神经变性疾病的治疗的制作方法

专利名称：神经变性疾病的治疗的制作方法
神经变性疾病的治疗本发明涉及使用新型红细胞生成剂(NEA)治疗脑和脊髓的神经变性 疾病的方法。商业可获得的蛋白治疗剂如人红细胞生成素(EPO)的生物利用率受 限于它们短的血浆半寿期和易受蛋白酶降解。这些缺点阻止了它们达到最 大的临床潜能。通过对EPO及其类似物进行化学修饰，已研发了新型红细 胞生成剂。这些新型红细胞生成剂提供了有效和延长了的红细胞生成活性， 允许最佳地控制患有肾病、AIDS和正在化疗的癌症患者的贫血症。本发明涉及通过将治疗有效量的新型红细胞生成剂(NEA)施与需要 此种治疗的患者而治疗脑和脊髓的神经变性疾病的方法，其中所述新型红 细胞生成剂是经化学修饰的人红细胞生成素或经化学修饰的人红细胞生成 素类似物，其包含具有特定分子量的共价连接的聚(乙二醇)基团和接头 结构。附图
简述图l描述了注射后2和6小时大鼠血清中EPO和本发明NEA的浓度。 图2描述了注射后2和6小时大鼠体液(liquor)中EPO和本发明 NEA的浓度。图3描述了注射后2和6小时大鼠体液和血清中EPO和本发明NEA 的浓度。具体地，本发明使用的NEA是经化学修饰的红细胞生成分子，其优 选地具有至少一个游离氨基并包含选自人红细胞生成素及其类似物的红细 胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少 一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红 细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)X-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇) 基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO (即羰基)与所述的氨 基之一形成酰胺键；其中R为低级垸基；x为2或3， m为约450至约卯0; n为1至3;且选择n和m,从而使产生的NEA减去未修饰的红细胞生成 素部分后的分子量为约20千道尔顿至约100千道尔顿。这样的NEA已经 描述在如美国专利6，583，272中，其根据需要的程度，在此引入作为参考。本发明中所用的NEA与EPO在生化和功能上是不同的。总之，体内 和体外的数据显示，与红细胞生成素相比，NEA呈现出相当低的与红细胞 生成素受体的结合亲和性，并与之更快解离。与人红细胞生成素(hEPO) 相比，这些NEA呈现出明显有利的临床特性，包括体内增加的循环半寿 期和血浆存留时间、降低的清除率和提高的临床活性。涉及本发明NEA的不同特性的一些上述观察可能可以通过一种新的 作用方式来解释。与红细胞生成素受体(EPO-R)的迅速解离和延长的血清半寿期可能导致通过与该受体的多种相互作用而产生增强和持续的红细 胞生成效应。由于空间原因，这些多种相互作用可能足够诱导EPO-R信 号级联，但没有紧密到足以导致强结合以致于受体/分子复合体内在化并降 解。统计上而言，只有某些百分比的分子可能发生这样一种强结合。总体 上，这种作用方式会导致一种分子在降解前激活多于一个受体的效应。重要的是，这些NEA的有利性质允许施用频率减少、更稳定地控制 血红蛋白、允许最佳地控制患有肾病、AIDS和正在化疗的癌症患者的贫 血症。预期这些好处会带来更好的治疗效果和患者生活质量的提高。天然存在的人红细胞生成素(hEPO)在体内不同组织中合成(例如 肾脏、脑等)，是体液因子，其尤其刺激血红细胞产生(Carnot，P和Deflandre, C(l卯6) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev， AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann， KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson， LO， Goldwasser， E， Freid， W和Plzak， LF (1957) Nature 179: 6331-4)。天然存在的EPO刺激骨髓中 定向类红系祖细胞的分裂和分化，通过结合至红系前体细胞上的受体发挥其生物学功能(Krantz, BS (1991) Blood 77: 419)。近年来，EPO除了用来治疗贫血外，这种分子还净皮推定为提供了神经 和心肌寸呆护效应。见综述论文W. Jelkmann和K. Wagner, Ann. Hematol 83:673-686 (2004)。本发明提供了本发明所述的NEA在治疗脑和脊髓的神经变性疾病中 的用途，通过在血液流路(blood circuit)中导入NEA来实现。本发明基 于以下发现，尽管本发明所述的NEA相对较大，仍能够穿过血脑屏障作 为脑和脊髓中神经元的神经保护剂。由于NEA具有上文所述的这些独特 而优越的临床特性，预计将它用来治疗神经变性疾病也会比采用红细胞生 成素的治疗具有更好的临床效果。利用重组DNA技术通过生物合成已制备出红细胞生成素(Egrie， JC， Strickland, TW， Lane, J等人(1986) Immunobiol. 72: 213-224)，并且是通过 将克隆的人EPO基因插入并在中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中 表达的产物。hEPO的主要的、完全加工形式的一级结构见SEQIDNO:l。 在Cys7-Cys161之间和在Cys29-Cys33之间有两个二硫桥。不含糖部分的 EPO多肽链的分子量为18,236道尔顿。在完整的EPO分子中，分子量的 大约40。/。为在该蛋白质的糖基化位点糖基化的糖基团(Sasaki， H， Bothner， B， Dell, A和Fukuda， M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059)。