具有ecm材料的生物可降解支架的制作方法

专利名称：：具有ecm材料的生物可降解支架的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包括具有ECM材料的生物可降解层的支架，所述ECM材料以片状、纤维状、颗粒状、粉末状等形式并入生物可降解层。
背景技术：
：支架是在形成新生功能性组织过程中用来引导细胞的组织、生长和分化的结构。为达到组织重建的目标，支架必须符合一些特定的要求。高多孔率和足够的孔径是促进细胞生长和细胞和营养成分在整个结构中的扩散所必须的。因为支架需要被周围组织吸收而不必用手术移除，所以生物可降解性是必不可少的。已经研究过许多不同的材料(天然的和合成的，生物可降解的和永久的)用作支架。在组织工程作为研究课题出现以前，这些材料中大部分已经被医学领域所熟知，并已经用作生物可吸收的缝合线。这类材料的实例是胶原蛋白或一些线性的脂肪类聚酯。然而，当在体内测试实验室所制的支架时，经常发现，细胞不易生长到这些支架内，这可能是因为合成的支架内没有生物信号分子(例如生长因子)。为了提高支架的生物性质并加速伤口愈合，一些实验室已经将生长因子添加到合成支架中并发现其对伤口愈合有有益效果。在所有这些发表论文中，单一的生长因子已经被并入薄层或者水凝胶中。已测试过的生长因子包括FGF-2(1;2)，测试浓度为25网/(^2的P-FGF-2(2)、FGF-1(3;4)、EGF(5)(14)或测试浓度为2pg/cm2的TGF-P(6;7)。来自温血脊稚动物的非细胞性的胞外基质被广泛应用于组织工程和整形外科(8)。已发现非细胞性胞外基质具有许多生长因子(9-11)。ECMs包含许多生物学分子并且已发现细胞易于填充这些浓缩的ECM层(12、13)。目前市场上的ECM是人源或者猪源的。将细胞从组织中分离，然后将组织冻干并切片。猪源的组织片层大小不同。这些片层的价格很高。此片层在未水化时比较坚硬。例如来自Acell公司的片层。他们出售可以促进伤口愈合的ECM片层(尿道膀胱基质，UBM)。这样的片层(7x5cm)重量约为100rag，密度约为190mg/cm3。ECMs或者ECM蛋白质在伤口治疗中的应用广为人知。这类产品为片层或者水凝胶形式。片层类产品的实例如来自Healthpoint的OASIS(冻干的猪源ECM片层)和来自Wrightmedical的Graftjacket(冻干的人源ECM片层)。这些片层可以为伤口处的细胞提供给支架和蛋白质复合物。市面上含有ECM蛋白质的非支架类产品的实例如来自MiUnlycke的Xelma，这是一种包含发育中的猪牙齿ECM的蛋白质提取物的水凝胶。发明概述该申请公开了将ECM并入支架可以保持ECM的生长促进作用。我们证明了在使用包含ECM材料的支架时，高浓度的ECM出人意料地不能产生更好的细胞形态。低于60%的浓度就足以获得最好的细胞形态和分布。另外，证明通过改变支架中离散的EMC材料的浓度，所述支架的物理特性会随之改变，但是这种改变是取决于支架的材料。本申请通过展示一种在灭菌后可保持ECM材料的生物活性的灭菌策略将此认识应用到患者身上。详细内容本发明涉及包含离散ECM颗粒的临时性的复合支架。通过将ECM的不连续区域添加到支架上，可能组合所述支架可提供的一定范围的物理特性(例如强度、柔软度、灵活性、耐用性)，与ECM的重建特性。另外，这种支架的价格低于其他的ECM支架，既因为粉末是来自生产非细胞ECM片层的废料，还因为可以确定针对每一种应用的离散的ECM原料的最佳量并且可以均一地分布到敷料中从而避免不必要的高浓度ECM。除了ECM的作用，基质材料的多孔结构提供给细胞向内生长的结构。在一个实施方案中，通过添加离散的ECM原料(比如颗粒状，片状、纤维状、或粉末状)来获得ECM的不连续区域，。ECM材料的离散相是指在其形态和密度上不同于他们所嵌入的基础材料的ECM材料。实施例5中的组织切片或实施例6中的扫描电镜(SEM)观察可以证明这一点。通过添加ECM的不连续区域，我们可以控制ECM的浓度。如实施例(例如实施例2和3)显示，控制浓度来优化细胞生长是至关重要的。在支架成型(例如冻干)前将ECM材料添加到支架中是优选的。通过这种方式，ECM材料均一地分布到支架中。即是说，在支架固化过程中(例如冷冻过程)支架一端的ECM的密度可能略微高于另一端。然而，在本文中均一分布允许这种支架内的密度梯度，只要支架中心的密度〉0。这样，优选的实施方式涉及临时性的连续的支架，其包含均一分布的ECM的不连续区域，其中ECM的不连续区域的浓度在20%(w/w)和60%(w/w)之间。在本文中，临时的支架是指可以消失、被水解、瓦解、生物降解/生物再吸收/生物可吸收的、可溶解的或者通过其他方式从伤口处消失的支架。可以不必从伤口移除任何东西是一个巨大的临床优点。这样，新形成的组织不会因移除临时支架而被破坏和压迫。传统上优选的是可以在1天-10周(取决于应用条件)内瓦解的支架。对于开放性伤口应用，优选可以在1-10天，比如2-7天内瓦解的支架。在该发明的一个方面中，所述支架是生物可降解的。在一个实施方案中，支架是连续性支架。也就是连续相的支架。具有不连续区域的连续性支架产生复合材料。如其他复合材料一样，这是由两种或者更多种组成性材料制成的工程材料，其具有显著不同的物理或化学性质并且可以在完成的结构中保持分离和相异。胞外基质(ECM)是动物或者人组织中的非细胞部分。从而ECM就是细胞周围的复合材料。所以，优选地，ECM不连续区域是无细胞区域。无细胞区域可以通过使用物理的、酶的和/或化学的方法而获得。细胞层可以用过例如擦抹组织而物理性地除去。可以使用去垢剂和酶来将组织中的细胞互相分离。也可以使用水或其他低渗溶液，因为低渗可以促使组织中的细胞破裂从而促进脱细胞过程。另一种获得无细胞区域的方法是将ECM粉末(ECM的不连续区域)添加到支架基质中。