抗癌环己二胺金属配合物的制作方法

专利名称：抗癌环己二胺金属配合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类环己二胺衍生物的金属配合物，其制备方法和这些配合物的作为治 疗哺乳动物肿瘤和癌症药物的应用。二、 技术背景环己二胺与金属铂(n/iv)所形成配合物的抗癌活性是众所周知的，临床使用的奥沙利铂(oxaliplatin)是环己二胺与金属铂形成配合物的一例[1。然而，环己二胺与其他 金属离子形成的配合物，环己二胺的衍生物的金属配合物，以及它们的生物分子链接 物的抗癌活性却是鲜为人知的。虽然奥沙利铂是目前最为广泛使用的一种抗癌药物，但它对人体具有明显的毒副作 用，例如恶心，呕吐，肾毒和神经毒性等等。因此，急待开发一类新的高选择性的抗癌 药物。基于环己二胺的铂配合物的改进也曾有报道。例如用丙二酸衍生物取代奥沙 利铂分子中的离去基团草酸根离子，并将丙二酸与生物分子链接以期提高药物分子对癌 细胞的选择性P，但效果并不理想。本发明人的最新研究表明，环己二胺的其它金属离子配合物，环己二胺衍生物的金 属配合物，以及它们的生物分子链接物具有选择性的抑制癌细胞生长活性。合成和筛选 这些药物分子是获得低毒副作用的药物分子，实现对癌症的有效治疗的一条重要途径。参考文献[1] J.Graham, et al. Nature Review, Drug Discovery, 2004,3.11 [2] Qing Zhi Gao， et al. U.S. Patent No.7,208，611 B2. 4/2007三、发明内容本发明的目的在于提供一类新型的环己二胺金属配合物，这些化合物具有选择性的抗癌活性和低毒副作用。其结构可用通式I表示<formula>formula see original document page 5</formula>(I)这一类化合物的特征是以环己二胺为母体，对其实施取代基衍生化和与生物分子的 链接，然后与金属离子配位.这里所指的衍生化包括各种有机官能团的取代，这里所指 的链接指的是二胺衍生物与生物分子通过化学键的链接。式(I)中的取代的或非取代的手性环己二胺包括它的所有可能的立体异构体，这些 立体异构体可以具有trans(l尺2&， trans(lS2》或者cis (l尺2^构型；或者是由以上两个 立体异构体组成的混合物。式(I)中的Rt和R2独立地选自任何一个有意义的有机基团，包括羧基，醛基，酮 基，羟基，胺基，巯基，卤素，取代及未取代的垸基，取代及未取代的环烷基，取代 及未取代的烯基，取代及未取代的块基，取代及未取代的芳香族化合物和取代及未取代 的杂环化合物，或者氢原子。式(I)中的A!和A2指的是环己二胺氮原子上的取代基团，它们可独立地选自，但 并不局限于以下所列的基团取代及未取代的垸基，取代及未取代的环烷基，取代及未 取代的烯基，取代及未取代的炔基，取代及未取代的芳香族化合物和取代及未取代的杂
环化合物，但不同时为氢原子。式(I)中的M可以是任何一个过渡系、贵金属和稀土金属离子以及这些金属离子 的放射性同位素。例如Zn(II)， Fe(II)/Fe(m)， Pt(II)/(IV)， Pd(II)， Au(II)和Ag(I)等。当 M所代表的金属离子是四配位金属离子时，通式(I)中的d, C2及Bi， B2可以是空位。 式(I)中B1， B2， Cl和C2独立地代表任何一个可与金属离子配位的离子、小分 子或生物分子，或代表一个空位；作为具体化实例，Bl， B2， C1和C2可以是卤离子， 硝酸根，氢氧根、水分子、硫酸根、磷酸根、铵基(胺)、羧酸根、咪唑、核碱基等， 并且B1和B2能够一起来表示一个取代的或未取代的配体或药物分子.例如水杨酸，丙 二酸，草酸，但当金属离子是Pt(II)时，不为草酸；可选择的药物分子包含四环素和强力 霉素等小分子药物。