专利名称：：仿生磷脂聚合物细胞膜及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属高分子材料膜
技术领域：
，涉及一种新型模拟组织细胞膜及其制备方法和在药物渗透中的应用。
背景技术：
：生物利用度是衡量一种药物能否开发成有效的临床药物的重要指标之一。药物的生物利用度受一系列因素的影响，具有关报道，80%的药物通过肠上皮细胞的被动扩散渗透进入血液。有研究表明，吸收性的数据能够用于早期药物开发中的体外活性分析。近十余年来，国外已普遍采用组织细胞模型作为药物吸收性研究的工具，主要有Caco-2细胞单层模型、MDCK细胞模型和BBMEC模型等。Caco-2细胞模型来源于人的结肠癌细胞，是著名的小肠吸收模型，该模型的研究结果与体内药物的处置有较好的相关性。Caco-2细胞模型现已被认可为小分子药物口服吸收的体外筛选模型，已为发达国家的药物研究机构或开发公司广泛采用。MDCK细胞模型来源于犬科动物的肾细胞，可以形成紧密结合的单细胞层。BBMEC模型，在建立初期即成为血脑屏障研究的重要工具，至今仍被应用。是目前模拟血脑屏障的最常用的体外模型。上述细胞模型在使用时均需要实验室培养，传统的培养方法需要培养至少21天才具有模拟细胞膜的性质，不同研究者建立细胞模型的方法存在一些差异，不同实验室对同一模型的评价结果也可能不尽相同，除此之外，还存在储存时间短，操作麻烦，成本高等缺陷。建立一种用于分析药物渗透和吸收性的体外仿生膜模型已成为世界药物学家关注的前沿。2002年7月在旧金山召开了第一届人工膜渗透性研究的国际会议，会上介绍了一种新的人工膜PAMPA模型，但该模型尚存在不足之处，主要在于(l)PAMPA价格虽然比Caco-2细胞模型低，但此模型自动化程度高，对少量样品的试验来说，其成本较大，对于普通实验室的少样测试不方便；(2)PAMPA是溶液成膜，会对某些试验测试造成误差；(3)PAMPA是小分子磷脂制成的双分子膜，很不稳定，不仅影响膜的稳定性，还影响药物检测的结果；(4)目前PAMPA采用卵磷脂膜以模拟肠的吸收性能，模拟的细胞膜部位尚嫌单一。-CH2、CH—COOHH3N+
发明内容本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜及其制备方法。本发明的另一目的是提供上述仿生磷脂聚合物组织细胞膜在药物吸收中的用途。本发明自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜含有疏水性脂肪烃端和亲水性磷脂基团齐聚物，所述仿生膜其单体包括含亲水性磷脂极性头部端基和疏水性脂肪烃尾部链段，其齐聚物作为成膜聚合物的原料。所述的齐聚物包括a,b，c三类齐聚物，各由R1，R2，R3三部分组成,其中Rl代表各种不饱和烷烃，，R2代表不同链长的脂肪烃，R3代表不同磷脂极性基团，每部分均可根据需要进行调节。所述的a类齐聚物具有式I的化学结构-R1R2R3所述的b类齐聚物具有式II的化学结构为所述的C类齐聚物具有式ffl的化学结构为:0——CH2~^~CF2+CH2—0-\7n0■P—0IIoZCH2zNH3IIH\c3H<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>上述齐聚物的特征在于原料中水份为01%;分子量为10009xl(f;疏水链段碳原子或氟原子或硅原子的数目为820;极性磷脂含量为O.lwt%99wt%。所述的亲水性的磷脂基团或其衍生物连接端基含有双键的疏水性脂肪烃上，合成出能自组装形成与生物膜非常相似的结构。所述的连接端基含有双键的不饱和疏水性脂肪烃，包括脂肪链或硅氧烷链或氟碳链。所述的亲水性的磷脂基团或其衍生物(式IV)选自卵磷脂，脑磷脂，肌醇磷脂，丝氨酸磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>IV其中X基团和磷脂的名称如表1所示。是的。表l式(IV)x基团和磷脂的名称<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>所述的亲水性的磷脂基团或其衍生物具备下述带电荷的磷脂结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本发明的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法基于下列原则-分子生物学理论表明，细胞膜结构具有亲水的头、疏水的尾，膜中磷脂呈液晶结构，这种结构容许离子传递和分子运动。将极性磷酸胆碱基或其衍生物引入疏水脂肪链上，这种材料在水溶液中或在生理条件下可以自组装成亲水头、疏水尾的结构。材料自组装以后，将疏水链末端的双键打开，使分子间疏水端縮合，从而保证了疏水链始终在内部，亲水端始终在表面。这种磷脂聚合物保证了材料在成膜以后，更好模拟组织细胞膜的结构和性能。本发明通过控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烃端的长度和磷脂含量，调节合成磷脂聚合物的稳定性和弹性，制备仿生膜。本发明的显著特色体现在合成的磷脂聚合物含有阴阳两性端基和垸烃非极性分子链，这使得磷脂聚合物容易自组装形成与生物膜非常相似的微观非均相结构。这种自组装使得磷脂聚合物容易自动形成液晶态，表现出液晶行为。