专利名称：制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法
技术领域：
一种制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法，涉及利用工程学与生物化学技术制备复合氨基酸的过程。
背景技术：
氨基酸是生物有机体的重要组成部分，在生命现象中起着至关重要的作用。氨基酸是生命机体之营养，生存和发展极为重要的物质，在生命体内物质代谢调控、信息传递方面扮演重要角色。
近30年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，氨基酸种类已由60年代50种左右，现在已突破400种。在产量方面，60年代初世界氨基酸产量不过10万吨，现在已跃上百万吨，产值超百亿美元。但与实际需求量还有较大距离，据专家们预计，到2010年年产值可望达到千亿美元。氨基酸作为营养添加剂、调味剂、饲料添加剂、医药原料、农药等在食品工业、医药、农业、畜牧业及人类健康、保健等诸多方面有着广泛的应用。
氨基酸的种类很多，而真正的蛋白质氨基酸只有20种，其它均为非蛋白质氨基酸或氨基酸衍生物。尽管某些非蛋白质氨基酸或氨基酸衍生物也有重要的生理作用，但作为氨基酸产业所研究与开发的对象均为蛋白质氨基酸，只有这些氨基酸才是构成蛋白质的基本成分。
在我国，氨基酸产业已初具规模，主要用于医学临床、食品制造和饲料添加剂，但尚无用于动物医疗保健的任何相关产品。
现在常用的生产氨基酸的方法有下列几种水解法包括酸水解、碱水解和酶水解法3种。酸水解法使用6～10mol/LHCl在110～120℃条件下，水解12～24小时。该法水解完全，且不引起氨基酸的消旋作用，但全部色氨基酸和部分丝氨酸、酪氨酸被破坏，腐蚀设备，大量产酸污染环境；碱水解法多用6mol/LNaOH条件下，水解6小时。该法水解完全，不破坏色氨酸也不腐蚀设备，但能使氨基酸发生消旋作用，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和胱氨酸大部分被破坏；酶水解法反应条件温和，氨基酸不被破坏，也不发生消旋作用，但水解不完全，产品出成率低，中间产物过多，很少用于氨基酸的工业化生产。
化学合成法应用化学合成法生产氨基酸，原料来源广泛，价格低廉，产品生产成本低，可规模化生产，但化学合成法制造的氨基酸都是DL-消旋体，需进行折分才能得到L-型产品，而且一种合成法只能生产1种或儿种氨基酸，故工艺复杂、设备投资巨大。
微生物发酵法这是20世纪的一项重大发明，特别是在阐明了氨基酸生物合成路线及其代谢机理以后，引用营养缺陷型和抗代谢类似物育种新方法，有目的地培育产出率高的新菌种，提高了产出率，但不足之处是目前只能制备少数几种氨基酸，如赖氨酸等，而且发酵浓度低，反应时间长，设备规模庞大，费用高、副产品多。
酶工程法为克服微生物发酵法的上述不足之处，在化学合成的基础上，应用特定酶的催化作用，使某些化合物转化成相应的L-型氨基酸。此法工艺简单，产物浓度高、生产效率高、副产品少，易分离精制。但具有微生物发酵法相同的缺点。
以上4种氨基酸制造技术，除碱水解法不符合产业化生产要求，很少使用外，酶水解法由于控制条件苛刻，多在实验室应用。在生产实践中只有酸水解法、微生物发酵法和酶工程法有使用，不足之处可归纳如下①酸水解法彻底破坏色氨酸，造成重要营养成分损失；对环境具有明显的不良作用；②微生物发酵法和酶工程法要求条件高，每生产一种(有时几种)氨基酸就需要一个特殊的菌种，缺乏相应菌种的氨基酸不能采用此法制备，而且不同的菌种均需单独发酵。
③全价(或复合)氨基酸产品需分别生产，再行混合，造成设备投资大、工艺复杂和产品成本偏高。
发明内容
本发明的目的是以动物胎盘为原料，利用工程学和生物化学技术制备兽用复方氨基酸口服液。
本发明的种制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法的流程为胎盘前处理→酸处理→除酸→分散→裂解→反渗透分离→赋形剂与乳化→分装。
胎盘前处理动物胎盘除去脂肪和异物，分离胎盘绒毛膜、羊膜，弃去尿囊膜，之后进行清洗、剪碎成块状后溶血。
绒毛膜和羊膜用4倍去离子水清洗2次，剪成块状，大小寸方。按体积比1∶7v/v取绒毛膜羊膜混合物和去离子水进行溶血，每次24小时，共进行3次。
胎盘酸处理在室温条件下，按比例(1∶3，v/v)称取胎盘组织与酸性处理液(pH值2.1～2.9)，置于容器内处理24小时，之后更换液体重复上述过程2次(共3次)。
