专利名称：Vegf类似物及使用方法
技术领域：
本申请涉及血管内皮生长因子(VEGF)类似物作为抑制或降低血管发 生的VEGF受体拮抗剂用于治疗与血管发生相关的病症和疾病的设计和用 途。本申请也披露了对天然受体(例如KDR)显示出提高的受体结合亲和性 的VEGF类似物。
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年10月6日递交的美国临时申请60/723,917和2006 年5月25日递交的美国临时申请60/808,106的优先权，将其全部内容通过 引用的方式并入本文。
背景技术：
血管内皮生长因子(VEGF)调节血管和淋巴管发生。它们主要通过内皮 细胞、造血细胞和基质细胞应答于缺氧和生长因子(例如转化生长因子、白 介素和血小板衍生的生长因子)刺激而产生。
在哺乳动物中，VEGF由一族基因编码，包括VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D和胎盘样生长因子(P1GF)。高度相关蛋白质包括o咲病 毒编码的称为VEGF-E的VEGF样蛋白和一系列称为VEGF-F的蛇毒。 VEGF和VEGF相关蛋白是胱氨酸结生长因子(cystine knot growth factors) 的血小板衍生的生长因子(PDGF)超基因家族的成员。所有PDGF超基因家 族的成员与PDGF享有高度的结构同源性(参见美国专利申请09/813,398， 其全文通过引用的方式并入本文中)。
血管形成主要需要VEGF-A、 VEGF-B和P1GF，而VEGF-C和VEGF-D 是形成淋巴管必不可少的。血管发生是通过自先前存在的脉管产生新的血 管或淋巴管的过程。当VEGF结合于内皮细胞上的受体、信号转导活化内 皮细胞吋，开始该过程。活化的内皮细胞产生溶解已存在的脉管周围的基 底膜中的微小的洞的酶。然后，内皮细胞开始增殖并穿过已有的脉管的被溶解的洞迁移出去，形成新的脉管(Alberts等，1994, Molecular Biology of the Cell.Garland Publishing, Inc., New York, N. Y. 1294 pp.)。
三种III型受体酪氨酸激酶在血管发生期间被VEGF活化,附样酪氨 酸激酶(Flt-l，又名VEGFR1)、激酶结构域受体或含激酶插入结构域的受体 (KDR，又名VEGFR2和Flk-l)以及Flt-4(又名VEGFR3)。 KDR是血管发生 信号转导中的主要受体，而Flt-l与调节血管形态发生相关，Flt-4调节淋巴 管发生。这些受体几乎仅在内皮细胞上表达，除了少数例外，例如Flt-l在 单核细胞中表达，调节趋化性(Barleon等，1996, Blood. 87: 3336-3343)。
VEGF受体与Fms、 Kit和PDGF受体密切相关。它们由七个胞外免疫 球蛋白(Ig)样结构域、 一个跨膜(TM)结构域、 一个调节性近膜结构域、 一个 被短肽中断的胞内酪氨酸激酶结构域、激酶插入结构域、然后是参与募集 下游信号分子的携带数个酪氨酸残基的序列组成。Flt-1和KDR的胞外域 的突变分析表明第二和第三Ig样结构域组成VEGF的高亲和配体结合结 构域，而第一和第四Ig结构域似乎分别调节配体结合和受体二聚化 (Davis-Smyth等，1998， J. Biol. Chem. 273: 3216-3222; Full等，1998， J. Biol. Chem. 273: 11197-11204;以及Shinkai等，1998， J. Biol. Chem. 273: 31283-31288)。受体酪氨酸激酶在配体介导的受体二聚化时被活化 (Hubbard, 1991， Prog. Biophys. Mol. Biol. 71: 343-358; Jiang和Hunter, 1999, Curr. Biol. 9: R568-R571;以及Lemmon和Schlessinger, 1998， Methods Mol. Biol. 84: 49-71)。VEGF受体的信号特异性在募集共同受体例如神经毡蛋白、 硫酸肝素、整联蛋白或钙粘着蛋白时被进一步调节。
VEGF分子在血管发生过程中与一种或多种酪氨酸激酶受体相互作用。 例如，VEGF-A主要通过KDR和Flt-1作用。VEGF-C和VEGF-D同样是 KDR和VEGFR3的特异性配体。人们认为P1GF和VEGF-B仅结合Flt-1 。 病毒VEGF-E变体活化KDR。 VEGF-F变体与VEGFR3或者KDR相互作 用。
除了所述两种典型的受体之外，还有数种调节VEGF生物活性和血管 发生的膜受体或可溶性受体。例如，神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2分别与 KDR和Flt-l两者相互作用，刺激那些受体的信号转导。已经表明:VEGF-A、 VEGF-B、 P1GF-2的同工型与神经毡蛋白-1结合(Soker等，1998, Cell. 92: 735-745; Makinen等，1999， J. Biol. Chem. 274: 21217- 21222;以及Migdal等，1998， J. Biol. Chem. 273: 22272-22278)。能够与神经毡蛋白相互作用的 VEGF同工型，艮卩，具有外显子7或外显子6和7的同工型，也能够与硫 酸肝素相互作用。
虽然VEGF-A是最好地表征的VEGF蛋白，但VEGF-A和KDR和Flt-1 之间相互作用的分子基础尚未很好地理解。虽然VEGFRl以比KDR高50 倍的亲和性结合VEGF-A，仍认为KDR是VEGF-A血管发生作用(即促细 胞分裂性、趋化性和诱导管形成)的主要转导物(Binetruy-Toumiere等，同 上)。然而，存在越来越多的证据Flt-1在造血作用以及单核细胞和其他的 可以导向肿瘤脉管系统并促进血管发生的骨髓来源的细胞的募集中具有重 要作用(Hattori等，2002, Nature Med. 8: 841-849; Gerber et ah， 2002， Nature. 417: 954-958; Luttun等，2002, Nature Med. 8: 831-840)。此外，在某些情况 下，Flt-1由肿瘤细胞表达，并且可以调节趋化性信号，由此潜在地扩展了 该受体在癌生长中的作用(Wey等，2005， Cancer. 104 : 427-438)。
单一 VEGF-A同二聚体引起两个KDR受体的二聚化以及它们的胞质 部分的自磷酸化。先前的研究表明，与糖蛋白激素类似，在VEGF-A的外 围环中带电荷的氨基酸残基在为其各自的受体提供高亲和性静电相互作用 中也是至关重要的(Szkudlinski等，1996， Nat. Biotechnol. 14(10): 1257-63; Fuh等，同上；Muller等，1997， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(14): 7192-7; Keyt等，1996， J. Biol. Chem. 271(10): 5638-46)。然而，应注意到，VEGF-A 中的很多突变对受体结合亲和性没有主要影响。在VEGF的外围环中的突 变主要导致丧失功能。此外，似乎先前的氨基酸置换均不能使得对KDR的 结合亲和性提高超过2倍。
血管发生引起有益的生物学事件，例如伤口愈合、心肌梗塞修复和排 卵。另一方面，血管发生也引起或促进疾病，例如实体瘤的生长和转移 (Isayeva等，2004， Int. J. Oncol. 25(2):335画43; Takeda等，2002， Ann Surg. Oncol. 9(7):610-16);动脉粥样硬化；异常的眼部新血管生成(如在例如早产 儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜静脉阻塞、和年龄相关性黄斑变 性的疾病中所见)(Yoshida等，1999, HistolHistopathol. 14(4): 1287-94; Aiello: 1997， Ophthalmic Res. 29(5):354-62);慢性炎症，例如类风湿性关节炎、骨 关节炎和脓毒性关节炎；神经退行性疾病(Ferrara, N.， 2004， Endocr. Rev. 25: 581-611);胎盘功能不全，即先兆子痫(Ferrara，同上)；和皮肤病，例如皮炎、
10牛皮癣、疣、皮肤恶性肿瘤、褥疮溃疡、淤积性溃疡、脓性肉芽肿、血管
瘤、卡波西氏肉瘤、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩(Arbiser， 1996, J. Am. Acad. Dermatol. 34(3):486-97)。在类风湿性关节炎中，例如，内皮细胞被活化并 表达粘附分子和趋化因子，导致白细胞自血液迁移到组织中。内皮细胞透 性增加，导致形成浮肿和关节肿胀(Middleton等，2004, Arthritis Res. Ther. 6 (2) :60-72)。
VEGF，特别是VEGF-A，被认为与血管发生提高、降低和/或失调相 关的很多疾病和病症(Binetruy-Tourniere等，2000， EMBO J. 19(7): 1525-33) 有关。例如，VEGF已经被认为通过刺激肿瘤相关性血管发生来促进实体 瘤生长和转移(Lu等，2003， J. Biol. Chem. 278(44): 43496-43507)。 VEGF也 是眼内新生血管形成和渗透性的重要介导物。VEGF在转基因小鼠中的过 表达导致临床视网膜内和视网膜下新生血管形成，并形成如在人眼疾病中 所见的通过血管造影术可检测的有漏隙的(leaky)眼内血管(Miller, 1997， Am. J. Pathol. 151(1): 13-23)。另外，在患有原因不明的不育和子宫内膜异位的 女性的腹腔液中发现了 VEGF (Miedzybrodzki等，2001， Ginekol. Pol. 72(5): 427-430)，并且，发现VEGF在睾丸和附睾中的过表达引起转基因小鼠不 育(Koipelainen等，1998， J. Cell Biol. 143(6): 1705-1712)。近来，在患有类 风湿性关节炎(RA)的患者的滑液和血清中发现了 VEGF-A，其表达与疾病 严重度相关(Clavel等，2003, Joint Bone Spine. 70(5): 321-6)。鉴于致病性血 管发生参与如此广泛的障碍和疾病，抑制血管发生、特别是VEGF信号转 导是期望的治疗目的。
通过使用中断VEGF-A和KDR相互作用和/或阻断KDR信号转导途径 的药剂实现了抑制血管发生和抑制肿瘤，所述药剂包括:阻断VEGF与KDR 结合的肽(Binetruy-Toumiere等，2000, EMBO J. 19 (7): 1525 - 33);VEGF抗 体(Kim等，1993, Nature 362, 841- 844; Kanai等，1998， J. Cancer 77， 933-936; Margolin等，2001, J. Clin. Oncol. 19， 851-856); KDR抗体(Lu等，2003,同上; Zhu等，1998， Cancer Res. 58, 3209-3214; Zhu等，2003， Leukemia 17, 604-611; Prewett等，1999， Cancer Res. 59, 5209-5218);可溶性受体(Holash等，2002， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 11393- 11398; Clavel等，同上)；酪氨酸激酶 抑制剂(Fong等，1999, Cancer Res. 59， 99-106; Wood等，2000， Cancer Res. 60， 2178-2189; Grosios等，2004， Inflamm Res. 53(4): 133-42);抗VEGF免疫毒素(Olson等，1997， Int. J. Cancer 73， 865-870);核酶(Pavco等，2000, Clin. Cancer Res. 6， 2094-2103);反义介导VEGF抑制(Forster等，2004， Cancer Lett. 20;212(1):95-103); RNA干扰 (Takei等，2004， Cancer Res. 64(10):3365-70; Reich等，2003， Mol Vis. 9:210-6);和低硫酸化的 (undersulfated)低分子量二醇开环型肝素(glycol-split heparin) (Pisano等, 2005, Glycobiology. 15(2)1-6)。然而，这些治疗中的一些导致了不合需要的 副作用。例如，Genentech的阿瓦斯丁(Avastin)， 一种靶向VEGF的单克隆 抗体，据报道在一些结肠癌患者中引起了严重的动脉血栓事件，而在非小 细胞肺癌患者中则引起了严重的、有些情况下甚至是致命的咯血(Ratner, 2004, Nature Biotechnol. 22(10): 1198)。更近一些，Genentech报道了在用阿 瓦斯丁治疗的11%的卵巢癌患者(试验的44名女性中的5名)中观察到胃肠 穿孔(2005年9月23日的Genentech新闻报道)。同样地，第一个VEGF靶 向药物Pfizer的受体酪氨酸激酶抑制剂SU5416显示严重的毒性(包括血栓 事件)，促使Pfizer终止开发(Ratner，同上)。鉴于期待受益于有效的抗血管 发生治疗的开发的患者的广泛性以及一些已知的抗血管发生治疗的弊端， 仍需要新的抗血管发生治疗剂。
发明概述
本发明包括VEGF类似物和编码VEGF类似物的核酸，所述VEGF类 似物与野生型VEGF相比展现出对一种或多种天然受体的强结合亲和性。 本发明也包括VEGF类似物和编码VEGF类似物的核酸，所述VEGF类似 物展现出受体结合亲和性和生物活性的解离。具体地说，所披露的类似物 的体内和体外生物活性与野生型VEGF相比显著降低，而对一种或多种天 然受体的结合亲和性与野生型VEGF相比却几乎相同或显著提高。所述 VEGF类似物可以表现出对天然受体例如KDR的结合亲和性提髙至少大约 三到四倍。
在本发明的一种实施方式中，所述VEGF类似物是修饰的VEGF同二 聚体或异二聚体。这些分子含有至少一个突变，其可以存在于所述VEGF 分子的两个亚单位中的一个或两者。在本发明的一种实施方式中，含有一 个或多个突变的VEGF类似物是VEGF-A。所述VEGF-A类似物可以是任 何VEGF-A同工型，例如，121、 145、 148、 165、 183、 189或206个氨基方式中，本发明的VEGF-A类似物是VEGF165b 同工型。在另一实施方式中，含有一个或多个突变的VEGF分子是VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D或P1GF。
本发明包括在一个或多个亚单位中含有一个或多个突变的VEGF融合 蛋白。本发明的VEGF融合蛋白包括至少一个VEGF亚单位，即融合于不 同的蛋白质的至少一个亚单位的亚单位，包括但不限于其他的胱氨酸结生 长因子或糖蛋白。例如，本发明包括嵌合体VEGF类似物，其中所述VEGF 分子含有融合于VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF 或P1GF亚单位的VEGF-A亚单位；融合于VEGF-A、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位的VEGF-B亚单位；融合于 VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位 的VEGF-C亚单位；融合于VEGF-A、VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-E、VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位的VEGF-D亚单位；或融合于VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F或PDGF亚单位的P1GF亚单位。 所述亚单位可以任选地由接头肽分隔。本发明也包括融合在一起的相同 VEGF的不同的同工型，例如融合于VEGF165b的VEGFws亚单位。