术语"红细胞生成素"或"EPO"指具有示于(SEQ ID NO: 1)或(SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列或基本与之同源的氨基,列的糖基化蛋白，其生 物特性涉及刺激血红细胞的产生以及刺激骨髓中定向红系祖细胞的分裂与 分化。此外，"红细胞生成素"指显示本领域已知的至少一种生物学性质 或结合亲和性的糖基化蛋白。从而，分子包括只显示神经保护效应。如这 里所用的，这些术语包括经过特意修饰的此类蛋白质，例如经定点诱变法 或随机突变法修饰。这些术语还包括具有一至六个额外糖基化位点的类似 物，在糖蛋白的狻基端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中额外氨基 酸包括至少一个糖基化位点)，以及具有如下氨基酸序列的类似物，即氨 基酸序列包括至少一个糖基化位点的重排。这些术语包括天然和重组产生的人红细胞生成素。红细胞生成素结合特定的跨膜受体(EPO-R)。有功能的人EPO-R 是细胞因子I类受体超家族的一员，表现为两个同样的484个氨基酸的糖 蛋白链的同型二聚体。每条链包含胞外结构域、疏水跨膜序列和连接蛋白 酪氨酸激酶JAK2的胞质结构域。未修饰的EPO与受体亚基结合，两个结 合位点的解离常数差别很大。EPO与受体的结合导致构象发生改变， EPO-R的两个亚基结合更加紧密，使得两个JAK分子发生自体磷酸化， 产生复杂的信号级联。已经表明EPO诱导的信号通路在刺激后30 - 60分 钟回复到接近基本的水平。EPO的效应被造血细胞磷酸酶(HCP)的作用 终止，导致EPO/EPO-R复合体的内在化与降解。近来，已经表明EPO比最初设想的更象是多效性的存活生长因子。人 们认为，EPO具有神经营养和神经保护的功能(Cerami A等人(2002) Nephrol. Dial. Transplant. 17: 8-12; Chong， ZZ等人(20(B) Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3: 141-154; Jumbe， NL (2002) Oncology 16: 91-107; Marti, HH等人(2000) News Physiol. Sci. 15: 225-229)、血管保护功能(Masuda， S等人(1999) Int. J. Hematol. 70: 1-6; Smith, KJ等人(2003) Cardiovasc. Res. 59: 538-548)、和心脏寸呆护功能 (Smith, KJ等人(2003) Cardiovasc. Res. 59: 538-548; Parsa， CJ等人(20(B) J. Clin. Invest. 112:999-1007)。已经表明，EPO-R出现在啮齿动物和哺乳 动物的脑特定区域(Digicaylioglu, M等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3717-3720; Li， Y等人(1996) Pediatr. Res. 40: 376-380; Marti， HH等人 (1996) Eur. J. Neurosci. 8: 666-676)。 EPO结合位点主要位于小鼠的海马、 内嚢、皮层和中脑(Digicaylioglu， M等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3717-3720)。此外，人们已经知道EPO刺激神经元干细l包和祖细胞的 增殖与分化(Shingo， T等人(2001) J. Neurosci. 21: 9733-9743; Studer， L等 人(200t)) J. Neurosci. 20: 7377-7383)。在缺氧的海马神经元原代细胞培养物中，EPO通过保持线粒体膜电势 进行神经保护，其中EPO的神经保护效应与PI-3K/Akt途径有重大关系(Chong， ZZ等人(2003) Circulation 106: 2973-2979)。线粒体膜电势的不稳 定导致细胞色素C的释放，后者激活胱天蛋白酶8、 l和3，促进DNA片 段化。EPO在脑中的体内神经保护效应首先被Sasaki领导的小组在1998年 于蒙古沙鼠中发现(Sadamoto， Y等人(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 26-32; Sakanak， M等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 95: 4635-4640)。向侧心室中注射EPO可防止局部缺血导致的无学习能力， 使海马CA1神经元免于死亡。在大鼠中的相似实验减少了局部缺血诱导的 无区域导航能力、皮层梗塞和丘脑变性(Sadamoto， Y等人(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 26-32)。此外，向脑室中输注可溶的EPO-R 后局部阻断了 EPO信号途径，已知的EPO对缺氧预处理的保护效应在小 鼠中显著降低了(Prass， K等人(2003) Stroke 34: 1981-1986)。早期人们认为，由于血脑屏障的缘故，全身施用的EPO将不能进入脑 (Junk, AK等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 10659-10664; Juul, SE 等人(1999) Pediatr. Res. 46: 543-547)。血脑屏障(BBB)将脑和脑脊髓液 (CSF，体液)与血液分隔，并且调节血液和脑之间物质的交换。在这里， 术语"BBB"包括血脑屏障和血-CSF屏障，主要包含脑毛细管、脉络丛 立方上皮细胞和蛛网膜。所有的BBB位点的特点在于存在临近细胞之间的 紧密结合、内皮孔的消失和胞饮微嚢的缺乏。此外，脑毛细血管的内皮线 粒体的数量密度比体内其他区域的有几倍的增加。构成BBB的细胞有效发 挥连续细胞层功能，使溶质的交换主要仅通过跨细胞通路。