断后，未经治疗的实验对照组体感运动区皮质内锥体细胞层及中脑红核内未见被标记的细胞。而在各细胞移植组的内锥体细胞层和红核内均可见被标记的神经元，但其荧光强度比在正常组弱得多，细胞轮廓不清。此外，在NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的脊髓横断处头端可见有被荧光金标记的神经元胞体和神经纤维，荧光强度弱。经免疫荧光组织化学显示，在脊髓损伤后，未经治疗的实验对照组的5-HT及D卩H阳性神经纤维主要分布在脊髓横断处的头端，在脊髓横断处及尾端未见5-HT及DpH阳性神经纤维。而在各细胞移植组的脊髓横断处均可发现有5-HT阳性神经纤维，在横断处尾侧也可见5-HT阳性纤维。这些阳性纤维分布均较稀疏，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组比其它组增多。在NT-3-SCs十NSCs组和NT-3-SCs+TrkC-NSCs组脊髓横断处及尾端可见D(3H阳性纤维，其它细胞移植组未见。10.脊髓再生神经纤维及髓鞘的检测各细胞移植组脊髓横断处均可见MAP2、NF阳性纤维，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的阳性纤维略多于其它各组。此外，仅在NT-3-SCS+TrkC-NSCs组脊髓损伤区内还可见ChAT阳性纤维，但数量较少。在正常组大鼠脊髓的白质和灰质中均有大量的MBP阳性纤维，脊髓全横断损伤后，在各组脊髓横断处较少见到MBP阳性纤维，仅在NT-3-SCS+TrkC-NSCs组的横断处可见少量MBP阳性纤维；其它组均未见MBP表达。用免疫荧光组织化学检测GAP-43,结果发现实验对照组的脊髓横断处没有GAP-43表达，但在三个细胞移植组的脊髓横断处，均可看到少量分布排列不规则的GAP-43阳性神经纤维。11.脊髓横断处硫酸软骨素蛋白多糖和层粘蛋白的表达硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的表达在荧光显微镜下观察，可发现CSPGs的表达主要集中在脊髓横断处的胶质瘢痕区内、空洞的附近或周围。CSPGs在实验对照组和各细胞移植组中都有不同程度的表达。在实验对照组中，发现在脊髓横断处瘢痕组织CSPGs表达呈强阳性，且范围较大；经细胞移植后，CSPGs的表达有所减弱，尤其是在NT-3-SCs+TrkC-NSCs组中，CSPGs的表达最弱，范围最小。层粘蛋白(laminin)的表达在实验对照组lamiriin主要表达于脊髓横断处，呈不规则网带状，在脊髓横断处表达较弱，在各细胞移植组的脊髓横断处也有laminin表达，但其表达范围及表达量明显不同，尤其是在NT-3-SCs+TrkC-NSCs组中，laminin的表达最强，范围最大。12.脊髓横断处S-100和fibronectin的表达经SABC-DAB免疫组化和苏木素复染后显示，在LacZ-SCs+LacZ-NSCs组、NT-3-SCs+NSCs组和NT-3-SCs+TrkC-NSCs组脊髓横断处的细胞索呈S-100阳性表达；而实验对照组脊髓损伤区的空洞较大，空洞内未见细胞索，也无S-100的表达；NSCs组空洞内可见细胞索，但也未见S-100表达。fibronectin主要在脊髓损伤区内表达，特别是在横断处的瘢痕组织内大量表达。实验对照组的损伤区内fibronectin表达范围较广；其它各细胞移植组fibronectin的表达范围逐渐减小，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的表达区域最小。13.大脑皮质内锥体细胞层、中脑红核和脊髓背核宿主神经元的存活情况(1)体感运动区皮质内锥体细胞层受损伤神经元的存活根据大鼠脑立体定位图谱[221]取材、切片并进行中性红染色后观察到，在正常的大鼠中，体感运动区皮质内锥体细胞层与内颗粒细胞层及多形细胞层之间的界限较清晰，内锥体细胞层内为大量的，分布均匀的大锥体细胞，胞体大且呈锥体形，顶部尖端朝向皮质表面发出顶树突，胞核大而圆，不着色。实验对照组脊髓全横断后，体感运动区内锥体细胞层的神经元密度明显减少，在脊髓损伤处移植细胞后存活细胞比实验对照组明显增多。如表7所示，除NSCs组与实验对照组无显著性差异外，各组之间的神经元密度均有统计学意义。NT-3-SCs+TrkC-NSCs组中神经元密度最高，但未达到正常对照组的水平。(2)中脑红核受损伤神经元的存活光镜下，中脑红核位于被盖内，界限明显，核团内可见许多大小不一的多极神经元胞体，周围是白质包绕。正常红核神经元胞体以卵圆形为主，大而饱满，排列不均匀；而在脊髓损伤后大鼠红核神经元胞体不规则，排列紊乱，数量减少。各细胞移植组存活的细胞数均比实验对照组有不同程度的增多，NT-3-SCS+TrkC-NSCs组增加最多，但还未达到正常对照组(见表7)。经统计学分析，各组之间两两比较均有统计学差异(尸O.Ol)。(3)L,脊髓背核受损伤神经元的存活在脊髓"节段横切片中位于中央灰质的脊髓中央管背外侧可见两个界限较清晰的背核，内侧是白质后索。