因为细胞成分可以引起免疫反应，所以一旦植入后，无细胞的产品可以最小化任何免疫排异的风险。广义来说，ECMs具有三种主要成分纤维元素(特别是胶原蛋白、弹性蛋白或网硬蛋白)、连接蛋白(例如纤连蛋白，层粘连蛋白)和空间填充分子(通常是粘多糖)。已知ECMs可以充当生长因子和细胞因子的库来吸引细胞和促进细胞增殖(9;10)。包含颗粒状ECMs的临时支架用在伤口中时会被自伤口边缘的细胞以及来自循环血的细胞所填充。当细胞侵入支架，支架材料会被降解并且支架最终会被新组织所替代。ECM不连续区域的浓度优选高于15%(w/w)，高于20y。(w/w)，比如高于30%(w/w)。ECM不连续区域的浓度优选低于95%(w/w),低于W"w/w)，比如低于80%(w/w)，或低于70。/。(w/w)。在本发明的特别优选的实施方案中，该浓度在20%(w/w)和60。/。(w/w)之间，比如在20%(w/w)和橋(w/w)之间。人的皮肤包含由其中的角质细胞形成的上层表皮。表皮之下是真皮，由其中的成纤维细胞和内皮细胞组成。当促进成纤维细胞生长时，本文的实施例(例如实施例3)显示ECM浓度从0%(w/w)增加到大约60%(w/w)可以导致支架表面细胞数量的显著增加以及细胞形态的显著改善。这样，本发明的一个方面涉及包含40%(w/w)-60°/。(w/w)ECM以促进成纤维细胞生长的伤口护理装置。在促进角质细胞生长时，本文的使用明胶支架的实施例显示ECM的浓度从0°/。(w/w)增加到大约25%(w/w)可以显著改善细胞聚集生长的能力(如角质细胞所做的)和细胞形态以及细胞总量。但是ECM的浓度增加到40%(w/w)以上会降低以表面的细胞数量、细胞形态和细胞数目表示的细胞生长促进作用。由此，该发明的一个方面是关于一个含有20。/。(w/w)-30%(w/w)ECM的伤口护理装置，其可以促进角质细胞的生长。本发明的伤口敷料可以包括很多层。这些层可以包括一层或多层的生物可降解材料，这些材料都可任选地包括ECM。如果ECM被并入超过一层中，其剂量可以在层间变化。在一个实施方式中，第一层包括40%(w/w)-60%(w/w)的ECM;第二层包括20%(w/w)一30%(w/w)的ECM。在另一个实施方式中，设计所述支架用于不同细胞类型的生长刺激。也就是，用于成纤维细胞的生长刺激时，最佳浓度是40%(w/w)-60°/。(w/w)ECM，用于内皮细胞的最佳浓度是30%(w/w)-60%(w/w)ECM，而用于角质细胞的生长刺激，最佳浓度是20%(w/w)-30%(w/w)ECM。本发明的一个实施方式涉及包括两种支架的伤口护理装置，第一种支架用来刺激成纤维细胞生长并含有40%(w/w)-60y。(w/w)的ECM不连续区域的浓度，和第二种支架用来刺激角质细胞生长并含有20%(w/w)-30W(w/w)的ECM不连续区域的浓度。可以添加第三种支架到该伤口护理装置上，其含有20°/。(w/w)-30。/。(w/w)的ECM不连续区域的浓度。本文的数据使包括40%(w/w)-60%(w/w)ECM的不连续区域的支架可用于刺激成纤维细胞生长。本文的数据也可使包括20%(w/w)-30。/。(w/w)的ECM不连续区域的支架用于刺激角质细胞生长。我们的经验是，当促进成纤维细胞生长时，生长的成纤维细胞会分泌出生长因子而诱导角质细胞的生长。这样，本发明的优选方面涉及其中ECM的不连续区域的浓度在40%(w/w)和50。/。(w/w)之间的支架。因此，促进了成纤维细胞的生长从而随后促进了角质细胞的生长，并愈合了伤口。以重量/重量百分比计算支架结构中的ECM浓度。即是浓度(w/w)=MECM/(MBCM+M支架)xl000/0。其中MECM是以克表示的ECM质量，而M支架是以克表示的支架的质量(不包括ECM)。在可溶解的支架(例如MPEG-PLGA)中，你可以将该支架溶解在溶剂中并过滤ECMs。在冻干后，对该材料称重。在非可溶性支架中，所述材料包埋在合适的包埋材料(例如石蜡)中，以统计学(statically)代表性数目切片并用合适的染料染色，所述染料只对ECMs染色而不对支架材料染色。使用图像分析，计算ECMs相对支架的量。例如，它们可包含成纤维细胞生长因子-2(基本FGF)、转化生长因子-p(TGF-P)和血管内皮生长因子(VEGF)。也优选地，本发明的ECM基础材料包含附加的生物活性组分，包括，例如一种或多种胶原蛋白、粘多糖、糖蛋白和/或蛋白聚糖。所述ECM可包括基膜，其大部分由IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖制成。本发明的ECM材料优选地用从肉类食品用动物收集来的组织制备，所述动物包括但不局限于猪、牛和羊。其他温血脊推动物也可用作组织来源，但来自肉类食品用动物的组织的更高可用性使得该组织是优选的。遗传工程去除半乳糖基(galacatosyl)、al，3半乳糖(GAL表位)的猪可用作生产ECM材料的组织来源。在优选的实施方式中，所述ECM是猪来源的。所述ECM材料可从任何动物获得。其可来自，但不局限于肠组织、膀胱、肝脏、脾脏、胃、淋巴结或皮肤。特别优选的是来自人尸体的皮肤、猪膀胱粘膜下层(UBS)、猪膀胱基质(UBM)或猪小肠粘膜下层(SIS)的ECM。优选回避人组织以最小化疾病的转移。这样，在优选的实施方式中，ECM的不连续区域来自动物组织。因为物种相似性，优选使用来自温血哺乳动物的ECM。在特别优选的实施方式中，ECM的不连续区域是UBM(膀胱基质)颗粒。所述UBM材料包括ECM蛋白质的特定混合物，其中一些量化为TGF-(3293±8pg/g、b-FGF3862土170pg/g和VEGF475土22pg/g(即是pgVEGF/gUBM)。ECM片层具有平均密度是3mg/cm2，浓度是大约TGF-(J:0,9pg/cm2、b-FGF:11,6pg/cm2和VEGF1,4pg/cm2。