转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料及制备方法及用途的制作方法

专利名称：转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程、生物组织工程领域，特别是涉及一种转基因细胞活化改性壳聚 糖医用敷料及制备方法及用途。
技术背景糖尿病现己成为全世界的常见病和多发病，在发达国家被列为继心血管疾病及肿瘤之 后的第三大疾病。根据2006年国际糖尿病联盟统计数字显示，目前全球一亿五千万人患有 2型糖尿病，但是其发病率在各地不一。我茵大约有近3000万糖尿病患者。按目前增长中 的发病率来说，糖尿病将于数十年内成为全球最普遍的疾病之一。WHO预测到2025年全 球糖尿病患者将达3.3亿，其中有75%糖尿病患者在印度、中国等发展中国家。我国糖尿 病患者的人数仅次于印度居世界第二位。糖尿病的危害不但在于其疾病本身，而且在于其 各种急慢性并发症，并且糖尿病已成为危及人类生存质量的罪魁祸首。其中，糖尿病足部溃疡是导致糖尿病患者截肢的主要原因。随着全球糖尿病患者人数 逐年增加以及人均寿命的延长，因糖尿病足部难愈性溃疡而需要截肢的患者不断增加。在 美国现有1600万糖尿病患者中，15%的患者可能在其一生中的某个阶段出现足部溃疡。调 查表明，糖尿病患者每年足部溃疡新发病率在2%-3%。每年大约25%糖尿病患者由于足部 感染而住院治疗，且非创伤性下肢截肢患者中至少50%是由糖尿病足部感染造成。由于糖 尿病导致足部溃疡发病率高，创面愈合慢，并发症多，严重影响着患者的生活质量。因此， 早期认识和正确处理该病具有重要临床意义。近年来，糖尿病导致的创面愈合障碍一直是国内外学者研究的重点。其发生机制涉及细胞代谢、免疫功能、生长因子和细胞供氧等多方面。创面愈合这一复杂过程涉及了以下四个环节稳定的内环境、炎症反应、细胞增殖及 重新塑型，包括炎症细胞、修复细胞、细胞因子及细胞外基质的相互调节。在整个修复阶 段，生长因子的参与至关重要。生长因子是一组具有促进细胞生长、增殖、合成作用的蛋 白质或多肽的专有名词。它具有促进成纤维细胞大量增殖、胶原纤维明显积累及增强创面 抗张力的作用，增加内皮细胞和成纤维细胞的趋化性，使其迁移向受损部位，促进成纤维 细胞产生胶原蛋白；能够刺激血管内皮细胞、角质化细胞及成纤维细胞的增殖分化，加速 血管化和再上皮化；它是炎症细胞的有丝分裂原和趋化因子，而后者的聚集、脱粒则是创面修复的重要始动因素；此外，它还可调节细胞外基质的合成，共同促进溃疡愈合。对于某些难愈性创面，有学者认为是生长因子分散在细胞外基质中以及蛋白水解酶活 性增强造成生长因子不足所致，所以在创面愈合过程中外源性补充某些生长因子，或通过 增强内源性生长因子的活性，或上调生长因子受体的表达，以达到主动调控创面愈合的作
用。然而将生长因子应用于创面改变局部微环境可促进创面愈合，但是也存在以下不足 生长因子半衰期较短；创面局部的蛋白水解酶活性较强，可分解大量生长因子；局部大剂 量使用生长因子可能有副作用；生长因子以乳膏或盐溶液作为载体会限制其生物利用度。 为了克服这些不足，必然会大量重复使用生长因子， 一方面造成医疗资源的浪费，另一方 面容易产生耐药性，从而导致生长因子不能充分发挥作用。以血小板衍化生长因子(PDGF)为代表的生长因子在创伤修复的应用给糖尿病创面愈 合带来了突破性进展。PDGF是1974年由Ross等首先发现的，最初是从血小板中得到的，故 称为血小板衍化生长因子。但后来发现血小板以外的许多细胞如内皮细胞、巨噬细胞、血 管平滑肌细胞等都能合成分泌PDGF或PDGF样生长因子。PDGF作为一种多功能的细胞因 子，与伤口愈合关系密切。在创面组织中，PDGF的含量及其生物活性变化通常会影响修复 质量和修复后的组织改建。PDGF是重要的促有丝分裂原，能够直接作用于成纤维细胞与角 化细胞等组织修复细胞，縮短细胞周期，加速细胞增殖，促进伤口愈合。PDGF加速细胞增 殖的机制可能与PDGF作为启动因子诱导处于接触抑制状态的细胞进入细胞周期有关。一个 静止细胞(GO期细胞)进入细胞周期，必须经过启动和推进两个阶段。在启动因子如PDGF、 碱性成纤维细胞与角化细胞生长因子等作用下，有关的启动基因进行表达，为细胞进入S 期积累物质和能量，然后在推动因子如表皮生长因子、转化生长因子和胰岛素样生长因子 一l等的作用下，细胞很快进入S期，加速细胞增殖。PDGF与推动因子的协同作用在体内和 体外都已被证实。PDGF还可诱导成纤维细胞与角化细胞分泌胰岛素样生长因子一1，间接 促进细胞增殖。另外，PDGF能够促进纤维连接蛋白、聚葡萄糖胺和胶原等细胞外基质的合成和分泌，影响创面修复后组织的改建。迄今为止，PDGF是唯一的于三期临床上证明有效且被美国食品及药品管理局(FDA) 批准并已成功上市的生长因子。Becaplermin即人重组血小板源生长因子(PDGF—BB)由 美国Chiron公司采用重组DNA技术在酵母菌中表达生产(U.S. License No.l 106，Emeryville, CA 94608); Ortho-McNeil制药公司成功将有效活性成分为Becaplermin的Regranex推向市 场(U.S. License No.ll96， San German, Puerto Rico 00683)，用来治疗皮下深层有充足血管 供应的糖尿病足部神经性溃疡。Regmnex是一种羧甲基纤维素型软膏，为无色或淡粉色， lg含100ug Becaplermin,目前有2 g， 7.5 g和15 g三种规格包装，限于外用。软膏制剂是 目前唯一的PDGF剂型。中国专利申请号96198773.1公开了一种含生长因子的凝胶制剂，生长因子是PDGF， 凝胶基质为纤维素聚合物，及可用的带电荷化学物质，选自包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、 鱼精蛋白、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、色氨酸、氨基胍、锌和镁的组 合，其中组合物为粘度在室温下约1000—500, OOOcps范围内的水性凝胶。北京金赛狮生物制药技术开发有限公司申请的两件专利，申请号分别为02153958.8: 重组血小板源生长因子水凝胶制剂的制备方法；02153957.X:重组血小板源生长因子的水 凝胶制剂。它们也是PDGF的凝胶制剂，发明涉及的rhPDGF-BB，是采取通用的基因工程 技术，构建重组人的水凝胶PDGF-BB菌株，扩大培养，发酵、纯化，得到蛋白质纯度大