从而，脂可溶 的溶质很容易地穿过BBB，而电解质、脂不溶的非电解质和蛋白则以比它 们进入非神经组织更慢的速度从血液进入脑。这种屏障的功能有助于脑抵 御有害物质。溶质分子跨膜有4种基本机制(1)简单扩散，(2 )促进扩散，(3 ) 通过水性通道的简单扩散，(4)通过蛋白载体的主动运输。由于其紧密的 连结，细胞旁扩散在BBB并不常见。至于跨细胞的扩散，总的原则是物质 的亲脂性越高，越容易扩散入脑。葡萄糖、醇和其他小分子通过扩散进入脑。大部分蛋白通常需要采取主动运输的方式。血脑屏障可以被某些手段"打开"，例如动脉内注射高渗甘露醇。甘 露醇械j人为通过收缩内皮细胞的渗透作用打开血脑屏障。CSF位于脑室、堆管和蛛网膜下隙中。CSF主要来源于侧部脉络膜丛 和第三和第四脑室，容量占脑重量的10-20%。人体内5小时(大鼠1小 时)周转的CSF容量为140-150ml。 CSF在它的产生引起的流体静力学 的压力下在脑室和蛛网膜下隙内移动。CSF保护了脑，调节脑细胞外液， 允许神经活性物质分布，并且是脑产生的废弃物的汇集处。Jumbe(Jumbe NL (2002) Oncology 16: 91-107)等人发现，静脉内注射 重组人EPO( 500U/kg )的大鼠中脑脊髓液与血清浓度的比值为大约lxl(T3。 注射阿法达贝泊汀(25|ug/kg)也有类似的效果。通过非房室模型分析浓 度时间曲线下的平均面积(AUCo-8)，脑脊髓液中的重组人EPO (rhEPO) 为340mUh/ml， 阿法达贝泊汀为3.6 ng h/ml，而血清中的这两个数字分 别为370,000 mU h/ml和4500 ng h/ml。而对于中风的实验，向实验动物全身施用高剂量rhEPO，可以减少中 脑动脉梗塞24小时后梗塞形成体积(Siren， AL等人(2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 4044-4049)，减少死亡率(Buemi， M等人(2000) Eur. J. Pharmacol. 392: 31-34)，防止神经元损伤(Alafaci， C等人(2000) Eur. J. Pharmacol. 406: 219-225)，增大大脑血流(Grasso， G (2001) J. Neurosurg. Sci. 45: 7-14),减少神经功能缺损(Grasso， G等人(2002) J. Neurosurg. 96: 565-570)。此外EPO还预防运动神经元的凋亡和神经疾病(Cerami， A等人 (2002) Nephrol. Dial. Transplant 17: 8-12)，改善运动功能的恢复(Gorio， A 等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9450-9455)，减少缺氧脑中的炎 性反应(Villa, P等人(2003) J. Exp. Med. 198: 971-975)。此外，正在考虑将红细胞生成素用于多发性硬化(MS) 。 MS是中枢 神经系统(CNS)即脑与脊髓的一种炎性疾病。在患有MS的人群中，称作 病斑或者病变的损伤斑出现在CNS的白质中看似随机的区域。在病变的部 位， 一种叫作髓磷脂的神经绝缘材料可能在自体免疫炎症中消失。髓鞘在一种称为脱髓鞘的过程中从轴突上剥裂。髓鞘在CNS中是由特定部分的少 突胶质细胞形成。到目前为止，还不清楚是什么原因导致MS。人们提出 了多种不同的理论，例如自体免疫、病原导致、遗传组分、宫内生化事件、 血脑屏障的破坏、节食和缺乏维生素、过敏反应及其他。此外，人们还讨 论了炎症同样会伤害轴突膜。目前为止对MS还没有可用的治疗方案。但 是，许多药物可以用来治疗这种疾病的症状。例如，皮质类固醇、许多免 疫抑制药和P干扰素都可以用来治疗。Diem等人(Brain (2005)， 128: 375-85)描述了 一种类固醇联合施用EPO 对目标炎症和神经变性的治疗方案。在MS模型中，曱基强的松龙和红细 胞生成素#>成功地用于联合治疗。Ehrenreich等人(Ehrenreich， H等人(2002) Mol. Med. 8: 495-505)在 中风患者中进行的实验表明，在施用rhEPO的患者中梗塞的大小有明显变 小的趋势，在中风l个月后有显著的神经学上的恢复和临床效果。病人在 中风后的第一天开始每天接受静脉内注射rhEPO(3.3x104 U)。患者的脑脊 髓液中EPO的平均浓度增加到17U/1 (正常值为大约1U/1)。注射后3小 时患者的血清水平大约为5，000U/1 (正常血清水平为大约15U/1)。此外， EPO还被成功地用来减少急性中风周围区域的再灌注损伤。已知EPO和EPO-R在人和啮齿动物的脑组织中表达(Si"n AL等人 (2001) Acta Neuropathologica 101: 271-276),是缺氧可诱导的(Jelkmann， W (1994) Clin. Investig. 72: 3-10),已证实有显著的神经保护作用 (Bernaudin, M等人(1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 19: 643-651; Genc， S等人(2001) Neurosci. Lett. 298: 139-141)。在成年人脑中，EPO和它的受 体在神经元和星形胶质细胞中只有弱表达(Si"n AL等人(2001) Acta Neuropathologica 101: 271-276)。总之，局部缺血和/或缺氧后的人脑中EPO 出现在血管组织和炎症细胞中，EPO-R出现在梗塞和周边梗塞区的血管、 神经元和星形胶质细胞中。在较久的缺血性梗塞中EPO和EPO-R在反应 的神经胶质中达到最强。在靶细胞中EPO-R刺激的净效果为增殖、抑制 凋亡，对于成红血细胞则是分化。认为BBB能够有效地排斥大的糖基化分子，例如EPO。尽管在传统 观点上，BBB被认为对于大分子是不能透过的，研究表明一些大分子能够 特异地穿过毛细血管的内皮运输到脑中，影响脑的功能。这是通过结合内 皮细胞腔面上的受体发生的。结合启动了内吞，然后穿过BBB 。