专利名称：一氧化氮供体型糖皮质激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化合物领域，具体涉及NO供体型糖皮质激素，本发明还公开了该衍生物的制备方法及其作为抗炎药物的用途。
背景技术：
糖皮质激素因为其强大的药理作用而被临床广泛地使用，但长期使用容易诱发高血压、柯兴氏综合症、骨质疏松、糖尿病等许多不良反应，为此近年来国际医药界一直在努力追求开发新的副作用更小，效果更好的糖皮质激素。
一氧化氮(NO)在体内参与众多生理功能的调节，与心血管系统、神经系统、免疫系统、骨代谢系统等有着密切的关系，是研究较为深入的一种小分子化合物。NO供体型药物近年来无论是在基础研究方面还是应用研究方面都有了较显著的发展。NO与某些药物相连，可以增强药效和/或降低毒副作用。法国NICOX公司申请的中国专利ZL 97180284.X公开了一类一氧化氮供体型糖皮质激素，通过一个二价连接的桥将甾体母核和—NO2连接起来，而公开的桥为亚烷氧基或亚环烷氧基，或者是如下几个通式表示的桥，包括
和
以及
和
然而上述化合物，由于采用了不稳定的—NO2作为NO供体，所得的NO供体型糖皮质激素稳定性不佳，不但储存时需要完全避光的环境，而且在常温下分解较快，储存时间较短。不利于推广应用。
中国专利ZL 97180284.X公开了一种用呋咱氮氧化物作为一氧化氮供体的氢化可的松衍生物。虽然稳定性比—NO2供体的糖皮质激素好，但是由于氢化可的松是一种低效、低副作用的糖皮质激素所以制得的NO供体型糖皮质激素抗炎效果一般，降低糖皮质激素副作用的效果也不明显。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种如下通式(II)的化合物 A—L—X 其中A与L相连的位置是通过A上取代基的羟基与L相连，优选可以通过A中的R”上的羟基，也可以通过17位上的羟基相连 其中A为甾体激素残基，具有如下结构，在1-2位是双键
其中，取代通式中所述的CH基中的H或CH2中的二个氢H2的取代基可如下 在2位，可以是F，Cl，Br 在3位，可以是，CO(酮基)，—O—CH2—CH2—Cl，OH 在4-5位，可以是双键； 在5-6位，可以是双键； 在6位，可以是Cl，F，CH3，—CHO； 在7位，可以是Cl，Br 在9位可以是Cl，F 在11位，可以是OH，CO，Cl； 在16位可以是CH3，OH，＝CH2 在17位，可以是OH，CH3，OCO(O)x(CH2)yCH3，或
即糠酰基 其中x为0或1的整数，y是0至4的整数， 在16-17位置，可以是下述基团；
其中，R2和R3可以相同或不同，并可以为氢或1至8个碳的饱和或不饱和烃基，可以为直链、支链，或环，优选R2为H，R3为正丙基、环己基. R和R’可以相同或不同，并且可以为氢或具有1至4个碳原子的直链或直链烷基。优选R和R’均为—CH3。
A为皮质甾类基团残基，桥基团L可以与R”或17位上的羟基以酯键的形式相连 所述的R”是CO(CR4R5)O—T1，或CO(CR4R5)—T2T1是H，CO(O)x1(CH2)y1CH3或T2是H或Cl，其中x1为0或1的整数，y1是0至4的整数 当R”是所述的残基所在时，为CO(CR4R5)O—，通过其中的羰基与17位相连，氧与桥基团L相连。
所述的残基还可以在17位，为—O—，与桥基团L相连。
二价桥基团L选自—(CO)Ob1(CR’4R’5)na(CO)(R7)— 其中，na为0至4的整数，b1为0至1的整数，R4、R’4或R’5、R5相等或彼此不同并选自H，具有1至8个碳原子的饱和或不饱和烃基，可以为直链、支链或环，优选na＝2，b1为0，R4＝R5＝R’4＝R’5＝H。通过L中的羰基与甾类基团残基A相连，通过R7与NO供体相连 R7 选自下列基团中的一种 —O(R8)O—，R8为C1～C4的亚烷基 —O(CH2)2O(CH2)2O—，—NHCH2CH2O—，或者 —OCH2C(Ph)O—，—O(CH2)2C(Ph)O—，Ph代表苯基。
—X是释放一氧化氮的功能基团，选自
R6为C1～C8的饱和或不饱和的烃基，优选苯基。
根据上述定义 本发明的所述的化合物的皮质激素残基A所代表皮质激素残基中的H，H2，R，R’，R”的可以选自但不仅限于以下化合物的相应基团布地奈德、环索奈德、阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松、倍他米松、氯泼尼松、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯波尼醇、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯奈德、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、丁基氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙醋酸酯、氟泼尼定醋酸酯、氟泼尼松龙、氟氢缩松、哈西奈德、卤倍他索丙酸酯、卤米松、卤泼尼松醋酸酯、氢可他酯、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲波尼松龙、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、波尼松龙25—二乙基氨基醋酸酯、、泼尼松、强的松龙戊酸酯、波尼立定、利美索龙、曲安西龙、曲安奈德、21—乙酰氧基孕烯诺龙、可的伐唑、安西奈德、氟替卡松丙酸酯、马泼尼酮、替可的松、曲安西龙六缩丙酮、 本发明所得的任一化合物其生理学上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗人或哺乳动物，特别是人类的炎性、变应性或过敏性疾病的药物中应用。其中炎性、变应性或过敏性疾病是指皮肤疾病如湿疹、牛皮癣、过敏性皮炎、神经性皮炎、疹痒和超敏性反应；鼻子、咽喉或肺部的炎性疾病如哮喘(包括过敏引起的哮喘反应)、鼻炎(包括枯草热)、鼻息肉、慢性阻塞性肺病、间质性肺部疾病和纤维变性；眼部炎症包括结膜和结膜炎；炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎；或自体免疫性疾病如风湿性关节炎。