于97%、蛋白质含量为lmg/ml的rhPDGF-BB药液样品。水凝胶基质为卡伯姆，添加一定 量的pH调节剂、等渗剂、稳定剂以及防腐剂等。最近的研究表明，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是由大分子构成的错综复 杂的网络，不仅静态地发挥支持、连接、保水、保护等物理作用，为细胞的生存及活动提 供适宜的场所，而且动态地对细胞产生全方位影响，通过信号转导系统影响细胞的形状、 代谢、功能、迁移、增殖和分化。在生命演绎过程中广泛存在于多种组织与器官中，细胞 外基质处于不断的更新过程中，并且在组织修复过程中细胞外基质更是重要的支撑结构。 研究表明，细胞外基质在伤口愈合中是必需的。体表慢性难愈合创面的发生机制的研究包括组织修复细胞支架改变、修复细胞过度凋 亡、生长因子与靶细胞受体间信号转导"失偶联"以及多种因子间网络调节"失控"。以往突 出强调生长因子促进溃疡愈合，而事实上细胞外基质对溃疡的愈合所起的作用更大，因此， 对于溃疡的研究，单纯研究生长因子是远远不够的，应该结合细胞外基质进行研究。细胞支架选用壳聚糖衍生物水凝胶的原因在于壳聚糖资源丰富、价格便宜且具有良好 的生物相容性和生物降解性，降解产物一般对人体无毒副作用，在体内不积蓄，无免疫原 性等众多优点，运用于溃疡治疗还表现出抑制细菌生长，加快溃疡愈合的优势。然而壳聚 糖本身不能形成水凝胶，只有经过修饰改性后才能成胶。 发明内容本发明的目的是克服现有技术，提供一种良好的亲水性、保湿性、透气性和柔韧性以 及良好的转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料。本发明的第二个目的是提供一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料在制备治疗糖尿 病溃疡药物中的应用。本发明的技术方案概述如下-一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，用下述方法制成(1)将巯基化壳聚糖以15-25 mg/mL比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因 子基因的皮肤成纤维细胞或角质化细胞以4xlO、4xlO"mL的浓度接种于步骤(1)制成的 培养基中，以10-15转/分旋转培养2-5天。所述巯基化壳聚糖的分子量为20-1000 KDa。所述巯基化壳聚糖优选N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖或2,3 — 二巯基丁二酸改性壳聚 糖，还可以选用其它的，如巯基乙酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚糖等。 所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、l-羟基苯并三唑以h l-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1%-3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入 N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亚胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25'C下搅拌2-4 h; (3)取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 nmol/L EDTA的5 mmol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次制成。 所述2，3 — 二巯基丁'二酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、l-羟基苯并三啤以l: 1-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1%-3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2,3 — 二巯基丁二酸按质量比为1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入2,3 一二巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亚胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次制成。所述l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺水溶液的配制是将l-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳酰二亚胺加入水中完全溶解即可。一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法，包括如下步骤(1)将分子量 为20-1000 KDa的巯基化壳聚糖以15-25 mg/mL比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养 基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤成纤维细胞或角质化细胞以4X 104 -4X 105 mg/mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以10-15转/分旋转培养2-5天。所述巯基化壳聚糖为N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖或2，3 — 二巯基丁二酸改性壳聚 糖，还可以选用其它的，如巯基乙酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚糖等。