专利名称：：采用降低的温度产生树突细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及用于诱导抗恶性肿瘤和感染疾病的免疫反应的方法和装置。更具体地，本发明涉及用于产生抗原呈递细胞的改良方法。
背景技术：
：利用抗原呈递自然机制的基于树突细胞的免疫疗法代表了最有前景的非毒性癌症治疗方法。其可以作为单独治疗，或者作为其他类型疗法(例如外科手术、放射和化疗)的辅助。该策略基于细胞产物的体外操纵和再导入来绕过免疫功能，目的是诱导肿瘤特异性的免疫反应。因此，这种基于树突细胞的免疫疗法的终极终极目标是体内诱导肿瘤特异性效应细胞，近期进展集中于能够识别并杀伤肿瘤细胞的CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)。另外，感染疾病例如HIV的治疗可以受益于基于树突细胞的接种策略。抗原呈递肿瘤特异性免疫反应的诱导，需要表达主要组织相容性复合物(MHC)分子以及膜结合并分泌的共刺激分子的专业抗原呈递细胞(APC)的参与。而且，这种APC必须能够吸收、加工并呈递与MHC结合的抗原。树突细胞(DC)是免疫系统的专业APC，其具有剌激幼稚T细胞和记忆T细胞的能力。导致DC成熟的阶段与细胞的某些性质有关。未成熟DC特别善于通过吞噬或胞饮作用吸收细胞外抗原，并在细胞内区室例如内体和吞噬体中将抗原加工成肽。这里，肽与II类MHC分子结合。未成熟的DC还具有将肽从外源蛋白质负载至I类MHC分子呈递途径的独特能力，一种被称为交叉呈递的过程。通过激活1型CD4+辅助性T细胞(Thl细胞)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)而有效剌激免疫反应的能力关键依赖于成熟DC。只有具有一系列膜结合共刺激分子和辅助分子(例如CD40,CD80,CD83,CD86和II类MHC)的完全成熟的DC才可能有效诱导抗原特异性T淋巴细胞的繁殖和分化1。DC的共刺激活性的重要作用由分泌的细胞因子、特别是IL-12p70来提供。Heufler等(1996)i清楚证明了其在T细胞活化中的作用以及其偏向Thl型反应。而且，Inoue等(2005)报道了肿瘤中表达IL-12的成熟DC的存在与患者存活之间的良好相关性。用于接种的成熟DC应该产生有限量的Thl细胞抑制性细胞因子IL-IO。CCR7是淋巴结中基底细胞产生的趋化因子CCL19和CCL21的受体。表达足够水平的活化CCR7的DC响应CCL19或CCL2尸而迁移至淋巴结。这里，它们遇到T淋巴细胞并可以引发免疫反应。产生成熟DC的方案已经描述了用于产生成熟DC的许多方案。目前用于诱导DC的最普遍使用的"标准"方案采用由IL-ip,IL-6,TNF-a和前列腺素E2组成的成熟鸡尾酒。尽管有归因于CCR7的迁移活性和体内免疫刺激活性，但是由该鸡尾酒成熟的DC产生了IL12p7()S生成能力降低的DC。另一组DC成熟方案包括聚肌苷:聚胞苷酸，聚-(I:C)。其通常与细胞因子例如TNFa、IL-ip、IFN-y和IFN-a结合使用。该方法产生的DC生成IL-12p70，但是它们通常表达低水平的CCR7。聚-(I:C)存在下获得的DC的低水平CCR7表达特征，限制了它们在体内迁移至淋巴结。近来，公布的专利申请US2005/0003533A1公开了表达CCR7的树突细胞的成熟方法，所述树突细胞在CD40L剌激后能够被诱导产生IL-12p70。因此，依然存在对开发用于产生如下成熟树突细胞的标准化方法的未满足的要求表达高水平的活化CCR7，并同时产生足量的IL隱12p70。而且，尽管许多研究者的努力，但是用于癌症疗法的基于树突细胞的疫苗一般提供了最温和临床效力的免疫反应。这些疫苗主要通过自体DC的体外操纵和抗原负载来产生。日益增加的对患者安全性的需求，要求高水平的重复性和符合管理内容的顺应性。因此，强烈需要正确产生装配DC的方法，所述DC有效诱导免疫反应并特别提供改良的临床反应。另外，体外产生的DC还可以作为治疗疫苗应用于治疗一些慢性感染疾病，例如HIV以及乙型和丙型肝炎，其中传统疫苗方法不能有效地起作用。临床前和首次临床4—s研究结果表明，基于DC的免疫疗法可能是治疗HIV以及乙型和丙型肝炎的慢性感染患者的有前景的策略。对于癌症免疫疗法，抵抗这些胞内感染剂的有效临床反应与产生CD8+效应细胞所需的Thl辅助反应的诱导有关5。因此，可以预期，体外产生的树突细胞应该具有相同的用于治疗癌症和慢性感染疾病的特征。