由于EPO-R 在脑毛细血管中表达，人们认为EPO穿过BBB的运输是通过受体介导的 运输完成的。值得注意的是，组织保护所要求的EPO血清浓度比红细胞生成所要求 的要高。其中一个原因是用于组织保护的受体比红系祖细胞的亲和力要低(大约1000倍)(Masuda， S等人(1993) J. Biol. Chem. 268: 11208-11216)。另外一个原因可能是由于BBB的存在。临床前实验表明，防止组织损伤所 需的最小治疗量EPO看起来是约300 - 500mlU/kg体重。 一单位的EPO 被定义为在大鼠中与lSjimol CoCl2(氯化钴)导致同样红细胞生成反应的量 的EPO。简单地说，EPO对脑和脊髓中的神经元有神经保护效应。但是， EPO在这种治疗中的潜在应用受到要达到这样的效应所需要的相当高治 疗量的限制。 一种新的具有更长半寿期并能穿过BBB的红细胞生成刺激因 子(ESA)是优选的，尤其是这种ESA可以以相对较低的起始密度向血管 中施用，防止不良副反应的发生。现有技术中的问题通过使用本发明所述的NEA可以得到解决，所述 的NEA如后附权利要求书中所述，包含共价连接的特定分子量的聚(乙 二醇)基团和接头结构。具体地，这种NEA被用来制备通过导入血液回 路而治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物。在优选的实施方案中，所述的 NEA为化学修饰的红细胞生成分子，其具有至少一个游离氨基并包含选自 人红细胞生成素及其类似物的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类 似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰 的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一 聚(乙二醇)基团的-CO (即羰基)与所述的氨基之一形成酰胺键；其中 R为低级烷基；x为2或3， m为约450至约卯0; n为1至3;且选择n和m，从而使产生的NEA减去未修饰的红细胞生成素部分后的分子量为 约20千道尔顿至约100千道尔顿。优选地，NEA是下式P—[NHCO—(CH2)X—(OCH2CH2)m—ORln (I)其中x、 m、 n和R如权利要求1中所定义，P为红细胞生成素部分的 残基，其不包括n个与聚(乙二醇)基团形成酰胺键的氨基。在上式中， R最优选为甲基，m为约650至约750， n为1。最优选地，本发明方法中所用的NEA具有下式[CH30(CH2CH20)mCH2CH2CH2CO-NH]nP其中m为650至750， n为l, P为红细胞生成素部分的残基。优选地，红细胞生成素部分为人红细胞生成素糖蛋白，其可以被内源 性的基因活化表达，具有SEQIDNO:l的氨基,列。备选地，红细胞生成素部分具有人红细胞生成素添加1至6个糖基化 位点修饰后的序列。在另一优选的实施方案中，本发明方法可治疗的脑与脊髓的神经变性 疾病与选自中风、TBI(创伤性脑损伤)或脊髓损伤的急性疾病相关。此外， 脑与脊髓的神经变性疾病可以与长期治疗相关，例如中风、精神分裂症、 阿尔兹海默症、亨廷顿症、痴呆、脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征、 帕金森症、海绵脑病、多发性硬化以及与细菌或病毒感染相关的神经变性。在当前的方法中，NEA以足以治疗或改善神经变性疾病的量("治疗 有效量")施用。NEA可以按照EPO治疗中采用的惯常方式施用于患者。 NEA确切的量决定于待治疗的疾病的确切种类、待治疗患者的状态和该组 合物中其他成分。jig的量只与各自的红细胞生成素(其为蛋白质)部分相 关。优逸地，患者每周一次每kg体重施用约0.1至约lOOng本发明所述的 ESA，优选约1至约lOfig每kg体重。如果必要，NEA可以更频繁地施用。但是，根据本发明使用的NEA 也可以每两周、每三周、每月或更长的时间间隔施用一次,这决定于所治 疗的疾病和施用方法。含有该缀合物的药物组合物被配制至有效浓度，以多种方式施用于患有特征为神经元死亡的神经变性疾病的患者。该缀合物 的平均临床有效量可能发生变化，需在有经验的医师的建议下按处方使用。本发明所述的NEA的比活性可通过本领域已知的多种检测法确定。 本发明所述的纯化的NEA的生物学活性是指施用NEA给人类患者后(例 如通过注射)对脑和脊髓中神经元的保护。本发明所述的药物制备物包括与可药用载体或赋形剂制剂的适用于注 射的药物组合物。所述药物组合物的制备在现有技术，例如US 2002/0037841 Al (相应于WO 01/87329)中是已知的，该美国专利全文51入 作为参考。用于制剂本发明所述产品的可药用载体包括人血清白蛋白、人 血浆蛋白等。此外，利用喷雾干燥制备组合物可能很适宜，可加入或不加入任何稳 定剂或填充剂。本发明所使用的ESA可在pH为7、含有渗透调节剂例如132mM氯 化钠的10mM磷酸钠/钾緩冲液中配制。任选地药物组合物可含有防腐剂。 该药物组合物可含有不同量的红细胞生成素蛋白，例如10-lOOOjig/ml, 优选50fig或400ng。NEA优选通过注射、透皮贴片、皮下储库或吸入的方式导入血液流路。NEA优选以多达两周的约25照至约500照每天的剂量施用于患有急 性神经变性的患者，对于患有神经变性疾病的患者的慢性治疗则以每周约 25照至约l，OOOng的剂量施用。对于后一种情况，用药可以延长到每个月 一次甚至更长的一段时间一次，根据疾病类型和施用方式而定。在一个优 选的实施方案中，对于急性疾病NEA施用约165pg/天，最多一周，对于 慢性疾病每周约200pg。此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含以上所述用途的有用的NEA 和提高血脑屏障通透性的物质，并且所述血脑屏障通透性的物质为甘露醇。以上所述的人红细胞生成素及其类似物蛋白可以通过内源性的基因活 化来表达。优选的人红细胞生成素糖蛋白为SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2 的那些糖蛋白，最优选SEQIDNO:l的那些糖蛋白。