上述任一项的化合物在制备类皮质激素药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备抗炎剂药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备免疫抑制类药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备血管生成抑制剂药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗呼吸道炎症或变应性疾病药物的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗皮肤病学疾病的药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗眼科疾病的药物中的的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗肠部炎症疾病的药物中的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗心脑血管疾病中的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗心肌、血管局部缺血疾病中的应用。
上述任一项的化合物在制备治疗肿瘤疾病中的应用。
一种药用组合物，该组合物包含上述本发明所述的任一化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物，及其与一种或多种生理学上可接受的药物辅料混合。该组合物还包含另一种治疗炎性、变应性或过敏性疾病的药物。另一种炎性、变应性或过敏性疾病的药物可以为β2肾上腺素受体激动剂。该组合物还可以包含抑制或杀死微生物的药物，抑制或杀死微生物的药物是指抗菌素。
上述的药用组合物，可以配制成液体制剂、灭菌制剂与无菌制剂、固体制剂、半固体制剂、气雾剂、喷雾剂与粉雾剂。上述制剂类型的定义由药剂学(第五版，崔福德主编，人民卫生出版社出版)中的相关剂型定义。
一种药用粉雾剂制剂，该制剂含有上述任一项定义的式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物，以及作为载体的乳糖或氨基酸。
本发明的化合物可以由下列方法制备得到将作为皮质激素残基A所代表的皮质激素即A—H(1)，H与A相应的O相连，与相应酰化剂二酸酐(2)反应得到中间体(3)，(3)再和NO供体(8)经酯化反应生成目标产物相应的一氧化氮供体型糖皮质激素(9)。
NO供体(8)是以R6—SH(4)为起始原料，与氯乙酸缩合、经过过氧化氢氧化、再与硝酸作用、再和H—R7—H反应得到。
具体工艺流程如下
由(1)到(2)的反应可以选用的溶媒A选自吡啶、DMF、DMSO、四氢呋喃、C1～C4的，酮类、醚类中的一种或几种。优选吡啶。
由(4)到(5)的缩和反应可以选用的溶媒选自水、吡啶、DMF、DMSO、四氢呋喃、C1～C4的酮类、氯代烃类、醚类中的一种或几种，优选C1～C4的，反应时加入适量的碱的水溶液，所述的碱为NaOH，KOH，碳酸钠、碳酸钾、优选NaOH和碳酸钾。加入的碱与化合物(2)的摩尔比为1.5～31。反应温度为0～50℃。
由(5)到(7)的反应中，将化合物(5)溶于2～10倍(重量体积比)溶媒中，所述的溶媒选自四氢呋喃、C1～C4酮类、酯类、氯代烃类、醚、羧酸类中的一种或几种。加入1.5～5倍(摩尔比)的H2O2，搅拌反应1～10h，不经分离，向反应物中加入5～15倍(摩尔比)的发烟硝酸，升温至50～110℃反应1～6h，冷却过滤得到化合物(7)。
化合物(8)的制备将摩尔比2～61的H—R7—H和化合物(7)溶于适量溶媒中，所用溶媒选自水、吡啶、DMF、DMSO、四氢呋喃、C1～C4的醇类，酮类、酯类、氯代烃类、醚类中的一种或几种，优选THF、吡啶、DMF、DMSO、C1～C4的氯代烃中的一种或几种。加入10～50％的碱溶液，所述的碱选自NaOH、KOH、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种、优选碳酸钠，所用的碱溶液的与化合物(7)的摩尔比(以所用的碱计)为0.5～21，反应1～6小时后用水稀释、溶媒萃取。干燥后用柱层析[(乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(V/V)]分离。
化合物(9)的制备，摩尔比为(0.5～1.5)(0.5～1.5)1的DCC、化合物(3)和(8)溶于适量溶媒中，加入DMAP适量(与化合物(8)摩尔比为0.01～0.1)所用溶媒选自吡啶、DMF、DMSO、四氢呋喃、C1～C4的酮类、酯类、氯代烃类、醚类中的一种或几种，优选氯代烃，在0～40℃下反应2～10小时，过滤，滤液浓缩柱层析[(乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝12(V/V)]即得目标产物化合物(9) 本发明所制得的化合物及其生理学上可接受的盐或溶剂合物与至少一种药学上可接受的辅料制成各种适用于口服、局部(如滴鼻、滴眼、吸入、腔道)及各种注射液形式的药物。可以制成片剂、胶囊剂、乳膏剂、软膏剂、搽剂、膜剂、栓剂、吸入剂、注射液、脂质体注射液，液体制剂、灭菌制剂与无菌制剂，、固体制剂、半固体制剂、气雾剂、喷雾剂与粉雾剂等药剂。粉雾剂的载体为优选为乳糖或氨基酸。