作为具体化实例，通式(I)所提供的某些四配位和六配位化合物可分别用结构式(II)和(III)表示:、'OH 、OH(II) (III)当A,和A2参与与金属离子配位时，通式(I)所提供的某些化合物可用通式(IV) 和(V)表示(IV) (V)本发明的另一个重要的目是提供权利要求1所提供的配合物的合成和制备方法。取代的环己二胺可通过多步有机合成方法制备；金属配合物可通过无机配位化合物制备方 法获得。本发明利用生物链接技术将生物分子与通式(I)所提供的化合物中的R" R2、 A卜A2、 B卜B2、 d和C2中的至少一个可通过化学键链接。这里的生物分子指的 是能够在癌细胞或肿瘤组织表面或内部浓集起来的生物小分子或大分子。它们可以包 括，但不局限于以下所列分子低聚肽、低聚核苷酸、多肽、多聚核苷酸、蛋白、脂类、 脂蛋白、毒素、Si-RNA、 mi-RNA、抗体、激素、配体、受体、葡萄糖及葡萄糖衍生物， 并且这些生物分子还有可能与另外一或一个以上的金属离子配位、与放射性同位素链 接、与纳米材料、荧光分子链接以达到分子影像，药物传送和获得治疗癌症药物的目 的。权利要求1中所述的化合物的Ri、 R2、 A!、 A2、 B!、 B2、 d或C2中的至少一个应 具有以下所述的反应性基团之一，这些基团包括但不限于羧基，醛基，酮基，羟基，胺 基，肼，巯基，乙烯基和卤素等，并且，该基团能以共价键的成键方式生物分子链接。 同时，所应用的生物分子可以具有羧基，醛基，酮基，酰基，羟基，胺基，肼，巯基， 乙烯基，卤素或其它反应性基团，或者是能够被以上所涉及的反应性基团之一所修饰， 并能利用该基团与R!、 R2、 A" A2、 B卜B2、 C!或C2中的至少一个以共价键的形式链 接。R!、 R2、 A!、 A2、 B卜B2、 d和C2可通过以下几种，但不限于这几种成键方式与 生物分子链接。例如形成腙、双硫键、肽键，酯键、醚键、C-N键等。其中，腙键可以在被靶中的细胞的溶酶体的酸性条件下断开；二硫键可在细胞内被还原断开；肽键则在溶酶体中被金属酶水解。
Aj、 A2、 B卜B2、 d或C2本身也可以是一个生物分子。B卜B2可以联合起来共同 代表一个生物分子。作为具体实例，通式(I)所提供的某些生物分子链接物可用式(V)和(VI)式表(V) <formula>formula see original document page 8</formula>(VI)<formula>formula see original document page 8</formula>本发明还有一个目的是公开上述化合物中典型化合物对人类癌细胞的体外抑制作 用。权利要求l所提供的化合物中的胺的衍生物的种类、光学活性、金属离子，配体以 及所链结的生物分子的种类可以有多种组合。经过对所产生化合物的细胞毒性筛选，可 以获得具有选择性抗癌活性的，低毒副作用的药物分子。权利要求1所提供的代表性的化合物的体外细胞活性试验表明，它们对人类癌细胞， 包括乳腺癌，肺癌，皮肤癌，胰腺癌，前列腺癌，膀胱癌和卵巢癌等表现出很高的细 胞毒性。因此，本发明所提供的药物分子可以用于制备一类抗癌药物。 四.具体实施例本发明由下述一些代表性化合物的实施例得到进一步阐述，但这些说明并不限制本 发明。在化合物的合成中所用起始化合物是商品化产品或能够从巳知合成方法制备。所有 有机化合物的制备方法可从文献中获得，并且这些方法对合成化学家是基本的和显而易 见的。因此，以下合成方法的描述可认为是详细的和具体的。 实施例l.合成N,N'-双水杨基-lR，2R-环己二胺(1) <formula>formula see original document page 9</formula>含244毫克(0.2毫摩尔)邻羟基苯甲醛的乙醇溶液与含114毫克(O.l毫摩尔)R， R-环己二胺的乙醇溶液在室温下反应2小时后，有黄色沉淀生成。向所得混合物体系中 加入1.0克硼氢化钠，待反应在室温下进行4小时后，将溶剂蒸发浓縮至干，粗品用色 谱柱纯化(甲醇二氯甲烷=2: 8)得产物297毫克(产率82%)。 