酸性处理液的制备在纯化水中导入Cl2气体，使其pH值达到2.1～2.9时停止供气，此液体即为酸性处理液。其反应式如下，
通过酸处理使胎盘蛋白的空间构象发生变化，使蛋白质从肽链高度折叠状态转变成伸展状态。同时，疏水基外露溶解度降低，分子的不对称性增加。酸作用破坏了蛋白质的次级键如氢键和盐键，是蛋白质的变性现象，导致蛋白质三级结构的破坏，但不影响其肽键的完整性。
酸处理过程对蛋白质具有水解作用，但使用酸进行水解必须是在110℃以上的温度条件下进行，在室温条件下(4℃～22℃)虽可发生水解，但一般是微量的；且水解液经除酸后浓缩再利用，不会造成已水解氨基酸的损失。
酸处理还有另外的作用①灭菌通过酸处理可使大部分病原微生物灭活；②使酶、激素灭活酶和激素实质上就是有生物活性的蛋白质，酸处理同样破坏其三级结构，从而导致失活。
除酸用中性纯化水清洗胎盘组织，至清洗液pH值达到6.0为止；清洗液以100～120ml/min的流速，自上而下通过处理成H+型的732阳离子交换树脂柱(150mm×2000mm)，至pH值达到6.0为止。流出液以薄膜浓缩法浓缩4倍(真空旋转薄膜浓缩仪)后与胎盘组织合并(3∶1v/v)。
分散上述胎盘组织与流出液混合物加入可密闭的无菌容器内，于12～15℃条件下(洁净度30万级)分散100天。
分散过程的化学机理就是蛋白质的水合拉伸作用，这种作用的明显与否取决于蛋白质分子的静电特性和空间结构特性。在一定的条件下，如酸碱度(pH值)偏酸时，羧基是不带电的，而碱基带有正电荷，可与氢离子发生排斥作用，这时丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸与多肽间的肽键被明显拉伸，这是因为某些功能基团(如羧基)的分子内催化作用，导致分子内质子转移，即从未电离的羧基转移至氨基上。
裂解经100天分散的胎盘组织用“高速涡旋超声波细胞裂解器”进行裂解，裂解条件为洁净度10,000级、温度12～20℃。裂解共进行3次，第1次60分钟，前20分钟转速不超过10,000转/分，20分钟后逐渐提高至13,000转/分。第2、3次分别在13,000转/分下裂解40分钟。
高速涡旋超声波细胞裂解器配有制冷设施，其工作温度为4～12℃。由高速电机转动所产生的巨大剪切力首先对物料进行粉碎，在传动器的带动下进行超声波粉碎室，经强力超声波作用后，已被粉碎的物料回流至剪切室，如此反复将物料完全裂解。第1次裂解完成后，物料经出料口送至高位槽，再由高位槽送至另一台裂解器中，进行第2、3次裂解。
分离应用板式反渗透过滤装置加氨基酸陶瓷过滤膜处理裂解液(流速8～10升/小时)，除去大分子(MW＞6,000dt)物质。
赋形剂与乳化过滤液导入乳化器，边加入赋形剂(山犁醇或木糖醇，1％，v/v)，边进行乳化，时间为30分钟，工作温度18～20℃。
赋形剂的作用有3点一是作为能量补充剂，参与氨基酸在体内的代谢，二是作为防腐剂，确保产品质量，三是作为矫味剂，改善适口性。
分装测定乳化液氨基酸含量，并用注射用水调整其为标准浓度(3.95mg/ml)后，在无菌条件下进行分装、落膜，加塞和扎盖。
本技术的特点有①资源利用生产原料是用动物(猪、羊)胎盘，它是养殖业的副产品，通常被丢弃。通过资源转化不仅提高了畜牧业的附加值，而且能“变废为宝”，保护环境。
②克服了现有技术的不足，简化了生产工艺，降低了设备投资，提高了产品出成率。可达50％。
③一次生产18种蛋白质氨基酸和1种非蛋白质氨基酸混合物，且天然比例，生物体匹配符合度高、生物利用率高，并含有6种必须氨基酸。
④氨基酸含量达到3.95mg/ml，大大高于国内现有产品的氨基酸含量，其中必须氨基酸的含量0.76mg/ml。
⑤本项技术一方面通过对废弃动物胎盘的利用保护环境，另一方面在制品生产过程中不产生危害环境的排放物。
⑥制备过程中可对病原微生物、生物酶产生灭活作用，并分离重金属离子，产品质量有保障。
本口服液中有19种氨基酸，其总含量为3.95mg/ml，其中羟脯氨酸0.35天冬氨酸 0.28苏氨酸0.11谷氨酸 0.44脯氨酸0.39甘氨酸0.78丙氨酸 0.29缬氨酸0.14蛋氨酸0.01异亮氨酸0.08亮氨酸0.19酪氨酸0.01苯丙氨酸0.11羟基赖氨酸0.06赖氨酸0.13鸟氨酸 0.01组氨酸0.03精氨酸0.37其中苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸为必需氨基酸，鸟氨酸为非蛋白氨基酸。
具体实施例方式
12实例说明(以猪胎盘为例)取新鲜或-12℃保鲜的猪胎盘10kg，分离绒毛膜、羊膜，称重。绒毛膜和羊膜合并使用。胎盘分离物分别用去离了水清洗2次，剪碎，按比例(1∶7v/v)加入去离子水进行溶血，溶血时间为24小时(共3次)。