由于两性端基的存在，磷脂聚合物的分子形态随着周围环境pH值的变化而变化，因而表现出环境敏感性，当周围环境pH值在26.5时，表现为脂质双分子层样结构，周围环境pH值在7.310.5时，表现为单分子层，厚度〈0.75mm，周围环境pH值在MO.5时，表现为双分子层微管，厚度X).75mm，可以调节渗透液体的PH值的大小，而模拟不同器官组织的pH值变化。本发明用磷脂聚合物在疏水链上引入不同极性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、丝氨酸磷脂和二棕榈酰磷脂酰胆碱等，根据含不同磷脂的聚合物为主要成膜材料建立不同靶目标的模拟细胞膜药物渗透模型。如含卵磷脂的磷脂聚合物为主要成膜材料可以构建肠吸收渗透模型，含脑磷脂的磷脂聚合物为主要成膜材料可以构建血脑屏障BBB渗透吸收模拟模型。图1磷脂聚合物在水溶液中可能的形态。图2PAMPA-CN的工作示意图。图3PAMPA-CN模型与Caco-2细胞/DS-PAMPA渗透性值比较。具体实施例方式下面以实施例对本发明加以进一步的说明，但是不限制本发明的内容。实施例l:磷脂聚合物的制备方法(1)a.按式(V)的路线合成单体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(V)称取一定量脂肪族二元醇，三乙胺溶于干燥的四氢呋喃中，冷却至O'C，搅拌缓慢滴加一定量甲基丙稀酰氯，保持温度在03r，混合物升温至5(TC反应2h,经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，展开剂为乙酸乙酯/正己烷:20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50。称取一定量甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯,三乙胺溶于千燥的四氢呋喃中，冷却至-2(TC，一定量COP溶于干燥的四氢呋喃中，搅拌缓慢滴加溶液，保持温度在-20-3CTC3h，经过滤，洗涤，干燥得单体中间体无色液体。称取一定量单体中间体和干燥乙腈，冷却至-2(TC，快速向溶液中加入无水三甲胺，混合物升温至6(TC反应16h,冷却至-2(TC，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。所述合成仿生膜单体的一般具有式(VI)的结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(VI)其中n=820，X基团和磷脂名称如表l所示。或，b.按式(VD)的路线合成单体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(VII)称取一定量(S)-1-酰基_2-苄基甘油，三乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，冷却至O'C，搅拌缓慢滴加一定量氯乙氧基磷酰二氯，保持温度在05'C，混合物反应4h，经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体(S)-1-酰基-2-苄基-6-氯磷脂，展开剂为乙酸乙酯/正己烷20/80和乙酸乙酯/正己烷50/50。称取一定量(S)-1-酰基-2-节基-6-氯磷脂，三甲胺溶于干燥的乙醇/氯仿混合溶液中，密封混合物升温至607(TC反应60h，冷却至-2(TC，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。(2)按式(VID)的路线制备齐聚物2007<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>一定量的单体在引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)存在下507(TC反应1024h，得到齐聚物产物。实施例2精确称取1，8-辛二醇28.76g(0.197mol)'三乙胺33.lg(0.327mol)溶于200mL干燥的四氢呋喃中，冷却至0t:，搅拌缓慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g(0.197mol)，保持温度在03'C，混合物升温至5(TC反应2h，经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体甲基丙稀酸辛二醇酯，展开剂为乙酸乙酯/正己垸20/80和乙酸乙酯/正己烷50/50。精确称取甲基丙稀酸辛二醇酯32.96g(0.154mol),15.6g三乙胺(0.154mol)溶于200mL干燥的四氢呋喃中，冷却至-2(TC，21.9g(0.154mol)COP溶于lOOmL干燥的四氢呋喃中，搅拌缓慢滴加溶液，保持温度在-20-3(TC3h，经过滤，洗涤，干燥得2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyloxy)ethylmethacrylate无色液体。精确称取2-(2-oxo-l，3，2-diox印hospholoyloxy)ethylmethacrylate5.0g禾口30ml干燥乙腈，冷却至-2(TC，快速向溶液中加入2ml无水三甲胺，混合物升温至6(TC反应16h，冷却至-2(TC，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。