发明内容本发明的第一方面涉及通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来产生树突细胞的方法。本发明的第二方面涉及树突细胞群，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来树突细胞的方法而产生。本发明的第三方面涉及包含树突细胞群的药物组合物，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来树突细胞的方法而产生。本发明的第四方面涉及细胞群用于刺激和/或扩增T细胞的用途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来树突细胞的方法而产生。本发明的第五方面涉及细胞群用于诱导受体中免疫反应的用途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来树突细胞的方法而产生。本发明的第六方面涉及细胞群生产用于治疗或预防癌症或感染疾病的药剂的用途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37°C的温度来树突细胞的方法而产生。下面参考附图详细说明本发明，其中图1描述了温度对DC的重要共剌激和辅助表面分子的影响。图IB描述了低温对CCR7表达的影响。图2描述了温度对由培养初期DC(A)产生的IL-IO、以及由未成熟DC(B)和成熟DC(C)产生的IL-IO的影响。图3描述了温度3TC、34。C和37。C对由新方法和标准方法生成的未成熟DC(A)和成熟DC(B)产生的IL-12p70的影响。图4描述了低温对CCR7表达的效果。图5描述了根据本发明(A)方法生成的未成熟和成熟DC的表型和"标准"方法(B)的对比。图6描述了成熟DC随时间的表型稳定性。图7描述了DC在第7天和第10天的表型和异种刺激(MLR)活性。图8描述了根据本发明方法和"标准"方法产生的DC的异种刺激活性。图9描述了通过IFN-y诱导测量的CMV-抗原的功能展示(ELISPOT(酶联免疫斑点)测定)。具体实施方式下面详细描述本发明。为了解释的目的，采用下述定义，并且适当时，单数使用的术语也包括复数，反之亦然。定义本文使用的"分化步骤"是指其中允许细胞相应确定的分化因子而分化的步骤。本文使用的"成熟步骤"是指其中允许细胞相应成熟因子的存在而成熟的步骤。本文使用的"减小的温度"或"降低的温度"是指温度低于37°C。用于产生树突细胞的方法是公知的J.H.Peters的方法，J.H.Peters首次描述了单核细胞体内转化成DC样细胞的能力，首先是自发，然后是在GM-CSF和IL-46存在下。Romani等(1994)7和Sallusto&Lanzavecchia(1994)8公布后，在这两种细胞因子存在下培养的单核细胞广泛用于制备DC。该过程开始于从外周血液分离单核细胞，并在GM-CSF和IL-4存在下培养5-7天。获得的细胞具有未成熟DC的性质，特征为低水平的共剌激分子和高胞吞活性。在LPS、TNF-oc或其他成熟剂诱导的成熟过程中，细胞显著上调共刺激和辅助分子例如CD40、CD80、CD83和CD86，并下调胞吞活性。体内组织培养一般在37°C进行。已知朗氏细胞在29-31°C的皮肤环境温度下是功能上活性的，并且几个研究己经记录了细胞系统中降低的培养温度的体外生物学作用，所述细胞系统例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和猪肺泡巨噬细胞。与Basil等(2003)9考察发热样温度对DC活化和成熟的影响的研究相反，在几个案例中测试了减小的温度对哺乳动物细胞生长的影响。Dexter等(1977)建议使用33°C用于培养造血干细胞9。Athanasas-Platsis等(1995)发现，与在37°C相比较，朗氏细胞标志物CDla在单核细胞上的表达在34°C培养24小时过程中被上调1Q。据我们了解，还没有人公开如何使用减小的温度来产生未成熟或成熟的树突细胞。本发明一个实施方案涉及在祖细胞发展为未成熟树突细胞过程中采用低于37°C的温度来产生树突细胞的方法。