按比例(1∶3v/v)混合胎盘分离物与酸性处理液进行酸处理。共进行3次，每次24小时。
酸性处理液的制备容器内加纯化水30升，导入Cl2气体(2升/分)，15分钟后取样测定，pH值达到2.1～2.9时停止供气，此液体即为酸性处理液。
酸处理后的胎盘用去离子水(1∶4v/v)清洗，至洗涤水pH值达到6.0为止，收集洗涤水，用活性碳柱或阳离子树脂交换柱除酸，至6.0为止。除酸后用薄膜法将洗涤液浓缩4倍。
浓缩后的洗涤液与胎盘组织混合，置于全封闭的容器内进行胎盘分散，时间为100天。
取出胎盘组织加入“高速涡旋细胞裂解器”进行裂解，第1次裂解60分钟，第2、3次40分钟。第1次前20分钟转速不超过10,000转/分，之后增至13,000转/分；第2、3次裂解转速均为13,000转/分。第3次裂解后进行反渗透过滤，除去大分子物质，保留过滤液。
过滤液导入真空乳化器，同时加入山犁醇或木糖醇(1％，v/v)，启动乳化器，乳化30分钟后取样测定含量，以注射用水调整氨基酸含量为3.95mg/ml，分装即可。
权利要求
1.一种制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法，其特征在于其流程为胎盘前处理→酸处理→除酸→分散→裂解→反渗透分离→赋形剂与乳化→分装；流程中的具体操作过程为a、胎盘前处理动物胎盘除去脂肪和异物，分离胎盘绒毛膜、羊膜，弃去尿囊膜，之后进行清洗、剪碎成块状后溶血，绒毛膜和羊膜用4倍去离子水清洗2次，剪成块状，大小寸方，按体积比1∶7取绒毛膜羊膜混合物和去离子水进行溶血，每次24小时，共进行3次；b、胎盘酸处理在室温条件下，按体积比1∶3称取胎盘组织与pH值为2.1～2.9的酸性处理液，置于容器内处理24小时，之后更换液体重复上述过程2次，共3次；c、除酸用中性纯化水清洗胎盘组织，至清洗液pH值达到6.0为止；清洗液通过阳离子交换树脂柱除酸后进行薄膜浓缩再与胎盘组织以体积比3∶1的比例合并；d、分散上述胎盘组织与流出液混合物加入可密闭的无菌容器内，于12～15℃条件下分散100天；e、裂解经100天分散的胎盘组织用“高速涡旋超声波细胞裂解器”进行裂解，裂解条件为洁净度10,000级、温度12～20℃。裂解共进行3次，第1次60分钟，前20分钟转速不超过10,000转/分，20分钟后逐渐提高至13,000转/分。第2、3次分别在13,000转/分下裂解40分钟；f、分离应用板式反渗透过滤装置加氨基酸陶瓷过滤膜处理裂解液，流速8～10升/小时，除去MW＞6,000dt的大分子物质；g、赋形剂与乳化过滤液导入乳化器，边加入按体积比1％的比例的赋形剂，边进行乳化，时间为30分钟，工作温度18～20℃；h、分装测定乳化液氨基酸含量，并用注射用水调整其为标准浓度为3.95mg/ml后，在无菌条件下进行分装、落膜，加塞和扎盖。
2.根据权利要求1所述的制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法，其特征在于酸性处理液的制备在纯化水中导入Cl2气体，使其pH值达到2.1～2.9时停止供气，此液体即为酸性处理液。
3.根据权利要求1所述的制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法，其特征在于赋形剂为山犁醇或木糖醇。
全文摘要
一种制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法，涉及利用工程学与生物化学技术制备复合氨基酸的过程。本发明的制备动物胎盘兽用复方氨基酸口服液的方法的流程为胎盘前处理→酸处理→除酸→分散→裂解→反渗透分离→赋形剂与乳化→分装。生产原料是用动物(猪、羊)胎盘，它是养殖业的副产品，能“变废为宝”，保护环境。克服了现有技术的不足，简化了生产工艺，降低了设备投资，提高了产品出成率。可达50％。一次生产18种蛋白质氨基酸和1种非蛋白质氨基酸混合物，并含有6种必须氨基酸。氨基酸含量达到3.95mg/ml其中必须氨基酸的含量0.76mg/ml。制备过程中可对病原微生物、生物酶产生灭活作用，并分离重金属离子。
文档编号A61P3/02GK1965863SQ20061014606
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月7日 优先权日2006年11月7日
发明者郝文华, 郑润宽, 徐勇 申请人:内蒙古神元生物工程股份有限公司