ESI-MS:计算值，[C20H26N2O2+H]+=327.4;实验值，327.5。!HNMR (C0C13): 5=1.29-1.45 (m 8H)， 3.12 (S， 2H)， 3.84 (m， 4H), 6.52-7.03 (m， 8H)实施例2.合成顺—N,N'-双水杨基—lR,2R—环己二胺合锌(II) (2)<formula>formula see original document page 9</formula>含32.6毫克(O.l毫摩尔)的化合物l的乙醇溶液与含0.1毫摩尔的高氯酸锌的乙 醇溶液在50mL容器中反应4小时。然后，向体系中加入20mL的乙醚并且搅拌至有大 量白色沉淀生成，过滤，室温下真空干燥得产物215毫克(产率55%)。 ESI-MS: 计算值，[C2QH24N2O2+H]+=390.8;实验值，391.4。!HNMR (C0C13): 5=1.30-1.44 (m， 8H)， 3.16 (S， 2H)， 3.90 (m， 4H)， 6.62-7.03(m， 8H)实施例3.合成顺—二氯(N,N'—双水杨基—1R， 2R—环己二胺)合铂(II) (3)<formula>formula see original document page 10</formula>(3)将含有32.6毫克(O.l毫摩尔)的化合物l的乙醇溶液与含41.5毫克(O.l毫摩尔) 的四氯合铂(II)酸钾的水溶液混合，室温下搅拌2分钟后有大量棕黄色固体析出，过 滤，真空干燥，得产物240毫克(产率40%)。 ESI-MS: 计算值，[C20H26N2O2PtCl2+H]+=593,5;实验值，593.3 。 1HNMR (C0300): 5二1.32-1.47 (m， 8H), 3.25 (S， 2H)， 3.62 (m， 4H)， 6.68-7,02 (m， 8H)实施例4.合成顺一二氯一3R， 4R—二胺基环己酸合铂(II) (4)<formula>formula see original document page 10</formula>(4)向含有6.0毫摩尔的醋酸锰和10.0毫摩尔的叠氮化钠的100毫升乙腈的悬浮液中加 入2.0毫摩尔的3-环己烯基甲酸和40毫升的TFA。反应在-20°下进行90分钟。双叠 氮化的3-环己烯基甲酸用硅胶柱纯化。产物为无色油状物。产率55%。向含有1.0毫摩尔的双叠氮化物的60毫升乙醇溶液中加入100毫克的Lindlar催化
剂。反应在3个大气压的氢气压下进行48小时。反应完成后催化剂被滤掉，并将溶剂 蒸发浓縮。3，4-二胺基环己酸用硅胶柱纯化。产物为无色油状物。产率68%。 '向含有0.1毫摩尔的3,4-二胺基环己酸的乙醇溶液中加入等摩尔的K2PtCl4的水溶 液。待反应进行30分钟后，向体系中加入过量的乙醚，并将所生成的沉淀过滤干燥。 产物为棕红色粉末，产物收率83%。ESI-MS:计算值，[C7H14Cl2N202Pt+H]+=423.99;实验值，424.01。元素分析数据，括号内为计算值(％): C， 20.2 (19.9); H, 3.3 (3.3)， N， 6.64 (6.62)。 实施例5.合成N，N，-双乙酸-lR，2R-环己二胺(5)含114毫克(l.O毫摩尔)的1R, 2R-环己二胺的乙腈溶液与2.0毫摩尔的a-溴代 乙酸叔丁酯反应，催化剂选用无水碳酸钾。反应在40'C下进行48小时，将溶液过滤并 浓縮至干得黄色油状物，然后将该物溶于l、 2-二氯甲垸溶液。在0'C下向该溶液中加 入适量三氟乙酸，反应进行4小时后，将溶剂蒸干，粗品用色谱柱法纯化，所得精品为 淡黄色粉末，得产物150毫克(产率66%) ESI-MS: 计算值，[C1()H18N204+H]+=231.3;实验值，231.4。 tHNMRj (D20) .S=1.29 (m， 2H)， 1.38 (m， 2H); 2.48 (m， 1H)， 3.62 (2H) 实施例6.