所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、l-羟基苯并三唑以l: l-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为1%-3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺 配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 toiol/LEDTA的5 mmol/L盐酸 水溶液透析2-4次，用含1 g/LNaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L盐 酸水溶液透析2~5次制成。所述2.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、l-羟基苯并三唑以l: l-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为1% 3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2,3 — 二巯基丁二酸按质量比为1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入2,3 一二巯基丁二酸，后逐滴加入的与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚 胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 Wnol/LEDTA的5 mmol/L盐酸
水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2~5次，再用1 mmol/L 盐酸水溶液透析2 5次制成。所述l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺水溶液的配制是将l-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳酰二亚胺加入水中完全溶解即可。一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。 用该方法制备的水凝胶辅料用于治疗各种皮肤创伤与溃疡，尤其是糖尿病足神经性溃 疡的再生与修复。 本发明的优点1. 细胞支架选用具有抗菌性的天然高分子材料——壳聚糖通过巯基化改性后使其在水 溶液状态形成双硫键实现自然胶联而形成凝胶，该凝胶具有优越的亲水性、保湿性、透气 性和柔韧性以及良好的生物活性等功能，能最大程度地满足现代医学对敷料的要求。2. —种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料中种子细胞通过基因重组技术，实现局部 PDGF-BB生长因子高表达、强分泌，与复合细胞外基质共同调控溃疡微环境，达到修复重 建的功能。


图l为各组间不同时间愈合率的比较。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。一.本发明涉及水凝胶的设计与优化，通过壳聚糖引入巯基，实现水凝胶制备，分别 测定巯基稳定性以及溶胀性能并对其进行物理化学性质表征。将以下所得溶液状材料，使 用0.22 nm滤器过滤达到无菌状态，分装置于2-8 'C备用。 实施例lN-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 4的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为2%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 5的比例，向上述溶液中加入N-乙酰 -L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺配制 的水溶液中，调节pH为5，于2(TC下搅拌3h;(3) 取出反应液，在10 。C避光条件下于3天内用含2 nmol/L EDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析3次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析3次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析3次制成。实施例2N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 1的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为1%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 0.5的比例，向上述溶液中加入N-乙酰—L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺配制 的水溶液中，调节pH为4，于15'C下搅拌4h; (3)取出反应液，在8 'C避光条件下于4天内用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析4次，用含1 g/L'NaCI的5 mmol/L盐酸水溶液透析5次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析5次制成。 实施例3N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为3%,搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: IO的比例，向上述溶液中加入N-乙酰 丄-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺配制 的水溶液中，调节pH为6，于25。C下搅拌2h;(3) 取出反应液，在15 。