更进一步地，P可以选自人红细胞生成素及其具有一至六个额外糖基化位点的类似物的残基。如下文详细所述，EPO的制备和纯化为本领域所 熟知。EPO指的是天然或重组的蛋白，优选人EPO，来自任何常规来源， 如组织、蛋白质合成、或天然或重组细胞的细胞培养物。包括任何具有红 细胞生成素活性的蛋白质，如突变蛋白或经修饰的蛋白。此处的"任何活 性"也包括与仅位于神经元细胞表面的EPO受体的结合特异性。因此，包 括不表现有红细胞生成活性的本发明的NEA衍生物。可通过重组DNA技 术或内源性的基因活化途径，经CHO-、 BHK-或HeLa细胞系表达制 备重组的EPO。通过内源基因活化进行蛋白质包括EPO的表达是本领域 所熟知的，并已公开在如美国专利号5，733，761， 5,641,670和5,733,746，国 际专利/〉开号WO 93/09222， WO 94/12650， WO 95/31560， WO 90/11354， WO 91/06667和WO 91/09955,其各自内容均在此处引入作为参考。优选 的制备红细胞生成素糖蛋白产物的EPO种类为人EPO种类。更为优选的 EPO种类为具有如SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的人 EPO,更优选氨基,列SEQIDNO: 1。此夕卜，P可以是具有一至六个额外糖基化位点的糖蛋白类似物的残基。 用一个或多个寡糖基团对蛋白质进行糖基化发生在多肽主链的特定位置， 且极大地影响了蛋白的物理性质，如蛋白的稳定性、分泌、亚细胞定位以 及生物学活性。糖基化通常有两种类型，o-连接的寡糖附着于丝氨酸或 苏氨酸残基，而N-连接的寡糖则附着于精氨酸残基。在O-连接和N-连接的寡糖中均存在的寡糖之一为N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是含 有9个或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常为N-连接及O-连接寡糖 的末端残基，且由于它带有负电荷，赋予该糖蛋白酸性特征。人红细胞生 成素具有165个氨基酸，含有三条N-连接和一条O-连接的寡糖链，这 些寡糖链约占该糖蛋白总分子量的40% 。N -连接的糖基化发生于第24位、 38位和83位的精氨酸残基，O -连接的糖基化则发生于第126位的丝氨酸 残基。这些寡糖链经由末端唾液酸残基修饰。酶去除糖基化红细胞生成素 的所有唾液酸残基会导致体内活性而不是体外活性的丧失，因为红细胞生成素的唾液酸化阻止了其被肝结合蛋白的结合及随后的清除。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白包括人红细胞生成素 的类似物，所述类似物具有一处或多处人红细胞生成素氨基酸序列的改变， 从而增加了唾液酸附着位点的数目。这些糖蛋白类似物可通过包括添加、 缺失或替换氨基酸的定点诱变形成，所述诱变增加或改变可供糖基化的位 点。唾液酸含量水平高于人红细胞生成素的糖蛋白类似物是通过增加不影 响生物学活性所需的二级或三级构象的糖基化位点而产生。用于本发明所 述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括糖基化位点处糖类附着水平增加 的类似物，所述类似物通常涉及紧邻N -连接或O -连接位点的一个或多 个氨基酸替换。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括从 红细胞生成素羧基端延伸一个或多个氨基酸并提供至少一个额外的糖基位 点的类似物。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括其氨 基酸序列包含至少一个糖基化位点的重排的类似物。此种糖基化位点重排 涉及在人红细胞生成素中缺失一个或多个糖基化位点和加入一个或多个非 天然存在的糖基化位点。具有额外糖基化位点的红细胞生成素类似物的详 细情况公开于EUiot在1995年3月1日发表的欧洲专利申请640 619。此外，用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白包含这样的氨 基酸序列，其包括至少一个额外的糖基化位点，例如但不限于包含通过选 自下列^务饰而修饰的人红细胞生成素序列的红细胞生成素Asii3()Thr32;Asn51Thr53，ASn57Thr59;Asn69;ASn69Thr71;Ser68ASn69Thr71Val87Asii88Thr90Ser87ASn88Thr90Ser87ASn88Gly89Thr90;Ser87ASn88Thr90Thr92; Ser87ASn88Thr9°Ala162; ASn69Thr71Ser87Asii88Thr90; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; ASn89Ile9QThr91; Ser87ASn89Ile90Thr91; ASn136Thr138; ASn138Thr14(); Thr125;和 PiV24Thr12S。此处使用的用于氨基酸序列修饰的表示指在未经修饰的相应蛋白质 (如SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: 2的hEPO )中上标数字所代表的位 置处变为各上标数字前紧邻的氨基酸。所述糖蛋白也可以是在糖蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的 类似物，其中该额外氨基酸包括至少一个糖基化位点，就是说，上文定义 的缀合物也指化合物，其中糖蛋白具有包含人红细胞生成素序列的序列和 人红细胞生成素序列羧基末端的第二序列，其中第二序列含有至少 一个糖 基化位点。该额外氨基酸可以包含来自人绒毛膜促性腺激素羧基末端的肽 片段。