癌抑制剂的制作方法

专利名称：：癌抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种癌抑制基因及由该基因编码的蛋白质的医药用途。
背景技术：
：很早就已经知道，癌症的发病起因于细胞蛋白质的变异或数量的变化。近年来，基因工程学的发展使编码特定蛋白质的基因的扩增或分析癌细胞中的基因变异成为可能，给癌研究领域也带来了飞跃性的发展。截止目前，还在持续地进行关于细胞癌化、癌细胞异常增殖的所谓癌基因的分析和鉴定。另一方面，因变异或表达下降导致癌化的癌抑制基因在近几年备受注目，迄今为止，作为癌抑制基因，已经发现了视网膜母细胞瘤的Rb基因、大肠癌的p53基因和APC基因、Wilms肿瘤的WT1基因等等。也报道了使用WT1基因的癌抑制剂(专利文献1)。而且，已经逐渐明确，癌的发生、恶性化发展、转移等并不是仅仅涉及一个基因的异常，而是涉及到多个基因的异常，并认为，还存在着更多的未鉴定的癌基因或癌抑制基因。虽然对具有癌抑制效果的基因已经了解了很多，但多数情况下，迄今其筛选鉴别的方法或者是通过将染色体DNA进行染色而将患者基因的变异可视化后进行检测(非专利文献1)，或者是通过LOH(杂合性缺失，LossofHeterozygosity)分析而选定一个大致的基因缺失范围以后、再逐渐縮小到重要的基因区(专利文献2)。可是，这些方法的缺点是其需要判别的DNA缺失区域非常大，縮小精简到重要的基因区域的工作需要花费大量的时间和劳力，因此，其作为探测癌抑制基因的方法是有局限的。而且，采用现有的基因进行的癌病变的分离、识别方法对恶性程度的判定是非常困难的。专利文献1:WO2003/002142号公报。专利文献2:WO01/032859号公报。非专利文献1:YasuhideYamashita,etal.,WorldJGastroenterol,11(33):5129-5135,2005。
发明内容发明所要解决的技术问题本发明的课题是通过替代现有方法的新方法检测出癌抑制基因而提供一种含有该癌抑制基因的癌抑制剂。本发明另外的一个课题是提供一种含有该癌抑制基因编码的蛋白质的癌抑制剂。本发明的进一步课题是提供一种通过检测该癌抑制基因的存在量或表达量而诊断癌症患者病变的恶性程度的方法。解决问题的手段为解决上述问题，本发明人对神经胶质瘤(Glioma)病例的DNA的部分缺失区全力进行了探索。神经胶质瘤主要分为星形胶质细胞瘤(Astrocytoma)、少突胶质细胞瘤(Oligodendroglioma)、室管膜瘤(Ependymoma)、恶性程度最高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma)，占全体脑肿瘤的30-40%。本发明人为了鉴定神经胶质瘤中的癌相关基因，采用新开发的阵列CGH(arrayCGH)法(InazawaJ.,etal.,CancerSci.95(7)，559,2004)筛选了癌症中高频缺失的基因。进一步，组合使用cDNA微阵列(cDNAmicroarray)和RT-PCR法鉴定出了神经胶质瘤中从DNA中缺失的、表达被显著抑制的基因，即RGC32(补体32的应答基因，responsegenetocomplement32)基因。进一步，在没有RGC32蛋白质的癌细胞中使RGC32蛋白质表达，结果确定其引发了贴壁依赖性(anchorage-dependent)增殖能力的下降和细胞增殖速度的下降，证实了RGC32蛋白质具有癌抑制基因产物的作用。基于以上这些认识完成了本发明。艮口，根据本发明，本发明提供一种含有RGC32基因或其等同基因的癌抑制剂。优选的是，所述基因或其等同基因被重组入载体中。优选的是，所述载体是病毒载体或动物细胞表达用质粒载体。优选的是，所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、或慢病毒载体。优选的是，所述基因或其等同基因被包封入脂质体中。根据本发明的另外一个方面，提供一种含RGC32蛋白质或其等同蛋白质的癌抑制剂。根据本发明的另外一个方面，提供一种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32基因进行分析的工序，所述分析使用包含RGC32基因全部或一部分的DNA或RNA。优选的是，所述分析是基因变异的检测或基因表达量异常的检根据本发明的另外一个方面，提供一种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32蛋白质进行分析的工序，所述分析使用抗RGC32蛋白质的抗体或其片段。优选的是，所述分析是蛋白质表达量异常的检测。发明效果根据本发明，提供了一种含有新发现癌抑制功能的RGC32基因或含有该基因编码的蛋白质的癌抑制剂。无论是从基于癌症个性的治疗或预后的改善的临床角度考虑，还是从癌症基础研究的角度考虑，这些药剂都是非常有用的。而且，通过测定RGC32基因的信使RNA的表达量，通过确认基因组DNA上RGC32基因的存在，或者通过测定RGC32蛋白质的量，可以预测脑肿瘤患者的病理学恶性程度。图1:表示在22种神经胶质瘤细胞株以及正常人脑中通过RT-PCR检测的MRP63、ALOX5AP、RGC32和F10基因的信使RNA的表达量。用阵列CGH分析确认了标有星号的Marcus细胞在染色体13q处存在有基因缺失。