ECM的形式本发明一方面提供具有持续生长因子给药的支架。本发明所使用支架的一个特性是在多孔基础材料中分散所述ECM的不连续区域，从而所迷ECM可接近细胞。当细胞在支架基质中迁移的时候，所述ECM的不连续区域暴露于蛋白酶活性并被降解，而据信这导致了生物活性組分从ECM的不连续区域中释放(14)。这样，可在使用期间一定程度上持续维持生物活性组分的释放，从而提供了对创伤灶和细胞的一定程度上持续的给药。在一个实施方式中，所述ECM的不连续区域在临时支架内均匀分布。ECM具有几种微型形式例如颗粒状、片状、纤维状或粉末状。所有这些都被认为是ECM的不连续区域，即离散ECM材料。ECM的不连续区域的优选形式是ECM颗粒。优选的颗粒具有平均直径为大约150|jm。由来自MalvernInstrument的Mastersizer200测定体积加权平均。例如，加权平均为100pm的表面具有最小颗粒为3jam，最大颗粒为750um。在此情况下，体积加4又平均是250nm。通过在多孔支架内分散ECM的不连续区域，可能优化该支架的物理特性(例如强度、柔軟度、灵活性，耐用性)，而没有对ECM的不连续区域的大损伤。为获得ECMs的有益效果和多孔支架可提供的物理特性，可将特定的ECM包括入创伤敷料(如支架)中并用于组织工程(例如软组织工程、骨骼、软骨、韧带和肌腱的重建)或牙科应用。这种多孔支架应优选是生物可降解的材料。所述临时支架是冻干形式、纤维形式(编织或不编织)、泡沫形式或是薄膜。在所有形式中，ECM的不连续区用于该支架的材料是任何生物可降解材料，可来自合成的和天然的原料。在天然材料构建的支架中，特别优选的是基于胞外基质衍生物的材料。这种材料的实例是蛋白质材料，例如胶原蛋白或纤维蛋白，和多糖材料，例如壳聚糖或粘多糖(GAGs)。在一个实施方式中，所述生物可降解支架由包含蛋白质的物质制成。这使降解可通过蛋白裂解酶进行。这样的支架优选地由以下蛋白质制成胶原蛋白、角蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原和这些蛋白的衍生物和类似物，或者变性蛋白质，例如明胶。通过使用聚合物材料，例如明胶、纤维蛋白、透明质酸、胶原蛋白、几丁质、壳多糖、角蛋白、海藻盐、PLA和PLGA制作支架，可能通过组合和修饰改变支架的物理特性(强度、柔软度、灵活性)。在另一个实施方式中，所述生物可降解支架由包含碳水化合物/多糖的物质制成。这使得可通过水解和酶促降解该多糖而进行降解。这样的支架优选地由多糖，例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、疏酸皮肤素、肝素、硫酸角质素和这些的衍生物、藻酸盐、HSC纤维素和纤维素衍生物(CMC)、一些藻酸盐、壳聚糖、几丁质、果胶和果胶衍生物、透明质酸和蛋白聚糖(粘多糖)和这些的衍生物制成。在另一方面，所述临时支架是合成的。这样的支架主要通过与酶促消化相组合的水解所降解。这些支架优选地由选自以下的材料制成PLA(聚交酯)、PGA(聚乙交酯)、PLGA(聚(丙交酯-共-乙交酯)、MPEG-PLGA、PCL(聚己内酯)、聚原酸酯、聚对二氧环己酮、聚酸酐、聚羟基烷基酸酯和以上这些材料的共聚物。已知的天然支架/凝胶的实例是胶原蛋白基(3、6),纤维蛋白基(4)、壳聚糖基(1)或明胶基(2、7)。常用的合成材料是PLA-聚乳酸。它是一种聚酯，在人体内降解形成乳酸，后者是天然化学物质易于从人体中去除。相似的材料是聚乙醇酸(PGA)和聚己内酯(PCL):它们的降解机制与PLA相似，但它们与PLA相比分别表现出更快和更慢的降解速率。可按如下方法合成这样的MPEG-PLGA多聚体将MPEG、DL-丙交酯、乙交酯和4%(w/v)甲苯中的辛酸亚锡添加到氮气套的瓶子中，密封该瓶子，并加热、振荡直到内容物透明、均一，其后将其放置在120-200°C炉子中1分钟-24小时。也可在合适溶剂(例如二氧杂环己烷)的溶液中进行该合成，以利于其后的纯化。将MPEG、DL-丙交酯、乙交酯和4。/。(w/v)二乙基己酸亚锡添加到氮气套的瓶子中并如上述处理。该聚合物可如下纯化将该聚合物溶解在合适的溶剂(例如二氧杂环己烷、四氢呋喃、氯仿、丙酮)中，并在无溶剂(例如水、甲醇、乙醇、l-丙醇或2-丙醇)中、-40°C-40°C温度下边搅拌边沉淀。使该聚合物沉淀，丢弃溶剂，然后该聚合物在40。C-120°C的真空烤箱中千燥过夜。如上文示例所述，支架的基础材料可由合成的和/或天然来源的材料制成一一其中包括它们的组合。因此，该支架可包括蛋白质、多糖和合成的聚合物的组合。本发明中使用的支架的一个功能是提供促进细胞生长的基质。促进细胞向支架内生长的一个标准是支架在室温下是固态。即是说，该支架具有固定的物理结构，双连续结构。利用该结构，有助于细胞通过支架迁移并形成新的组织。另一个促进细胞生长的标准是具有开孔的支架，或至少具有允许细胞迁移到多孔性。多孔性定义为P-l-p(V/M)。其中P是支架的多孔性，p是所使用聚合物系统的密度，M是重量，而V是所制造的支架的体积。本发明的一个实施方式涉及包括如本文描述的ECM的不连续区域的多孔支架。如在实施例中所举例说明的，超过50%的多孔性使得细胞生长。这样，在一个优选实施方式中，所述支架包括大于50%的多孔性，例如>80%，甚至大于90%，或95%的多孔性。优选多孔支架具有开放互相连接的孔。在本发明的优选实施方式中，所述临时支架具有0.1-8mm,优选的0.3-3mm，更优选的0.5-2隨厚度。在本发明的特别优选的实施方式中，生物可降解层的厚度是大约1mm。在本发明的优选实施方式中，所述生物可降解层与伤口直接接触。根据本发明的支架的目的是用作创伤敷料。牢记的在创伤敷料中一个因素是使其柔软且舒服。