合成Herceptin-N，N，-二乙酸-lR，2R-环己二胺(6) (6)在催化剂CDI的存在下，含0.10微摩尔化合物5和15.5毫克(O.IO微摩尔)Herceptin 的浓度比为1:1的水溶液在室温下反应1小时，生物链接后的大分子用孔径专一的(Size exclusive)柱分离，反应转化率由分析母液中残留的化合物5的含量确定，转化率95 %。实施例7.合成顺一二氯(Herc印tin-N,N，-二乙酸-lR^R-环己二胺)合铂(II) (7)(7)将实施例6制备的化合物6的水溶液与含0.0415mg (lxlO"毫摩尔)K2PtCl4的水 溶液在室温下混合，待反应进行30分钟后，用孔径专一化柱将生物大分子与小分子从 溶液中分离，反应的转化率由测定母液中氯离子的含量(电位滴定法)而确定，转化率98 %。实施例8.合成化合物(8) <formula>formula see original document page 13</formula>向含有19.1毫克(0.1毫摩尔)的次氮基三乙酸的水溶液中加入等摩尔的N, N-环 己基二酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。待反应进行10分钟后，向体系中加入含0.1毫 摩尔Herceptin的水溶液。反应在室温下进行1小时后，用孔径专一化树脂柱将生物大 分子物质从溶液中分离并将其溶于10mL的纯水中。在另外一个50毫升的反应器中， 加入含有0.2毫摩尔的化合物硝酸银的水溶液和含有0.1毫摩尔的化合物3的乙醇溶 液，反应进行2分钟后将氯化银沉淀用离心法除去。所得滤液加入次氮基三乙酸与 Herceptin生成的链接物中。待反应在室温下进行1小时后，溶液用孔径专一化树脂柱 过滤分离。产物收率98%。 实施例9.化合物的体外抗癌细胞生长活性。权利要求1所提供的化合物对人类癌细胞表现出很高的细胞毒性。被筛选的癌细 胞包括乳腺癌，肺癌，皮肤癌，胰腺癌，前列腺癌，膀胱癌和卵巢癌等。因此，本发 明所提供的药物分子是一类具有广普抗癌活性的药物分子。下面给出部分化合物对乳腺 癌细胞和非小肺癌细胞的抗生长活性。化合物2， 3， 4， 7和8在5.0 pM浓度下对肺癌细胞NCI-H460的生长抑制作用如 图l所示；该结果证实实施例所提供的配合物具有有效的体外抗癌细胞活性.化合物2 在1.0, 5.0和10.0^M浓度下对乳腺癌细胞MCF-7和对正常乳腺细胞MCF-10A的生长 抑制作用如图2和3所示；以上试验结果可以看出，化合物1对乳腺癌细胞MCF-7 具有选择性的细胞毒性。化合物2在1.0， 5.0和10.0 浓度下对肺癌细胞HBT-174的生长抑制作用如图 4所示；而对正常上皮组织细胞WT-1的生长抑制作用如图5所示。该试验结果表明该 化合物具备选择性的抗癌细胞生长的特性。化合物2和3在0.1， 0.5和1.0 nM浓度下对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作 用的细胞菌落试验结果如图6和7所示。该结果进一步证实本发明所提供的化合物是有 效的抗癌药物分子。化合物2和3在0.5， 1.0和5.0 浓度下对肺癌细胞HBT-174的生长抑制作用 的细胞菌落试验结果如图8和9所示。该结果进一步证实本发明所提供的化合物是有效 的抗癌药物分子。实施例10.化合物对乳腺癌细胞MCF-7的基因表达的调控作用。权利要求1所提供的化合物的抗癌活性与其对癌细胞的某些重要基因表达的调控作 用密切相关。在基因表达调控的研究中采用了 RT-PCR的分析方法。mRNA的相对表达 值用GAPDH标准化。下面给出部分化合物对细胞生长周期和凋亡有关基因的调控作 用。化合物2在1.0 浓度下对MCF-7癌细胞中CyclinDl和Bcl-2表达的抑制作用如 图10所示。该实验结果表明，在所测试浓度下，癌细胞被药物分子作用48小时后， 其CyclinDl和Bcl-2的表达被有效地调控。 五.