上述任一所述式(II)的化合物在治疗哺乳动物的疾病中的剂量以皮质激素残基A所代表的皮质激素A—H计为0.001mg-1mg/kg/天。
上述任一所述式(II)化合物，在治疗哺乳动物的疾病中的剂量以A—H的计为0.005mg-0.5mg/kg/天。
上述任一所述式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗炎性、变应性或过敏性疾病中的剂量以皮质激素残基A所代表的皮质激素A—H的计为0.001mg-1mg/kg/天 上述任一所述的式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗炎性、变应性或过敏性疾病中的剂量以皮质激素残基A所代表的皮质激素A—H的计为0.005mg-0.5mg/kg/天。
本发明所制得目标化合物，实质上是一种NO供体型糖皮质激素，即用化学合成的方法将糖皮质激素活性残基与NO供体键合起来得到，在本发明中，采用了呋咱类化合物作为NO供体，与现有技术中如法国NICOX公司申请的中国专利ZL 97180284.X中公开的采用硝酸酯作为NO供体的技术方案相比，本发明采用的NO供体所制得的目标化合物更为稳定，能够在常温下长期储存而不变质分解变质。而本发明由于采用了1，2位是双键的甾体激素残基，与中国专利CN20071009805.5公开的采用氢化可的松为甾体激素残基的NO供体型糖皮质激素相比，抗炎作用有了显著的提高的同时，更能够显著的降低糖皮质激素的副作用，我们惊奇的发现，在采用1，2位是双键的糖皮质激素时，呋咱衍生物类NO供体的连接不但克服了糖皮质激素的副作用，而且产生了显著的协同作用，达到了意想不到的技术效果。综上所述，本发明中所选用的1，2位是双键的甾体激素母核，在和采用呋咱类的NO供体制成NO供体型糖皮质激素时，与现有技术中的硝酸酯为供体的NO供体型糖皮质激素和以1，2位是饱和键的以氢化可的松为甾体激素母核的以呋咱衍生物为供体的NO供体型糖皮质激素相比，本发明所述的化合物既有NO供体型糖皮质激素对慢性炎症的更好的抗炎效果，令人意外的是，呋咱衍生物与1，2位是双键的甾体母核的结合还产生了令人意想不到的对慢性炎症的抗炎效果。根据外国文献Wallace JL(Nitric oxide as a regulator of inflammatory processes[J].MemInst Oswaldo Cruz.2005，100(S1)5—9.)报道NO供体型糖皮质激素对慢性炎症模型的治疗机理，其抗炎机制可能是由于在治疗慢性炎症时长时间的释放释放低水平的NO，血管平滑肌舒张使内皮层拉伸，变得更加紧密，阻碍了水和其他小分子的通透，从而抑制炎症物质的渗出，对抗炎症的作用。其具体的作用机制还有待于进一步研究，而在将本发明采用所选用的甾体激素母核和NO供体结合时，由于某种机制，使糖皮质激素和呋咱衍生物的NO供体产生了协同作用，出现意想不到的抗炎效果。产生这种效果的原因可能是由于在对比实施例4中的NO体外释放曲线所表现出来本发明所得的化合物在释放低剂量的NO时，释放的速度更快，维持一定释放水平的持续时间更长引起的。
图1是NO体外释放曲线图
具体实施例方式 层析方法 层析柱的长度最少70cm，内部装填254-硅胶，并将需要分离的有机物全溶于最少量的氯仿甲醇＝11中，用最少量254-硅胶将该溶液吸收后置于层析柱内硅胶的上部，使用流动相，洗脱流动相采用[乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(V/V)]，层析柱下用若干个10ml试管接经过柱层析得到的溶液，控制流速为10ml/3min，将每个试管的溶液用HPLC进行分析，将保留时间相同的试管溶液合并，取主点的化合物进行重结晶，得到相应的产物。
确定主点的方法将需要分离的有机物用HPLC进行分析，除原料外峰面积最大的点确定为主点，其保留时间为主点的保留时间。
HPLC的条件按照化合物1相应的AH的分析方法测定，如果没有相应的测定方法也可以按照以下方法测定。
设备HP 1084B液相色谱仪，HP 79850BLC终端和UV检测器 柱材料Supelcosil Lc-18，5um，150×4.6mm 检测波长245nm 流动相乙腈水四氢呋喃＝36643 柱温25℃ 流速约0.8ml/分 合成实施例中对化合物的编号沿用前述流程图对通式的编号结合实施例号编成，如流程图中通式(3)化合物，具体到实施例1中相应化合物为(3.1)，实施例2中相应化合物为(3.2) DCC是二环己基碳二酰亚胺 DMAP是4—N，N二甲基氨基吡啶，实施例中数粒指2～5粒，每粒20～50mg NO供体的合成 苯巯基乙酸(5.1)的合成 将苯硫酚(4.1)24.2g(0.22mol)，氢氧化钠8.8g(0.22mol)溶于150ml乙醇中，加入由氯乙酸22.78g(0.24mol)和碳酸钠12.7g(0.12mol)配成得200ml水溶液，室温搅拌3h，回流1h。冷却至室温后加入6mol/L盐酸调pH等于2，减压蒸去乙醇，有白色沉淀生成，过滤，得白色棒状晶体33.3g，收率90％，m.p.62—63℃。