柔软且舒服的含义是其在用于开放性伤口时，不会不适或疼痛，因为边缘不会切割并压迫敏感伤口的周围，并且敷料会随着伤口的曲率而弯曲。这也保证了伤口区域和含ECM支架间的直接接触。这样柔软且舒服的基质的一个实例是壳聚糖，其在1-2%(w/w)溶液中制备并冻干。所得是柔软的开放性基质，即具有开放的相互连接的孔的支架。该基质也具有足够的开孔使得细胞生长和迁移。在一组实施方式中，根据本发明的敷料用于急性伤口、烧伤、慢性伤口和/或外科伤口。在另一个实施方式中，根据本发明的敷料用于整形外科。在一个相关的实施方式中，包含ECM不连续区域的支架用于组织工程(例如，重塑软组织、骨骼、软骨、韧带和肌腱)或者牙科应用。在许多这些应用中，需要根据本发明的敷料被灭菌。本发明的一个实施方式涉及包括ECM不连续区域的灭菌的、临时的、连续支架。通常表示为临时的、连续的、防菌包装的包括ECM不连续区域的支架，在包装上标记说明此产品是灭菌的。如在实施例4中举例说明的，通过例如辐射的灭菌保持了对ECM依赖性支架类型的生物学作用。防菌材料是本领域技术人员已知的。参考文献1.0bara，K.，Ishihara，M.,Fujita,M.，Kanatani，Y.，Hattori，H.，Matsui，T.，Takase，B.，Ozeki，Y.，Nakamura，S.，Ishizuka，T.，Totninaga，S.，Hiroi，S.，Kawai，T.，&Maehara，T.2005,"Accelerationofwoundhealinginhealing-impaireddb/dbmicewithaphotocrosslinkablechitosanhydrogelcontainingfibroblastgrowthfactor-2"，/F0w"c^e;7a/r，vol.13，no.4，pp.390-397.2.Miyoshi,M.，Kawazoe，T.，Igawa，H.H.，Tabata，Y.，Ikada，Y"&S画ki，S.2005，"EffectsofbFGFincorporatedintoagelatinsheetonwoundhealing"，/,"/o/w"er,5W./W//zz.#《vol.16，no.7,pp.893—907.3.Pandit,A.，Ashar，R.，Feldman,D.，&Thompson,A.1998，"Investigationofacidicfibroblastgrowthfactordeliveredthroughacollagenscaffoldforthetreatmentoffull-thicknessskindefectsinarabbitmodel",尸/a化jec0/7"r.，vol.101，no.3，pp.766-775.4.Pandit，A.S.，Wilson,D.J.，&Feldman,D.S.2000，"Fibrinscaffoldasaneffectivevehicleforthedeliveryofacidicfibroblastgrowthfactor(FGF-1)11，/.S/o/z/"er.J;7/7人，vol.14，no.3，pp.229-242.5.Ulubayram，K.，Nur，C.A.,Korkusuz，P.，Ertan，C.，&Hasirci，N.2001，"EGFcontaininggelatin-basedwounddressings",3/咖"er/a/51，vol.22，no.11，pp.1345-1356.6.Pandit,A.，Ashar,R.，&Feldman,D.1999，"TheeffectofTGF-betadeliveredthroughacollagenscaffoldonwoundhealing",/.//^e"Swrg.，vol.12，no.2,pp.89-100.7.Yamamoto，M.，Tabata，Y.,Hong，L.，Miyamoto,S.，Hashimoto,N.，&Ikada，Y.2000，"Boneregenerationbytransforminggrowthfactorbetalreleasedfromabiodegradablehydrogel"，/.Cw7"0〃e/e雄，vol.64，no.1-3，pp.133-142.8.Badylak，S.F.2002，"Theextracellularmatrixasascaffoldfortissuereconstruction",Se/zz//.Ce//Zer."/o/.20。么0cL,'7J(^;.'J77.—《义，vol.13，pp.377—383.9.Hodde，J.P.，Record,R.D.，Liang,H.A.，&Badylak,S.F.2001，"Vascularendothelialgrowthfactorinporcine—derivedextracellularmatrix",j5WoMe//"/z72M々》.(X>;W-2《，vol.8，pp.11-24.10.Voytik-Harbin，S.L.，Brightman,A.0.，Kraine，M.R.，Waisner，B.，&Badylak，S.F.1997，"Identificationofextractablegrowthfactorsfromsmallintestinalsubmucosa"，/.6W/扁c力e瓜，vol.67，pp.478-491.11.McDevitt,C.A.，Wildey，G.M.，&Cutrone,R.M.2003,"Transforminggrowthfactor-betalinasterilizedtissuederivedfromthepigsmallintestinesubmucosa",/.^/MeA#<s/^r.20^.#07.7/<57丄d77.