图1为化合物2， 3， 4， 7禾n 8在5.0 jaM浓度下对肺癌细胞NCI-H460的生长抑制作 用.细胞被化合物处理48小时后用SRB方法分析细胞存活的数量. 图2为化合物2在1.0，5.0和10.0pM浓度下对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用.细 胞被化合物处理48小时后用SRB方法分析细胞存活的数量.图3为化合物2在1.0, 5.0和10.0 pM浓度下对正常乳腺细胞MCF-10A的生长抑制作 用.细胞被化合物处理48小时后用SRB方法分析细胞存活的数量. 图4为化合物2在1.0，5.0和10.0 pM浓度下对肺癌细胞HBT-174的生长抑制作用.细 胞被化合物处理48小时后用SRB方法分析细胞存活的数量.图5为化合物2在1.0， 5.0和10.0 浓度下对正常上皮组织细胞WT-1的生长抑制作 用.细胞被化合物处理48小时后用SRB方法分析细胞存活的数量. 图6为化合物2在0.1, 0.5和1.0 浓度下对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制作用的细胞 菌落试验结果。每盘中细胞播种的数量为250,并在第二天加入化合物处理。然后每三 天更换化合物一次，并在第十天进行细胞染色。图7为化合物3在0.1, 0.5和1.0 浓度下对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制作用的细胞 菌落试验结果。每盘中细胞播种的数量为250，并在第二天加入化合物处理。然后每三 天更换化合物一次，并在第十天进行细胞染色。图8为化合物2在0.5， 1.0和5.0 浓度下对肺癌细胞HBT-174的生长抑制作用的细 胞菌落试验结果。每盘中细胞播种的数量为250,并在第二天加入化合物处理。然后每 三天更换化合物一次，并在第十天进行细胞染色。图9为化合物3在0.5, 1.0和5.0 |aM浓度下对肺癌细胞HBT-174的生长抑制作用的细 胞菌落试验结果。每盘中细胞播种的数量为250，并在第二天加入化合物处理。然后每 三天更换化合物一次，并在第十天进行细胞染色。 图10为化合物2在1.0 pM浓度下对MCF-7癌细胞中CyclinDl ， Bcl-2， Bcl-xL和Bax 表达的抑制作用.细胞被化合物处理24小时。mRNA的相对表达值用RT-PCR分析方 法确定，并用GAPDH标准化。
权利要求
1、一类二胺金属化合物，其特征是具有选择性抗癌活性，该类化合物组成可由通式(I)表示其特征是环己二胺及其衍生物可以独立地选自其任一可能的手性异构体，包括trans(1R，2R)，trans(1S，2S)和cis(1R，2S)异构体；或者是这些异构体组成的混合物；其中，R1和R2独立地选自任何一个有意义的有机基团，包括羧基，羟基，胺基，巯基，卤素，取代及未取代的烷基，取代及未取代的环烷基，取代及未取代的烯基，取代及未取代的炔基，取代及未取代的芳香族化合物和取代及未取代的杂环化合物，或者氢原子；其中，取代基A1和A2可以独立地选自任意一个，但不局限于以下所述的基团取代及未取代的烷基，取代及未取代的环烷基，取代及未取代的烯基，取代及