正常I^脊髓两侧背核内有大小不一的神经元，实验对照组脊髓损伤后背核内神经元数量大大减少，结构不清，而在各移植细胞组存活神经元逐渐增多。表7中各组比较结果为正常对照组>NT-3-SCs+TrkC-NSCs组>NT-3-SCs+NSCs组>LacZ-SCs十LacZ-NSCs组>NSCs组〉实验对照组(见表7)，且各组之间有统计学差异。表7各组大鼠大脑皮质躯体感觉运动区内内锥体细胞层、中脑红核和脊髓L!背核内存活神经元数量(i土s)的比较存活神经元数量组别内锥体细胞层.(个/mm2)红核(个/切片)背核(个/切片)正常对照组i。50.11±55.06a121.99±2.98a40.12±2.85a实验对照组705.91±40.57b45.28±1.27b7.93±0.79b神经干细胞移植组737.84±40.46e58.11±l,91c15.74±2.44eLacZ基因转染雪旺细胞和神经干细胞移植组811.37±15.99'd68.27±2.17d22.58±2.13dNT-3基因转染雪旺细胞和神经干细胞移植组886.17±19.14e85.24±4.28e27.66±1.28eNT-3基因转染雪旺细胞和TrkC基因转染神经干细胞移950.15±26.75f104.33±5.73f32.99±1.92f植组单因素方差分析(one-wayANOVA)内锥体细胞层(internalpyramidallayer):F=67.35,PO.001;aVSb，aVSc，aVSd，aVSe,aVSf，bVSd,bVSe，bVSf，cVSd，cVSe,cVSf,dVSe,dVSf，eVSf，尸<0.0；bVSc，/^>0.05红核(rednuclei):F=360.30,尸〈0.001;aVSb，aVSc，aVSd，aVSe,aVSf，bVSc,bVSd,bVSe，bVSf,cVSd,cVSe,cVSf,dVSe，dVSf，eVSf,尸O.Ol背核(Clarke'snucleus):F=166.35，尸O.OOl;aVSb,aVSe,aVSd,aVSe,aVSf,bVSc，bVSd,bVSe,bVSf,cVSd，cVSe,cVSf,dVSe,dVSf，eVSf，尸<0.0514.脊髓损伤处电镜观察结果光镜半薄切片显示，在未移植细胞的实验对照组中，脊髓损伤处可见较大空腔，空腔中有贯穿脊髓横轴的瘢痕组织。其它各细胞移植组损伤处的空腔较小，瘢痕组织也较小，可见较多的细胞和再生的有髓神经纤维，也可见较多新生的血管。电镜下，我们观察了实验对照组、NSC组、NT-3-SC+NSC组和NT-3-SC+TrkC-NSC组共四组脊髓损伤处，观察结果如下(1)成纤维细胞、胶原原纤维实验对照组在脊髓损伤处可见较多的成纤维细胞和胶原原纤维。成纤维细胞呈长梭形，细胞核梭形或不规则形，含有较多的异染色质。NSC组、NT-3-SC+NSC组的成纤维细胞逐渐减少，胶原原纤维也相应逐渐减少，NT-3-SC+TrkC-NSC组这两种结构成分则较少。(2)髓鞘形成在脊髓损伤处上述4组都可见到再生的有髓神经纤维，高倍电镜下观察到包绕轴突形成髓鞘的雪旺细胞有明显基膜。实验对照组的髓鞘包绕的轴突大多出现溃变现象，轴质内微管和神经丝排列紊乱，出现一些电子密度高的退变细胞器如线粒体。NSC组、NT-3-SC+NSC组也有许多溃变的轴突，但新生的、形态结构正常的髓鞘逐渐增多。NT-3-SC+TrkC-NSC组可见较多形态结构正常的髓鞘，其包绕的轴突内微管和神经丝排列整齐，线粒体形态结构正常。髓鞘的板层结构正常。(3)细胞及其连接结构4组脊髓损伤处可见神经胶质细胞、吞噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等细胞，还可见一种胞体较大、细胞核一般大而圆且电子密度较低。在实验对照组,这种细胞较少，多呈散在性分布，其细胞核靠近核膜的异染色质明显易见。细胞之间可见电子密度高的连接结构。在NSC组、NT-3-SC+NSC组和NT-3-SC+TrkC-NSC组可见许多这种胞体较大的细胞，且成群分布,其细胞核靠近核膜的异染色质较少，胞质有粗面内质网和高尔基复合体等细胞器。细胞之间常见细胞连接,各自的细胞膜局部电子密度增高,类似于突触前膜和突触后膜，之间有间隙，有些细胞连接的一侧胞质内有数个小泡结构。这种连接类似于发育早期不成熟的突触样结构。尤其在NT-3-SC+TrkC-NSC组,大细胞聚集处常见到突触样的细胞连接；有些大细胞还伸出较长的突起，末端膨大，与另一些细胞的突起形成突触扣结样的结构。实验结果表明1.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞体外联合培养能有效地促进神经干细胞更多地分化为神经元样细胞，并向有形成突触潜能的神经元方向分化;2.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能促进脊髓全横断大鼠后肢功能的恢复；3.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能促进脊髓损伤处移植的神经干细胞更多地分化为有形成突触潜能的神经元；4.