—4〃.，vol.67A，pp.637-640.12.Badylak,S.F.，Record,R.，Undberg，K"Hodde，J"&Park,K.1998，"Smallintestinalsubmucosa:asubstrateforinvitrocellgrowth",/.S/o鹏ter.5W.尸(？7戸.W，vol.9，pp.863-878.13.Lindberg，K.&Badylak,S.F.2001，"Porcinesmallintestinalsubmucosa(SIS):abioscaffoldsupportinginvitroprimaryhumanepidermalcelldifferentiationandsynthesisofbasementmembraneproteins",S"/72s2〃^/#a/./i*7.-，vol.27，pp.254-266.14.Li，F.，Li，W.，Johnson,S.，Ingram,D.，Yoder，M.，&Badylak，S.2004，"Low-molecular-weightpeptidesderivedfromextracellularmatrixaschemoattractantsforprimaryendothelialcells",^7^^e/2.wz2^《Ji^./"G—W.."义-皿，vol.11，pp.199-206.图l:以3种不同浓度(细胞/cm"接种人初级成纤维细胞的明胶支架的LDH测量。条形柱表示在第3天的生长，以Abs测量。图2:以3种不同浓度(细胞/cnO接种人初级成纤维细胞的MPEG-PLGA支架的LDH测量。条形柱表示在笫3天的生长，以Abs测量。图3:以3种不同浓度(细胞/cm"接种人初级角质细胞的明胶支架的LDH测量。条形柱表示在第3天的生长，以Abs测量。图4:以3种不同浓度(细胞/cm"接种人初级角质细胞的MPEG-PLGA支架的LDH测量。条形柱表示在第3天的生长，以Abs测图5:以3种不同浓度(细胞/cm"接种人脐静脉内皮细胞的明胶支架的LDH测量。条形柱表示在第3天的生长，以Abs测量。图6:以3种不同浓度(细胞/cm"接种人脐静脉内皮细胞的MPEG-PLGA支架的LDH测量。条形柱表示在第3天的生长，以Abs测量。图7:MPEG-PLGA支架中ECM颗粒分布的数字图像。图8:MPEG-PLGA支架的SEM图片(250xi文大)。图9:包含40%ECM颗粒的MPEG-PLGA的SEM图片(250x放大)。图10:MPEG-PLGA支架中内皮细胞生长的数字图像。图11:包含23%ECM颗粒的MPEG-PLGA支架中内皮细胞生长的数字图像。图12:包含23%ECM颗粒的MPEG-PLGA支架中内皮细胞生长的数字图像放大显示在支架的更深层的毛细管样形态。具体实施例方式实施例1:初级人成纤维细胞在有和没有ECM颗粒的合成支架中的向内生长由包含40%(w/w)UBM(Acell)颗粒(平均直径是大约150jim)的生物可降解聚酯制成的支架在细胞形态和3D生长的测试中与没有ECM颗粒的支架之间进行比较。Metoxy-聚乙二醇一聚(丙交酯-共-乙交酯)(Mn2.000-30.000，L:G1:l)溶解在1，4-二氧杂环己烷中形成1.5%的溶液。对于包含UBM的支架，将0.03gUBM添加到3ml聚合物溶液(40%w/w干物质)，高速混合并倒入3x3cm的模子中。将该溶液在-5°C冷冻，并在-20。C冻干5小时，在20°C放置大约60小时。其后将该样品放置在干燥器中拉伸(水压泵)5小时。评估接种在两种支架表面上的初级成纤维细胞的生长和形态测试。将从第1、3和7天的结果分级成1-5,其中l对应最差的情况而5是最好的。在混合ECM颗粒的支架中，细胞的分布和生长全部这些天中都是5级，并好于对照支架(全部这些天中定级为2会)。结论粉末ECM基质的生物活性在并入合成的支架后保持了其活性，并与单独的支架相比引起在支架上明显更好的生长。实施例2:在包含5种不同浓度的ECM的明胶-ECM复合材料中的细胞形态和3D生长。接种在明胶-ECM支架表面的初级成纤维细胞的细胞形态和3D生长的研究。该明胶支架通过加热而交联，并包含逐渐升高浓度的UBM(O、12%(w/w)、26°/"w/w)、4"/"w/w)、51%(w/w)和58%(w/w))。浓度计算为UBM的量比固体的总量，即包含0.05g聚合物和0.07gUBM的58。/。(w/w)支架对应于13.8mgUBM/cm3。将来自猪皮的明胶(A型，布卢姆值为175,Sigma)溶解在milli-Q水和t-BuOH(95:5)中，形成1°/。溶液。对于包含UBM的样品，将该UBM边搅拌边添加到该溶液中(0、12、26、41、51、58%w/w:0、0.007、0.018、0.035、0.053、0.07g/支架)。将5ml包含UBM的明胶溶液倒入模子中(D-5cm)。将含有溶液的模子在+5。C放置1小时，然后在-20。C冷冻，在-20。C冻干5小时，再在20°C放置36小时。其后将该样品在真空烤箱中120°C交联15小时。该研究显示通过提高所述复合支架中的UBM浓度，与没有UBM相比，成纤维细胞分布的更好并具有更高的增殖速率。在研究的前2天中，发现在没有UBM的支架上，细胞只生长在它们被应用的区域内，而细胞在UBM浓度大于26。/。(w/w)的支架表面分布的更好更均匀。从第14天开始，清楚的发现与包含UBM的复合支架相比，没有UBM的明胶支架上的细胞数量更少。关于细胞形态，成纤维细胞在平坦明胶支架上具有圆形但附着的形态，但随着UBM量的升高，观察到更多的成纤维细胞形态。从41。/。(w/w)UBM开始，观察到最佳的成纤维细胞形态和分布。将UBM浓度升高到大于41。/。(w/w)不能产生在复合支架上更好的细胞形态和分布。