在一种实施方式中，所述VEGF类似物是单链分子。例如，本发明的 VEGF类似物包括两个VEGF亚单位，即，通过接头肽连接在一起的单体。 两个连接亚单位中的一个或两个可含有一个或多个碱性氨基酸置换。此外， 所述连接亚单位可以是不同的VEGF蛋白亚单位，并且可以是相同亚单位 的不同的同工型。例如，本发明包括通过GS接头连接到具有I83K氨基酸 置换的VEGF^亚单位的野生型VEGF!65亚单位。
在本发明的另一实施方式中，包含一个或多个突变的VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D或P1GF亚单位或二聚物融合于毒素。这种实
施方式的肽可用于靶向并破坏肿瘤细胞。
本发明的VEGF类似物包括一个或多个碱性氨基酸置换，例如赖氨酸 或精氨酸置换，所述置换选自44、 67、 72、 73、 83和87位。在本发明的 一种实施方式中，所述VEGF类似物在83位含有碱性氨基酸置换，并且任 选地在44、 67、 72和73位具有一个或多个碱性氨基酸置换。例如，本发 明包括具有I83K突变的VEGF类似物。本发明也包括例如在72、 73和83 位具有碱性氨基酸的VEGF类似物。
13在本文中所述的具有碱性氨基酸置换的VEGF类似物可以含有另外的 氨基酸置换，以进一步提高对KDR的受体结合亲和性和/或降低对神经毡 蛋白-1的受体结合亲和性。例如，本发明包括在146和160位的突变，以 干扰神经毡蛋白-1结合位点。
本发明的类似物还可以含有另外的氨基酸置换，其赋予提高的稳定性 和提高的血清半衰期。例如，本发明包括消除蛋白酶剪切部位的氨基酸置 换，所述置换位于111和148位。
本发明的VEGF受体拮抗剂与野生型VEGF相比可以展现出提高的血 浆半衰期。这可以通过本领域己知的方法进一步修饰VEGF类似物以提高 半衰期，或者，作为选择，提高的血浆半衰期可为VEGF类似物的固有特 性。本发明的VEGF受体拮抗剂与野生型VEGF相比还可以展现出吸收速 度增加和/或作用持续时间减少。
本发明的修饰类似物起到VEGF受体拮抗剂的作用，从而为患有与血 管发生相关的广谱疾病和病症的患者提供了期待已久的解决办法。所述 VEGF受体拮抗剂可以单独或与另一种用于治疗与血管发生相关疾病的 VEGF受体拮抗剂、抗癌药物、或抗血管发生药物结合施用给患者，所述 疾病包括然而并非限于实体瘤癌症、血管瘤、类风湿性关节炎、骨关节炎、 脓毒性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、血管再狭窄、动 静脉畸形、脑膜瘤、新生血管性青光眼、牛皮癣、卡波西氏综合征、血管 纤维瘤、血友病性关节、肥厚性瘢痕、Osier-Weber综合征、脓性肉芽肿、 晶体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、希林二氏病(von Hippel-Lindau
disease)、血管粘附病变、滑膜炎、皮炎、神经退行性疾病、先兆子痫、原 因不明的女性不育症、子宫内膜异位、原因不明的男性不育症、翼状胬肉、 伤口、疮、皮肤溃疡、胃溃疡和十二指肠溃疡。
附图简述
图1A比较了 I83K突变体和野生型VEGF-A与KDR的结合。图1B 显示了在存在I83K VEGF-A突变体的情况下与野生型VEGF-A相比 HUVEC-2内皮细胞增殖的降低。
图2A比较了 E44R类似物和野生型VEGF-A与KDR的结合。图2B 比较了在存在E44R VEGF-A类似物的情况下与野生型VEGF-A相比HUVEC-2细胞的增殖。
图3A比较了 E72R+E73R VEGF突变体和野生型VEGF-A与KDR的
结合。图3B比较了在存在E72R+E73R突变体的情况下与野生型VEGF-A
相比HUVEC-2细胞的增殖。
图4比较了 E44R和EE72/ 73RR突变体与野生型VEGF-A的结合。 图5比较了 Q87K突变体和野生型VEGF-A的结合。 图6比较了 E67K突变体和野生型VEGF-A的结合。
发明详述
本发明提供了修饰的血管内皮生长因子(VEGF)家族的血管发生生长 因子，其展现出令人惊奇的VEGF受体拮抗剂活性。作为VEGF受体拮抗 剂，本发明的化合物具有"抗血管发生"性质。被"修饰"表示，尽管所述蛋 白质含有不同于感兴趣的野生型VEGF即人类VEGF或动物VEGF的氨基 酸序列，但是所述序列没有被改变得与已知的其它物种的VEGF序列相同。 在本文中，术语"突变的"和"置换的"可互换使用，指修饰的氨基酸残基。 在本文中，术语"修饰的VEGF分子"、"修饰的VEGF蛋白"、"VEGF类似 物"、"VEGF受体拮抗剂"、"VEGF嵌合体"、"VEGF融合蛋白"和"VEGF 单链分子"可互换使用，指修饰的VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D 和P1GF类似物分子。
在本文中，"拮抗剂"可互换地使用，指起到阻断、抑制或降低VEGF 的天然生物活性(例如诱导血管发生)的作用的分子。在本文中所用的术语 "抗血管发生"表示本发明的修饰的VEGF分子阻断、抑制或降低血管发生 的进程或自先前存在的脉管形成新的血管或淋巴管的进程。本发明的VEGF 类似物的活性干扰正常的通常当VEGF结合于受体时发生的VEGF/受体信 号转导。因此，本发明的类似物是VEGF受体拮抗剂。不希望被理论束缚， 认为本发明的VEGF类似物干扰了信号转导所需的KDR 二聚化。
抑制血管发生可为完全的或部分的。所述VEGF受体拮抗剂可以体外 和体内抑制血管发生至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约25%、 至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少 约80%、至少约90°/。和至少约100%。技术人员本领域可以通过已知的方法 测量血管发生的抑制。测定血管发生的抑制可以包括利用阴性对照和/或阳
15性对照。例如，通过比较用本发明的VEGF类似物治疗的对象的血管发生 和未用类似物治疗的类似对象的血管发生，技术人员可以作结论本发明 的VEGF类似物抑制了 VEGF诱导的血管发生。
本发明的修饰的VEGF分子与野生型VEGF相比，对一种或多种天然 的VEGF受体显示出提高的受体结合亲和性或类似的受体结合亲和性。如 本文中所用的，天然的VEGF受体是与VEGF特异性相互作用的未修饰的 受体。例如，内源性VEGF受体是天然的VEGF受体。在本发明的一种实 施方式中，所述天然受体是KDR。 KDR是VEGF-A、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E和VEGF-F的受体。另一实施方式中，所述天然受体是Flt-l 。 Flt-l 是VEGF-A、 VEGF-B和P1GF的受体。
"受体结合亲和性"是指配体在体内或体外结合受体的能力，可以通过 本领域容易获得的方法进行评价，所述方法包括但不限于竞争性结合测定 和直接结合测定。如本文中所用的，受体结合亲和性指的是VEGF分子结 合天然VEGF受体的能力，所述受体包括但不限于Flt-l (又名VEGF-R1)、 KDR (又名VEGF-R2)和Flt-4 (又名VEGF-R3)。例如，本发明的修饰的 VEGF-A分子与野生型VEGF-A相比，对KDR显示出提高的受体结合亲和 性或类似的受体结合亲和性。在一种实施方式中，本发明的修饰的VEGF 分子的受体结合亲和性比野生型VEGF提高了至少约1.25倍、至少约1.5 倍、至少约1.75倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、 至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍。
在另一实施方式中，所述修饰的VEGF显示了与野生型VEGF类似或 可比的对KDR和减参与血管发生的其他受体的受体结合亲和性。类似的 或可比的受体结合亲和性为野生型VEGF的至少约75。/。、至少约80%、至 少约85°/。、至少约90%、至少约95%或至少约97%或更高。例如，本发明 包括显示了野生型VEGF所显示的受体结合亲和性的约75。/。到85y。、约850/0 到95%和约95%到100%的VEGF-A类似物。
本发明也包括对至少一种天然受体显示出提高的或类似的受体结合亲 和性，而对另一天然受体显示出降低的受体结合亲和性。例如，本发明的 VEGF-A类似物与野生型VEGF-A相比可以显示出对KDR提高的或类似的 受体结合亲和性，但是，其与野生型VEGF-A相比可以显示出对Flt-l、神 经毡蛋白-1或神经毡蛋白-2降低的受体结合亲和性。
16本发明的VEGF类似物与野生型VEGF相比还显示出生物活性降低。 "生物活性"是指VEGF在体内和体外天然的生物学活性，包括但不限于 VEGF在内皮细胞中诱导细胞增殖的能力。生物活性降低导致血管发生。 在本发明的一种实施方式中，本发明的VEGF与相同同工型的野生型VEGF 相比也显示出生物活性降低。例如，本发明的VEGF,65类似物可以显示与 野生型VEGF165相比降低的生物活性，VEGF165b类似物可以显示与野生型 VEGF165b相比降低的生物活性。
可以通过本领域已知的几种方法评价生物活性，所述方法包括但不限 于体外细胞活力测定来测定暴露于VEGF时内皮细胞(例如人脐静脉内皮细 胞(HUVEC))的活力。内皮细胞活力与暴露于野生型VEGF的内皮细胞相比 降低至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、 至少约30°/。、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少 约60%、至少约70%、至少约80°/。、至少约90%或至少约95%或更多则表 明生物活性降低。
也可以体内评价生物活性。例如，可以通过检测有肿瘤的对象肿瘤周 围缺少血管发生增加来在体内评价生物活性。检测缺少血管发生增加可以 通过本领域已知的几种方法实现，所述方法包括但不限于体内基质胶 (matrigel)迁移测定、盘血管发生测定、包含小鼠血管发生角膜移植和海绵 移植物模型的背部皮肤褶皱室测定。在一种实施方式中，通过比较所述肿 瘤及其周围的血管发生和未经处理的对象的类似类型、尺寸和位置的肿瘤 的血管发生来评价血管发生。本领域已知的活检法可用于抽取并分析脉管 形成。
受体结合亲和性和生物活性的"解离(Dissodation)"是指受体结合亲和 性和生物活性不相关这样的概念。比较而言，对于野生型VEGF蛋白例如 野生型VEGF-A,受体结合亲和性和生物活性是相关的。例如，预计受体 结合能力增加会导致野生型VEGF-A的生物活性提高。另一方面，本发明 的修饰的VEGF分子表现出与野生型VEGF相比相似的受体结合亲和性或 受体结合亲和性增加，而与野生型VEGF相比生物活性降低。
由于相关基因家族的可变剪接产生了多种同工型的哺乳动物VEGF。 本发明描述了相应于参与血管发生的VEGF同工型的VEGF类似物。除非 另有指明，本发明的VEGF类似物可以使用任何VEGF同工型产生。VEGF-A类似物可以存在同工型，包括但不限于分别为121、 145、 148、 165、 183、 189和206个氨基酸的同工型。三种主要的mRNA是VEGF121、 VEGF、65和VEGF189。如本文中所用的，VEGF121 (SEQ IDNO.:6)、 VEGF145 (SEQ ID NO.:8)、 VEGF148 ( SEQ ID NO.:IO)、 VEGF165 (SEQ ID NO.:4)、 VEGF165b(SEQIDNO.:13)、 VEGF183 (SEQ ID NO.:15)、 VEGF189 (SEQ ID NO.:17)和VEGF206 (SEQ ID NO.:19)是能够被修饰以具有抗血管发生性质 的VEGF-A同工型。本文中所述的氨基酸位置是基于缺少前导序列例如 SEQ ID NO.:3的前导序列的VEGF分子。具有前导序列的VEGF-A同工型 的氨基酸序列是SEQIDNO.:2、 5、 7、 9、 12、 14、 16和18的序列。
各种VEGF-A同工型具有由110个氨基酸组成的常见的氨基末端结构 域。VEGF-A同工型具有由外显子2-5编码的受体结合结构域。在由外显子 6a、 6b、 7a和7b编码的神经毡蛋白和肝素结合结构域中发现了所述同工型 之间最显著的差异。
最常见的VEGF-A同工型是VEGF165。编码VEGF165的核酸是SEQ ID NO.:l的序列。近来，描述了称为VEGF,65b的内源性剪接变体，其含有由 在羧基末端由外显子9而不是外显子8编码的序列。编码该蛋白质的核酸 分子是SEQ ID NO.: 11的序列。当加入VEGF,65时，VEGF165b (具有前导序 列的SEQ ID NO.:12;没有前导序列的SEQ ID NO.:13)抑制内皮细胞中 VEGF信号转导(参见Woolard等，2004， Cancer Research. 64: 7822-7835; 也参见U.S.2005/0054036，其全文通过引用的方式并入本文中)。
在本发明的一种实施方式中，所述VEGF类似物是VEGF-A类似物。 VEGF-A类似物包括"修饰的VEGF-A蛋白"、"VEGF-A受体拮抗剂"、 "VEGF-A嵌合体"、"VEGF-A融合蛋白"和"VEGF-A单链分子"。A VEGF-A 类似物是含有至少一个修饰的VEGF-A亚单位的VEGF-A分子。
VEGF-B存在两种同工型VEGF-B167 (SEQ ID NO.:48)和VEGF-B186 (SEQ ID NO.:50) (Makinen等，1999， J. Biol. Chem. 274: 21217-21222)。在本 发明的一种实施方式中，VEGF类似物是VEGF-B类似物。VEGF-B类似 物包括"修饰的VEGF-B蛋白"、"VEGF-B类似物"、"VEGF-B受体拮抗剂"、 "VEGF-B嵌合体"、"VEGF-B融合蛋白"和"VEGF-B单链分子"。VEGF-B 类似物是含有至少一个修饰的VEGF-B亚单位的VEGF-B分子。
VEGF-C作为前肽(SEQ IDNO.:51)产生，其被蛋白水解剪切形成21-kd的活性蛋白(Nicosia, 1998， Am. J. Path. 153: 1 l-16)。在本发明的一种实施方 式中，VEGF类似物是VEGF-C类似物。VEGF-C类似物包括"修饰的 VEGF-C蛋白"、"VEGF-C类似物"、"VEGF-C受体拮抗剂"、"VEGF-C嵌 合体"、"VEGF-C融合蛋白"和"VEGF-C单链分子"。VEGF-C类似物是含 有至少一个修饰的VEGF-C亚单位的VEGF-C分子。
VEGF-D也作为前肽(SEQ ID NO.:52)产生，其被蛋白水解剪切形成活 性蛋白。VEGF-D与VEGF-C具有48。/。的相同性(Nicosia，同上)。在本发明 的一种实施方式中，VEGF类似物是VEGF-D类似物。VEGF-D类似物包 括"修饰的VEGF-D蛋白"、"VEGF-D类似物"、"VEGF-D受体拮抗剂"、 "VEGF-D嵌合体"、"VEGF-D融合蛋白"和"VEGF-D单链分子"。VEGF-D 类似物是含有至少一个修饰的VEGF-D亚单位的VEGF-D分子。