3)3，4—二苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物(7.1)的合成 将(5.1)20.16g(0.12mol)溶于90ml冰醋酸中，滴加24.3ml 30％H2O2，室温搅拌3h，得(6.1)。产物不经分离。直接向反应液中缓慢滴加发烟硝酸48ml，内温不超过40℃，1h内滴完。升温至100℃反应，有大量红棕色气体产生，溶液从无色逐渐变为黄色，红棕色。4h后反应液冷却至室温，有白色针状晶体析出，过滤，干燥得16.8g，收率76％，m.p.153—155℃ 4.1)2-[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙醇(8.1)的合成 将二甘醇1.06g(10mmol)和(7.1)1g(2.7mmol)溶于10mlTHF中，滴入25％氢氧化钠水溶液(0.5ml，3mol)，2小时后，反应液从淡黄色变为橙黄色。将反应液倾入20ml水中，用乙酸乙酪(3×20ml)萃取，有机层合并后加饱和食盐水洗一次，用无水硫酸钠干燥。过滤后将滤液浓缩。柱层析[乙酸乙酯石油醚(60—90℃)＝12(VV)]得油状物0.32g，收率30％。ESLMS[M十H1’＝331。
4.2)2-[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙胺基]乙醇(8.2)的合成 将乙醇胺0.6g(10mmol)和(7.1)1g(2.7mmol)溶于10mlTHF中，滴入25％氢氧化钠水溶液(0.5ml，3mmol)，2小时后，反应液从淡黄色变为橙黄色。将反应液倾入20ml水中，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取，有机层合并后加饱和食盐水洗一次，用无水硫酸钠干燥。过滤后将滤液浓缩。柱层析[乙酸乙酯石油醚(60—90℃)＝12(VV)]得淡黄色油状物0.26g，收率35％。ESLMS[M十H]’＝331。
实施例1 呋咱甲泼尼龙的合成 1)4-(甲泼尼龙-21-氧-)-4-氧代-丁酸(3.1)的合成 将5.62g(15mmol)甲泼尼龙溶于80ml吡啶中，加入3g(30mmol)丁二酸酐，加热回流10小时后停止反应，冷却后倒入200ml饱和冰盐水中，用盐酸调pH＝5，静止析出白色固体，过滤、水洗，得到产物6.01g，收率84.4％。
2)4-(甲泼尼龙-21-氧-)-4-氧代—丁酸—2—[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯(9.1)的合成 将化合物(3.1)0.6g(1mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，加入(8.1)1mmol，DCC0.206g(1mmol)，DMAP数粒，室温下反应20h，至反应液中有白色絮状产物生成，过滤，浓缩柱层析乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(VV)]，得到固体0.45g即(9.2)收率50％。结构式如下
元素分析计算值(％)C，58.00；H，5.89；N，3.56；O，28.47；S，4.08元素分析实测值(％)C38H46N2O14S C，58.17；H，5.93；N，3.63；O，28.18；S，4.09 13C-NMR(CDCl2)1位至38位碳的数值 实施例2 呋咱地塞米松 1)2-(地塞米松-21-氧-)-2-氧代-乙酸(3.2)的合成 将5.89g(15mmol)地塞米松溶于80ml吡啶中，加入2.58g(30mmol)乙二酸酐，加热回来8小时后停止反应，冷却后倒入200ml饱和冰盐水中，用盐酸调pH＝5静止析出白色固体，过滤水洗得到产物4.69g，收率65.3％IR 2)2-(地塞米松-21-氧-)-2-氧代—乙酸—2—[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯(9.2)的合成 将化合物(3.2)0.5g(1mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，加入(8.1)1mmol，DCC 0.206g(1mmol)，DMAP数粒，室温下反应20h，至反应液中有白色絮状产物生成，过滤，浓缩柱层析乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(VV)]，得到固体0.35g即(9.2)收率50％。结构式如下
元素分析计算值(％)C，55.66；H，5.32；F，2.45；N，3.61；O，28.84；S，4.13 元素分析实测值(％)C36H41FN2O14S C，55.51；H，5.26；F，2.57；N，3.58；O，28.63；S，4.45 13C-NMR(CDCl2)1位至36位碳的数值 实施例3 呋咱环索奈德 1)4—(去异丁酰环索奈德-21-氧)-4-氧代-丁酸(3.3)的合成 将7.62g(15mmol)去异丁酰-环索奈德溶于80ml吡啶中，加入3g(30mmol)丁二酸酐，加热回流10小时后停止反应，冷却后倒入200ml饱和冰盐水中，用盐酸调pH＝5，静止析出白色固体，过滤、水洗，得到产物5.5g，收率55％。
2)4—(去异丁酰环索奈德-21-氧)-4-氧代-丁酸[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯(9.3)的合成 将0.7g(1mmol)化合物(3.3)溶于无水二氯甲烷中加入(8.1)1mmol，DCC 0.206g(1mmol)，DMAP数粒，室温下反应20h，至反应液中有白色絮状产物生成，过滤，浓缩柱层析乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(VV)]，得到固体0.40g即(9.3)收率35％。结构式如下