C避光条件下于2天内用含2 pmol/LEDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析2次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析2次制成。实施例4N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖的制备将500 mg壳聚糖加入100 mg的N-乙酰-L-半胱氨酸，待完全溶解后，逐滴加入4 ml EDAC水溶液，用lmol/LNaOH调节pH至5并保持恒定，室温下搅拌3 h。取出反应液， 在10 'C避光条件下于3 d内用含0.2% EDTA的5 mmol/L盐酸溶液透析一次，用含1%NaCl 的5 mmol/L盐酸溶液透析两次，再用1 mmol/L盐酸溶液透析两次。 实施例6巯基乙酸改性壳聚糖的制备称取2.5g壳聚糖，加入47.5 g水配成浓度为5 %的壳聚糖溶液。滴加2.5g巯基乙酸，混 合均匀后测定pH值。加入1.12mLEDAC后于常温下搅拌反应3h。取出混合溶液，在10 °C 避光条件下在3d时间内用5mmol/L的盐酸溶液透析一次，5mmolPL盐酸/1 %NaCl混合溶 液透析两次，再用lmmol/L盐酸溶液透析两次。 实施例7硫代乙酸醇改性壳聚糖的制备称取0.8072g硫代乙酸醇，配成8ml溶液，加入4ml乙酸酐，充分搅拌均匀后，加两滴 浓硫酸，放于恒温振荡器中振荡3h,放置过夜，用水或氨水洗至中性。 实施例82.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三哇以1: 4的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为2%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2，3 —二巯基丁二酸按质量比为1: 5的比例，向上述溶液中加入2,3 — 二 巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺配制 的水溶液中，调节pH为5，于20'C下搅拌3h;(3)取出反应液，在10 。C避光条件下于3天内用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析3次，用含1 g/L'NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析3次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析3次制成。 实施例92.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 1的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为1%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2,3 — 二巯基丁二酸按质量比为1: 0.5的比例，向上述溶液中加入2,3 — 二巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺配 制的水溶液中，调节pH为4，于15'C下搅拌4h;(3) 取出反应液，在8 'C避光条件下于2天内用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析2次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析2次制成。实施例102.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖的制备(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓度 为3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2,3 — 二巯基丁二酸按质量比为1: 10的比例，向上述溶液中加入2，3 — 二 巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基")碳酰二亚胺配制 的水溶液中，调节pH为6，于25'C下搅拌2h;(3) 取出反应液，在15 。C避光条件下于4天内用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L盐酸水溶 液透析4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析5次，再用1 mmol/L盐酸水溶 液透析5次制成。本发明在壳聚糖分子结构中成功引入巯基后，在溶液状态下即能氧化形成二硫键，后 者相互胶联，结果形成网络互穿的水凝胶。二、组织工程化种子细胞的修饰处理 实施例11种子细胞的修饰血小板衍化生长因子(PDGF-BB)基因修饰皮肤成纤维细胞或角质化细胞以人脐静脉内皮细胞提取的总RNA为模板，合成cDNA序列，普通PCR扩增目的基因片段， 连入pMD-19 T载体，进行双酶切处理并将其产物与含有绿色荧光蛋白且能独立表达的 pSELECT-GFPzeo-mcs载体经T4连接酶相连接，成功构建PDGF-BB基因的真核表达载体重组子 pSELECT-GFPzeo-mcs/PDGF-BB。进一步运用脂质体介导转染技术将PDGF-BB基因导入皮肤成 纤维细胞或角质化细胞，以实现PDGF-BB基因在真核细胞中的表达。三、 微重力条件下旋转共培养水凝胶/细胞三维复合物 实施例12一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，用下述方法制成(1)将实施例1制备的分子量为100 KDa N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖以20 mg/mL 比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤 成纤维细胞以4xlO"mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以10转/分旋转培养3 天。