实施例3:含有6种不同浓度的ECM颗粒的MPEF-PLGA或明胶的复合支架的制备及其中的细胞形态和3D生长。明胶和ECM的复合支架的制备将来自猪皮的明胶(A型，Gelitapharmagrade832)溶解在mi11i-Q水和t-BuOH(95:5)中，形成1%溶液。对于包含UBM的样品，将该UBM边搅拌边添加到该溶液中；0、0.006、0.013、0.021、0.033、0.05、0.075g/支架(0、10、20、30、40、50、60%w/w)。将5ml包含UBM的明胶溶液倒入模子中(D=5cm)。将含有溶液的模子在+5。C放置l小时，然后在-20。C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20°C放置18小时。其后将该样品在真空烤箱中130°C交联15小时。MPEG-PLGA和ECM的复合支架的制备Metoxy-聚乙二醇一聚(丙交酯-共-乙交酯)(Mn2.000-30.000，L:G1:1)溶解在1，4-二氧杂环己烷中形成1.5%的溶液。对于包含UBM的样品，将该UBM边搅拌边添加到该溶液中；0、0.017、0.038、0.064、0.1、0.15、0.225g/支架(0、10、20、30、40、50、60%w/w)，高速混合并将10ml倒入7.3x7.3cm的模子中。将该溶液在-5。C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20。C放置约15小时。其后将该样品放置在干燥器中拉伸(水压泵)24小时。为评估复合支架的细胞形态和3D生长，从每种类型的支架上打孔取出生物活检材料，并在该支架的表面以2.5x104细胞/ci^的密度接种初级人成纤维细胞(传代3次)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC，传代4次)或初级角质细胞(传代5次)，所述接种在包含抗生素(青霉素、链霉素和两性霉素B)的少量生长培养基中(初级成纤维细胞在10%FCS的DMEM中；HUVEC，s在EGM-2中；初级角质细胞在KGM-2中)。在添加附加的生长培养基之前，将该支架在37°C、5%C02温育。在第1、3和7天评估该支架的细胞粘附、形态、生长和群落，其通过使用中性红染色，再使用装备了EvolutionMP冷彩色照相机(MediaCybernetics)的LeicaDMIRE2倒置显孩支镜进行评估。4吏用ImageProPlus5.1软件(MediaCybernetics)采集数字图像。使用CytotoxicityDetection试剂盒(LDH，RocheDiagnosticsGmbH)计算细胞数量。细胞以3种不同的浓度(1.25x104，2.5xl04和5xl04细胞/cm2)按照上述相同的方法接种到不同支架类型的顶部。在第1、3和7天评估支架，其通过用PBS洗涤该支架，其后用0.5%CHAPS在4°C平振荡器上进行细胞裂解。将上清转移到微平板上，根据操作说明书测量LDH的量。成纤维细胞成纤维细胞的定量测量显示随着时间的增加，细胞数量也增加，但在不同浓度UBM的明胶支架间没有见到影响(图1)。在MPEG-PLGA支架中，细胞随时间和支架中UBM的量而升高(图2)。在无UBM的明胶支架中的细胞形态和3D生长显示在研究的第一天，粘附细胞以圆形形态生长并停留在其应用的位置。这些细胞在剩余的研究期间变的有一点点纺锤形。向该支架中添加10%(w/w)UBM不会改变此种模式，但在20W(w/w)UBM情况下，越来越多的细胞变成具有正常成纤维细胞形态的纺锤形细胞，并且这些细胞开始在表面更广泛的扩展。在30-40°/。(w/w),观察到最大比例的纺锤形细胞，并且看到在支架表面的细胞生长向细胞以更加3D的细胞形态在支架深层生长的转变。在MPEG-PLGA中，观察到相同的模式，并具有例外升高UBM浓度产生在支架上和其内升高数量的细胞。在20-30%(w/w)UBM之间，看见逐渐'扩展的细胞以及更多具有纺锤形形态的细胞。从40。/。(w/w)以上，细胞开始以3D形态生长，并且取代在表面的生长而生长到支架的深层。角质细胞接种初级角质细胞到含有10%(w/w)UBM的明胶支架上，显示与没有UBM的支架相比细胞数量升高。在研究的笫一天，在10-20%(w/w)UBM中可见最大数量的细胞，但之后在20-30%(w/w)UBM的研究中显示最大效果。UBM浓度的升高导致支架上细胞数量的降低(图3)。在MPEG-PLGA支架上，在没有UBM的支架上可见最大的细胞数量。添加UBM导致在增加UBM数量的支架中细胞数量的降低。在研究的最后阶段，此效果更加明显。通常，因为浓度上的重叠，在重复试验之间观察到相对大的变化〖图4)。细胞形态和3D生长显示粘附到明胶支架表面的角质细胞的良好单生长。在10。/。(w/w)UBM支架中，升高数量的细胞彼此紧密连接生长，如同小片层。该效果似乎随时间发展更明显。将浓度升高到20-30。/"w/w)UBM仍产生粘附生长但不如10%(w/w)UBM时紧密。大于20-30%(w/w)UBM，可见更多的单细胞生长同时具有升高的细胞扩展，以及细胞数量的下降。在没有UBM的MPEG-PLGA支架中，细胞在支架的中心聚集，紧密生长几乎如同片层。提高UBM浓度导致升高的细胞扩展，以及细胞数量的下降。在2个最高浓度下，发现死亡细胞陷入支架结构内。内皮细胞用Huvec，s接种的明胶支架显示这样的趋势，最适为大约20-30%(w/w)UBM数量升高，其后可见降低(图5)。含有Huvec，s的MPEG-PLGA显示UBM的浓度升高导致细胞数量的升高。通常，在2种使用Huvec，s的支架类型的邻近浓度的重叠中可见大的变化(图8)。细胞形态和3D生长显示明胶支架中UBM升高到30°/。(w/w)UBM产生Huvec，s粘附到表面的能力的提高，并以扁平形态及正常短突起生长。