未取代的炔基，取代及未取代的芳香族化合物和取代及未取代的杂环化合物，但不同时为氢；其中，M包含任何一个过渡系、贵金属或稀土金属离子或其放射性同位素；其中，B1，B2，C1和C2独立地选自任何一个可与金属离子配位的离子、分子或代表一个空位；当M所代表的金属离子是四配位金属离子时，通式中的C1，C2，可以是空位；或者，当A1和A2参与金属离子配位时，通式中的C1，C2或B1，B2可以为A1和A2所取代；B1，B2，C1和C2包含卤离子，硝酸根，氢氧根、水分子、硫酸根、磷酸根、铵基(胺)、羧酸根、咪唑、核碱基等，并且B1和B2能够一起来表示一个取代的或未取代的双齿配体或药物分子；双齿配体包含水杨酸、丙二酸，草酸，但当M＝Pt(II)时，不包含草酸；药物分子包括四环素和强力霉素等小分子药物。
2、 权利要求1中所述的化合物，其特征是Rh R2、 Ai、 A2、 B卜B2、 d或C2中的至 少一个具有以下所述的反应性基团之一，这些基团包括但不限于羧基，醛基，酮基，羟基，胺基，肼，巯基，乙烯基和卤素等，并且，该基团能以共价键的成键方式与 生物分子链接。
3、 权利要求2所述的生物分子，其特征是能够选择性地在肿瘤细胞，组织表面或内部 浓集；这些生物分子包括低聚肽、低聚核苷酸、多肽、多聚核苷酸、蛋白，脂类、 脂蛋白、毒素、Si-RNA、 mi-RNA、抗体、激素、配体、受体、葡萄糖及糖类衍生 物等。
4、 权利要求2所述的生物分子，其特征是可以具有羧基，醛基，酮基，酰基，羟基， 胺基，肼，巯基，乙烯基，卤素或其它反应性基团，或者是能够被以上所涉及的反 应性基团所修饰，并能利用该基团与R卜R2、 A卜A2、 B卜B2、 d或C2中的至少 一个以共价键的形式链接。
5、 制备权利要求1所提供的化合物的方法，其特征在于取代的环己二胺通过多步有机 合成方法制备；金属配合物通过无机配位化合物制备方法获得；R,、 R2、 A,、 A2、 Bj、 B2、 d或C2与生物分子的有代表性的链接采用任意可能的生物链接方式，包括 但不限于形成肽键、腙、双硫键、酯键、醚键和C-N键等。
6、 权利要求l所提供的化合物作为治疗肿瘤和癌症药物的应用，并且所有的药物和药 剂包含了权利要求1所述的化合物用于治疗哺乳动物的癌症和肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一类具有选择性抗癌活性的药物分子，其结构可由通式(I)表示，其特点是用手性环己二胺的衍生物与金属离子配位形成金属配合物；揭露了典型化合物的制备方法及其对人类乳腺癌和肺癌细胞生长的抑制作用及其作用机制。式中R₁和R₂包括任何一个有意义的有机基团或者是氢原子，A₁和A₂可独立地选自任何有机基团；M代表任一过渡系、贵金属或稀土金属离子或其放射性同位素；B₁，B₂，C₁和C₂独立地代表任一配体离子，分子或空位；B₁和B₂可一起表示一双齿配体，R₁，R₂，A₁，A₂，B₁，B₂，C₁和C₂还能与生物分子链接。
文档编号A61P35/00GK101130556SQ20071005939
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者请求不公布姓名 申请人:高 健;刘亚光;周亚清