(可以用2.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖或巯基乙酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚 糖替代本实施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖，成为新的实施例) 实施例13一种转基因细胞活化改rf壳聚糖医用敷料，用下述方法制成(1)将实施例2制备的分子量为20 KDaN-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖以15 mg/mL比 例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤成 纤维细胞以4xl04 /mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以10转/分旋转培养5 天。(可以用2.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖或巯基乙酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚 糖替代本实施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖，成为新的实施例) 实施例14一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，用下述方法制成 (1)将实施例3制备的分子量为1000 KDa N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖以25 mg/mL比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的角质 化细胞以4xl()S/mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以15转/分旋转培养2天。(可以用2.3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖或巯基乙酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚糖替 代本实施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖，成为新的实施例)四、 一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料(水凝胶/细胞三维复合物)治疗糖尿病 溃疡动物模型。实施例15实验动物选用遗传性糖尿病(db/db汰鼠，适应性喂养l周，实验当日禁食，麻醉条件下 背部净毛，面积9cmx8cm，待消毒后用特制打孔器在背部脊柱两侧共切割4个圆形创面， 直径2cm，深至皮下，止血后，随机分为4组(1)模型对照组；(2)药物(RegranexGel') 治疗组；(3)水凝胶治疗组；(4) 一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料组(水凝胶/细 胞三维复合物治疗组)。单笼喂养，每周更换水凝胶敷料2次，直至伤口愈合。(见图l)图l 中，A组 一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料组(水凝胶/细胞三维复合物组)；B组 药物((RegranexGd')治疗组；C组水凝胶治疗组；D组模型对照组。治疗后l、 3、 7、 14、 21d向溃疡内滴注等渗盐水至液面与创缘皮肤相平为止，并作记 录；治疗后l、 3、 7、 14、 21d用透明膜覆盖创面，沿边缘画线，剪膜，置分析天平称取质 量并换算成面积，再转换为再上皮化速率。再上皮化速率=(原始创面面积一未愈创面面积)
/原始创面面积><100% (详见表l);通过数码照相、计算机储存、分析、比较观察创面组 织颜色、形态以及生长速度的变化。表1不同时间创面愈合率的比较(^ ± ^ )3天(％ )7天(％)14天(％)21天(％)本发明医用敷料 组 模型对照组41.89±13.973.71±6.5992.71±1.9597.61±1.4556.37土5.0761.39±8.284.34±2.7189.8U2.91分别在治疗l、 3、 7、 14、 21d处死3只动物，每组创面留取12个标本，置入4%中性多 聚甲醛溶液中固定lh，用磷酸盐缓冲液洗脱3次，脱水透明后，石蜡包埋组织，切片，HE 染色。通过光镜观察炎性细胞(中性粒细胞、吞噬细胞等)形态、浸润情况与成纤维细胞、 血管内皮细胞、上皮细胞形态和数量变化，从组织及细胞水平观察其病变特点。通过电子 显微镜观察肉芽组织中细胞的超微结构。通过对本发明提供的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料(水凝胶/细胞三维复合 物)进行动物实验研究表明，本发明提供的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料与 RegmnexGel对糖尿病大鼠皮肤溃疡相比，明显加快溃疡的修复，且成本较低。本发明应用微重力三维组织细胞旋转培养系统(the rotary cell culture system ， RCCS)， 对大鼠皮肤成纤维细胞与角质化细胞进行微重力三维组织培养，微重力三维组织细胞旋转 培养系统的目的是建立动物细胞的三维培养体系。细胞与培养液在容器内经过旋转，重力 向量被持续随机化，细胞以一个终速度连续自由落体的方式悬浮于培养基中，从而处于一 种模拟自由落体状态，在一定程度上类似于微重力环境。在微重力条件下培养细胞可产生 低剪切力、低涡流，减少培养液对细胞产生的机械损伤，并可增加细胞营养的传递作用， 加速代谢产物的排除，从而有利于细胞的增殖与分化。另外，微重力旋转培养还可以避免 气泡的产生，可以通过滤膜来完成气体交换，使气体、营养成分和代谢废物能最佳扩散， 这些优势是静止培养方法无法达到的。本发明成功培养出一种转基因细胞活化改性壳聚糖 医用敷料，能够有效实现生长因子和细胞外基质共同作用于溃疡面以促进其修复。