IL-10是DC发展的负调节剂，并且在GM-CSF存在下的单核细胞系活化过程中产生11。Kirkley等(2003)报道，对应于培养温度从37°C至31°C的下降，LPS刺激的巨噬细胞系产生IL-10显著减少12。因此，本发明方法中涉及的降低的温度可以借助例如低IL-10浓度来为DC产生提供改良的条件。已经测试了在GM-CSF和IL-4存在下于不同温度(3TC、34°C和37T)培养单核细胞对未成熟DC的CDla表达水平的影响，CDla是对IL-10的抑制性作用极度敏感的分子。我们发现，更低温下产生的DC具有更高的表达水平。所有进一步实验在34。C下进行。下一个原理发现是，在更低温度培养后，培养物上清液中检测到的IL-10水平实际上明显更低。本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中生成的树突细胞为成熟的树突细胞。本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中祖细胞和成熟的树突细胞的发展包括所述细胞的分化。本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中分化步骤温度低于37°C的方法。本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中温度为3TC至37°C的方法。该温度可以是31°C、32°C、33°C、34°C、35°C或36°C中的任何温度。本发明的一个实施方案涉及其中温度为34°C的方法。本发明的一个实施方案涉及其中袓细胞是自体祖细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及其中祖细胞选自髓样祖细胞或干细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及其中髓样祖细胞是单核细胞的方法。本发明的另一个实施方案涉及通过本发明方法产生的树突细胞群。本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述细胞表达CCR7禾口/或IL-12p70。本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述细胞表达CDla、CD14低、CD83、CD86和IL-10低。本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，进一步包括与细胞表面的MHC分子结合呈递的至少一种抗原。本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述至少一种抗原是肿瘤抗原。本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述肿瘤抗原选自癌症/睾丸抗原、家族特异性分化抗原、肿瘤过表达抗原、突变或异常表达抗原以及病毒抗原。本发明另一实施方案涉及上述树突细胞群用于刺激和/或扩增T细胞的用途。本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于刺激和/或扩增T细胞的用途，其中所述T细胞是自体T细胞。本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于刺激和/或扩增T细胞的用途，其中所述用途是体外用途。本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于诱导受体中免疫反应的用途。本发明另一实施方案涉及包含树突细胞群的药物组合物，其中所述群如上所定义。本发明一个实施方案涉及药物组合物作为药剂的用途。本发明另一实施方案涉及包含树突细胞群的药物组合物，进一步包含常规的佐剂和赋形剂。本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或感染疾病的药剂的用途。本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或感染疾病的药剂的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌，或者可以是任何类型的癌症。