胎盘生长因子(PIGF)存在三种同工型PlGF-l (SEQIDNO.:54)、PlGF-2 (SEQ ID NO.:56)和P1GF-3 (SEQ ID NO.:58)。 P1GF-2含有外显子6编码的 肽，其赋予肝素和神经毡蛋白-1结合性，这是另外两种同工型所没有的。 据报道，PlGF-l和PlGF-2都能够诱导内皮细胞迁移(Migdal等，1998， J. Biol. Chem. 273: 22272-22278)。在本发明的一种实施方式中，VEGF类似物 是P1GF类似物。在另一实施方式中，VEGF类似物是PlGF-l或PlGF-2。 P1GF类似物包括"修饰的P1GF蛋白"、"P1GF类似物"、"P1GF受体拮抗剂"、 "P1GF嵌合体"、"P1GF融合蛋白"和"P1GF单链分子"。P1GF类似物是具有 至少一个修饰的P1GF亚单位的P1GF分子。
本发明的VEGF类似物是修饰的动物或人类VEGF分子。在本发明的 一种实施方式中，所述VEGF类似物是哺乳动物VEGF分子。在本发明的 另一实施方式中，所述VEGF类似物是鸟类VEGF分子。本发明的VEGF 类似物包括但是不局限于修饰的灵长类、犬科、猫科、牛类、马(equinine)、 猪、羊、鼠科、大鼠、和兔VEGF分子。在本发明的一种实施方式中，所 述动物VEGF类似物是VEGF-A类似物。例如，本发明动物VEGF-A类似 物可以是动物VEGF165或VEGF165b类似物。
除了人类的物种的修饰的VEGF分子在相应于本文中披露的修饰的人 类VEGF分子的位置上具有置换，并且可使用任何比对程序，所述比对程 序包括然而并非限于DNASIS、 ALIONment、 SIM和GCG程序，例如Gap、 BestFit、 FrameAlign和Compare 。如本领域技术人员可以理解的，替换为碱性氨基酸对的相应氨基酸可以不同于人类VEGF-A中的氨基酸。例如， 技术人员应理解，谷氨酸(E)可能相应于动物中不同的酸性氨基酸，例如天 冬氨酸(D)。
在另一实施方式中，相应氨基酸确定为位于规定结构中相同的一般位 置，例如，位于外环结构上。基于蛋白质的氨基酸，可以使用软件预测所 述蛋白质的结构。因此，本领域技术人员可以使用预测蛋白质祈叠和环结 构的软件来鉴定相关蛋白质中的相应位置。
设針VEGF灸体拮抗刮
可以通过比较感兴趣的VEGF的氨基酸序列和其它物种的VEGF的氨 基酸序列鉴定其他物种中VEGF蛋白质的碱性残基来设计本发明包括的 VEGF受体拮抗剂。例如，可以通过比较人类VEGF-A与另一物种的 VEGF-A设计VEGF-A分子。在U.S. 6,361,992中披露了这样的方法，通过 引用的方式将其全文并入本文中。也可以考虑来自不同物种的VEGF的相 对生物活性来选择用于比较和氨基酸置换的物种。此外，基于有关糖蛋白 的结构的同源性模型可用于识别表面暴露的氨基酸残基。同源模建可以通 过本领域公知的方法进行，包括但不限于利用蛋白质模建计算机软件。
本发明也提供一种修饰的VEGF蛋白，其中所述修饰的VEGF包含在 相应于来自另一物种的VEGF蛋白的相同氨基酸位置上被置换的氨基酸， 所述修饰的VEGF相对于野生型VEGF具有提高的结合亲和性和/或降低的 生物活性。例如，蛇毒VEGF-F在体外以高亲和性结合KDR，并强烈刺激 脉管内皮细胞的增殖。人们可以比较人类VEGF-A和蛇毒VEGF，设计在 蛇毒和人类序列不同的一个或多个位置具有氨基酸置换的人类VEGF-A蛋 白，构建具有所选变化的VEGF-A蛋白，并将修饰的人类VEGF-A施用给 人类。虽然与人类VEGF相比，蛇毒VEGF-F显示KDR结合亲和性和生物 活性增加，即结合亲和性和生物活性相关，但本领域技术人员应理解可以 凭借经验试验氨基酸置换来确定提高受体结合亲和性但降低或对生物活性 没有影响的氨基酸置换。然后，提高受体结合亲和性和/或降低生物活性或 对生物活性没有影响的氨基酸置换可以与已知提高受体结合亲和性和/或 降低生物活性的一个或多个其他的氨基酸置换组合。
在本发明的另一实施方式中，所述修饰的VEGF分子可以含有一个或
20多个在相应于节肢动物中天然存在的VEGF同源物的相同氨基酸位置上置 换的氨基酸。在节肢动物中，单一生长因子行使在高等生物体中PDGF和 VEGF行使的职责。本领域技术人员应理解可以凭借经验试验氨基酸置 换来确定提高受体结合亲和性但是降低生物活性或对生物活性没有影响、 或者对受体结合亲和性具有很小的影响但是降低了生物活性的氨基酸置 换。
此外，本发明也提供一种修饰的VEGF蛋白，其中所述修饰的VEGF 包含在相应于来自相同物种或不同物种的不同的VEGF或VEGF同工型或 密切相关的糖蛋白(例如PDGF家族中的蛋白质)的相同氨基酸的位置上被 取代的碱性氨基酸。例如，可以比较VEGFw和来自相同物种的PDGF， 并基于任何序列趋异来对VEGF蛋白进行氨基酸置换。技术人员可以使用 本领域已知的方法来比较VEGF蛋白或VEGF相关蛋白的两个或更多序列， 所述方法如使用比对软件，包括然而并非限于DNASIS、 ALIONment、 SIM 和GCG程序例如Gap、 BestFit、 Frame Align和Compare 。
在本发明的另一方面，本文中所述的氨基酸置换可以被引入密切相关 蛋白质，例如VEGF-E (SEQ IDNO.:60)、 VEGF-F (SEQ ID NO.:62)和PDGF (SEQEDNO.:63和SEQIDNO.:64)。例如，可以比较选自E67、 E72、 E73、 183和Q87的一个或多个碱性氨基酸置换以及来自相同物种的PDGF同工 型，并对PDGF同工型进行氨基酸置换。
本发明的VEGF类似物可设计为与野生型VEGF-A相比显示出对Flt-1 受体的受体结合亲和性降低。虽然这些类似物对Flt-1的受体结合亲和性降 低，它们与野生型VEGF-A相比可具有提高的或可比的对KDR的受体结 合亲和性。
本发明的VEGF类似物可设计为与野生型VEGF-A相比显示出对共同 受体的受体结合亲和性降低，所述共同受体包括但不限于神经毡蛋白-1或 神经毡蛋白-2。具有对神经毡蛋白-1或神经毡蛋白-2降低的受体结合亲和 性的类似物与野生型VEGF相比可以具有对KDR、 Flt-1或VEGR3提高的 或相似的受体结合亲和性。例如，VEGF-A类似物可以设计为显示出对神 经毡蛋白-1受体结合亲和性降低而对KDR和/或Flt-1受体结合亲和性提 高。在本发明的一种实施方式中，显示出对神经毡蛋白-1受体结合亲和性 降低的VEGF-A是在VEGF165b剪接变体中设计的类似物。在另 一实施方式，
21VEGF-B,67和PlGF-2类似物可以设计为显示出对神经毡蛋白-l受体结合亲 和性降低而对Flt-l结合亲和性提高。
在本发明的一种实施方式中，通过干扰VEGF神经毡蛋白结合位点， VEGF类似物设计为与野生型VEGF相比显示出对神经毡蛋白-1或神经毡 蛋白-2的受体结合亲和性降低。这可以通过降低神经毡蛋白-1受体结合结 构域中半胱氨酸氨基酸残基的数量来实现。例如，可通过使用引起二硫键 破坏的氨基酸例如丝氨酸置换SEQIDNO.:4的146和/或160位的半胱氨酸 残基将VEGF^类似物设计成干扰VEGF^中神经毡蛋白1结合位点。在 SEQ EDNO.:4的146和160位的半胱氨酸残基置换干扰神经毡蛋白-1结合， 但是不干扰肝素结合。如本文中所述，在146和域160位的突变可与一个 或多个突变结合来提高、维持或恢复对KDR、 Flt-l和/或VEGFR3的受体 结合亲和性。
同样，本发明包括与野生型VEGF相比对神经毡蛋白-2受体结合亲和 性降低的VEGF类似物。例如，本发明包括VEGF-C和VEGF-D类似物， 其与野生型VEGF-C或VEGF-D相比，分别显示出对神经毡蛋白-2结合亲 和性降低但对KDR和/或VEGFR3结合亲和性提高或相似。
本发明也包括稳定性和对蛋白酶的耐性提高的VEGF类似物。在一种 实施方式中，将在SEQ ID NO.:4的Alll和A148位的氨基酸置换引入到 VEGF-A类似物中，以提高对蛋白酶的耐性。本发明也包括分别含有防止 VEGF-C前肽或VEGF-D前肽裂解的突变的VEGF-C和VEGF-D类似物。 例如，本发明包括含有一个或多个引起对丝氨酸蛋白酶纤维蛋白溶酶和/或 纤维蛋白溶酶原家族的其它成员的耐性的突变的VEGF-C和VEGF-D类似 物。
在本发明的另一实施方式中，可以在显示出拮抗性的天然存在的VEGF 分子中产生显示出对一种或多种VEGF受体、优选KDR的受体结合亲和性 提高的VEGF类似物。例如，可以修饰VEGF^b， 一种从肾组织分离的同 工型，以引入与该蛋白质的受体结合能力提高而生物活性降低相关的氨基 酸置换。同样，技术人员可以在含有VEGF165b的性质的VEGF的合成或新 的同工型中引入本发明的氨基酸置换。特别地，本发明的突变可与其他的 VEGF蛋白使用，所述蛋白质除了外显子8 (CDKPRR; SEQ ID NO.:71)编 码的氨基酸之外还含有氨基酸SLTRKD (SEQ ID NO.:70)(即外显子9编码的氨基酸)或在所述蛋白质中以SLTRKD代替CDKPRR。 氛基睃置换
本发明的VEGF类似物含有赋予提高的受体结合亲和性和降低的生物 活性的一个或多个碱性氨基酸置换。在本发明的一种实施方式中，所述 VEGF类似物是VEGF受体拮抗剂，包括然而并非限于VEGF-A拮抗剂。
本发明的修饰的VEGF可以在VEGF的一个或多个亚单位(即单体)中 具有碱性氨基酸置换。碱性氨基酸包括赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)， 并可以是这三种氨基酸中的任何一种的修饰的任何其他的碱性氨基酸、在 自然界不存在的合成碱性氨基酸、或任何其他的在中性pH带正电荷的氨基 酸。其中优选的氨基酸选自赖氨酸和精氨酸。
在一种实施方式中，本发明的修饰的VEGF分子包含至少一个修饰的 亚单位，其中所述修饰的亚单位包含在野生型人类VEGF165 (SEQ ID NO.:4)、 VEGF121 (SEQ IDNO.:6)、 VEGF 145 (SEQ ID NO.:8)、 VEGF148(SEQ ID NO.:IO)、 VEGF165b (SEQ ID NO.: 13)、 VEGF183 (SEQ ID NO.: 15)、 VEGF189 (SEQ ID NO.:17)或VEGF2()6 (SEQ ID NO，:19)的183位的碱性氨基酸置换。 例如，本发明包括在对应于VEGF-A同工型的氨基酸序列的SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 13、 15、 17或19的I83K氨基酸置换。
本发明也包括在其它VEGF分子(即，VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D和 PIGF)中相应于83位的位置上的碱性氨基酸置换，例如VEGF-B167 (SEQ ID NO.:48)或VEGF-B186 (SEQ ID NO.:50)的183位和P1GF画1 (SEQ ID NO.:54)、 P1GF陽2 (SEQ ID NO.:56)或P1GF- 3 (SEQ ID NO.:58)的191位。
本发明包括除了人类以外的动物的修饰的VEGF分子，其中所述VEGF 分子在一个或多个亚单位中含有在相应于人类VEGF-A的83位的位置上的 碱性氨基酸置换。在一种实施方式中，所述修饰的动物VEGF是修饰的 VEGF-A分子。例如，本发明包括灵长类(SEQIDNO.:22)183位、牛类(SEQ ID NO.:25)的182位、犬类(SEQ ID NO,:28) 182位、鸡(SEQ ID NO.:31) 183 位、马(SEQ ID NO.:I82) 182位、鼠类(SEQ ID NO.:37) 182位、猪(SEQ ID NO.:40) 182位、大鼠(SEQ ID NO.:43) 182位和羊(SEQ ID NO.:46) 182位的 碱性氨基酸置换。
本发明也设想修饰的VEGF相关蛋白质，包括但不限于含有相应于SEQ ID NO.:4的183位的位置上的氨基酸置换的VEGF-E、 VEGF-F和 PDGF。例如，可以修饰VEGF-F(SEQIDNO.:62)以包括I83氨基酸置换。
本发明的修饰的VEGF分子可以含有碱性氨基酸置换，其与野生型 VEGF例如野生型VEGF-A相比进一步提高了 VEGF的结合亲和性或降低 了生物活性。与野生型VEGF相比，在VEGF,65(SEQIDNO.:4)、 VEGF121 (SEQ ID NO.:6)、 VEGF145 (SEQ ID NO.:8)、 VEGF148 (SEQ ID NO.:IO)、 VEGF165b(SEQIDNO.:13)、 VEGF183 (SEQ ID NO.:15)、 VEGF 189 (SEQ ID NO.:17)和VEGF206 (SEQIDNO.:19)的44、 67、 72、 73和/或87位中的一个 或多个位置具有碱性氨基酸置换的VEGF分子可以提高对KDR的结合亲和 性。例如，本发明包括碱性氨基酸修饰E44R、 E44K、 E72R、 E72K、 E73R、 E73K、 Q87R、 Q87K和E67K。
在本发明的一种实施方式中，相应于SEQIDNO.:4的44、 67、 72、 73 和/或87位的碱性氨基置换与相应于SEQ ID NO.:4的83位的碱性氨基酸置 换偶联，以产生VEGF受体拮抗剂。例如，本发明的修饰的氨基酸包括 72+73+83、 44+83、 72+83、 73+83、 44+72+83、 44+73+83、 44+72+73+83、 44+83+87、 83+87、 67+72+73+83、 44+67+83、 67+72+83、 67+73+83、 44+67+72+83、 44+67+73+83 、 44+67+72+73+83、 44+67+83+87和67+83+87 位的碱性氨基酸置换。
在本发明的另一实施方式中，所述类似物是在E44、 E67、 E72、 E73 和Q87位含有一个或多个碱性氨基酸并任选地在183位含有碱性氨基酸置 换的VEGF^b分子。当VEGF-A同工型是VEGF65b时，通过引入在其他 VEGF165中仅增加受体结合亲和性的单一氨基酸修饰，可以产生本发明的具 有与野生型VEGF-A相比提高的结合亲和性和降低的生物活性的VEGF类 似物，包括VEGF股。
技术人员可以理解，本发明包括VEGF蛋白和VEGF相关蛋白，其中 VEGF-A含有相应于VEGF-A (SEQ ID NO.:4)的E44、 E67、 E72、 E73和/ 或Q87位的碱性氨基酸修饰。例如，本发明包括含有在A44、 E67、 G72、 Q73和S87位的一个或多个碱性氨基酸置换的修饰的VEGF-B类似物(SEQ ID NO: 48和50)以及含有在E44、 E67、 E72、 E73和Q87位的一个或多个 碱性氨基酸置换的修饰的VEGF-F类似物(SEQ ID NO.:62)。
本发明的修饰的动物即非人类VEGF-A分子可以同样地含有另外的氨