从40。/。(w/w)和以上，细胞以更圆的形态生长，并且细胞数量下降。在没有UBM的MPEG-PLGA支架中，Huvec，s数量低并且以圓形形态生长，从而导致在第7天没有细胞。向该支架中添加10-20%(w/w)UBM产生细胞的扩展效果，但对形态没有作用。将浓度升高到大于30-40%(w/w)产生最佳的细胞形态，并且升高浓度进一步产生更高的细胞3D生长。通常在包含UBM的明胶和MPEG-PLGA两种支架中可见细胞形态和3D生长的变化。总结提高UBM浓度对初级成纤维细胞、初级角质细胞和人内皮细胞的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例4:ECM+/-并入支架的灭菌对初级成纤维细胞的细胞形态和3D生长的作用。Metoxy-聚乙二醇——聚(丙交酯-共-乙交酯)(Mn2.000-30.000，L:G1:l)溶解在1，4-二氧杂环己烷中形成1.5°/。的溶液。对于包含UBM的样品，将0.045g非灭菌的UBM添加到10ml聚合物溶液中(23%w/w干物质)，高速混合并倒入7x7cm的模子中。将该溶液在-5°C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20°C放置约18小时。其后将该样品放置在干燥器中拉伸(水压泵)15小时。有和没有UBM的样品以0、lx25kGy和h"kGy进行P辐射。以相同的方法制备另一个样品，但使用预灭菌(2x25kGy0辐射)的UBM(O.045g/5ml溶液)，并且该样品在制备后不灭菌。将来自猪皮的明胶(A型，布卢姆值为175，Sigma)溶解在mi11i-Q水和t-BuOH(95:5)中，形成1%溶液。将0.015g非灭菌的UBM边搅拌边添加到5ml溶液中(23%w/w干物质)，并倒入模子中(D=5cm)。将含有溶液的模子在+5。C放置2小时，然后在-20°C冷冻，在-20。C冻干5小时，再在20。C放置20小时。其后将该样品在真空烤箱中120°C交联15小时。有和没有UBM的样品以0、lx25kGy和2x25kGy进行P辐射。以相同的方法制备另一个没有UBM的样品，该样品在制备后以0、lx25kGy和2x25kGy灭菌。将来自猪皮的明胶(A型，布卢姆值为175，Sigma)溶解在milli-Q水和t-BuOH(95:5)中，形成1%溶液。将0.015g预灭菌的UBM(1x25kGy)边搅拌边添加到5ml溶液中(23%w/w干物质)，并倒入模子中(D=5cm)。将含有溶液的模子在+5。C放置l小时，然后在-20。C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20°C放置50小时。其后将该样品在真空烤箱中130°C交联15小时。细胞形态和3D生长研究显示提高UBM片层的辐射降低在UBM片层上的细胞数量但对细胞形态没有影响。在明胶支架和含有30°/。(w/w)UBM的明胶中，可见降低的细胞数量和从典型的成纤维细胞到更圆的细胞形态的改变，在明胶支架中效果最明显。在并入明胶支架前对UBM颗粒灭菌与在灭菌支架前并入UBM颗粒相比，产生更好的细胞形态和3D生长。在MPEG-PLGA中，增加的辐射导致具有成纤维细胞形态的细胞数量增加，这是因为增加了对支架的湿润。对含有30%(w/w)UBM的MPEG-PLGA支架辐射与U鹿颗粒在并入支架前被辐射的支架相比导致更高的细胞数量和更好的成纤维细胞3D形态。本研究显示在非辐射明胶支架中得到最高的生物活性，并且辐射降低该活性。相反的，当UBM颗粒并入MPEG-PLGA支架并随后灭菌时，得到最高的生物活性。据信辐射降低UBM的生物活性。辐射可消极或积极地影响支架材料，这依赖于与生物活性相关的材料。有迹象显示支架材料(例如MPEG-PLGA)在灭菌期间具有对UBM的保护作用。实施例5:MPEG-PLGA中的ECM的不连续颗粒。用初级成纤维细胞以2.5x104细胞/ci^的密度，在小体积生长培养基(10%FCS于含有抗生素(青霉素、链霉素和两性霉素B)的DMEM)中接种含有41%(w/w)的UBM颗粒的MPEG-PLGA支架。在添加附加生长培养基前将该支架温育在37°C、5°/"02中。7天后，将该支架置于Lillys中固定3天，然后包埋在石蜡中，切片成8j^n薄片并用Meyer，s苏木精伊红(HE)染色。使用装备有EvolutionMP冷彩色照相机(MediaCybernetics)的BX-60Olympus显微镜采集数码图象(4x和20x放大)，并使用ImageProPlus5.l软件获取数目图象。MPEG-PLGA支架中ECM颗粒的分布的数字图像显示被HE染红的离散的UBM颗粒，并与支架材料区分。支架中生长的成纤维细胞染成蓝色(图7)。实施例6:SEM显示的MPEG-PLGA中的UBM离散颗粒。如实施例1中描述的制备支架。SEM图片显示有(图9)和无(图8)UBM颗粒的MPEG-PLGA支架。该图片取自支架的顶部表层，并且250倍放大。所述SEM图片在丹麦技术研究所(2005-160)取得。实施例7:含有ECM颗粒的支架中，三维内皮细胞生长和分化。Metoxy-聚乙二醇一聚(丙交酯-共-乙交酯)(Mn2.000-30.000，L:Gl:l)溶解在1，4-二氧杂环己烷中，形成1.5%的溶液。对于包含UBM的样品，将0.045g非灭菌的UBM添加到10ml聚合物溶液中(23%w/w干物质)，高速混合并倒入7x7cm的模子中。将该溶液在-5°C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20°C放置约16小时。其后将该样品放置在干燥器中拉伸(水压泵)15小时。将来自脐带的初级人内皮细胞与初级人真皮成纤维细胞一起在MPEG-PLGA支架和含有23。