称量适当的磷脂聚合物单体和AIBN溶于甲醇一四氢呋喃混合液中置入聚合试管中，氮气保护下封闭试管，试管60'C振荡反应16h，冷却停止反应，减压收集得到磷脂聚合物。实施例3精确称取1，9-壬二醇31.52g(0.197roo1),三乙胺33.lg(0.327mol)溶于200mL干燥的四氢呋喃中，冷却至0'C，搅拌缓慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g(0.197mol)，保持温度在03'C，混合物升温至50'C反应2h，经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体甲基丙稀酸辛二醇酯，展开剂为乙酸乙酯/正己烷20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50。精确称取甲基丙稀酸辛二醇酯34.25g(0.154mol)，15.6g三乙胺(0.154mol)溶于200mL干燥的四氢呋喃中，冷却至-20°C，21.9g(0.154mol)COP溶于lOOmL干燥的四氢呋喃中，搅拌缓慢滴加溶液，保持温度在-20-3(TC3h，经过滤，洗涤，干燥得2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyloxy)ethylmethacrylate无色液体。精确称取2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyioxy)ethylmethacrylate5.0g禾口30ml干燥乙腈，冷却至-2(TC，快速向溶液中加入2ml无水三甲胺，混合物升温至6(TC反应16h，冷却至-2(TC，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。称量适当的磷脂聚合物单体和AIBN溶于甲醇一四氢呋喃混合液中置入聚合试管中，氮气保护下封闭试管，试管6(TC振荡反应16h，冷却停止反应，减压收集得到磷脂聚合物。实施例4将少量的合成的含卵磷脂聚合物放置在P層PA-CN的微孔上，PAMPA-CN由上下两个腔室组成，上层为供体液(缓冲溶液和药物)，下层为接收液(缓冲溶液)，缓冲溶液由50mM磷酸钠(pH6.0-7.5)，50mM柠檬酸钠(pH3.0-5.5)，50mM硼酸钠(pH8.0-10.0)组成，3(TC培养215小时形成卵磷脂聚合物仿生细胞膜。接收液中溶液的浓度由UV光谱来测量。少量测试磺胺撒克西啶，诺福克，双氢克尿塞，立痛定，心得安，戊脉安等几种药物渗透率分别为16.0，45.0，16.0，128.0，133.0,148.0nm/s。研究结果表明，构建的模型与Caco-2细胞模型有相似的药物渗透吸收功能，通过比较发现，采用该模型得出的参数与体内药物特别是那些被动吸收的药物的研究结果有较大的相关性。本发明的建立不同靶目标的模拟细胞膜模型是与体内实验数据或药物参数比较，建立模拟模型公式P^dC/ACodT;P—渗透率，V—接受液体积，A—膜表面积，Co—供体液浓度，dC/dT—浓度变化速率。通过人工膜的表观渗透率由方程计算。其计算公式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>Vdn(ml)=供体槽的体积(0.2ml),Vac(ml)=接受槽的体积(0.30or0.35ml),Cac=接收槽在加入药物孵化后的浓度(mM)，Cdo-供体槽最初的浓度(mM)，S(cm2)=膜的面积(0.3cm2)，t(s)-孵化时间.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(4)户m是膜的渗透性,尸o是未解离样品固有的渗透性，p尺a是解离常数111"、尸am是表观渗透性，UWL表示不搅拌水层。联合G)—(5)得到:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(7)实施例5将几种卵磷脂聚合物溶解于十二垸中配制成0.2mg/ml溶液，准确取4ul磷脂聚合物溶液放置在PAMPA-CN的微孔上，PAMPA-CN由上下两个腔室组成，上层为供体液(缓冲溶液和药物)，下层为接收液(缓冲溶液)，缓冲溶液由50mM磷酸钠(pH6.0-7,5)，50mM柠檬酸钠(pH3.0—5.5)，50mM硼酸钠(pH8.0-10.0)组成，30。C培养215小时形成卵磷脂聚合物仿生细胞膜。接收液中溶液的浓度由UV光谱来测量。少量测试诺氟沙星，法莫替丁，阿替洛尔，西米替丁，布洛芬等几种药物的渗透率。研究结果表明，几种合成磷脂的药物渗透性能与商用PAMPABLM-0磷脂模型有相似的药物渗透吸收功能，通过比较发现，采用该模型得出的参数与体内药物特别是那些被动吸收的药物的研究结果有较大的相关性。渗透率计算公式同实施例5。表2是四种不同磷脂在pH7.4下的渗透率。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、仿生磷脂聚合物细胞膜，其特征在于含有疏水性脂肪烃端和亲水性磷脂基团齐聚物，其单体包括含亲水性磷脂极性头部端基和疏水性脂肪烃尾部链段，其齐聚物作为成膜聚合物的原料。