本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或感染疾病的药剂的用途，其中所述感染疾病选自HIV和肝炎或者其他慢性感染疾病。现在通过下述并非以任何方式限制的实施例描述本发明。实施例l:降低温度下树突细胞的生成树突细胞通常从血库获得的暗黄覆盖层生成。60mL暗黄覆盖层用60mL无钙且无镁的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，产品号BE17-512F,Cambrex,Belgium)稀释，并应用至四个50-mL管，每个管含有15mL淋巴细胞分离齐U(产品号1053980,AXIS-SHIELDPoCAS，Norway)。离心(460g，30min,20。C)后，将10-20mL上部血浆层转移至单独的管。估计这是大约40%的血浆(稀释的血浆)。血桨的最终制备包括添加肝素(25IU/mL)并离心(1500g，15min,4°C)。从界面收集单核细胞，用含有EDTA的DPBS稀释两倍，并通过4-5次离心来洗涤，第一次以250g、第二次以200g，接下来以150g离心，所有离心在4°C,12min。最后一次离心之前，使用Coulter计数仪(BeckmanCoulter,modelZ2)计数细胞，单核细胞的量估计为平均尺寸约9m的细胞数目)。细胞保存在-80。C(于10%DMSO稀释的血浆中，每管107个单核细胞)，或者立即用于实验。细胞以2xl06单核细胞/mL的浓度重悬于吸附介质(添加了2mML-谷氨酰胺和2%血浆的RPMI1640(Cambrex))。5mL的细胞混悬液置于T25非TC处理的Falcon瓶中。37°C吸附1小时后，除去非粘附细胞，粘附细胞用温的RPMI1640冲洗两次，然后每个瓶中添加7mL的培养介质(添加了2mML-谷氨酰胺和1%血浆的RPMI1640)。所述瓶置于不同的温度的单独CCV培养箱中31°C、34°C和37°C。在第1、3和5天添加终浓度分别为100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加终浓度为10ng/mL的TNF-a以诱导成熟，温度升至37。C持续培养最后24小时。在第7天，收集细胞，并通过FACS分析来确定它们的表型。使用直接轭合的抗体CDla-藻红蛋白(PE)、CD14-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD83画PE、CD86-PE、HLA隱DR、-P,-Q曙FITC(全部来自Pharmingen,BecktonDickinson,Brandby,Denmark)禾口CCR7-FITC(R&DSystemsEurope,Abington,UK)对细胞染色。使用适当的同种型对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(BecktonDickinson)和CELLQuest软件(BecktonDickinson)分析样品。代表性实验的结果示于图1。与37。C培养的细胞相比，降低温度下培养的细胞更多表达CDla，而在更低温度下培养的细胞群中观察到更少的CD83和CD86阳性细胞。31°C和34°C培养后的CDla的平均荧光指数(MFI)两倍于37°C培养。通过表达CD83和CD86的DC的百分比判断的成熟度在31-34。C更低。这反映了对降低温度下培养的细胞对成熟因子更低的敏感度，或者成熟过程本身需要37°C的温度。实施例2:降低的温度对IL-10生成的影响。在单核细胞分化为树突细胞过程中考察了作为DC负调节剂的IL-10的产生。测量了其在第1、3和5天于培养上清液中的浓度。通过包括捕获抗体(Ab)、标准品或样品、生物素化的检测Ab和HRP-链霉抗生物素的夹心ELISA测量IL-10的产生，使用了eBioscience的"Ready-Set-Go"试剂盒，基本根据生产商推荐并做了一些调整。捕获Ab与Nuncmaxisorp96孔板结合过夜并洗涤后，室温下延长封闭步骤至少3小时。通过开始于200pg/mLIL-10的七个连续的标准品稀释液来产生标准曲线。标准品和样品在室温下保持2小时，随后在4°C保持过夜。接下来的步骤根据生产商方案进行。