/。(w/w)UBM的支架表面共培养。所述结构浸没在所定义的内皮细胞生长培养基中培养6-IO天，其后将其空运并培养另外9天。在培养的最后一天，用4%福尔马林緩冲液固定这些结构，切开并石蜡包埋。通过CD31/PECAM(血小板内皮细胞粘附分子)的免疫组织化学过氧化酶染色，使内皮细胞在5pm切片上显现。在鉴定成纤维细胞中，用组合苏木子背景染色的PECAM过氧化酶对平行切片染色。由于内皮细胞生长和分化受成纤维细胞性能的影响，所有的支架材料用两种不同的纤维原群落测试，但没有产生不同的结果。所有的MPEG-PLGA支架支持成纤维细胞和内皮细胞生长。发现成纤维细胞在所有MPEG-PLGA支架的整个体积内。在培养期间，UBM颗粒均一分布并且支架保持完整。然而在MPEG-PLGA支架上的内皮细胞和成纤维细胞培养只有内皮细胞表面生长——内皮细胞在由支架顶部的相邻成纤维细胞产生的基质内增殖。添加UBM颗粒促进成纤维细胞和内皮细胞在支架深层中的生长，并且内皮细胞采用了毛细管样形态。内皮细胞被导引沿着UBM颗粒的表面，而不是转移入这些颗粒内。因此，.我们发现在支架中包括UBM颗粒导致内皮细胞生长和分化的明显提高。不同的成纤维细胞群落没有产生不同的结果。MPEG-PLGA支架(图10)和MPEG-PLGA中含23%(w/w)UBM(图11)显示内皮细胞在MPEG-PLGA支架的表面的生长，其中该生长进入含有UBM颗粒的深层(内皮细胞染成红色(显示为黑)一一成纤维细胞不可见)。在含有23%(w/w)UBM的MPEG-PLGA支架的更深层中可见内皮细胞的毛细管样形态(图12)。这些结构在MPEG-PLGA支架中没有见到。实施例8:包含不同浓度ECM颗粒的支架的物理和机械特性。所制备的样品含有明胶基质的冻干支架含有明胶基质和40w/wUBM颗粒的冻干支架含有明胶基质和80w/wUBM颗粒的冻干支架将来自猪皮的明胶(A型(PG-832-6Gelita))溶解在milli-Q水和t-BuOH(95:5)中，形成1%溶液。对于包含UBM的样品，将UBM边搅拌边添加到溶液中(40°/。w/w:0.033g/5ml，80%w/w:0.2g/5ml)。将5ml包含UBM的明胶溶液倒入模子中(D=5cm)。将含有溶液的模子在+5。C放置2.5小时，然后在-20°C冷冻，在-20°C冻干5小时，再在20°C放置100小时。所制备的样品含有PLGA基质的冻干支架含有PLGA基质和40w/wUBM颗粒的冻干-支架含有PLGA基质和80w/wUBM颗粒的冻干支架Metoxy-聚乙二醇——聚(丙交酯-共-乙交酯)(Mn2.000-30.000，L:G1:l)溶解在1，4-二氧杂环己烷中形成1.5%的溶液。对于包含UBM的样品，将UBM添加到聚合物溶液中(40%(w/w):0.lg/10ml,80%(w/w):0.6g/10ml)，高速混合并倒入7x7cm的模子中。将该溶液在-5°C冷冻在1，4-二氧杂环己烷层上，在-20°C冻千5小时，再在20。C放置约100小时。其后将该样品放置在干燥器中拉伸(水压泵)15小时。物理特性和机械测试依赖于基质材料和所添加到UBM的量，可得到不同物理和机械性质。*随着所添加的UBM的量，多孔性降低，从而密度升高。*如果所述基质是疏水的，则UBM提供提高的湿润能力。*在高到至少40%(w/w)UBM时，明胶支架保留了其拉伸强度，其后强度降低，而PLGA支架被UBM颗粒轻微增强。组合物中低物质浓度与冻干程序一起产生低拉伸强度，其也是在本实施例中样品中的情<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>用游标尺测量高度。如下计算密度密度-质量/(面积x高度)如下计算多孔性多孔性=(聚合物密度-样品密度)/聚合物密度该聚合物密度是根据所添加的UBM(3mg/cni3)调整的重量。以一滴水完全被样品吸收的时间长度来计算湿润能力，以图片监视。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在来自StableMicroSystems的织物分析仪上进行拉伸测试。权利要求1.包括ECM的不连续区域的，临时性的连续的支架，其中所述ECM的不连续区域的浓度在20％(w/w)和60％(w/w)之间。2.权利要求1的临时性支架，其中所述支架是生物可降解的。3.权利要求1或2的临时性支架，其中所述ECM的不连续区域是均一分布的。4.权利要求1-3任一项的临时性支架，其中所述生物可降解支架由包含蛋白质的物质制成。5.权利要求1-3任一项的临时性支架，其中所述生物可降解支架由包含多糖的物质制成。6.权利要求1-3任一项的临时性支架，其中所述生物可降解支架由包含合成聚合物的物质制成。7.以上任一项权利要求的临时性支架，其中所述生物可降解支架由权利要求4-6所给材料的任意组合制成。8.以上任一项权利要求的临时性支架，其中所述支架具有开放的相互连接的孔。9.以上任一项权利要求的临时性支架，其中所述支架具有0.l-8mm的厚度。10.以上任一项权利要求的临时性支架，其中所述支架为防菌包装，在其包装上有标记表明此产品是灭菌的。全文摘要我们将胞外基质(ECM)的不连续区域添加到生物可降解支架中。从而可能组合该支架可以提供的一定范围的物理特性和ECM的重建特性。公开了用于各种应用的离散ECM材料的最佳量，此浓度在敷料中均匀分布从而避免了不必要的ECM高浓度。除了ECM的作用，所述基础材料的多孔结构为细胞提供了向内生长的结构。文档编号A61L15/00GK101296712SQ200680040135公开日2008年10月29日申请日期2006年10月26日优先权日2005年10月27日发明者B·尼尔森,H·埃韦兰德,L·F·尼尔森,L·K·耶斯佩森,P·S·尼尔森申请人:科洛普拉斯特公司