优选该糖蛋白为选自如下的类似物(a)具有自羧基末端延伸的氨 基^j^歹'J Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gin (SEQ ID NO:3)的 人红细胞生成素；(b )进一步包含Ser87 Asn88 Thr9。EPO的(a )的类似 物；以及(c )进一步包含Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90EPO的(a )的类 似物。所述糖蛋白也可以是其氨基酸序列含有至少 一个糖基化位点的重排的 类似物。所述重排可以包括人红细胞生成素中任一N-连接的糖基位点 的缺失，以及在人红细胞生成素氨基酸序列中的第88位添加N-连接的糖 基位点。优选该糖蛋白为选自Gin24 Ser87 Asn88 Thr9G EPO; Gin38 Ser87Asn88 Thr90 EPO和Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO的类似物。本文中使用的术语"低级烷基"表示具有1至6个碳原子的直链或支 链烷基基团。低级烷基基团的实例包括甲基、乙基和异丙基。根据本发明， R可为任意低级烷基。其中R是曱基的缀合物是优选的。符号"m"表示聚(环氧乙烷)基团中的环氧乙烷残基(OCH2CH2) 的数目。环氧乙烷的单个PEG亚单元的分子量为大约44道尔顿。因此， 缀合物的分子量(除去EPO的分子量)依赖于数值"m"。在本发明所述 的缀合物中，"m"是大约450至大约900 (相当于分子量为大约20kDa 至大约40kDa)，优选地是大约650至大约750 (相当于分子量为大约 30kDa)。对数值m的选择使得本发明的所得到的缀合物具有与未修饰的 EPO相当的生理活性，其活性可以是与未修饰的EPO的相应活性相同、 更大或其一部分的活性。"大约"某个数量的分子量表示该分子量在通过 常规分析技术确定的数量的合理范围之内。对数值"m，，如此选择，从而 与红细胞生成素糖蛋白共价连接的每一个聚(乙二醇)基团的分子量在大 约20kDa至大约40kDa之间，优选是大约30kDa。在本发明的缀合物中，数值"n"是与红细胞生成素蛋白的游离氨基(包 括赖氨酸的s-氨基和/或N端氨基)通过酰胺键共价结合的聚(乙二醇) 基团的数目。本发明的缀合物中，每个EPO分子可以具有一个、两个或三 个PEG基团。"n"是1至3的整数，优选地"n"是1或2，更优选地"n，， 是l。式(I)的化合物可以从已知的聚合材料<formula>formula see original document page 18</formula>通过式(II)化合物与红细胞生成素糖蛋白的缩合而制备，其中R和m如 上所述。其中x是3的式II化合物是oc -低级烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG - SBA )。其中x是2的式I1化合物 是oc -低级烷氧基，聚(乙二醇)的丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG -SPA)。可以使用胺与活化酯反应形成酰胺的任何常规方法。在上述反 应中例证性的琥珀酰亚胺酯是导致酰胺形成的离去基团。使用诸如式II化 合物的琥珀酰亚胺酯与蛋白质产生缀合物公开于美国专利5，672，662中，公 布于1997年9月30日(Harris等人)。人HPO含有9个游离氨基，即N端氨基加上8个赖氨酸残基的s — 氨基。当聚乙二醇化试剂与式II的SBA化合物化合时，发现在pH7.5，蛋 白质PEG比率为1: 3以及反应温度为20 - 25。C时，产生了单聚乙二醇 化种类、二聚乙二醇化种类和痕量的三聚乙二醇化种类的混合物。当聚乙 二醇化试剂是式II的SPA化合物时，在除了蛋白质PEG比率为1: 2之 外的相似条件下，主要产生单聚乙二醇化种类。聚乙二醇化EPO可以以混 合物施用，或者以阳离子交换层析分离的不同聚乙二醇化种类施用。通过 控制反应条件(例如反应物的比例、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间等 等)，可以改变不同聚乙二醇化物质种类的相对量。本发明提供了包含上述缀合物的组合物的用途。该组合物含有至少90 %的单-PEG缀合物，就是说，其中n为1,可通过实施例5所示制备。 通常，期望是红细胞生成素的单-PEG缀合物，这是由于它们易于具有比 二-PEG缀合物更高的活性。单-PEG缀合物的百分比以及单-和二-PEG的种类的比率可以通过在洗脱峰值附近集中更宽的级分从而降低单 -PEG的百分比，或通过在洗脱峰值附近集中更窄级分从而增加组合物中 单-PEG的百分比来控制。大约卯。/。的单-PEG缀合物是产率和活性的 良好平衡。有时，期望的组合物是例如其中至少92%或至少96%的缀合物 是单-PEG (n-l)的组合物。在本发明的一个实施方案中，其中n为l 的缀合物的百分比是卯Q/。至96 % 。本发明所述的化学修饰的红细胞生成蛋白能够通过简单扩散穿过 BBB是违反直觉的，因为本发明所述的NEA高度亲水，并且分子量大。 这是由于Patridge等人(Pharmaceutical Research, Vol. 15， No. 4， 1998)指出，用小PEG分子(分子量为2000道尔顿)进行PEG化会减少肽如源 自脑的神经营养因子向脑的被动摄入。不过，我们下面的实施例清楚地说 明，NEA出现在CSF中。这些发现与我们猜想的一致，本发明所述的在 其分子结构中整合有聚(乙二醇)部分的NEA能够通过促进或主动运输 途径穿过BBB。患有中风的患者必须尽快用本发明的NEA予以治疗。对于慢性神经 系统疾病，由于其在血液流路中的停留时间(即更长的半寿期)延长，NEA 可以周期性地施用。由于NEA具有较长的停留时间并显示与EPO受体降 低的亲和力，血红蛋白的水平可以被控制在一个相当窄的范围内。因为通 常与施用EPO出现的血红蛋白水平的峰值和谷值通过施用NEA而降低， 副反应如血栓的风险和人们不期望的血液增稠都减少了 。下面的实施例进一步阐述了本发明。这些实施例描绘了本发明的多种 具体方案，但并不对其应用进行限制。