来自相同试剂盒的四甲基联苯胺基质溶液用于HRP的酶反应，终止反应后，测量光密度，由于490nm和620nm读数之间的差异而进行波长校正。这类实验的一个的结果示于图2A。单核细胞在第一天自发产生的IL-10是低的，而在第一天添加了GM-CSF和IL-4之后显著上调。34°C培养至5天的细胞一般产生比37°C培养的细胞显著更低量的IL-IO。在第5天对几种DC培养物的测试显示相似的模式(图2B)。甚至在第5天洗涤细胞、将它们置于37°C、第6天添加成熟剂并在第8天收集上清液之后，34°C与37°C相比降低的IL-10产生依然持续(图2C)。这些结果表明，在低于37°C的温度下培养的细胞需要低IL-10产生的稳定表型。实施例3:降低的温度对IL-12p70生成的影响。我们还考察了温度对IL-12p70产生的影响。通过包括捕获抗体(Ab)、标准品或样品、生物素化的检测Ab和HRP-链霉抗生物素的夹心ELISA测量IL-12p70的产生。使用了针对IL-12p70的试剂盒"DuoSetELISA生成系统"(R&DSystems),基本根据生产商推荐并做了一些调整。捕获Ab与Nuncmaxisorp96孔板结合过夜并洗涤后，室温下延长封闭步骤至少3小时。通过开始于500pg/mLIL-12p70的七个连续的标准品稀释液来产生标准曲线。标准品和样品在室温下保持2小时，随后在4°C保持过夜。接下来的步骤根据生产商方案进行。使用过氧化氢-四甲基联苯胺混合物作为HRP的基质溶液，在终止反应后测量光密度，由于490nm和620nm读数之间的差异而进行波长校正。表l.在培养开始的5天里，温度对MCM模拟物诱导的成熟过程中产生IL-12p70的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>可以看到(表l)，34'C产生的细胞产生明显更高水平的IL-12p70。实施例4:组织培养塑料的选择我们比较了两种组织培养塑料非组织培养聚苯乙烯(PS)(产品号353813,T25BD-Bioscience,USA)和PrimariaTM塑料(产品号353813,T25BD-Bioscience,USA)。实验设计与实施例1中描述的过程类似，使用2%自体血浆预处理15-45min的塑料表面作为组分来源，例如额外细胞组分，象纤维蛋白素原和纤维结合素，再不含血清的AIM-V介质中34"C直至第5天，随后将培养物置于37°C。在第6天添加成熟剂TNFa,IL-1卩，1L-6和前列腺素E2，在第8天收集培养物。根据培养条件，袓细胞选择发展成巨噬细胞或DC。培养几天后，本该发展成巨噬细胞的细胞形成附着细胞培养物，而本该发展成DC的细胞形成松散附着的细胞培养物。最初，相等数目的细胞被接种并附着至不同的组织培养塑料。从第6天对DC培养物光学显微镜检査，显示PrimariaTM塑料上附着的细胞数目明显少于另一种塑料上生长的细胞。通常，PrimariaTM塑料上生长的细胞还表现为更"清洁"，即更少碎屑，反映了在成熟过程中更小程度的细胞死亡。我们测试了使用不同浓度的血浆来预处理塑料。2%，10%，20%或40%血浆预处理PrimariaTM塑料后没有发现DC性质上的显著差异(数据未显示)。但是，我们发现，污染淋巴细胞的量随着血浆浓度增加至10%而减少。因此，我们在随后实验中在实施例1中所述方法中加入了使用10%血浆处理PrimariaTM塑料的步骤。在随后实验中，我们比较了本发明方法与"标准方法"，除非另有说明，其如下所述进行。树突细胞通常从获自血库的暗黄覆盖层产生。60ml暗黄覆盖层用60mL无Ca和无Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS,产品号BE17-512F，Cambrex，Belgium)稀释，并应用至4个50-mL管，每个管含有15mL淋巴细胞分离剂(产品号1053980,AXIS-SHIELDPoCAS,Norway)。离心后(460g,30min，20°C)，10-20mL上部血浆层转移至单独的管。从界面收集单核细胞，用无钙和镁的PBSEDTA稀释两次，3次离心洗涤，首次250g，第二次175g，最后一次110g，所有离心在《C,12min。最后一次离心之前，使用Coulter计数仪(BeckmanCoulter,modelZ2)计数细胞，单核细胞的量估计为平均大小约9pm的细胞数目。