元素分析计算值(％)C，59.85；H，6.16；N，3.17；O，27.18；S，3.63 元素分析实测值(％)C44H54N2O15S C，59.63；H，6.04；N，3.21；O，27.41；S，3.71 13C-NMR(CDCl2)1位至44位碳的数值 实施例4 呋咱曲安西龙 1)6—(曲安西龙-21-氧)-6-氧代-己酸(3.4)的合成 将曲安西龙5.9g(15mmol)溶于80ml吡啶中，加入3.84g(30mmol)己二酸酐，加热回流10小时后停止反应，冷却后倒入200ml饱和冰盐水中，用盐酸调pH＝5，静止析出白色固体，过滤、水洗，得到产物5.1g，收率53％。
2)将6—(曲安西龙-21-氧)-6-氧代-己酸-[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙胺基]—乙酯(9.3)的合成 将化合物(3.4)0.1mmol溶于无水二氯甲烷中加入(8.2)1mmol，DCC 0.206g(1mmol)，DMAP数粒，室温下反应20h，至反应液中有白色絮状产物生成，过滤，浓缩柱层析乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(VV)]，得到固体0.3g即(9.4)收率30％。结构式如下
元素分析计算值(％)C，56.17；H，5.80；F，2.28；N，5.04；O，26.86；S，3.85 元素分析实测值(％)C39H48FN3O14S C，56.28；H，5.88；F，2.31；N，4.97；O，26.71；S，3.85 13C-NMR(CDCl2)1位至39位碳的数值 实施例5 外用制剂 以下实施例用于详细解释说明本发明配伍组方，但不受限于下述实施例，以下实施例制剂的制备按相应制剂的常规制备方法制成。
活性成分实施例1制得4-(甲泼尼龙-21-氧-)-4-氧代—丁酸—2—[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯，按甲泼尼龙计1g 药用辅料 环糊精 20g 羧甲基纤维素50g 丙二醇 200g 尼泊金乙酯 5g 蒸馏水 加至1000ml 制备工艺 将活性成分与环糊精分别过100目筛，按照处方量称取，混匀，加入适量无菌蒸馏水充分研磨；将羧甲基纤维素与丙二醇混匀，然后加入适量热蒸馏水，放置待溶胀成凝胶后，再加入含有研磨后的活性成分和环糊精与尿素和尼泊金乙酯的水溶液，加水至足量即可。
其活性成分中还可以增加抗菌素如红霉素、氟康唑等药物 实施例6 吸入制剂 活性成分4—(去异丁酰环索奈德-21-氧)-4-氧代-丁酸[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯，以环索奈德计为2g 辅料 乳糖 1000g 制备工艺 将活性成分和乳糖分别粉碎成99％粒径为2-5μm的固体，混匀后，装填如胶囊即可。
其活性成份还可以增加β2肾上腺素受体激动剂如马来酸福美特罗、沙美特罗。
实施例7 口服制剂-分散片 活性成分2-(地塞米松-21-氧-)-2-氧代—乙酸—2—[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯，按地塞米松计5g 药用辅料 羟丙基γ-环糊精 10g 预胶化淀粉 300g 制备工艺主药过100目筛，羟丙基γ-环糊精和预胶化淀粉过80目筛，称取处方量的主药，与羟丙基γ-环糊精充分混匀后研磨，再与预胶化淀粉混合均匀，直接压片即得。每片活性成分以地塞米松计为5mg 实施例8 口服制剂—胶囊 活性成分6—(曲安西龙-21-氧)-6-氧代-己酸-[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙胺基]—乙酯，以曲安西龙计为10g 二甲基β-环糊精40g 羟乙酸纤维素 300g 瓜耳胶50g 10％淀粉浆适量 制备工艺 先将所有的固体辅料过100目筛，按处方量称取，将活性成分和二甲基β-环糊精混匀，加入适量蒸馏水充分研磨后，加入羟乙酸纤维素、瓜耳胶和10％淀粉浆适量制粒，60℃以下烘干，18目筛整粒，胶套充填即可，每粒胶囊含活性成分以甲基泼尼松龙计算为10mg。
实施例9. 17-呋咱莫米松的合成 1)4—(莫米松-17-氧)-4-氧代-丁酸(3.9)的合成 将莫米松6.1g(15mmol)溶于80ml吡啶中，加入3g(30mmol)丁二酸酐，加热回流10小时后停止反应，冷却后倒入200ml饱和冰盐水中，用盐酸调pH＝5，静止析出白色固体，过滤、水洗，得到产物5.1g，收率53％。
2)4-(莫米松-17-氧-)-4-氧代—丁酸—2—[2-(3-苯磺酰基—1，2，5—恶二唑—2—氧化物—4—氧—)乙氧基]乙酯(9.1)的合成 将化合物(3.9)0.6g(1mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，加入(8.1)1mmol，DCC 0.206g(1mmol)，DMAP数粒，室温下反应20h，至反应液中有白色絮状产物生成，过滤，浓缩柱层析乙酸乙酯石油醚(60～90℃)＝12(VV)]，得到固体0.45g即(9.9)收率50％。结构式如下
元素分析计算值(％)C，54.35；H，5.28；Cl，8.44；N，3.34；O，24.77；S，3.82 元素分析实测值(％)C38H44Cl2N2O13S C，54.22；H，5.21；Cl，8.51；N，3.36；O，24.86；S，3.84 13C-NMR(CDCl2)1位至39位碳的数值 试验实施例1 稳定性对比试验 参考中国药典2005原料药和药物制剂稳定性试验指导原则，分别在常温、高温条件下进行稳定性试验 对照品1～3 采用中国专利CN 97180284.X公开的以甲泼尼龙、地塞米松、曲安西龙为甾体激素母核的NO供体型糖皮质激素，分别为 甲基泼尼松龙21-(3-硝基氧)丙酸酯、 地塞米松-21-(3-硝基氧)丙酸酯 曲安西龙-21-(3-硝基氧)丙酸酯 并按照实施例8的方法制成胶囊为对照品1、2、3，活性成分以相应的甾体激素母核计均为10mg/粒。