24基酸修饰以与野生型动物VEGF相比提高修饰的动物分子的结合亲和性或 降低生物活性。本发明包括使用这些修饰结合如上所述的相应于SEQ ID NO.:4的183的氨基酸置换。例如，本发明包括选自灵长类(长尾猕猴) VEGF-A(SEQIDNO.:22)的E44、 E67、 E72、 E73、 183和187位的一个或 多个碱性氨基酸置换； 一个或多个选自牛类VEGF-A (SEQ ID NO.:25)的 E43、 E66、 E71、 E72、 182和Q86位的碱性氨基酸置换； 一个或多个选自 犬科VEGF-A(SEQIDNO.:28)的E43、 E66、 E71、 E72、 182和Q86位的碱 性氨基酸置换； 一个或多个选自鸟类(鸡)VEGF-A(SEQ ID NO.:3 l)的E44、 E67、 D72、 V73、 183和Q87位的碱性氨基酸置换； 一个或多个选自马 VEGF-A(SEQIDNO.:34)的E43、 E66、 A71、 E72、 182和Q86位的碱性氨 基酸置换； 一个或多个选自鼠科VEGF-A (SEQ ID NO.:37)的E43、 E66、 S71、 E72、 182和Q86位的碱性氨基酸置换； 一个或多个选自猪VEGF-A (SEQ IDNO.:40)的E43、 E66、 E71、 E72、 182和Q86位的碱性氨基酸置换； 一个或多个选自大鼠VEGF-A(SEQIDNO.:43)的E43、 E66、 S71、 E72、 182 和Q86位的碱性氨基酸置换；和一个或多个选自羊VEGF-A (SEQ ID NO.:46)的E43、 E66、 E71、 E72、 182和Q86位的碱性氨基酸置换。
含有一个或多个碱性氨基酸置换的VEGF类似物也可与设计为干扰共 同受体结合位点的氨基酸置换结合。在一种实施方式中，本发明的VEGF 类似物含有被干扰的神经毡蛋白-1结合位点。所述神经毡蛋白-1结合位点 包含VEGF165 (SEQ ID NO.:04)的111- 165位氨基酸。该结构域与由外显 子6和7编码的肝素结合结构域重叠。本发明包括其中或附近(即，约5个 氨基酸内)的干扰神经毡蛋白-l结合位点结构域但不干扰肝素结合结构域 结合硫酸肝素的能力的任何氨基酸修饰。技术人员可以凭借经验确定这样 的氨基酸修饰。
在本发明的一种实施方式中，通过降低所述结构域中半胱氨酸氨基酸 残基的数量、即通过降低VEGF-A的111-165位氨基酸之间的半胱氨酸氨 基酸残基的数量来干扰所述神经毡蛋白-1结合结构域。例如，可通过用引 起二硫键破坏的氨基酸例如丝氨酸置换SEQ ID NO.:4的146和/或160位的 半胱氨酸残基将VEGF,65类似物设计成干扰神经毡蛋白1结合位点。在SEQ ID NO.:4的146和160位的半胱氨酸残基置换干扰神经毡蛋白-1结合但是 不干扰肝素结合。还可以通过在146或160终止氨基酸肽来干扰所述神经本发明还可以包括围绕SEQ ID NO.:4的146和160位的氨基酸的修饰， 从而146和160位的半胱氨酸残基不能形成二硫键。例如，本发明包括但 是不局限于能够干扰二硫键形成的136-165位的一个或多个氨基酸置换。
本发明的修饰的VEGF类似物含有本文中所述的相应于SEQ ID NO.:4 的E44、 E67E72、 E73、 183和Q87的一个或多个碱性氨基酸置换。例如， 本发明包括具有位置E44B+C146X、 E44B+C160X、 E44B+C146X+C160X、 E67B+C146X、 E67B+C160X、 E67B+C146X+C160X、 E44B+E67B+C146X、 E44B+E67B+C160X、 E44B+E67B+C146X+C160X、 E72B+C146X、 E72B+C160X、 E72B+C146X+C160X、 E73B+C146X、 E73B+C160X、 E73B+C146X+C160X、 E72B+E73B+C146X、 E72B+E73B+C160X、 E72B+E73B+C146X+C160X、 I83B+C146X、 I83B+C160X、 I83B+C146X+C160X、 Q87B十C146X、 Q87B+C160X、 Q87B+C146X+C160X、 E44B+E67B+E72B+C146X、 E44B+E67B+E72B+C160X、 E44B+E67B+E72+C 146X+C160X、 E44B+E67B+E73B+C146X、 E44B+E67B+E73B+C160X、 E44B+E67B+E73B+C 146X+C 160X、 E44B+E67B+E72B+E73B+C146X、 E44B+E67B+E72B+E73B+C160X、 E44B+E67B+E72B+E73B+C146X+C160X、 E67B+E72B+E73B+C146X、 E67B+E72B+E73B+C0160X、 E67B+E72B+E73B+C 146X+C0160X、 E44B+E72B+E73B+C146X、 E44B+E72B+E73B+C160X、 E44B+E72B+E73B+C146X+C160X、 E44B+I83B+C146X、 E44B+I83B+C160X、 E44B+I83B+C146X+C160X、 E67B+I83B+C146X、 E67B+I83B+C160X、 E67B+I83B+C 146X+C 160X、 E44B+E67B+I83B+C 146X、 E44B+E67B+I83B+C 160X、 E44B+E67B+I83B+C146X+C160X、 E72B+I83B+C146X、 E72B+I83B+C160X、 E72B+I83B+C146X+C160X、 E73B+I83B+C146X、 E73B+I83B+C160X、 E73B+I83B+C146X+C160X、 E72B+E73B+I83B+C146X、 E72B+E73B+I83B+C160X、 E72B+E73B+I83B+C146X+C160X、 I83B+Q87B+C146X、 I83B+Q87B+C160X、 I83B+Q87B+C146X+C160X、 E44B+E67B+E72B+I83B+C146X、 E44B+E67B+E72B+I83B+C160X、 E44B+E67B+E72+I83B+C146X+C160X、 E44B+E67B+E73B+I83B+C146X、
26E44B+E67B+E73B+I83B+C160X、 E44B+E67B+E73B+I83B+C146X+C160X、 E44B+E67B+E72B+E73B+I83B+C146X、 E44B+E67B+E72B+E73B+I83B+C160X、 E44B+E67B+E72B+E73B+I83B+C146X+C160X、 E67B+E72B+E73B+I83B+C146X、 E67B+E72B+E73B+I83B+C160X、 E67B+E72B+E73B+I83B+C146X+C160X、
E44B+E72B+E73B+I83B+C146X、 E44B+E72B+E73B+I83B+C160X和 E44B+E72B+E73B+I83B+C146X+C160X的氨基酸置换的VEGF类似物，其 中B是碱性氨基酸，X是任何除了半胱氨酸之外的氨基酸。在一种实施方 式中，X是丝氨酸。
本发明的修饰的蛋白质也可以含有另外的置换、特别是不改变所述蛋 白质的改进的性质的保守置换。然而， 一般地，这样的修饰的蛋白质将在 除了上列的位置之外含有小于五个置换，并且在除了上列的位置之外的位 置上，与相应野生型VEGF亚单位显示完全的氨基酸序列相同性。
技术人员可以理解，因为VEGF蛋白和相关蛋白之间高度的同源性， 本发明披露的所有的氨基酸置换和肽修饰可以引入在任何VEGF蛋白或相 关蛋白中，无论哪个物种。技术人员可以使用本领域已知的方法、包括但 不限于使用氨基酸序列比对软件来关联本文中所述的氨基酸置换。
具有提离的血清半哀期的VEGF真似物
本发明的VEGF类似物与野生型VEGF相比可以具有提高的血桨半衰 期。在一种实施方式中，所述与野生型VEGF相比提高或保持受体结合亲 和性而降低生物活性的修饰，与野生型VEGF相比也提高了 VEGF的血浆 半衰期。在另一实施方式中，本发明的修饰的VEGF蛋白被进一步修饰， 从而与野生型VEGF相比提高了血浆半衰期。
本领域已知许多修饰可用于提高蛋白质、特别是糖蛋白的半衰期。例 如，本发明的修饰的VEGF蛋白可以另外包含至少一个具有潜在的糖基化 位点的序列，包括在a或p链上含有N-糖基化和/或O-糖基化位点的序列。 提供潜在的糖基化识别位点的序列可为在两个亚单位中的任一个上的N末 端或者C末端延伸。示例性的修饰的蛋白质含有ANITV (SEQ ID NO.:72)和ANITVNITV (SEQ ID NO.:73)的亚单位上的N末端延伸。
也可以使用肽延伸例如hCG的羧基末端延伸肽来提供提高的半衰期。 参见US 09/519,728，通过引用的方式将其全文并入本文中。可以通过本领 域己知的任何方法将VEGF类似物的亚单位共价结合于CTEP，所述方法 通过肽键或能够在蛋白质的氨基末端和羧基末端形成共价键的异双功能试 剂，包括然而并非限于肽接头。
在本发明的另一实施方式中，本发明的碱性氨基酸置换与通过消除一 个或多个蛋白酶剪切位点提高稳定性和提高血清半衰期的一个或多个氨基 酸置换结合。在一种实施方式中，所述另外的氨基酸置换降低蛋白酶剪切。 在另一实施方式中，所述另外的氨基酸置换防止蛋白酶剪切。本发明包括 含有一个或多个引起对纤维蛋白溶酶和/或纤维蛋白溶解原家族的其它成 员的耐性的突变的VEGF类似物。在本发明的一种实施方式中，VEGF分 子的至少一个亚单位含有相应于Alll和/或A148位氨基酸、例如VEGF165 (SEQIDNO.:4)或VEGF!6sb(SEQIDNO.:13)的A111P和/或A148P。例如， 本发明包括含有Alll位的氨基酸置换的VEGF121、 VEGF145、 VEGF148、 VEGF183、 VEGF,粉和VEGF2Q6o本发明包括VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D 和P1GF中的一个或多个突变，其抑制或降低蛋白酶裂解。例如，本发明包 括防止为生物活性所需的VEGF-C和VEGF-D的裂解的氨基酸置换。
在另一实施方式中，可以通过连接VEGF单体和构建融合蛋白来提高 半衰期。增加VEGF类似物的尺寸而不干扰结合位点可以提高所述分子的 半衰期。
可以通过其他的适当的化学基团的交联、包括然而并非限于聚乙二醇 化或配合来提供增加的半衰期。这样的方法是本领域已知的，例如如美国 专利5,612,034、美国专利6,225,449和美国专利6，555，660所述，每个所述 专利都通过引用的方式将其全文并入本文中。也可以通过增加所述分子中 带负电荷的残基的数量、例如谷氨酸和/或天冬氨酸残基的数量来增加半衰 期。这样的改变可以通过定点突变或通过将含有一个或多个带负电荷的残 基的氨基酸序列插入所述修饰的VEGF中来实现，其中，插入物选自GEFT 和GEFTTo
蛋白质的半衰期是蛋白质稳定性的指标，并指示所述蛋白质的浓度降 低一般所需的时间。本文中所述的修饰的VEGF分子的血清半衰期可以通过适于测量来自对象的样品中VEGF水平随时间变化的任何方法进行确 定，所述方法例如然而并非限于使用抗VEGF抗体的免疫测定来测量在 施用所述修饰的VEGF后一段时间取得的血清样品中VEGF水平，或者通 过检测在施用标记的VEGF后从对象取得的样品中的标记的VEGF分子即 放射标记分子。
本发明的VEGF类似物的吸收速率可以导致作用持续时间增加或降 低。通过抵消与施用途径相关的吸收质量，吸收速率提高而作用时间降低 的VEGF类似物可有益于通过皮下施用或其它的与吸收速率缓慢和/或持续 时间增加的施用途径接受VEGF类似物药物组合物的患者。
接头
本发明的VEGF类似物可以含有通过接头肽分开的两个或多个单体。 接头月太可用于形成单链构象的VEGF类似物。技术人员可以理解各种类型 的接头可用于本发明以形成能够结合VEGF受体并起到VEGF受体拮抗剂 作用的VEGF单链分子。接头肽不应阻碍单链分子结合VEGF受体的能力。
所述接头肽的长度可为约2至约50或更多个氨基酸。例如，所述接头 可以由约2个氨基酸、约3个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6 个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、 约10-15个氨基酸或约15-20个氨基酸组成。在本发明的一种实施方式中， 所述接头是甘氨酸-丝氨酸或含有甘氨酸-丝氨酸。在另一实施方式中，所述 接头是富含甘氨酸的多肽链。
可以使用本文中所述的方法构建含有接头的VEGF分子。技术人员将 能理解，含有接头肽的本发明的VEGF类似物分子可以在一个或多个单体 中包括任何本文中所述的突变。此夕卜，含有一个或多个接头肽的VEGF类 似物可以连接超过一种VEGF蛋白或同工型。例如，本发明包括但是不局 限于具有连接于含有I83B置换的修饰的VEGF165单体的野生型VEGF165单 体的修饰的VEGF单链分子；连接于含有I83B置换的修饰的VEGF165b的 野生型VEGF^单体；和融合于修饰的VEGF-F单体的修饰的VEGF,65单 体。
VEGF缺合圣^
29本发明也包括含有一个或多个修饰的VEGF蛋白或片段的融合蛋白， 即嵌合体。"融合蛋白"和"嵌合体"在本文中可互换使用。如本文中所用的， VEGF部分是含有一个或多个本发明的碱性氨基酸置换的VEGF蛋白或蛋 白片段。VEGF融合蛋白可以具有一个或多个VEGF部分。
可以通过本领域己知的方法在适当的编码框中将适当的编码所需氨基 酸序列的核酸序列彼此连接、并通过本文中所述的任何方法表达所述融合 蛋白来得到所述融合蛋白。或者，可以通过蛋白质合成技术例如使用肽合 成仪来得到所述融合蛋白。
本发明的融合蛋白含有至少一个包含本文中所述的一个或多个碱性氨 基酸置换的VEGF蛋白或蛋白片段。在一种实施方式中，所述融合蛋白含 有在VEGF165 (SEQ ID NO. 4)、 VEGF165b (SEQ ID NO. 13)、 VEGF121 (SEQ ID NO.:6)、 VEGF145 (SEQ ID NO.:8)、 VEGF148 (SEQ ID NO.:IO)、 VEGF183 (SEQ ID NO.:15)、 VEGF189 (SEQ ID NO.:17)或VEGF206 (SEQ ID NO.:19)的183位 的碱性氨基酸置换。在另一实施方式中，所述融合蛋白在另一 VEGF蛋白 例如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或P1GF的同工型中含有在相应于SEQ ID NO.:4的I83K的至少一个碱性氨基酸置换。技术人员可以理解，人类或动 物VEGF蛋白或其片段可用于本发明的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，融合了两个不同的VEGF蛋白亚单位或 其片段。例如，本发明包括融合于VEGF-B亚单位或其片段、VEGF-C亚 单位或其片段、VEGF-D亚单位或其片段、或P1GF亚单位或其片段的 VEGF-A亚单位或其片段；融合于VEGF-A亚单位或其片段、VEGF-C亚单 位或其片段、VEGF-D亚单位或其片段、或P1GF亚单位或其片段的VEGF-B 亚单位或其片段；融合于VEGF-A亚单位或其片段、VEGF-B亚单位或其 片段、VEGF-D亚单位或其片段、或P1GF亚单位或其片段的VEGF-C亚单 位或其片段；融合于VEGF-A亚单位或其片段、VEGF-B亚单位或其片段、 VEGF-C亚单位或其片段、或P1GF亚单位或其片段的VEGF-D亚单位或其 片段;和融合于VEGF-A亚单位或其片段、VEGF-B亚单位或其片段、 VEGF-C亚单位或其片段、或VEGF-D亚单位或其片段的P1GF亚单位或其 片段。
本发明包括包含同种VEGF蛋白或其片段的两种或多种不同的同工型 的融合蛋白。例如，本发明包括由融合于VEGF121亚单位或其片段、VEGF145亚单位或其片段、VEGF兩亚单位或片段或其亚单位、VEGF,6sb亚单位或 其片段、VEGF旧亚单位或其片段、VEGFn9亚单位或其片段、或VEGF206 亚单位或其片段的VEGF,65亚单位或其片段组成的融合蛋白。本发明还包 括由融合于VEGF^亚单位或其片段、VEGF"5亚单位或其片段、VEGF148 亚单位或片段或其亚单位、VEGF165b亚单位或其片段、VEGF旧亚单位或 其片段、VEGFw亚单位或其片段、或VEGF2。6亚单位或其片段的VEGF165 亚单位或其片段。