细胞以2x106单核细胞/mL的浓度重悬于吸附介质(RPMI1640(Cambrex)，添加有2mML-谷氨酰胺和1%热失活自体血浆)。5mL的细胞混悬液置于T25无处理的Primaria瓶中。37。C吸附1小时后，除去非吸附的细胞，向每个瓶添加5mL培养介质(RPMI1640，添加有2mML-谷氨酰胺和1%血浆)。第1天，培养基更换为新鲜培养基。第3天，添加2ml培养基。第5天，收集所有非吸附细胞并置于含有新鲜培养基的T25PrimariaTM瓶中。所述瓶置于37。C的C02-培养箱中。在第1、3和5天添加浓度分别为100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加TNF-a或细胞因子鸡尾酒(IL-1，IL-6,TNF-a和PGE-2)以诱导成熟。在第7天，收集细胞，并通过FACS分析确定其表型。实施例5:IL-12p70的产生。图3显示了IL-12p70产生经过两天后(第7天和第8天)的测量，我们能够显示，新方法产生的树突细胞比标准方法产生的树突细胞产生了更高量的IL-12p70。实施例6:CCR7的表达。为考察低温对CCR7表达的影响，我们采用了由IL-1(3、IL-6、TNF-a和前列腺素E2组成的成熟鸡尾酒来替代仅使用TNF-a。图1B中所示实验结果比较了新方法和标准方法的3个不同温度。可以看到，新方法的CCR7表达高于标准方法。我们还在标准迁移实验中测试了新方法产生的树突细胞的CCR7受体表达的功能性(ChemotxDisposableChemotaxisSystem(116-5型)，来自NeuroProbe,Gakhersburg,MD,USA)。这里，我们看到树突细胞向趋化因子CCL19迁移，且新方法产生的DC(数据未显示)证实了功能性CCR7受体的表达。实施例7:细胞产量。本文描述的新方法还显示了比标准方法提高的细胞产量。在三个不同运行中，我们发现在所有测试温度(31。C、34°C和37。C)下，新方法具有比标准方法更高的细胞产量，参见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例8:根据本发明方法产生的DC的批间标志物变化为符合对生产医疗目的的树突细胞的GMP要求，树突细胞性质的批间差异应该小。为此目的，我们从8个不同供体的血液在3周时段内进行树突细胞的制备，使用了相同批次的所有采用的试剂和0.5%自体血桨添加至AIM-V介质。为了比较，使用"标准"方法(37。C)进行DC生产。实验在融化的PBMC上进行。表3概括了这些实验中产生的DC的性质。与通过"标准"方法产生的DC性质的高差异相反，发现通过新方法获得的DC性质差异度非常低。表3.通过标准方法或新方法产生的树突细胞的不同标志物表达百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>S:标准方法，N:本发明方法，ND:未测定，X:平均值最后，图4A表示了通过新方法产生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)树突细胞的表型。这里，我们还测量了CD80、甘露糖受体(MR)和两种朗氏细胞标志物-CD207(langerin)和E-钙黏着蛋白的表达。可以看到，通过本发明方法产生的细胞不是朗氏细胞。图5B表示通过新方法和标准方法产生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)树突细胞的表型。这里，我们针对标准DC标志物的表达而对细胞进行染色。对于未成熟(第5天)，我们具有更清洁的CDla群。成熟群(第8天)显示了与标准方法相比，新方法产生的细胞中的高且均一的HLAD、CD83和CD86表达。而且，通过新方法，CCR7表达更均一表达。实施例9.通过本发明方法产生的树突细胞的稳定性。在注射入有机体后，树突细胞应该迁移并达到淋巴结，以刺激T细胞。因此，DC保持其表型几天是非常重要的。进行稳定性测试的普遍方式是收集第8天的细胞，洗出细胞因子后继续在缺乏刺激性细胞因子下培养细胞。我们已经通过不用细胞因子培养细胞两天而进行了这种实验。图5表示了第8天和额外两天培养后收集的DC的FACS分析结果。显然，测量参数CDla、CD14、CD83、HLA-D和CCR7的表达很大程度上保持不变，因此表型保持稳定。