实施例实施例1:用mPEG - SBA对EPO进行PEG化 人EPO的发酵与纯化例如描述在US6583272的实施例1中。 依照US6583272的实施例1中所述的无血清方法纯化的EPO经分析 方法确定是均一的，并显示出由8个同种型组成的典型的同种型。通过正 常红细胞(normocythaemic)小鼠检测，该EPO具有190，000IU/mg的生物 学比活性。釆用的PEG化试剂为曱氧基-PEG-SBA，即R为曱基；x 为3; m为650至750 (平均约680,相应的平均分子量为大约30kDa )的 式II化合物。 PEG化反应向lOOmg EPOsf ( 9.71ml的10.3mg/ml的EPOsf储存液，5.48拜ol) 中，加入10ml的含有506mg的30kDa曱氧基-PEG - SBA (16.5 |u mol)(得 自Shearwater Polymers, Inc., Huntsville， Alabama)的0.1M磷酸钾緩沖 液，pH为7.5，室温(20-23'C)混合2小时。蛋白质终浓度为5mg/ml，蛋白质与PEG试剂的比值为1: 3。两小时后，加入冰醋酸调节pH至4.5终止 反应，保存于-20°C，直至纯化。 纯化1. 缀合混合物将大约28ml SP-SEPHAROSE FF (磺基-丙基 阳离子交换树脂)装入AMICON玻璃柱(2.2 x 7.5 cm)中，用20mM pH4.5 的乙酸盐緩沖液以150ml/小时的流速平衡柱子。将含有30mg蛋白质的 6ml反应混合物用平衡緩沖液稀释5倍，加样到柱上。未被吸附的材料 用緩冲液洗去，被吸附的PEG缀合混合物用含有0.175M NaCl的平衡 緩沖液洗脱。仍留在柱子上的未修饰的EPOsf用750mM NaCl洗脱。 用起始緩沖液重新平衡柱子。样品经SDS-PAGE分析，测定它们的 PEG化程度。发现0.175M NaCl洗脱液中含有单PEG化种类、二 PEG 化种类和痕量的三PEG化种类，而750mM NaCl洗脱液中含有未修饰 的EPOsf。2. 二 PEG-EPOsf和单PEG-EPOsf:在前一个步骤中从柱中洗 脱出的纯化的缀合混合物用緩冲液稀释4倍，并被重新加样到柱上，如 前文所述进行洗涤。分别用0.1M NaCl和0.175M NaCl从柱中洗脱出了 二 - PEG - EPOsf和单-PEG - EPOsf 。并使用750mM NaCl进行洗脱， 洗脱出任何未修饰的EPOsf。或者，将反应混合物用乙酸盐緩冲液稀释5倍并加样到SP -琼脂糖柱 (约0.5mg蛋白质/ml凝胶)上。洗涤柱并吸附单-PEG - EPOsf、 二-PEG-EPOsf ，并且如前文所述进行洗脱未j务饰的EPOsf。 结果通过化学缀合数均分子量为30kDa的线性PEG分子合成出PEG-EPOsf, PEG - EPOsf衍生于EPOsf的伯氨基基团和30kDa PEG - 丁酸的 琥珀酰亚胺酯4汙生物之间的反应，形成一种酰胺键。结果总结于表1。包含单-和二 - PEG — EPOsf的纯化的缀合混合物 通过SDS - PAGE分析不含有未修饰的EPOsf。缀合混合物占23.4mg或 初始材料的78%。阳离子交换层析分离单-和二-PEG-EPOsf表明，在缀合混合物中单-与二-PEG的比例几乎是1: 1。在反应完成后，各种組 分的比率为单二未修饰=40: 38: 20 ( % )。总产率几乎是定量的。表1. EPOsf PEG化的结果样品 蛋白质(mg) 产率(％)反应混合物 30 100单- 12.0 40二- 11.4 38未修饰的 6.0 20缀合混合物23.4 78实施例2:用mPEG - SPA对EPO进行PEG化将实施例2中使用的EPOsf的不同等分试样与30kDa曱氧基-PEG - SPA(Shearwater Polymers, Inc., Huntsville， AIabama)反应。反应是在蛋 白质试剂比率为l: 2的条件下进行的，纯化按照实施例2的方法进行。 主要产生了单-PEG化的产物。所述的EPO缀合物的体内活性描述在US6583272的实施例4中。实施例3:体内测试内实验。EPO和EPO缀合物(根据实施例1获得)都通过静脉内以25ng/kg 体重的单个剂量施用于大鼠的尾静脉。在显示的时间点(注射后2和6个 小时)，先收集脑脊髓液(CSF)的样品，然后收集血浆和(舌下或末端)。 通过向小脑延髓池插入采样针(0.7 x 19 mm)获取CSF。通过毛细管力用硅 管(ID 0.5毫米)排尽CSF。利用这种技术，从一只大鼠可获得约0.1ml CSF。 化合物EPO，浓度1.84mg/ml施用量2ml/千克体重 组合物水性緩冲液EPO缀合物，浓度6.2 mg/ml 施用量2ml/千克体重 组合物水性緩沖液收集样品中的化合物浓度经酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。 结果表1 - 3显示本发明所述的NEA能够穿过血脑屏障。在2到6小时的 时间期间内缀合物在体液中的浓度增加了 。
权利要求
1. 红细胞生成分子用于制备治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物中的用途，通过向需要此种治疗的患者的血液流路中施与有效量的药物而治疗脑和脊髓的神经变性疾病，其中所述红细胞生成分子包含选自人红细胞生成素及其类似物的具有至少一个游离氨基的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷基；x为2或3，m为约450至约900；n为1至3；且选择n和m，从而使所产生的红细胞生成分子的分子量减去红细胞生成部分的分子量后为约20千道尔顿至约100千道尔顿。
2. 根据权利要求l的红细胞生成分子的用途，所述红细胞生成分子具 有下式P-[NHCO-(CH2)x—(OCH2CH2)m-ORn (I) 其中x、 m、 n和R如权利要求1中所定义，且P为红细胞生成素部 分的残基，其不包括n个与聚(乙二醇)基团形成酰胺键的氨基。
3. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中R为 甲基。
4. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中m为 约650至约750。
5. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中n为1。
6. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中R为 曱基；m为约650至约750;且n为l。
7. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，所述红细胞 生成分子具有下式[CH30(CH2CH20)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P其中m为650至750， n为1，且P如权利要求1所定义。
8. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中红细胞 生成素部分为人红细胞生成素。
9. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中红细胞 生成素部分具有序列SEQIDNO: 1。
10. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中红细 胞生成素部分具有通过添加1至6个糖基化位点而被修饰的人红细胞生成 素的序列。
11. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中脑和 脊髓的神经变性疾病涉及选自中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤的急性疾病。
12. 根据前述权利要求1 - 10中任意一项所述的红细胞生成分子的用 途，其中脑的神经变性疾病涉及慢性治疗和选自精神分裂症、阿尔兹海默 症、亨廷顿症、痴呆、脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征、帕金森症、 海绵脑病、多发性硬化以及与细菌或病毒感染相关的神经变性。
13. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中红细 胞生成分子以注射、透皮贴片、皮下储库或吸入施用于血液流路。
14. 根据前述任意一项权利要求的红细胞生成分子的用途，其中以红 细胞生成素部分的量测定的施用量为以多达约两周的约25照至约500照 每天施用于急性患者，或者对于慢性治疗则以每周约25照至约l，OOO照施 用。
15. 根据权利要求14的红细胞生成分子的用途，对于急性患者多达一 周以165|iig /天施用，或者对于慢性治疗以每周200照施用。
16. 试剂盒，其包含根据前述任意一项权利要求的有用的红细胞生成 分子。
17，根据权利要求16所述的试剂盒，其包含红细胞生成分子和提高血 脑屏障通透性的物质。
18. 才艮据权利要求16或17的试剂盒的制备方法。
19. 用于治疗脑和脊髓的神经变性疾病的方法，其包括向需要此种治疗的患者的血液流路中施与治疗有效量的红细胞生成分子，所述红细胞生 成分子包含选自人红细胞生成素及其类似物的具有至少 一个游离氨基的红 细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述 红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)X—(OCH2CH2)m—OR的聚(乙二醇) 基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO与所述的氨基之一形成 酰胺键；其中R为低级烷基；x为2或3， m为约450至约900; n为l至 3;且选择n和m,从而使所产生的红细胞生成分子的分子量减去红细胞 生成素部分的分子量后为约20千道尔顿至约100千道尔顿。
20. 药物，其包含治疗脑和脊髓的神经变性疾病的红细胞生成分子， 通过向需要此种治疗的患者的血液流路中施与有效量的药物而治疗脑和脊 髓的神经变性疾病，其中所述红细胞生成分子包含选自人红细胞生成素及 其类似物的具有至少一个游离氨基的红细胞生成素部分，所述人红细胞生 成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点 而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式 -CO-(CH2)X-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一 聚(乙二醇)基团的-CO与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷 基；x为2或3， m为约450至约900; n为1至3;且选择n和m，从而 使所产生的红细胞生成分子的分子量减去红细胞生成部分的分子量后为约 20千道尔顿至约100千道尔顿。
21. 如上所定义的本发明。
全文摘要
本发明涉及红细胞生成分子在制备治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物中的用途，通过向需要此种治疗的患者的血液流路中施与有效量的药物而治疗脑和脊髓的神经变性疾病，其中所述红细胞生成分子包含选自人红细胞生成素及其类似物的具有至少一个游离氨基的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接；本发明还涉及包含本发明的红细胞生成分子的试剂盒。
文档编号A61K47/48GK101277715SQ200680036094
公开日2008年10月1日 申请日期2006年9月18日 优先权日2005年9月28日
发明者A·哈泽尔贝克, F·赫廷, J·胡维勒, M·雅尔斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司