本发明通过基因重组技术将含有PDGF-BB基因的重组子转染入皮肤成纤维细胞或角 质化细胞，与含有巯基的壳聚糖高分子水凝胶材料在RCCS中共同培养成三维复合物，用 于治疗糖尿病溃疡动物模型，实现持续恒定地合成及分泌生长因子，从而达到高效合理地 使用生长因子的目的，并与细胞外基质共同作用，有效影响组织修复的自然过程，縮短创 面愈合时间，促进难愈性溃疡的愈合并有效改善创面愈合后的功能及外观。本发明提供的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，充分发挥水凝胶在溃疡病治 疗中的优势，表现在该水凝胶具有良好的屏障功能，对水和气体具有双向通透性；且能 有效抵御细菌入侵，防止外界感染；使创面始终处于湿润的微环境中，不仅有利于伤口的 愈合，而且可以浸润暴露在外的末梢神经，减轻患者的疼痛；该水凝胶能有效吸收伤口分 泌物，避免粘连；水凝胶具有良好的柔软性、可塑性和粘附性，与皮肤溃疡面有较好的接 触性能；种子细胞通过凝胶层进行持续释放生长因子的作用，与细胞外基质共同发挥治疗 作用；该水凝胶通过壳聚糖巯基化实现自身交联，具有良好的生物相容性，且可生物降解， 不会造成排异反应和伤口的感染；其外观呈透明状，有利于对伤口愈合情况的观察；操作方便，对创面处理结果满意等等。通过对本发明提供的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的物理化学性质表征、所含种子细胞的功能测定以及进行动物实验评价模型溃疡愈合速率、新生血管数目、PDGF-BB及其受体基因表达、细胞外基质等含量，研究结果表明一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料可达到加速组织自然修复的过程，有效縮短创面愈合时间，促进难愈性溃疡的愈合并能有效改善创面愈合后的功能和外观，性价比优于目前唯一被美国FDA批准并上市治疗糖尿病足溃疡的Regranex Gel。一、细胞基础培养基组成成分成分(mg/L):氯化钙…200; L-丝氨酸…42;九水硝酸铁---0.1; L-苏氨酸—-95;氯化钾---400; L-色氨酸…16;无水硫酸镁—-97.67; L-酪氨酸…72;氯化钠一6400; L-缬氨酸…94; 无水磷酸二氢钠…108.7; D-葡萄糖…1000; L-精氨酸盐酸盐…84;丙酮酸钠…110; L-胱氨酸盐酸盐--63;酚红---15; L-谷氨酰胺---584; D-泛酸钙…4;甘氨酸…30;氯化胆碱一4; L-组氨酸盐酸盐…42;叶酸…4; L-异亮氨酸…105; i-肌醇一7.2; L-亮氨酸—-105; 烟酰胺—-4; L-赖氨酸盐酸盐—-146;盐酸吡哆醛…4; L-蛋氨酸---30;核黄素…0.4; L-苯丙氨酸…66;盐酸硫胺一产品指标外观粉红色固体粉末、溶解性、完全溶解，溶液澄明。pH值(1)力QNaHC03 7.50 8.10 (2)不加NaHC03 6.00 6.60水分(o/o): S5.0渗透压(mOsm/kgH20): (1)力tl NaHC03 300 332; (2)不加NaHC03 238 263 细菌内毒素(EU/ml)S10 微生物检查(CFU/g)^1000贮藏2 °C-8 'C冷藏，干燥,密封，避光贮藏。规格1L/包有效期二年配制方法J(1) 将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器 后加注射用水(水温20 °C-30 °C)到950mL，轻微搅拌溶解；(2) 加入3.7g碳酸氢钠；(3) 轻微搅拌溶解，加注射用水至1L;(4) 用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L盐酸溶液调pH至所需值；(5) 用0.2 nm滤膜正压过滤除菌；(6) 溶液应在2 °C-8 'C下避光保存。 二、细胞完全培养基配制方法(1) 取过滤后的基础培养基88.5ml;(2) 加入胎牛血清10ml;(3) 加入谷氨酰胺lml;(4) 加入混匀的青霉素及链霉素(双抗)溶液0.5ml;(5) 混匀，调节pH值至7.2-7.4，在2 。C-8 。C下避光保存。
权利要求
1.一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，其特征是用下述方法制成(1)将巯基化壳聚糖以15-25mg/mL比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤成纤维细胞或角质化细胞以4×104-4×105/mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以10-15转/分旋转培养2-5天。
2. 根据权利要求1所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，其特征是所述巯基化 壳聚糖的分子量为20-1000 KDa。
3. 根据权利要求1所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，其特征是所述巯基化 壳聚糖为N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖或2， 3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖。
4. 根据权利要求3所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，其特征是所述N-乙 酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以l: l-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1% 3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 0.5-IO的比例，向上述溶液中加入 N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25 。C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 Mmol/L EDTA的5 mmol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用 1 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次制成。