本发明的碱性氨基酸置换可存在于所述蛋白质的一个或多个亚单位 中。例如，含有VEGF^亚单位和VEGF^b亚单位的融合蛋白可以仅仅在 VEGF,65亚单位含有氨基酸置换。本发明包括通过GS接头融合于含有I83k 氨基酸置换的VEGFw的野生型VEGFw亚单位。本领域技术人员可以理 解，本发明的含有一个突变亚单位的融合蛋白可以在两个方向产生，艮P， 所述含有突变的亚单位可以位于融合蛋白的N-末端或C-末端。
在本发明的另一实施方式中，VEGF亚单位或其片段融合于相关蛋白 亚单位或其片段。例如，VEGF亚单位或其片段可融合于PDGF亚单位或 其他的糖蛋白亚单位亚单位或其片段。
本领域普通技术人员可以理解，可以使用人类或动物VEGF序列构建 本文中所述的融合蛋白。此外，可以使用融合于动物VEGF亚单位的人类 VEGF亚单位构建融合蛋白。
VEGF融合蛋白应该理解为VEGF类似物。本文中披露的所有修饰， 例如，进一步提高受体结合亲和性的修饰、提高半衰期和稳定性的修饰、
降低或抑制蛋白酶裂解的修饰和干扰共同受体结合位点例如神经毡蛋白-1 结合位点的修饰，可以引入到所述VEGF融合蛋白的一个或多个亚单位中。 本发明的融合蛋白还可以含有分开两个或多个VEGF亚单位或VEGF 相关蛋白亚单位的接头。所述接头可以共价连接于所述融合蛋白的肽并在 融合蛋白的肽之间。
VEGF和棄素^合圣仓
本发明提供了包含毒素和含有一个或多个本文中所述的碱性氨基酸置 换的一个或多个修饰的VEGF亚单位即单体的融合蛋白。例如，VEGF-毒 素融合蛋白的VEGF单体即亚单位可以含有在相应于(SEQ ID NO.:4或SEQIDNO,:13)的44、 67、 72、 73、 83和87位氨基酸的一个或多个氨基酸位置 上的碱性氨基酸。本发明的VEGF和毒素融合蛋白可以任选地含有分开所 述毒素和一个或多个VEGF亚单位的接头序列。
如本文中所用的，术语"毒素"是指生物学来源的有毒物质。本发明的 毒素可为本领域己知的可溶性毒素。所述包含可溶性毒素的融合蛋白可用 于靶肿瘤。所述融合蛋白也可用于诊断目的。
毒素的实例包括但是不局限于假单胞菌属外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、 蓖麻毒素、相思豆毒蛋白毒素、炭疽毒素、志贺毒素、肉毒杆菌毒素、破 伤风毒素、霍乱毒素、甲藻毒素、岩沙海葵毒素、鱼肉毒素、棕网蛇毒素、 箭蛙毒素、a食鱼螺毒素、泰攀蛇毒素、河飩毒素、a蝎毒素(alpha tilyustoxin)、蛤蚌毒素、变性毒素、微囊藻素、乌头碱、脱叶霉素A和B、 肠毒素、中毒性休克综合征毒素(TSST-I)、鼠疫耶尔森菌(K/^W&)毒素、 气性坏疽毒素等等。
在一种实施方式中，本发明提供了一种包含融合于修饰的VEGF的可 溶性毒素和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方式中，本发 明提供了包含可溶性毒素的修饰的VEGF融合蛋白在制备用于治疗或预防 与血管发生相关的疾病或病症的药物中的用途。
不希望囿于理论，相信本发明的VEGF-毒素融合蛋白通过靶向和杀死 VEGF受体和周围内皮细胞和肿瘤细胞而预防或降低血管发生、肿瘤生长 和/或癌症扩散。
VEGF炎体拮抗刮的表达和/或合成
本发明包括编码本发明的修饰的VEGF蛋白的核酸以及用于表达所述 核酸的载体和宿主细胞。
如本文中所用的，术语"核酸"或"多核苷酸"是指单链或双链形式的脱 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。本发明包括编码本发明的修饰的 VEGF分子的核酸分子。例如，本发明包括编码修饰的VEGF,65分子的核 酸分子。可以通过本领域已知的方法突变编码野生型VEGF165的SEQ ID NO.:l的核酸分子，使得突变的VEGF^核酸分子编码所述修饰的蛋白质。 同样，可以通过本领域已知的方法突变编码野生型VEGF165b的SEQ ID NO.:ll的核酸分子，使得其编码本发明的VEGF^b分子。
32一旦构建、修饰或分离编码感兴趣的特殊修饰的VEGF的核酸或编码 含有碱性氨基酸置换的蛋白质的一部分的核酸的区域，那么，可以将所述 核酸克隆到可以指导修饰的VEGF蛋白的体内或体外合成的适当载体中。 或者，编码本发明的VEGF类似物的核酸可以在感兴趣的表达载体中直接 进行克隆或修饰。所述载体预期具有必要的指导和调节插入基因或杂合基 因转录的功能元件。这些功能元件包括但是不局限于启动子、所述启动子 上游或下游区域、例如可以调节所述启动子的转录活性的增强子、复制起 点、促进邻近所述启动子的插入物的克隆的适当的限制酶切位点、抗生素 抗性基因或其他的可以用于选择含有所述载体的细胞或含有所述插入物的 载体的标记、RNA剪接点、转录终止区或任何可以用于促进插入基因或杂 合基因表达的其它区域。(通常参见，Sambrook等，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，第二版(1989))。用于在不同宿主细胞中表达核酸的适当 的启动子是本领域公知的，根据用于表达的载体-宿主系统容易互换。在 U.S. 6,361,992中描述了示例性的载体和宿主细胞，通过引用的方式将其全 文并入本文中。
存在很多可用于表达所述核酸插入物的本领域普通技术人员已知的大 肠杆菌(^c/^n'c/H'" co/0表达载体。其他的适用的载体包括来自芽胞杆菌属 例如枯草芽胞杆菌、及其他肠杆菌科例如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和很多 假单胞菌属的表达载体。这些表达载体一般地含有与宿主细胞相容的表达 调控序列(例如复制起点)。此夕卜，存在很多公知的启动子，例如乳糖启动子 系统、色氨酸(Tip)启动子系统、P-内酰胺酶启动子系统或来自X噬菌体的 启动子系统。所述启动子一般控制表达，任选地具有操纵子序列，并具有 例如用于起始和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列。如果必要，可以 通过插入Met密码子5 '和框内的具有下游核酸插入物提供氨基末端甲硫氨 酸。此外，可以使用标准寡核苷酸诱变方法除去所述核酸插入物的羧基端 延伸。
另外，可以使用酵母表达系统。酵母表达系统有几种优点。第一，存 在证据在酵母分泌系统中产生的蛋白质显示正确的二硫键。第二，通过酵 母分泌系统有效地进行翻译后糖基化。酿酒酵母预前a因子前导区(由MF "-l基因编码)习惯上用于指导从酵母分泌蛋白质。(Brake等，'Varies-F actor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in
33Saccharomyces cerevisiae." Proc. Nat. Acad. Sci.， 81 :4642-4646 (1984))。所述 预前a因子的前导区含有信号肽和包括KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识 别序列的前部分。该酶在Lys-Arg 二肽裂解信号序列的羧基侧裂解前体蛋 白。VEGF编码序列可以框内融合到所述预前a因子前导区。然后将该构 建体置于强转录启动子例如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的调控下。 所述核酸编码序列后是翻译终止密码子，继之以转录终止信号。或者，所 述核酸编码序列可以融合于第二蛋白质编码序列，例如SJ26或P-半乳糖苷 酶，其可用于通过亲和色谱法促进所述融合蛋白的纯化。插入蛋白酶切割 位点以分开融合蛋白的组分适用于在酵母中表达的构建体。有效的翻译后 糖基化和重组蛋白表达也可在杆状病毒系统内实现。
哺乳动物细胞允许在利于重要的翻译后修饰(例如折叠和半胱氨酸配 对、添加复合糖结构和分泌活性蛋白)的环境中表达蛋白质。可用于在哺乳 动物细胞中表达活性蛋白的载体的特征在于在强病毒和其它启动子和聚腺 苷酸化信号之间插入蛋白质编码序列。所述载体可以含有给予潮霉素抗性、 庆大霉素抗性的基因或其它适于作为选择性标记的基因或表型、或氨甲喋 呤抗性的基因用于基因扩增。可以使用编码氨甲喋呤抗性的载体将嵌合蛋 白编码序列引入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或使用合适的选择标记将其引 入其它细胞系。可以通过Southern印迹分析证实载体DNA在转化细胞中 的存在。通过Northern印迹分析可以证实相应于插入物编码序列的RNA的 产生。本领域已经研发了很多能够分泌完整的人类蛋白质的其他合适的宿 主细胞系，包括CHO细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkat细胞等等。 用于这些可以细胞的表达载体可以包含表达调控序列(例如复制起点、启动 子、增强子)和必要的信息处理位点(例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、 聚腺苷酸化位点和转录终止子序列)。示例性的表达调控序列是来源于免疫 球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等等的启动子。根据细胞宿主 的类型不同，可以通过公知的方法将含有谜底核酸片段的载体转移到宿主 细胞中。例如，通常使用氯化钙转化原核细胞，而可以使用磷酸钙、DEAE 葡聚糖、或阳离子脂质体介导的转染或电穿孔法转化其他的细胞宿主。
可以在体内或者在体外表达所述基因或杂合基因。体内合成包括转化 可以作为所述载体的宿主细胞的原核或真核细胞。例如，转化真菌的技术 在文献中是公知的，己由例如Beggs (如上)描述Hinnen等(Proc. Natl. Acad.Sci. USA 75: 1929-1933， 1978), Yelton等，(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1740- 1747,1984)和Russell (Nature 301 : 167-169, 1983)描述。可以使用将克 隆DNA序列引入真菌细胞的其他技术例如电穿孔法(Becker and Guarente, Methods in Enzymol. 194: 182-187， 1991)。宿主细胞的基因型通常含有通过 在表达载体上的选择性标记可互补的遗传缺陷。选择特定宿主和选择性标 记恰在本领域普通技术人员的水平内。
例如通过磷酸钙介导的转染可将包含本发明的修饰的VEGF和VEGF 融合蛋白的克隆DNA序列引入到培养的哺乳动物细胞中(Wigler等，Cell 14: 725， 1978; Corsaro禾卩Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603， 1981; Graham 和Van der Eb, Virology 52: 456， 1973)。也可以使用将克隆的DNA序列引入 哺乳动物细胞中的其它技术，例如电穿孔法(Neumann等，EMBO J. 1: 841-845,1982)或脂质转染法。'为了鉴别细胞已经整合了克隆的DNA，通常 将选择性标记和目的基因或cDNA —起引入细胞中。优选的用于培养的哺 乳动物细胞的选择性标记包含给予抗药(新霉素、潮霉素和氨甲喋呤)性的基 因。所述选择性标记可为可扩增的选择性标记。优选的可扩增的选择性标 记是DHFR基因。特别优选的可扩增的标记是DHFRf (参见美国专利 6,291 ，212) cDNA (Simonsen和Levinson， Proc. Natl, Acad. Sci. USA 80: 2495-2499， 1983)。选择性标记由Thilly综述(Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham， Mass.)，选择选择性标记恰在本领域普通 技术人员的水平内。
或者，可在体外表达系统中表达所述基因。例如，体外转录系统是市 售的习惯用于合成相对大量的mRNA。在这样的体外转录系统中，将编码 修饰的VEGF的核酸克隆到邻近转录启动子的表达载体中。例如，Bluescript II克隆和表达载体含有侧面是强原核转录启动子的多克隆位点。(Stratagene Cloning Systems, La Jolla， Cailf)。可获得含有所有自DNA模板体外合成 RNA的必要试剂，例如Bluescript载体。(Stratagene Cloning Systems, La Jolla， Cailf)。然后，将如这样的系统在体外产生的RNA在体外翻译，以产生所 需VEGF类似物(Stratagene Cloning Systems, La Jolla， Cailf)。
产生VEGF受体拮抗剂的另一方法是通过蛋白质化学技术将两个肽或 多肽连接在一起。利用Fmoc ( 9-芴甲氧羰基)或者Boc(叔丁氧羰基)化学使 用现行的实验室设备可以化学合成肽或多肽。(Applied Biosystems， Inc.,
35Foster City, Cailf)。本领域技术人员容易理解，可以通过标准化学反应合成 相应于杂合VEGF蛋白的肽或多肽。例如，可以合成肽或多肽但不在合成 中进行裂解，而是可以合成杂合肽的另一片段，随后自树脂裂解，从而暴 露在另一片段上功能被阻断的端基。通过肽縮合反应，分别通过两个片段 羧基端和氨基端的肽键共价连接这两个片段，以形成杂合肽。(Grant，G.A.， "Synthetic Peptides: A User Guide," W. H. Freeman and Co., N. Y. (1992)以及 Bodansky， M和Trost, B.， Ed""Principles of Peptide Synthesis," Springer-Verlag Inc., N.Y. (1993))。或者，可以如上所述在体内独立地合成所述肽或 多肽。分离后，这些独立的肽或多肽可以通过相似的肽縮合反应形成VEGF。 例如，克隆或合成的肽片段的酶连接或化学连接可以允许连接相对短的肽 片段以产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域(Abrahmsen， L.，等， Biochemistry, 30:4151 (1991); Dawson等，"Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation," Science, 266:776-779 (1994))。
本发明也提供具有拮抗剂活性的修饰的VEGF的片段。本发明的多肽 片段可以是通过在能够产生所述肽的表达系统中克隆编码所述肽的核酸获 得的重组蛋白。例如，可以从天然的或VEGF蛋白除去氨基端或羧基端氨 基酸，在一种如上所述的很多可用的测定中检测各自的活性。在另一实施 方式中，本发明的修饰的蛋白质的氨基末端或羧基末端氨基酸的一部分、 或者甚至所述蛋白内部的区域，可以被能够促进所述修饰的VEGF的纯化 的多肽片段或者其他部分例如生物素替换。例如，修饰的VEGF可以通过 将编码两个多肽片段的各核酸克隆到表达载体中的二者之一肽化学融合于 麦芽糖结合蛋白，从而编码区的表达产生杂合多肽。可以通过将杂合多肽 经过直链淀粉亲和层析柱来亲和纯化杂合肽，然后，通过用特异性蛋白酶 因子Xa裂解杂合多肽从麦芽糖结合区分裂修饰的VEGF。(参见，例如New England Biolabs Product Catalog, 1996， pg. 164)。