2、按权利要求1所述的仿生磷脂聚合物细胞膜，其特征在于所述的亲水性磷脂选自卵磷脂，脑磷脂，肌醇磷脂，丝氨酸磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱；所述的疏水性包括脂肪链或硅氧烷链或氟碳链等。3、按权利要求1所述的仿生磷脂聚合物细胞膜，其特征在于所述的疏水性脂肪烃尾部链段是不饱和烃链。4、按权利要求1所述的仿生磷脂聚合物细胞膜，，其特征在于所述的亲水性的磷脂基团带电荷。5、按权利要求1所述的仿生磷脂聚合物细胞膜，其特征在于其分子形态随环境pH值变化，当pH值为26.5时，表现为脂质双分子层样结构;pH值为7.310.5时，表现为单分子层；pH值〉10.5时，表现为双分子层微管。6、按权利要求5所述的仿生磷脂聚合物细胞膜，其特征在于所述分子形态为单分子层时其厚度〈0.75mm，分子形态为双分子层时其厚度>0.75mm。7、权利要求1的仿生磷脂聚合物细胞膜的制备方法，其特征在于通过控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烃端的长度和磷脂含量，调节合成磷脂聚合物的稳定性和弹性。8、按权利要求7的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)单体制备取脂肪族二元醇，三乙胺溶于干燥四氢呋喃，冷却至O'C，搅拌滴加甲基丙稀酰氯，温度为03'C，混合物升温至50'C反应2h，过滤，洗涤，层析柱分离得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯液体，展开剂为乙酸乙酯/正己垸20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50;取甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，三乙胺溶于干燥四氢呋喃中，冷却至-20。C，一定量COP溶于干燥四氢呋喃中，搅拌滴加溶液，温度为-20-30'C，3h，过滤，洗涤，干燥得单体中间体无色液体；取单体中间体和干燥乙腈，冷却至-20'C，向溶液中加无水三甲胺，混合物升温至608(TC反应1650h，冷却至-2(TC，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体；(2)齐聚物制备上述单体在引发剂偶氮二异丁腈存在下507(TC反应1024h，得到齐聚物产物。9、按权利要求8的方法，其特征在于所述齐聚物原料中水份为01%;分子量为10009xl06;疏水链段碳或氟或硅原子的数目为820;极性磷脂含量0.l90wt%;玻璃转化温度为3773.2°C;接触角为70°120°。10、权利要求1的仿生磷脂聚合物细胞膜在制备建立不同靶目标的模拟细胞膜模型中的用途。11、按权利要求10的用途，其中所述的建立不同靶目标的模拟细胞膜模型是卵磷脂基仿生膜建立小肠模拟细胞膜模型，或脑磷脂基仿生膜建立脑组织模拟细胞膜模型，或肌醇磷脂基仿生膜建立胃组织模拟细胞膜模型以及各磷脂基的调控与组合模拟人体各种组织器官模拟模型如皮肤或口腔粘膜模型。12、按权利要求10的用途，其中所述的建立不同靶目标的模拟细胞膜模型是与体内实验数据或药物参数比较，建立模拟模型公式P=VdC/ACodT;其中，P—渗透率，V—接受液体积，A—膜表面积，Co—供体液浓度，dC/dT一浓度变化速率；通过人工膜的表观渗透率由方程计算，其计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>F/mx%=-x-x100Vdn(ml)=供体槽的体积(0.2ml)，(0.30or0.35ml)，Cac=接收槽在加入药物孵化后的浓度(mM)，(mM)，(1)(2)Vac(ml)=接受槽的体积Cdo=供体槽最初的浓度S(cm2)=膜的面积(0.3cm2),t(s)-孵化时间.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(4)Pm是膜的渗透性，尸o是未解离样品固有的渗透性，p尺a是解离常数111"、尸am户mWPam是表观渗透性，UWL表示不搅拌水层，联合(3)_(5)得到:1i+1oh1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(7)全文摘要本发明属高分子材料膜
技术领域：
，提供了一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜及其制备方法和在药物吸收中的用途。本发明克服现有技术的缺陷，将亲水性的磷脂基团或其衍生物连接端基含有双键的疏水性脂肪烃上，合成出能自组装形成与生物膜非常相似的微观非均相结构。本发明的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜稳定，储存时间长，成本低，制备方法简单快速。本发明构建的模型与Caco-2细胞模型有相似的药物渗透吸收功能，通过比较发现，采用该模型得出的参数与体内药物特别是那些被动吸收的药物的研究结果有较大的相关性，可以用于药物开发的早期筛选研究。文档编号A61L27/16GK101181647SQ20071012955公开日2008年5月21日申请日期2007年6月30日优先权日2006年7月18日发明者晖于,刘培峰,钧张,段友容,许金萍,鄢祝兵申请人:上海市肿瘤研究所