在类似实验中，在第8天没有洗出细胞因子，我们测试了第7天和第10天的树突细胞的表型和异种刺激活性。图6A和6B分别显示了表型和异种刺激活性。结果显示，异种刺激作用在培养10天后依然高，第10天的表型特征类似于第7天测量的特征，证实了所产生的树突细胞的高稳定性。实施例10.由新方法生成的树突细胞的异种刺激。我们比较了通过"标准"方法和本发明方法获得的DC的异种刺激能力。细胞在含有5%AB人血清的RPMI1640介质中培养。响应细胞是通过外周血液暗黄覆盖层密度分离从健康供体获得的单核细胞。刺激细胞是暴露于成熟细胞因子鸡尾酒2天后获得的经辐射的成熟树突细胞，如实施例4所述。剌激细胞，0.1xl(f个细胞/10(^1，与图7所示滴定数目的剌激细胞(10(V1)混合，并在U底96孔微滴定板中培养5天。最后18个小时添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.1ji居里/mL)。随后，收集细胞用于闪烁计数。数据给出为四个平行培养的平均cpm值。使用Wilcoxon测试来估计用于产生DC的两种方法之间的差异。可以看到，通过本发明方法获得的树突细胞具有3-10倍的异种刺激活性。实施例11.由新方法生成的树突细胞的抗原呈递为了说明DC呈递抗原至T细胞的潜力，对通过裸露的或CMV肽脉冲的DC刺激的T细胞进行INFyELISPOT测定。选择INFyELISPOT测定是因为该测定提供了单细胞水平上的清晰结果，并且T细胞遇到APC呈递的抗原之后释放INF。使用的CMV肽限于HLA-A2，并且供体材料已知为HLA-A2阳性，因为该群的80%具有CMV反应，所以选择该病毒模型。图9描述了ELISPOT测定结果，显示了用载有CMV肽的DC刺激的T细胞存在强反应，表明这些DC能够将抗原呈递至T细胞。参考文献1.Heufler，C,Koch，F.，Stanzl，U.，Topar,G.，Wysocka,M.'Trinchieri，G.，Enk，A.，Steinman，R.M.,Romani,N.，andSchuler，G.lnterleukin-12isproducedbydendriticcellsandmediatesThelper1developmentaswellasinterferon-gammaproductionbyThelper1cells.Eur.丄lmm,l.，26:659-668，1996.2.Scandella，E.，Men,Y.,Gillessen，S.，Forster，R.，andGroettmp，M.ProstaglandinE2isakeyfactorforCCR7surfaceexpressionandmigrationofmonocyte-deriveddendriticcells.Blood,100:1354-1361，2002.3.Jonuleit，H.，Kuhn，U.，Muller，G.，Steinbrink，K.,Paragnik，L.，Schmitt，E,，Knop，丄，andEnk，A.H.Pro-inflammatorycytokinesandprostaglandinsinducematurationofpotentimmunostimulatorydendriticcellsunderfetalcalfsemm-什eeconditions.Eur.丄lmmunol"27:3135-3142，1997.4.Chen,M.，Li，Y.G.，Zhang，D.Z.，Wang,Z.Y.，Zeng,W.Q.!Shi，X.F.，Guo，Y.，Guo，S.H.，andRen,H.TherapeuticeffectofautologousdendriticcellvaccineonpatientswithchronichepatitisB:aclinicalstudy.World丄Gastroenterol.，11:1806-1808，2005.5.Lu，W.，Arraes，L.C，Ferreira，W.T.，andAndrieu,丄M.Therapeuticdendritic-cellvaccineforchronicHIV-1infection.Nat.Med.，10:1359-136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