本发明的VEGF类似物可以是异二聚体或同二聚体。在一种实施方式 中，所述VEGF类似物是含有一个或多个VEGF亚单位的融合蛋白。本发 明的VEGF融合蛋白可以是含有被连接肽分开的两个或多个VEGF亚单位 的单链蛋白。在另一实施方式中，本发明的VEGF类似物是含有一个或多 个融合于毒素的VEGF亚单位的融合蛋白。本发明的VEGF类似物和VEGF 类似物融合蛋白可以通过本领域已知的手段进行分离和纯化。所有本发明的VEGF类似物在至少一个VEGF亚单位中含有至少一个 碱性氨基酸置换。在本发明的一种实施方式中，本发明的VEGF类似物在 至少一个或至少两个VEGF亚单位中含有至少2个碱性氨基酸置换、至少 3个碱性氨基酸置换、至少4个碱性氨基酸置换或至少5个碱性氨基酸置换。
本发明包括含有VEGF活性片段(即不是全长蛋白质的肽)的VEGF类 似物。本发明的修饰的VEGF的活性片段也可以直接地合成或通过化学破 坏或机械破坏较大的修饰VEGF蛋白来获得。活性片段定义为来自天然氨 基酸序列的至少约5个连续氨基酸至少10个连续氨基酸、至少20个连续 氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨 基酸、至少60个连续氨基酸、至少70个连续氨基酸、至少80个连续氨基 酸、至少卯个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、至少110个连续氨基 酸、至少120个连续氨基酸、至少130个连续氨基酸、至少140个连续氨 基酸、至少150个连续氨基酸、或至少160个连续氨基酸的氨基酸序列，其 具有相关活性，例如结合或调节活性。无论是否连接于其它序列，所述片 段也可包含特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、置换或其他选择修 饰，条件是所述肽的活性与修饰的VEGF相比未显著变化或削弱。这些修
饰可以提供一些附加性能，例如去除或添加能够成二硫键的氨基酸，以提 高其生物寿命和/或生物活性等等。在任何情况下，所述肽必须具有生物活 性，例如结合活性、调节结合结构域的结合，等等。通过诱变激素的特定 区域，然后表达和试验表达的多肽来确定所述VEGF的功能区或活性区。 这样的方法对于本领域技术人员是显而易见的，可以包括编码所述受体的 核酸的位点特异性诱变(Zoller， M. l.等)。
使用者法
本发明包括降低VEGF介导的血管发生的方法，该方法包括使表达激 酶结构域受体(KDR)的细胞与本文中所述的包括VEGF-A,65和VEGF-A165b 类似物的VEGF类似物接触，从而降低VEGF介导的血管发生。通过本发 明的方法耙定的表达KDR的细胞可以包括原核和/或真核细胞。所述细胞 可以保持在体外，或者可以存在于体内，例如存在于诊断患有癌症或其它 血管发生相关疾病的患者或对象。
本发明包括用治疗有效量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治疗诊断患有血管发生相关疾病或病症的患者的方法，该方法包括给所述患者
施用所述VEGF类似物或融合蛋白来降低或抑制所述血管发生相关疾病或 病症。为了血管发生的降低，所述患者的结果可以与施用安慰剂的患者的 结果进行比较。示例性的血管发生相关疾病在本申请全文有述，包括但是 不局限于选自肿瘤和瘤形成、血管瘤、类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒 性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、血管再狭窄、动静脉 畸形、脑膜瘤、新生血管性青光眼、牛皮癣、卡波西氏综合征、血管纤维 瘤、血友病关节、肥厚性瘢痕、Osier-Weber综合征、脓性肉芽肿、晶体后 纤维组织增生、硬皮病、沙眼、希林二氏病、血管粘附病变、滑膜炎、皮 炎、子宫内膜异位、翼状胬肉、糖尿病性视网膜病、角膜损伤或移植相关 的新血管发生、伤口、痍和溃疡(皮肤、胃和十二指肠溃疡)。
患有由血管发生增加、血管发生降低或者其它血管发生失调引起或加 重的疾病的患者可以单独用VEGF类似物或VEGF类似物与已知的VEGF 受体拮抗剂、抗血管发生治疗、抗癌治疗或其他已知的治疗所述疾病或病 症的治疗结合来进行治疗。如本文中所用的，"治疗"包括不局限于已知的 药物。己知的VEGF受体拮抗剂或者抗血管发生治疗包括但是不局限于中 断VEGF/KDR相互作用和/或阻断KDR信号转导途径的药剂，例如，阻断 VEGF结合KDR的肽、抗VEGF的抗体、抗KDR的抗体、可溶性受体、 酪氨酸激酶抑制剂、抗VEGF免疫毒素、核糖酶、反义介导的VEGF抑制 和低硫酸化的低分子量二醇开环型肝素。
如果本发明的VEGF类似物与另一种治疗结合使用，所述治疗的结合 产生协同效应。此外，本发明的VEGF类似物可以与不希望的副作用相关 的药物相结合。通过结合VEGF类似物和所述药物，可以降低有副作用的 药物的有效剂量，从而降低副作用发生的可能性。
本发明包括用治疗有效量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治疗 诊断患有癌症的患者的方法，该方法包括给所述患者施用所述拮抗剂来降 低或抑制所述癌症的扩散，即，降低或抑制转移。本发明包括用治疗有效 量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治疗诊断患有癌症的患者的方 法，该方法包括给所述患者施用所述拮抗剂来降低或抑制肿瘤生长。在一 种实施方式中，所述VEGF类似物通过降低或防止VEGF-诱导的血管发生 抑制血管发生来其作用。在另一实施方式中，所述VEGF类似物是通过靶
38向或杀死肿瘤细胞、脉管细胞(例如内皮细胞)和/或VEGF受体来防止或降 低血管发生的VEGF-毒素融合蛋白。
本发明的方法可治疗的癌症包括所有的实体瘤和转移性癌，包括然而 并非限于膀胱癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺 癌、胰腺癌、肺癌、脑部癌症和皮肤癌。本发明包括但是不局限于通过本 领域已知的方法(参见美国专利6，596，712)用本发明的VEGF类似物单独的、 与化疗结合或与放疗结合治疗癌症。例如，VEGF类似物可以与铯、铱、 碘或钴放射一起使用。
本发明包括用治疗有效量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治疗 诊断患有不育的患者的方法，该方法包括给所述患者施用所述拮抗剂来由 本领域技术人员治疗不育。可以通过本领域已知的定量和定性参数(例如， 卵母细胞的量、受精率、胚泡形成速度和胚胎形成速度)来量度不育。所述 不育疾病包括与危害患者育性的VEGF的表达相关的任何疾病，包括然而 并非限于原因不明的女性不育、子宫内膜异位和原因不明的男性不育。本 发明包括但是不局限于通过单独施用VEGF类似物或与其它抗VEGF治疗、 抗血管发生治疗和/或不育治疗相结合来治疗不育。
本发明也包括用治疗有效量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治 疗诊断患有血管发生相关眼病的患者的方法，该方法包括给所述患者施用 所述拮抗剂来降低或抑制所述眼病。所述眼病包括任何与异常的眼内新血 管生成相关的眼病，包括然而并非限于早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜 病、视网膜静脉阻塞、和年龄相关性黄斑变性。本发明包括但是不局限于 通过单独施用VEGF类似物或与其它抗VEGF治疗、抗血管发生治疗和/ 或其他的眼病治疗相结合来治疗血管发生相关眼病。例如，本发明的VEGF 类似物可以与辉瑞的哌加他尼钠(培加尼布)结合使用给患者来治疗糖尿病 性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞和年龄相关性黄斑变性，哌加他尼钠是一种 加入聚乙二醇的抗VEGF适体，通过结合并抑制VEGF的活性来其作用。
本发明还包括用治疗有效量的任何本文中所述的VEGF受体拮抗剂治 疗诊断患有血管发生相关炎性病症或自身免疫性疾病的患者的方法，该方 法包括给所述患者施用所述拮抗剂来降低或抑制所述炎性病症。所述炎性 病症或疾病包括任何与VEGF的表达和VEGF活化细胞相关的炎性障碍， 包括然而并非限于所有类型的关节炎(特别是类风湿性关节炎和骨关节炎)、哮喘、肺纤维化和皮炎。本发明包括但是不局限于通过单独施用VEGF类 似物或与其它抗VEGF治疗、抗血管发生治疗、炎症治疗和/或自身免疫性 疾病治疗相结合来治疗血管发生相关炎性病症或自身免疫性疾病。
在本发明的另一实施方式中，本发明的修饰的VEGF蛋白用作诊断剂。 本发明的VEGF类似物或VEGF受体可以显示在例如蛋白质或肽阵列中的 合成表面上。所述阵列是本领域公知的，可用于筛选结合KDR及其他已知 参与血管发生的受体的VEGF类似物。本文中披露的VEGF类似物可用作 阳性对照来评价推定的VEGF类似物结合KDR及其他己知参与血管发生的 受体的能力。本发明也包括包含本发明的VEGF类似物来筛选推定的可参 与血管发生的VEGF受体的阵列。
在PCT/US/99/05908中描述了适于表征本文中所述的类似物的测定， 通过引用的方式将其全文并入本文中。例如，可以使用各种免疫测定，包 括然而并非限于竞争性结合测定和利用例如放射免疫测定的非竞争性测定 系统、ELISA、三明治免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀素反应、 免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体 结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定和免疫电泳测定等等。
药浙刦型
本发明提供了通过给对象施用有效量的本发明的治疗剂的诊疗方法。 所述对象可为动物，包括然而并非限于例如牛、猪、马、鸡、猫、狗等的 动物，优选哺乳动物、最优选人类。在一种具体实施方式
中，所述对象是 非人类哺乳动物。
本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种本发明的修饰的VEGF 蛋白和药学上可接受的载体。所述组合物可以另外包含其它已知的适于治 疗针对的特殊疾病的药物。本发明的VEGF受体拮抗剂的有效量是与不存 在所述化合物的情况相比阻断、抑制或降低了内皮细胞的VEGF刺激的量; 换言之，是与不存在所述化合物的情况相比，降低了内皮的血管发生活性 的量。所述有效量(和施用方式)基于个体进行确定，并将根据施用的特定治 疗性VEGF受体拮抗剂、考虑所述对象(体积、年龄、一般健康)、治疗的 病症(癌症、关节炎、眼病等等)、治疗症状的严重程度、寻求结果、施用的 特定载体或药物剂型、施用途径和其它对本领域技术人员显而易见的因素
40来确定有效量。本领域普通技术人员可以使用本领域已知的技术来确定有 效量。本文中所述的化合物的治疗有效量可以使用本领域已知的体外试验、
动物模型或其他的剂量-反应研究进行测定。本发明的VEGF蛋白可单独使 用或与其它治疗结合。当VEGF类似物与另一治疗结合时，可降低治疗有 效量。
本发明的药物组合物可以适于皮内、静脉内、皮下、口、直肠、阴道、 肠胃外、腹膜内、体表、肺、鼻内、口腔内、眼、鞘内、硬膜外或其它施 用途径进行制备、包装或出售。所述化合物可以通过任何方便的途径施用， 例如通过灌输或弹丸注射、通过经上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、 直肠粘膜和肠粘膜等等)，并且可以和其他的生物活性剂一起施用。施用可 以是全身的或局部的。例如，可以将本发明的药物组合物通过微灌输局部 施用到肿瘤。此外，可以单剂量或一系列剂量进行施用。
对于药学应用，本发明的VEGF类似物可与药学上可接受的载体结合 施用，并且可以任选地包含药学上可接受的稀释剂或赋形剂。此外，本发 明的VEGF类似物可与其他的已知治疗结合施用，包括然而并非限于抗 VEGF治疗、抗血管发生治疗、抗癌治疗、不育治疗、自身免疫性疾病治 疗、炎症治疗、眼病治疗和皮肤病治疗。
因此，本发明也提供了适于给对象施用的药物组合物。所述载体可以 是液体，以便所述组合物适宜肠胃外施用，或者可以是固体，即配制成用 于口服的片剂或丸剂。此外，所述载体可以是可气雾化的液体或固体的形 式，从而所述组合物适宜吸入。当胃肠外施用时，所述组合物应是无热原 的，并处于可接受的胃肠外载体中。或者可以利用已知的方法将活性化合 物配制或封装在脂质体中。其他的预期剂型包括投射纳米颗粒和基于免疫 学的剂型。
脂质体是含有俘获的水体积的完全封闭的脂双层膜。脂质体是可以为 单层(一层膜)或多层(洋葱样结构，其特征在于多膜双层，各由水层自下一 层分开)。所述双层由两个具有疏水性"尾部"区域和亲水性"头部"区域组成 的脂单层组成。在所述膜状双层中，脂单层的疏水性(非极性)"尾部"朝向所 述双层的中心，而亲水性(极性)"头部"朝向水相。
本发明的脂质体可以通过本领域已知的任何方法形成。几种方法可用 于形成本发明的脂质体。例如，可以使用多层脂质体(MLV)、稳定的多层脂质体(SPLV)、小单层脂质体(SUV)、或逆相蒸发脂质体(REV)。然而优选， 通过过滤器挤出MLV，根据所用过滤器尺寸，形成大单层脂质体(LUV)。 通常，可以使用30、 50、 60、 100、 200或800 nm孔的聚碳酸酯过滤器。 在Cullis等的美国专利5,008,050号(其相关部分通过引用的方式并入本文) 披露的该方法中，脂质体悬浮液可以重复通过挤出装置，产生一群粒度分 布均匀的脂质体。
例如，所述过滤可以通过直通膜式过滤器(核孔聚碳酸酯过滤器)或弯径 过滤器(例如孔径O.l^m的核孔Membrafil过滤器(混合纤维素酯))或例如均 化作用的可选择的减縮尺寸技术进行。所述脂质体的尺寸可为直径约0.03 至约2微米以上；优选约0.05至0.3微米，最优选约0.1至约0.2微米。所 述尺寸范围包括脂质体MLV、 SPLV或LUV。
可用于本发明的脂质体剂型的脂类合成或天然的磷脂，并且可包括磷 脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、 磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SPM)和心磷脂，其中，可单独或结 合使用，也可以与胆固醇结合使用。可用于本发明的磷脂也可包括二肉豆 蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)。在其它实施方 式中，也可以使用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、或氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。同样可以使用二肉豆蔻酰磷脂酰 胆碱(DMPC)和二硬脂酰磷脂胆碱(diarachidonoylphosphatidylcholine , DAPC)。
在制备所述脂质体期间，有机溶剂也可用于悬浮所述脂类。用于本发 明的合适的有机溶剂包括具有多种极性和介电性能的有机溶剂，其溶解脂 类，例如氯仿、甲醇、乙醇、二甲亚砜(DMSO)、 二氯甲垸和溶剂混合物 例如其中苯甲醇(70:30)。从而形成了含有所述脂类的溶液(其中所述脂类 及其他组分全部均匀分布的混合物)。通常基于生物相容性、低毒和溶解能 力来选择溶剂。
为了将本发明的VEGF受体拮抗剂封装到所述脂质体中，美国专利 5，380，531号(其相关部分通过引用的方式并入本文中)所述的方法也可与本 发明的类似物一起使用。
含有本发明的VEGF类似物的脂质体可以治疗性地用于哺乳动物特别 是人类来治疗很多需要缓释剂型以及重复施用的疾病状态或药理学病症。施用含有本发明的药剂的脂质体的模式可以决定可以运输VEGF类似物的 生物体中的位点和细胞。