实验品1～3 分别采用实施例1、2、4所制得的活性成分(9.1)、(9.2)、(9.4)按照实施例8的方法制成胶囊为实验品1、2、3，活性成分含量以相应的甾体激素母核计也均为10mg/粒 取实验品1～3与对照品1～3胶囊各60粒，在不同的条件下，即常温(25℃±2℃/60％RH±10％)下放置0天，1个月，3个月，分别在高温(60℃±2℃)下放置5天，10天，每次分别取实验品1、2、3，对照品1，2，3的胶囊各10粒，进行含量分析。其中不同的条件，参考中国药典2005原料药和药物制剂稳定性试验指导原则，RH代表相对湿度，±后面的数代表可以浮动的数值范围。
表1 稳定性数据对比
稳定性对照试验表明，与对照品相比，各个储存条件下实验品组的含量均具显著性差异(P<0.05)，而且实验组与对照组相比，随着储存时间的增长，活性成分含量的差距越来越大，更说明采用本发明所得化合物为活性成分的实验品制得的胶囊的稳定性要优于现有技术。
试验实施例2 药理实验 1.皮质激素药理活性 药理活性可以采用糖皮质激素激动剂活性的功能体外试验进行评价。
依据K.P.Ray等(Biochem J.(1997)，328，707—715)描述的功能试验，给出一种糖皮质激素激动剂的反式抑制活性测试方法。在37℃下，用适当剂量的受试化合物处理稳定转染有报告基因的A549细胞1小时，该报告基因含来自ELAM启动子连接sPAP(分泌性磷酸脂酶)基因的响应NF-КB元件。然后用肿瘤坏死因子(TNF，10ng/ml)刺激该细胞16小时，并用标准的比色法测试此时产生的碱性磷酸酶含量。构建剂量响应曲线，并可通过曲线估算EC50值。
依据R.J.H.Austin等(Eur Resp J.(2002)，20，1386-1392)描述的功能试验，测试化合物立接反式激活基因表达的能力。在37℃下，用适当剂量的受试化合物处理稳定转染有报告基因的A549细胞6个小时，该报告基因含小鼠乳腺瘤病毒长末端重复系列(MMTV-LTR)的糖皮质激素响应区连接renilla荧光素酶基因。通过将细胞酶与适合的底物一起孵育后，通过测量所发出的光来测定荧光素酶活性。构建剂量响应曲线，并通过曲线估算EC50值，其中最大响应值是相对于地塞米松值(100％)来计算的。
实施例1的化合物在该试验中的最大响应值小于70％。
实施例2的化合物在该试验中的最大响应值小于50％。
实施例3的化合物在该试验中的最大响应值小于30％ 实施例4的化合物在该试验中的最大响应值小于50％ 孕酮受体活性的筛选 已经有报道称人乳癌细胞系T47D对孕酮有上调内源性碱性磷酸酯酶的反应(Di Lorenzo等人，Cancer Research(1991)51，4470—4475)。将T47D细胞以每孔1 X 105个细胞的密度接种到96孔板中并使其在37℃下生长一夜。将甾族化合物溶解于DMSO中，将其加入到细胞中(最终DMSO浓度为0.7％)，然后将其在37℃下培养24小时。然后将该细胞用PBS洗涤并用RIPA缓冲剂(在磷酸盐缓冲液中包含1％IGEPAL，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)进行溶解。用溶解于1M二乙醇胺、0.28M NaCl、0.5mMMgCl2中的作为底物的对-硝基苯磷酸酯(1.5mg/ml)用分光光度法(405nm)来对碱性磷酸酯酶的活性进行测定。剂量响应曲线是由所评估的EC50值得出的。
实施例2 的化合物在该试验中的EC50值大于100nM。
通过以上实验证明，实施例1到4的化合物具有明显的药理活性。
试验实施例3 实施例制得的化合物与对照品相比，对骨质、血压的影响 1.材料和方法 1.1 材料4月龄雌性SD大鼠70只，重量200±10g。随机分为7组，每组10只，对照组10只和服药组60组。采用试验实施例1中的实验组与对照品组分组(给药采用实施例6制成的胶囊内容物)，所用剂量为以原甾体激素计。
1.2 饲养各组任其自由活动，统一条件喂养。
2、给药与对比 2.1、给药情况如下表对照组给与安慰剂(按照实施例8的方法得到的不含活性成分的胶囊的内容物)，服药组分别给与的情况如下。
安慰剂按照实施例8的方法得到的不含活性成分的胶囊内容物。
2.2、观察指标90天后进行血压测定，在进行骨检验 (1)全身BMD(骨密度)XR-36型双能x线骨密度仪扫描测量各组大鼠BMD(美国Norland公司)； (2)大鼠股骨干重、灰重及灰分钙含量测定采用陶永辉等(陶永辉，谭成，蔡刚明.去势雌性大鼠骨质疏松症的药物干预疗效的评价.中国骨质疏松杂志，2002，847-50)的方法。
(3)血压测量切开颈部皮肤，分离出左颈总动脉后，进行插管固定，连接八导生理记录仪，稳定10min后，记录血压，测出收缩压、舒张压。
2.3 统计学处理数据用x±s表示，在SPSS10.0软件下处理，所有数据方差分析两两比较t检验。
2.4 结论 1 各组收缩压、舒张压的变化 通过上述实验证明，相应组别的实验品组与对照品组的血压对比具有显著性(P<0.01)，而各个组别的实验品组与采用安慰剂的对照品组的血压相比，均无显著性。说明与能够引起高血压的传统糖皮质激素相比，采用本发明制备的NO供体型糖皮质激素能够明显抑制现有引起高血压的副作用，甚至将其抑制到与安慰剂相同 2 各组骨的生理数据的变化 1-3组与其它组BMD的分析结果 通过上述实验证明，作为NO供体型糖皮质激素的1-3组的化合物与安慰组对BMD的影响无显著性差异，而与相应的糖皮质激素相比具有显著性差异，由此说明本发明制得的NO供体型糖皮质激素能够显著的克服传统糖皮质激素致BMD降低的副作用。