5. 根据权利要求3所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料，其特征是所述2，3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、l-羟基苯并三唑以l: 1-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1% 3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2，3 — 二巯基丁二酸按质量比为1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入 2,3 — 二巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25 'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 Mmol/L EDTA的5 mmol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2 5次，再用 1 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次制成。
6. —种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法，其特征是包括如下步骤(l)将 分子量为20-1000 KDa的巯基化壳聚糖以15-25 mg/raL比例加入细胞完全培养基溶液， 制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤成纤维细胞或角质化细胞以 4X 104-4X 105 /mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中，以10-15转/分旋转培养 2-5天。
7. 根据权利要求6所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法，其特征是所述巯基化壳聚糖为N-乙酰-L-半胱氨寧改性壳聚糖或2，3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖。
8. 根据权利要求7所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法，其特征是 所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 1-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1% 3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与N-乙酰-L-半胱氨酸按质量比为1: 0.5-IO的比例，向上述溶液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚 胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25 'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 Mmol/L EDTA的5 mraol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用1國ol/L 盐酸水溶液透析2-5次制成。
9. 根据权利要求7所述的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料的制备方法，其特征是 所述2. 3 — 二巯基丁二酸改性壳聚糖由下述方法制成(1) 将壳聚糖、1-羟基苯并三唑以1: 1-8的摩尔比分散于水中，使壳聚糖的质量百分浓 度为1%-3%，搅拌直至形成透明溶液；(2) 以壳聚糖与2, 3—二巯基丁二酸按质量比为1: 0. 5-10的比例，向上述溶液中加入2， 3 一二巯基丁二酸，后逐滴加入与壳聚糖等质量的1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚 胺配制的水溶液中，调节pH为4-6，于15-25 'C下搅拌2-4 h;(3) 取出反应液，在8-15 。C避光条件下于2-4天内用含2 Mraol/L EDTA的5 mmol/L盐 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mraol/L盐酸水溶液透析2-5次，再用1 mraol/L 盐酸水溶液透析2-5次制成。
10. 权利要求1-5之一的一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料在制备治疗糖尿病溃疡 药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料及制备方法及用途，转基因细胞活化改性壳聚糖医用敷料用下述方法制成(1)将巯基化壳聚糖以15-25mg/mL比例加入细胞完全培养基溶液，制成培养基；(2)将转染血小板衍化生长因子基因的皮肤成纤维细胞或角质化细胞以4×10⁴-4×10⁵/mL的浓度接种于步骤(1)制成的培养基中旋转培养；本发明选用具有优越的亲水性、保湿性、透气性和柔韧性的凝胶为细胞支架，能满足现代医学对敷料的要求，本发明医用敷料中的种子细胞通过基因重组技术，实现局部PDGF-BB生长因子高表达、强分泌，与复合细胞外基质共同调控溃疡微环境，达到修复重建的效果。
文档编号A61L15/28GK101125216SQ200710058738
公开日2008年2月20日 申请日期2007年8月14日 优先权日2007年8月14日
发明者于德民, 卫丽君, 丹 宋, 张新歌, 张绍敏, 李兰英, 李朝兴, 毋中明, 鑫 王, 超 郑 申请人:天津医科大学代谢病医院