本发明的脂质体可以单独施用，但通常与根据施用的预定途径和标准 药物实践选择的药物载体混合施用。所述制剂可以肠胃外、例如静脉注射。 对于肠胃外施用，它们例如可以无菌水溶液的形式使用，如果等渗性是必 要的或要求的，所述水溶液可含有其他溶质，例如足量的盐或葡萄糖以使 所述溶液等渗。本发明的脂质体也可以皮下或肌内使用。根据所述制剂的 特殊性质，本领域技术人员可以预见其它使用方式。
对于口服模式，本发明的脂质体剂型可以片剂、胶囊、糖锭、锭剂、 粉剂、糖浆、酏剂、水溶液和悬浮液等等的形式使用。使用片剂时，可用 载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。各种崩解剂例如淀粉、润滑剂和滑石 常用于片剂中。对于以胶囊形式口服，可用的稀释剂是乳糖和高分子量聚 乙二醇。当需要水悬浮液用于口服时，活性成分和乳化剂和悬浮剂结合。 如果需要，可以加入某些甜味剂和/或调味剂。
对于局部施用模式，本发明的药物剂型可以掺入例如溶液、悬浮液、 凝胶、油、软膏或油膏等的剂型。在例如Gennaro等(1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing例举的药物剂型的领域中描述了 所述局部剂型的制备。对于局部施用，所述组合物也可以作为粉剂或喷雾 剂、特别是气溶胶形成进行施用。对于施用给人类治疗疾病状态或药理学 病症，处方医师将最终决定给定人类对象的药剂的合适剂量，预计该剂量 可根据个体的年龄、重量和反应以及所用药剂的药物动力学而变化。
本发明的药物组合物还包括生物聚合物的贮存剂型例如生物可降解的 微球。生物可降解的微球用于控制药物释放速度，并将药物靶向体内的特 异性位，由此优化其治疗反应、减少毒副作用并消除重复注射的不便。生 物可降解的微球相对大的聚合物植入物的优点在于他们不需要外科手术方 法来移植和除去。
用于本发明的生物可降解的微球用在作用位点延迟所述蛋白质的释放 并长时间保持治疗有效浓度的聚合物形成。所述聚合物可以挑选乙基纤维 素、聚苯乙烯、聚(s-己内酯)、聚(乳酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。 PLGA 共聚物是一种具有可再生和缓释特性的合成的生物可降解的和生物相容的 聚合物。PLGA共聚物的优点在于其降解速率从数月到数年，并且是聚合
43物分子量和聚乳酸与聚乙醇酸之比的函数。当前市售几种使用PLGA的产 品用于胃肠外应用，包括美国的Lupron Depot和Zoladex，以及欧洲的 Enantone Depot、Decapeptil、和PariodelJLA (参见Yonsei， Med J. 2000 Dec;41 (6): 720-34综述)。
本发明的药物组合物另外可以以适于鼻部施用的剂型来制备、包装、 或出售，因为在鼻上皮的紧密连接显示了渗透性增加(Pietro和Woolley, The Science behind Nastech's intranasal drug delivery technology. Manufacturing Chemist, 2003年8月)。所述剂型可以包含干燥颗粒，其包含 活性成分，^^径在约0.5至约7纳米、优选约1至约6纳米范围内。所述组 合物便于采用干粉形式，以使用包含可指向推进剂流来分散所述粉末的干 粉储存器的装置或者使用自动推进溶剂/粉末分配容器(例如在密封容器中 的低沸点推进剂中溶解或悬浮的活性成分的装置)进行施用。优选地，所述 粉末包含颗粒，其中98%重量的颗粒的直径大于0.5纳米，而至少95。/0数 量的颗粒的直径小于7纳米。更优选地，至少95%重量的颗粒的直径大于 1纳米，而至少90%数量的颗粒的直径小于6纳米。干粉组合物优选包含 固体细粉稀释剂(例如糖)，并方便以单位剂量形式提供。
配制用于鼻部输送的本发明的药物组合物也可以提供溶液或悬浮液小 滴形式的活性成分。所述剂型可以制备、包装或出售为包含所述活性成分、 任选无菌的水溶液或稀酒精溶液或悬浮液，并且方便使用任何喷雾或雾化 装置进行施用。所述剂型可以另外包含一种或多种另外的成分，包括但不 限于调味剂(例如糖精钠)、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂(例如 羟苯甲酯)。通过这种施用途径提供的小滴的平均直径优选为约0.1至约200 纳米。
适于鼻内施用的另一剂型是包含所述活性成分、平均颗粒为约0.2至 500微米的粗粉。所述剂型以从鼻中吸入的方式进行施用，即，通过鼻部通 道从接近鼻子的盛装粉末的容器快速吸入。
适于鼻部施用的剂型可以例如少至0.1% (w/w)、多至100% (w/w)的所 述活性成分，此外可以包含一种或多种另外的本文中所述的成分。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以通过吸入施用。对于吸入治 疗，所述活性成分可为在用于通过计量剂量吸入器施用的溶液中或为适于 干粉吸入器的形式。在另一实施方式中，所述组合物适于通过支气管灌洗
44进行施用。
口服的合适剂型包括硬胶囊或软胶囊、丸剂、片剂(包括糖衣片剂)、酏 剂、悬浮液、糖浆或吸入及其控释形式。
本发明的VEGF受体拮抗剂可以急性施用(即，在引起晏征的事件发作 期间或发作后不久)或可以在退行性疾病的过程中施用，以减少或改善否则 会出现的症状的进展。施用的时间和间隔根据对象症状而变化，并且可在 本领域技术人员确定的数小时、日、周或更长的时程中以数小时至数天的 间隔施用。典型的日程安排为每天约0.01pg/kg体重、每天约1 mg/kg体重、 每天约10 mg/kg体重、每天约100 mg/kg体重和每天约1 g/kg体重。
考虑VEGF蛋白、蛋白质剂型和待治疗的疾病，本发明的VEGF受体 拮抗剂可以静脉内、口服、鼻内、眼内、肌内、鞘内或任何合适的途径进 行施用。用于治疗炎症性关节炎的修饰的VEGF可以直接注射到滑液中。 用于治疗实体瘤的修饰的VEGF可以直接注射到所述肿瘤中。用于治疗皮 肤病的修饰的VEGF可以例如洗液或喷雾的形式局部施用。用于治疗脑肿 瘤的鞘内施用可以包括直接注射到脑中。或者，修饰的VEGF可以偶联或 缀合于第二分子(载体)，其为肽或非蛋白部分，具有穿透血脑屏障并穿过血 脑屏障运输活性剂的能力。合适的载体的实例在美国专利号4,902,505; 5，604，198;和5，017，566中披露，通过引用的方式将其全文并入本文中。
通过给对象施用携带编码修饰的VEGF蛋白的核酸序列的载体来进行 施用本发明的VEGF受体拮抗剂的另一方法，其中所述载体能够指导所述 蛋白质的表达和分泌。合适的载体通常是病毒载体，包括DNA病毒、RNA 病毒和反转录病毒。利用载体运输系统和进行基因治疗的技术是本领域已 知的(参见Lundstrom, 2003, Trends Biotechnol. 21 (3): 117-22，近期综述)。
转基因动物
在本发明的一种实施方式中预期制备转基因非人类动物，其含有受体 结合亲和性增加的修饰的VEGF构建体、任选地含有拮抗性。
在很多专利和出版物中已经描述了转基因非人类动物的成功制备，例 如美国专利6,291,740 (2001年9月18日授权)；美国专利6,281,408(2001 年8月28日授权)和美国专利6,271,436 (2001年8月7日授权)，通过引用 的方式将其全文内容并入本文中。
45改变动物例如驯养哺乳动物(包括母牛、猪、山羊、马、牛类、和绵羊) 的遗传构成的能力允许很多商业应用。这些应用包括产生以容易收获的 形式(例如，表达到奶或血液中)表达大量外源蛋白质的动物；产生体重、饲 料转化效率、胴体成分、奶产量或含量、抗病性和对特定微生物感染的抗 性增加的动物；以及产生生长速度或繁殖能力提高的动物。在基因组中含
有外源DNA序列的动物称为转基因动物。
生产转基因动物的最广泛应用的方法是将DNA显微注射到受精卵的 原核中(Wall等,J. Cell. Biochem. 49:113 [1992])。其他的生产转基因动物的 方法包括用反转录病毒或反转录病毒载体感染胚胎。已经报道了用野生型 或者重组反转录病毒感染植入前后小鼠胚胎(Janenich， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]; Janenich等，Cell 24:519 [1981]; Stuhlmann等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7151 [1984]; Jsthner等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927 [1985]; Van der Putten等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6148-6152 [1985]; Stewart等，EMBO J. 6:383-388 [1987])。
用反转录病毒感染胚胎的另一方法是将病毒或产生病毒的细胞注射到 小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等，Nature 298:623 [1982])。已经报道了使用
妊娠中期小鼠胚胎的子宫内反转录病毒感染将转基因引入小鼠的种系中 (Jahner等，同上[1982])。己经报道了用反转录病毒或反转录病毒载体感染牛 胚胎和羊胚胎来产生转基因动物。这些方案包括将反转录病毒颗粒或生长 停止的(即丝裂霉素C处理)细胞的显微注射，这将反转录病毒发散到受精 卵的卵周隙或早期胚胎中(PCT国际申请WO 90/08832 [1990];和Haskell 和Bowen， Mol. Reprod. Dev. 40:386 [1995]。 PCT国际申请WO卯/08832描 述了在2-8细胞期将野生型猫白血病病毒注射到绵羊胚胎卵周隙中。来源 于注射胚胎的胎儿显示多位点整合。
美国专利6，291，740 (2001年9月18日授权)描述了通过使用诱导分裂 细胞的反转录病毒载体(例如来自小鼠白血病病毒(MLV)的载体)将外源 DNA导入预成熟卵母细胞和成熟未受精卵母细胞生产转基因动物。该申请 也描述了用于巨细胞病毒启动子驱动以及小鼠乳腺肿瘤LTR表达各种重组 蛋白的方法和组合物。
美国专利6,281,408 (2001年8月28日授权)描述了利用胚胎干细胞产
生转基因动物的方法。简言之，胚胎干细胞用于与桑椹胚混合细胞共培养
46来产生转基因动物。通过例如电穿孔、显微注射或反转录病毒递送在共培 养前将外源遗传物质导入胚胎干细胞。通过选择标记例如新霉素来选择用
这种方式转染的ES细胞用于整合基因。
美国专利6，271，436 (2001年8月7日授权)描述了生产转基因动物的方 法，所述方法包括分离原生殖细胞；培养这些细胞产生原生殖细胞衍生 的细胞系；转化原生殖细胞和培养细胞系；以及使用这些转化细胞和细胞 系产生转基因动物。产生转基因动物的效率大大提从，从而允许使用同源 重组来产生转基因的非啮齿动物种。
舍有修饰的VEGF圣仓的式刻盒
在另一实施方式中，本发明提供了可用于例如治疗或非治疗应用的含 有VEGF类似物和/或VEGF类似物融合蛋白的试剂盒。所述试剂盒包含带 有标记的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可由多种材料 例如玻璃或塑料形成。容器容纳例如如上所述的组合物，所述组合物包含 对于治疗或非治疗应用有效的VEGF类似物或VEGF融合蛋白。容器上的 标记表明所述组合物用于特定的治疗或非治疗应用，并且也可以只是在体 内或者体外应用的方向，例如如上所述的那些。
本发明的试剂盒一般包含如上所述的容器和一种或多种包含从商场和 使用者的立场需要的材料(包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和附 带使用说明的包装说明书)的其他容器。本发明的试剂盒还可以包含由野生 型VEGF例如野生型VEGFws或165b组成的对照。
提供以下实施例来描述和说明本发明。同样，它们不应视为限制本发 明的范围。本领域技术人员应理解，很多其他的实施方式也落入本发明范 围内，正如在上文和权利要求书中所述。
实施例
实施例l:设计VEGF受体拮抗剂
本发明的VEGF-A拮抗剂设计为与野生型VEGF-A相比受体结合亲和 性提高而生物活性降低。一种方法是向VEGF-A的环加入正电荷。这种设 计超拮抗剂的方法包括综合本领域已知的不同方法，所述方法包括然而并 非限于同源模建、序列比较、电荷扫描诱变和连接单体以及在连接单体中引入突变。
己经表明Vammin或蛇毒VEGF以高亲和性结合KDR-IgG，并强烈刺 激体外脉管内皮细胞的增殖(参见Yamazaki等，2003， J. Biol. Chem. 278， 51985-51988，通过引用的方式将其全文并入本文中)。VEGF-A受体拮抗剂 是基于VEGF165与vammin的同源性而设计的。VEGF165在72和73位具有 谷氨酸残基，而vammin在这些位置分别含有甘氨酸和赖氨酸残基。通过 修饰VEGF-A以在72和73位含有两个碱性氨基酸残基，修饰的VEGF-A 与野生型VEGF-A相比显示出受体结合亲和性显著增加(图3A)。
实施例2:鉴定VEGF受体拮抗剂
产生VEGF类似物I83K、 E44R、 E72RE73R、 E67K和Q87K，并测定 它们与野生型VEGF相比结合KDR和降低细胞增殖的能力。 方法
用固定化的KDR-Fc温育酵母细胞表达的VEGF类似物，并测定所述 类似物结合KDR-Fc的能力。如下进行结合测定
1. 用150 ng/孔KDR-Fc(R & D System, Inc.)和100 |il pH9.6的50 mM 碳酸氢钠缓冲液(15 mM Na2C03 + 35 mM NaHC03)涂敷Nunc MaxiSorp 96微孔板。单独的板用于各试验的VEGF类似物和野生型VEGF。
2. 4。C温育所述板过夜。
3. 第二天，在洗涤缓冲液(PBS中0.05。/。tween)洗涤孔三次。
4. 在室温用含3。/oBSA3、 0.03% tween的PBS封闭孔。
5. 在封闭之后，在洗涤缓冲液(PBS中0.05。/。tween)洗涤孔三次。
6. 以不同浓度将VEGF-A (野生型或突变型)加入50jxl结合缓冲液(PBS 中1% BSA和0.03% tween)的孔中。
7. 以70,000 cpm/孔将1251-标记的VEGF-A (野生型或突变 体)(PerkinElmer)加入各孔中的50 pl结合缓冲液(PBS中1% BSA和0.03% tween)。
8. 混合孔的内容物并在室温缓慢震荡下温育2小时。
9. 在洗涤缓冲液(PBS中0.05。/otween)洗涤孔三次。
10. 向各孔加入120nl裂解缓冲液(0.2 MNaOH+0.5% SDS)。在室温有 力震荡板20分钟。11. 将来自各孔的裂解缓冲液转入单独的管。用裂解缓冲液洗涤孔两 次、另外两次，并在相应管中与裂解溶液缓冲液合并。
12. 通过用y计数器计数来确定野生型vegf-a和各种vegf-a突变 型结合的测量。
如下，测定在存在VEGF类似物的情况下HUVEC内皮细胞的增殖能
力
1. 使用含生长因子的Media-200以3,000细膨孔将HUVEC内皮细胞 (第6代)接种到96孔板中。
2. 温育过夜后，除去培养基并加入添加了 2。/。透析FBS (Invitrogen)的 Media 199 (Invitrogen)。
3. 温育细胞20小时。
4. 在孔板板中在添加了 2%透析FBS的Media 199中连续稀释野生型 VEGF-A和VEGF-A类似物，开始于200 ng/孔。
5. 从各孔除去培养基，并用20(Hil/孔稀释VEGF培养基进行置换。