1-3组与其它组股骨干重的分析结果 通过上述实验证明，作为NO供体型糖皮质激素的1-3组的化合物与安慰组对股骨干重的影响无显著性差异，而与相应的糖皮质激素相比，能够限制的克服股骨干重降低的副作用 1-3组与其它组股骨灰重的分析结果 通过上述实验证明，与对股骨干重的影响相似，作为NO供体型糖皮质激素的1-3组的化合物与安慰组对股骨干重的影响无显著性差异，而与相应的糖皮质激素相比，能够限制的克服股骨干重降低的副作用。
对比实施例4 体外NO释放试验 按照冯晓春等(ZLR-8对大鼠胃溃疡愈合的影响及体外一氧化氮的释放，中国药科大学学报，2004，35(4)357-360)和赵蕊等(生理溶液中硝普钠释放一氧化氮巯基通路的动力学研究.中国药学杂志，2003，38(2)104—105)公开的方法进行测验 1 Greiss试剂的配制 氨苯磺胺4g、N—萘乙烯二胺盐酸盐0.2g和85％磷酸10mL用蒸馏水稀释至100mL。
2 标准曲线的制备 配制0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.20，0.40μg/mL的亚硝酸盐 2 标准曲线的制备 配制0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.20，0.40μg/mL的亚硝酸盐氮系列标准溶液，分别取10mL与Greiss试剂2.5mL充分混匀，室温放置10min后，于540nm测定其吸收度。得线性回归方程A＝2.3908c+0.0013，R2＝0.9995。其中A代表吸收度， c 代表亚硝酸盐浓度(μg/mL) 3 目标化合物NO释放量的测定化合物先溶于0.01mol/L二甲亚砜中，再用磷酸缓冲液稀释。缓冲液里含有过量的半胱氨酸(5mmol/L)，混匀，受试物终浓度为10-4mol/L。将溶液置于37℃水浴，于不同时间点取溶液2mL与Greiss试剂500μL混合，室温放置10min，于540nm处测吸收度。从给药起每15分钟为一个时间点，每个时间点取3个样本，NO释放量以其相当于氧化产物——亚硝酸盐的量(μg/mL)表示。
测定的释放度曲线见图1 从图1的NO体外释放度曲线图中可以看出，本发明的实施例1～4制得的化合物和现有技术中的相应NO供体型糖皮质激素相比，NO释放更为迅速，能够更快的达到释药高峰，稳定的维持在较高的释放度上。由此说明本发明所选用的NO供体在制成NO供体型糖皮质激素后，NO的释放更快，更稳定。
对比实施例4 对大鼠棉球肉芽肿抗炎效果对比动物试验 1.试验动物与分组，SD大鼠130只，雌雄不限体重200g±10g，分为，实验1～3组，对照1～5组，对照1’～4’组，以及阳性对照组。分别以采用实施例1、2、4所制得的活性成分(9.1)、(9.2)、(9.4)为实验组1～3所用药物，以采用中国专利CN 97180284.X公开的以甲泼尼龙、地塞米松、曲安西龙、氢化可的松为甾体激素母核的NO供体型糖皮质激素 甲基泼尼松龙21-(3-硝基氧)丙酸酯、 地塞米松-21-(3-硝基氧)丙酸酯 曲安西龙-21-(3-硝基氧)丙酸酯 氢化可的松-21-(3-硝基氧)丙酸酯 为对照组1～4所用药物，以中国专利CN 200710019806.5公开的NO供体型氢化可的松为对照组5 以甲泼尼龙、地塞米松、曲安西龙、氢化可的松为对照组1’～4’组所用药物，以上各组的剂量以原糖皮质激素计分别为 氢化可的松 20mg/kg 甲泼尼龙 1mg/kg 地塞米松 0.5mg/kg 曲安西龙 0.5mg/kg 2.实验方法 根据外国文献Intahphuak S(Intahphuak S，Panthong A，Kanjanapothi D，etal.Anti-inflammatory and analgesic activities of Mallotus spodocarpus Airy Shaw[J].JEthnopharmacol，2004，9069—72)等人公开的方法，将上述随机分组的大鼠用20％乌拉坦以5mL/kg的剂量麻醉后，手术植入棉球，棉球的重量为50±1mg，手术后第二天开始灌胃给药，连续7d。给药容量为10ml/kg，以总容量5％DMSO溶解，5％吐温-80助溶，0.5％CMC-Na混悬。给药剂量如上所述，并以溶剂作为阳性对照组。于末次给药后12h处死大鼠，剥离棉球，将棉球置于干燥箱中65℃，12h烘干，称取棉球重量，减去棉球重量即为肉芽重量，所述的肿胀抑制率＝(相应组肉芽重量-阳性对照组肉芽重量)/阳性对照组肉芽重量 测量结果见下表 从上表中数据可以看出本发明所制得的化合物(9.1)、化合物(9.2)、化合物(9.4)对棉球诱导的大鼠肉芽组织增生的慢性炎症有显著的抑制作用，与相应的等摩尔剂量的原型甾体激素相比，抗炎效果也具有显著差异(P<0.05)，而与中国专利ZL 97180284.X公开的采用相同的甾体激素母核的硝酸酯类NO供体型糖皮质激素相比，本发明所制得的化合物对棉球诱导的大鼠肉芽组织增生的慢性炎症的抗炎效果也具有显著差异(P<0.05)。
然而，对与同样采用了呋咱类NO供体的中国专利ZL 97180284.X公开的以氢化可的松为甾体激素母核的NO供体型糖皮质激素，虽然与采用同样摩尔剂量的氢化可的松的对照组4’相比，抗炎效果稍好，但并不具有统计学意义上的显著性。
权利要求
1.如下通式(II)的化合物
A—L—X
其中A为甾体激素残基，具有如下结构，
其中在1-2位是双键，A与L相连的位置是通过A中的R”上的羟基，也可以通过17位上的羟基相连，
其中，取代通式中所述的CH基中的H或CH2中的二个氢H2的取代基可如下
在2位，可以是F，Cl，Br
在3位，可以是，CO(酮基)，—O—CH2—CH2—Cl，OH
在4-5位，可以是双键；