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能促进大鼠全横断脊髓损伤处神经纤维的再生，有些再生的下行神经纤维通过了脊髓横断处；5.雪旺细胞在大鼠全横断脊髓损伤处能形成髓鞘，NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能促进再生神经纤维的髓鞘形成；6.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能明显抑制脊髓损伤处cSPGs的表达，而促进laminin的表达；7.NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植能促进全横断脊髓损伤大鼠受损宿主神经元的存活。这些实验结果为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础。人神经营养素-3受体基因重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用〈110〉中山大学〈120〉人神经营养素-3受体基因重组腺病毒在制备治疗神经损伤药物中的应用〈160〉1〈210〉1〈211〉2530〈212〉DNA〈213〉人种〈400〉15'-tcggagatggatgtctctctttgcccagcc幼gtgtagtttctggcggattttcttgctg60gg犯gcgtctggctggsictatgtgggctccgtgctggcttgccctgcaaattgtgtctgc1208LgC犯gaCtgccggcggccggacgatgggaacctcttccccctcctggaa180gggcaggattCgLggg2lELCagc犯tggg幼cgccagtatcaacatcacggacatctcaagg240agagaactggcgcagtcttcacacgctcaacgccgtggac300atggagctctacaccggacttcaaaagctgaccatcaagaactcaggacttcggeigcatt360cagcccsgagcctttgccaag犯cccccatttgcgttatataaacctgtc肌gt3glCCgg420CtC3CC3C8Ctctcgtggcagctcttccagacgctgagtcttcgggaattgcagttggag480cagaactttttcaactgcagctgtgacatccgctggatgcagctctggcggg鄉鄉gg540g鄉c頃gctcaacagccag犯cctctactgcatcaacgctgatggctcccagcttcct600ctcttccgcatgaacatcagtcagtgtgax;cttcctgagatcagcgtgagccacgtcaac660ctgaccgtacg鄉gggtgac犯tgctgttatcacttgcaatggctctggatcacccctt720cctgeitgtggactggatagtC8LCtgggCtgcagtccatcagaccaatctg780atgttcatgccatcaacttgacgctggtga3tgtg3CgElgtgaggac组840ggcttcaccctgacgtgcattgC3g3g犯Cgtggtgggcatgagcaatgccagtgttgcc900ctcactgtctactatcccccacgtgtggtgagcctggaggagcctgagctgcgcctggeig960cactgcatcgagtttgtggtgcgtggc咖cccccsccaacgctgcactggctgcacaat1020gggcagcctctgcgggagtccaagatcatccatgtgg犯tactaccaagagggag卿tt1080tccg鄉gctgcctgctcttc幼c犯gccc-3CCC￡LCt3C￡lacaatggcstactataccctc1140acccactgggcac3gcc肌ccagaccatcaatggccacttcctcaaggag1200ccctttccag卿gC3Cgg3taactttatcttgtttgacg犯gtgagtcccacacctcct固atcactgtgacccsc犯accacttttggggtatccatagc&gttgg3Ctt1320gctgcttUgcctgtgtcctgttggtggttctcttcgtcatg3tcaacaa3tatggtcg31380CggtCC3犯tttgg犯tg犯gggtcccgtggctgtcatca'gtggtgagggiggactcagcc1440agcccactgc3ccacatc犯ccacggceitcaccacgccctCgtC8Ctgg8tgccgggccc1500ga_ca_ctgtggtcattg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