6. 在37。温育细胞72小时。
7. 使用Promega的CellTiter - Glo⑧发光细胞活力测定来分析细胞增 殖。简言之，解冻CellTiter缓冲液，转移到CellTiter-Glo基质中，并混合 孔以制备基质混合物。从各孔将100^il生长培养基移到新的96孔板中，并 将孔混以lOOpl基质混合物。震荡板2分钟，并在室温另外温育10分钟。
8. 使用积分时间设置为250mS的板阅读器(Tecan)读取板的发光信号。
分析
I83K类似物对KDR-Fc的受体结合亲和性略低于野生型VEGF-A (图 1A)。然而，与野生型VEGF-A相比，183K类似物显示内皮细胞增殖显著 降低(图1B)。与野生型VEGF-A相比，VEGF-A类似物E44R、 EE72/73RR、 E67K和Q87K均显示受体细胞结合亲和性提高(图2A、 3A、 4、 5和6)。 然而，类似物E44R和EE72/73RR显示内皮细胞增殖变化很小或无变化(图 2B和3B)。这些结果表明包含I83K的VEGF165类似物可以有效地起到 VEGF-A受体拮抗剂的作用。此外，虽然VEGF-A类似物E44R和EE72〃3RR 不能单独降低内皮细胞增殖，当加入到I83K时，这些修饰有进一步提高受 体结合亲和性的潜能。
49在本申请中论述的所有出版物、专利和专利申请都通过引用的方式并 入本文中。虽然在上述说明书中，本发明已经关于某些优选实施方式进行 描述，并为了例证的目的列出了一些细节，但是本领域技术人员容易理解， 本发明也接受其它实施方式，并且在不背离本发明的基本原则的情况下， 本文中所述的某些细节也可显著改变。
权利要求
1. 一种修饰的血管内皮生长因子(VEGF)，其包含至少一种引起所述修饰的VEGF起到受体拮抗剂作用的突变，其中所述突变导致受体结合亲和性和生物活性解离。
2. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂，其中所述拮抗剂对天然VEGF 受体的受体结合亲和性大于野生型VEGF对所述天然VEGF受体的受体结 合亲和性。
3， 权利要求2的VEGF受体拮抗剂，其中所述天然VEGF受体是 Flt-1或KDR。
4. 权利要求2的VEGF受体拮抗剂 约3至4倍。
5. 权利要求2的VEGF受体拮抗剂 约2倍。
6. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂 野生型VEGF的生物活性相比降低。
7. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂 体或异二聚体。
8. 权利要求7的VEGF受体拮抗剂 的各亚单位含有至少一个突变。
9. 权利要求8的VEGF受体拮抗剂 的一个亚单位含有至少一个突变。
10. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂 个或多个VEGF亚单位的融合蛋白。
11.权利要求10的VEGF受体拮抗剂，其中一个或多个VEGF亚单 位各含有至少一个突变。
12. 权利要求10的VEGF受体拮抗剂，其中至少一个VEGF亚单位含有至少一个突变。
13. 权利要求10的VEGF受体拮抗剂，其另外包含接头肽。
14. 权利要求10的VEGF受体拮抗剂，其另外包含毒素。
15. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂，其中所述突变是在相应于SEQ，其中受体结合亲和性提高至少 ，其中受体结合亲和性提高至少 ，其中所述拮抗剂的生物活性与 ,其中所述拮抗剂表达为同二聚 ，其中所述同二聚体或异二聚体 ，其中所述同二聚体或异二聚体 ，其中所述拮抗剂表达为包含一IDNO.:4的83位的位置上的碱性氨基酸置换。
16. 权利要求15的VEGF受体拮抗剂，其中所述碱性氨基酸是I83K。
17. 权利要求15的VEGF受体拮抗剂，其中所述碱性氨基酸是I83R。
18. 权利要求15的VEGF，其中所述拮抗剂含有相应于SEQ ID NO.:4 的44、 67、 72、 73和87位的一个或多个另外的碱性氨基酸置换。
19. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述另外的置换选自 E72R和E73R。
20. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述另外的置换选自 E72K和E73K。
21. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述另外的置换是E44R 或E44K。
22. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述另外的置换是Q87K 或Q87L。
23. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述另外的置换是E67K。
24. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂，其中所述VEGF-A受体拮抗 剂和天然VEGF受体的相互作用导致血管发生的抑制。
25. 权利要求24的VEGF受体拮抗剂，其中所述天然VEGF受体是 KDR。
26. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述拮抗剂含有氨基酸 E72R+E73R+I83K。
27. 权利要求18的VEGF受体拮抗剂，其中所述拮抗剂含有氨基酸 E44R+E72R+E73R+I83K。
28. 权利要求15或18的VEGF拮抗剂，其中所述拮抗剂在相应于 SEQ IDNO.:4的111-165位的氨基酸中含有一个或多个另外的氨基酸置换，所述一个或多个另外的氨基酸置换干扰神经毡蛋白-1结合。
29. 权利要求28的VEGF拮抗剂，其中所述另外的氨基酸置换不干扰硫酸肝素结合。
30. 权利要求28的VEGF拮抗剂，其中所述拮抗剂在相应于SEQ ID NO.:4的C146或C160的位置含有氨基酸置换。
31. 权利要求30的VEGF拮抗剂，其中所述氨基酸置换是C146S或 C160S。
32. 权利要求28的VEGF拮抗剂，其中所述拮抗剂在相应于SEQ ID NO.:4的C146和C160的位置含有氨基酸置换。
33. 权利要求32的VEGF拮抗剂，其中所述氨基酸置换是C146S和 C160S。
34. 权利要求15或18的VEGF拮抗剂，其中所述拮抗剂含有一个或 多个另外的氨基酸置换，所述一个或多个另外的氨基酸置换降低或防止所 述拮抗剂的蛋白酶裂解。
35. 权利要求34的VEGF蛋白酶拮抗剂，其中所述蛋白酶是纤维蛋 白溶酶。
36. 权利要求34的VEGF拮抗剂，其中所述一个或多个另外的氨基 酸置换选自相应于SEQIDNO.:4的Alll和A148位的位置。
37. 权利要求36的VEGF拮抗剂，其中所述氨基酸置换是A111P或 A148P。
38. 权利要求36的VEGF拮抗剂，其中所述氨基酸置换是A111P和 A148P。
39. 权利要求14的VEGF拮抗剂，其中所述毒素选自假单胞菌属外 毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒素、相思豆毒蛋白毒素、炭疽毒素、志 贺毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、甲藻毒素、岩沙海葵毒 素、鱼肉毒素、棕网蛇毒素、箭蛙毒素、a食鱼螺毒素、泰攀蛇毒素、河 飩毒素、a蝎毒素、蛤蚌毒素、变性毒素、微囊藻素、乌头碱、脱叶霉素 A、脱叶毒素B、肠毒素、中毒性休克综合征毒素(TSST-1)、鼠疫耶尔森菌 (K /7eW&)毒素和气性坏疽毒素。
40. 权利要求8-12中任一项的VEGF拮抗剂，其中至少一个所述亚 单位是VEGF-A亚单位。
41. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是 VEGF^亚单位。
42. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是VEGF165b。
43. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是 VEGF121亚单位。
44. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是VEGF45。
45. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是 VEGF^亚单位。
46. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是 VEGF183。
47. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是VEGF!89亚单位。
48. 权利要求40的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-A亚单位是 VEGF206。
49. 权利要求8-12中任一项的VEGF拮抗剂，其中至少一个所述亚 单位是VEGF-B亚单位。
50. 权利要求49的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-B亚单位是 VEGF-B^亚单位。
51. 权利要求49的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF-B版。
52. 权利要求8-12中任一项的VEGF拮抗剂，其中至少一个所述亚 单位是VEGF-C亚单位。
53. 权利要求8-12中任一项的VEGF拮抗剂，其中至少一个所述亚 单位是VEGF-D亚单位。
54. 权利要求8-12的VEGF拮抗剂，其中至少一个所述亚单位是PIGF 亚单位。
55. 权利要求54的VEGF拮抗剂，其中所述P1GF亚单位是P1GF國1 。
56. 权利要求54的VEGF拮抗剂，其中所述P1GF亚单位是PlGF-2。
57. 权利要求1-56中任一项的VEGF拮抗剂，其中血管发生被部分 抑制。
58. 权利要求1-56中任一项的VEGF拮抗剂，其中血管发生大约几 乎完全被抑制。
59. —种药物组合物，其包含权利要求1-58中任一项的VEGF受体 拮抗剂。
60. 权利要求59的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
61. 权利要求60的组合物，其中所述组合物配制为用于气溶胶递送。
62. 权利要求61的组合物，其中所述组合物配制为鼻喷雾剂。
63. 权利要求60的组合物，其中所述组合物配制为用于口服施用。
64. 权利要求63的组合物，其中所述组合物配制为片剂、丸剂或胶囊。
65. 权利要求60的组合物，其中所述组合物配制为储存剂或栓剂。
66. 权利要求60的组合物，其另外包含一种或多种额外的药物，所 述药物选自抗VEGF药物、抗血管发生药物、抗癌药、不育药、自身免疫 药物、炎症药物、眼病药物和皮肤病药物。
67. —种用治疗有效量的权利要求1-58中任一项的VEGF受体拮抗 剂治疗诊断为患有癌症的患者的方法，该方法包括给所述患者施用所述拮 抗剂，从而降低或抑制所述癌症的扩散。
68. 权利要求67的方法，其中所述癌症是选自膀胱癌、乳腺癌、肝 癌、骨癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、乳 腺癌和皮肤癌的实体瘤癌症。
69. —种用治疗有效量的权利要求1-58中任一项的VEGF受体拮抗 剂治疗诊断为患有血管发生相关眼病的患者的方法，该方法包括给所述患 者施用所述拮抗剂，从而减轻或抑制所述眼病。
70. 权利要求69的方法，其中所述眼病选自早产儿视网膜病、糖尿 病性视网膜病、视网膜静脉阻塞、黄斑变性和与角膜损伤或移植相关的新 血管发生。
71. —种用治疗有效量的权利要求1-58中任一项的VEGF受体拮抗 剂治疗诊断为患有血管发生相关疾病或病症的患者的方法，该方法包括给 所述患者施用所述拮抗剂，从而减轻或抑制所述血管发生相关疾病。
72. 权利要求71的方法，其中所述疾病或病症选自血管瘤、类风湿 性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特发性肺纤 维化、血管再狭窄、动静脉畸形、脑膜瘤、新生血管性青光眼、牛皮癣、 卡波西氏综合征、血管纤维瘤、血友病性关节、肥厚性瘢痕、Osier-Weber 综合征、脓性肉芽肿、晶体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、希林二氏病、 血管粘附病变、滑膜炎、皮炎、原因不明的女性不育症、子宫内膜异位、 原因不明的男性不育症、翼状胬肉、伤口、疮、皮肤溃疡、胃溃疡和十二 指肠溃疡。
73. 权利要求1的VEGF受体拮抗剂，其中所述VEGF的两个亚单位之一或两者包含延长半衰期的修饰。
74. 权利要求73的VEGF受体拮抗剂，其中所述延长半衰期的修饰 是N端或C端延伸。
75. 权利要求73的VEGF受体拮抗剂，其中所述延长半衰期的修饰 是聚乙二醇化。
76. 权利要求10的VEGF受体拮抗剂，其中所述融合蛋白含有两个 融合在一起的VEGF亚单位或VEGF相关蛋白亚单位。
77. 权利要求76的VEGF受体拮抗剂，其中所述两个VEGF亚单位 或VEGF相关蛋白亚单位选自融合于VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位的VEGF-A亚单位；融合于 VEGF-A、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位 的VEGF-B亚单位；融合于VEGF-A、VEGF-B、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位的VEGF-C亚单位；融合于VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-E、 VEGF-F、 PDGF或P1GF亚单位的VEGF-D亚单位； 和融合于VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F或 PDGF亚单位的P1GF亚单位。
78. —种VEGF165b受体拮抗剂，其包含选自SEQ ID NO.:13的E44B、 E67B、 E72B、 E73B、 I83B和Q87B的一个或多个突变，其中B是碱性氨 基酸。
79. 权利要求78的VEGF165b受体拮抗剂，其中所述拮抗剂与野生型 VEGF165或野生型VEGF165b相比展现出提高的受体结合亲和性。
80. —种VEGF受体拮抗剂，其包含一个或多个干扰神经毡蛋白-1 结合的突变，并包含选自SEQ ID NO.:4的E44、 E67、 E72、 E73、 183和 Q87的一个或多个碱性氨基酸置换。
81. 权利要求80的VEGF受体拮抗剂，其中所述一个或多个干扰神 经毡蛋白-1结合的突变选自C146S和C160S。
全文摘要
本发明披露了抑制VEGF介导的内皮细胞的活化或增殖的修饰的VEGF蛋白。所述类似物可用于抑制例如癌症、炎性疾病、眼病和皮肤病的血管发生相关疾病中VEGF介导的内皮细胞的活化。
文档编号A61K38/16GK101501065SQ200680045967
公开日2009年8月5日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月6日
发明者B·D·温特劳布, M·W·斯兹库德林斯基 申请人:特罗弗根公司