在5-6位，可以是双键；
在6位，可以是Cl，F，CH3，—CHO；
在7位，可以是Cl，Br
在9位可以是Cl，F
在11位，可以是OH，CO，Cl；
在16位可以是CH3，OH，＝CH2
在17位，可以是OH，CH3，OCO(O)x(CH2)yCH3，或
即糠酰基
其中x为0或1的整数，y是0至4的整数，
在16-17位置，可以是下述基团；
其中，R2和R3可以相同或不同，并可以为氢或1至8个碳的饱和或不饱和烃基，可以为直链、支链，或环；
R和R’可以相同或不同，并且可以为氢或具有1至4个碳原子的直链或直链烷基；
A为皮质甾类基团残基，桥基团L可以与R”或17位上的羟基以酯键的形式相连
所述的R”是CO(CR4R5)O—T1，或CO(CR4R5)—T2
T1是H，CO(O)x1(CH2)y1CH3或T2是H或Cl，其中x1为0或1的整数，y1是0至4的整数
当R”是所述的残基所在时，为CO(CR4R5)O—，通过其中的羰基与17位相连，氧与桥基团L相连；
所述的残基还可以在17位，为—O—，
二价桥基团L选自
—(CO)Ob1(CR’4R’5)na(CO)(R7))—
其中，na为0至4的整数，b1为0至1的整数，R4、R’4或R’5、R5相等或彼此不同并选自H，具有1至8个碳原子的饱和或不饱和烃基，可以为直链、支链或环，优选na＝2，b1为0，R4＝R5＝R’4＝R’5＝H；
R7选自下列基团中的一种
—O(R8)O—，R8为C1～C4的亚烷基
—O(CH2)2O(CH2)2O—，—NHCH2CH2O—，或者
—OCH2C(Ph)O—，—O(CH2)2C(Ph)O—，Ph代表苯基；
—X是释放一氧化氮的功能基团，选自
R6为C1～C8的饱和或不饱和的烃基。
2.如权利要求1所述的式(II)化合物，优选通过A中的R”上的羟基相连。
3.如权利要求1或2所述的式(II)化合物，其特征是R和R’均为—CH3。
4.如权利要求1或3中任一所述的化合物，在16-17位置的下述基团
其R2为H，R3为正丙基、环己基。
5.如权利要求1至4中任一所述的式(II)化合物中释放一氧化氮的功能基团，其特征是所述的R6优选含有苯环的取代基。
6.如权利要求1至5中任一所述的式(II)化合物，其特征在于甾体残基A的H，H2，R1，R2，R3具有下面所列的化合物所定义的结构；布地奈德、环索奈德、阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松、倍他米松、氯泼尼松、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯波尼醇、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯奈德、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、丁基氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙醋酸酯、氟泼尼定醋酸酯、氟泼尼松龙、氟氢缩松、哈西奈德、卤倍他索丙酸酯、卤米松、卤泼尼松醋酸酯、氢可他酯、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲波尼松龙、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、波尼松龙25—二乙基氨基醋酸酯、、泼尼松、强的松龙戊酸酯、波尼立定、利美索龙、曲安西龙、曲安奈德、21—乙酰氧基孕烯诺龙、可的伐唑、安西奈德、氟替卡松丙酸酯、马泼尼酮、替可的松、曲安西龙六缩丙酮。
7.如权利要求1至6中任一所述的式(II)或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗炎症性、变应性或过敏性疾病的药物中的应用。
8.一种药用组合物，包括权利要求1至7中任一所述的式(II)化合物或其生理学上可接受盐或溶剂合物和至少一种药学上的载体。
9.一种制备如权利要求1至7中任一所述的式(II)化合物的方法包括如下步骤
1)将作为皮质激素残基A所代表的皮质激素即A—H(1)在有机溶剂中与酰化剂二酸酐(2)反应得到中间体(3)
2)中间体(3)再和NO供体(8)经酯化反应生成目标产物相应的一氧化氮供体型糖皮质激素式(II)化合物
3)以R6—SH(4)为起始原料，与氯乙酸缩和、经过过氧化氢氧化、再与硝酸作用、再和H—R7—H(5)反应得到NO供体(8)。
10.权利要求1至7中任一所述的项式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗炎性、变应性或过敏性疾病中的剂量以皮质激素残基A所代表的皮质激素A—H计为0.001mg-5mg/kg/天。
全文摘要
本发明提供了一种一氧化氮供体型糖皮质激素，为如下通式的化合物(II)或其酯或盐A-L-X，其中A为甾体激素残基，桥基团L可以与R”或17位上的羟基以酯键的形式相连，二价桥基团L选自-(CO)Ob1(C R’4R’5)na(CO)(R7))-，其中，na为0至4的整数，b1为0至1的整数，R4、R’4或R’5、R5相等或彼此不同并选自H，具有1至8个碳原子的饱和或不饱和烃基，可以为直链、支链或环，优选na＝2，b1为0，R4＝R5＝R’4＝R’5＝H；本发明还提供了该化合物或其生理上可接受的盐或溶剂合物在生产治疗炎性、变应性或过敏性疾病的药物中的应用。
文档编号A61K31/58GK101397328SQ20071005979
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者卢彦昌, 静 李, 陈立营, 松 陈 申请人:天津药业研究院有限公司