图2:图2A表示在35个神经胶质瘤的临床检体中，用实时RT-PCR法、以GAPDH为对照测定RGC32基因的信使RNA的表达量，显示病理组织学分类上的相关。可以发现，从较低级别(Grade)的弥漫性星形细胞瘤(II级)到多形性胶质母细胞瘤(GBM,IV级)各级别的细胞瘤与RGC32基因的表达呈显著的负相关。图2B是从是否存在p53基因的点突变的角度在每一病理学分类中比较了RGC32基因的表达量，结果显示，在任何同一级别中均存在p53基因的点突变，(在不同的级别之间)没有显著差异；而在存在p53基因的点突变的检体中，RGC32基因的表达量有下降的趋向。图3:图3A表示在不表达RGC32基因的信使RNA的U-373MG细胞中，以p21和GAPDH作为阳性对照，使其感染腺病毒Ad-p53和对照腺病毒Ad-lacZ以后，通过RT-PCR分析的结果。图3B表示采用p53基因同源缺失(p53-/-)的HCT116细胞和正常型(p53+/+)的HCT116细胞，添加引发DNA损伤的阿霉素(ADR)以后，p53、p21基因的Western印迹分析以及对p21、RGC32、以及对照GAPDH基因进行RT-PCR分析的结果。图3C表示RGC32基因的基因组DNA结构的示意图。黑框表示外显子结构，楔形表示p53的应答序列(共有序列，consensussequence)。对RGC32-RE2与实际的p53应答序列进行了比较。大写字母表示与p53应答序列一致的碱基，小写字母表示与其不一致的碱基。R为嘌呤碱基，Y为嘧啶碱基，W表示A或T的碱基。图4:表示将RGC32國RE2、RGC32-RE2X2(RGC32-RE2的2个拷贝)与质粒连接构建为荧光素酶报告质粒(pGL3-RGC32-RE2、pGL3-RGC32-RE2X2)，以p21(pGL3-p53CBS)作为阳性对照，与phRL-TK载体同时将具有SV40最小启动子的野生型p53(pCMV-Tag3-p53)、变异型p53(pCMV-Tag3-p53Mut)或者对照载体(pCMV-Tag3)分别导入SaOS2细胞以后，分别测定3次报告活性的结果。纵轴表示相对于作为阴性对照的空载体pGL3-启动子的相对活性。图5:表示使用HCT116(p53-A)或HCT116(p53+/+)，通过是否添加阿霉素(lpg/ml，24小时)来调制细胞裂解液，将其与抗p53抗体或者与作为对照使用的抗FLAG抗体进行免疫沉淀，以沉淀物为材料检测沉淀物中含有哪种DNA，检测中使用对p21启动子区域、RGC32-RE2、RGC32-RE3特异的引物进行PCR。Input表示使用免疫沉淀前的细胞裂解液的阳性对照。图6:图6A中的左上图表示在没有RGC32基因表达的U—87MG细胞中导入结合Myc的RGC32基因表达载体(pCMV-Tag3-RGC32)或阴性对照(pCMV-Tag3-Mock)48小时以后，采用10貼细胞裂解液，按Western印迹方法通过抗Myc抗体检测外部导入基因的表达情况。图6A中的左下图表示将上述条件下的2种基因导入细胞在培养基中在存在G418的条件下培养3周、用结晶紫染色观察集落形成能力的培养皿的照片。图6A中右图是以直径为2mm以上的集落数来表示集落形成能力的结果，相比于对照，RGC32的表达显著降低了集落形成能力。图6B表示在U—87MG细胞中导入RGC32基因(pCMV-Tag3-RGC32)、阴性对照(pCMV-Tag3-Mock，(空载体))，获得G418抗性克隆(RGC32基因表达克隆有2种)以后，通过水溶性四氮唑盐的色度检测出其细胞增殖速度作为活细胞数量。图7:在没有RGC32表达的U—87MG细胞中导入结合Myc的RGC32基因表达载体(pCMV-Tag3-RGC32)，采用该瞬时表达的细胞，用抗Myc抗体(红)、以及抗P-微管蛋白(tubulin)抗体(绿)、DAPI(兰)分别染色，从间期(interphase)观察至胞质分裂期(cytokinesis)。图7的下段中表示的是将它们合并在一起的荧光显微图像。图8:表示在Dox诱导GFP或GFP-RGC32以后，FACS分析HeLaTet-On细胞的结果。箭头表示4N的峰(G2/M期)。图9:表示在表达GFP或GFP-RGC32的HeLaTet-0n细胞中，用胸腺嘧啶核苷2次解除Gl/S同步以后，FACS分析的结果。箭头表示4N的峰(G2/M期)。其证明，相比于作为对照的表达GFP的细胞，表达GFP-RGC32的HeLaTet-On细胞从M期的进展被延迟。图10:表示在表达GFP或GFP-RGC32的HeLaTet-0n细胞中，用胸腺嘧啶核苷2次解除Gl/S同步以后，对M期磷酸化酶P1K1、细胞周期蛋白Bl、Aurora-A、Aurora-B以及对照P-肌动蛋白分别用它们的抗体按Western印迹法进行检测的结果。图11:表示将GFP-RGC32或GFP的经Dox诱导后的HeLaTet-On细胞裂解液与抗GFP抗体进行免疫沉淀，然后用抗Plkl抗体按Western印迹法进行检测的结果。Celllysate表示的是在细胞裂解液对照中的检测结果。图12:表示先准备RGC32的基因重组蛋白，通过与人重组Plkl、脱磷酸化oc-酪蛋白的组合，用自动放射影象仪(Autoradiography)检测的Plkl磷酸化酶活性的结果。具体实施例方式下面，详细地说明本发明的实施形式和实施方法。(1)本发明的癌抑制剂根据本发明的一个实施形式，本发明的癌抑制剂作为有效成分包含RGC32基因或其等同基因。根据本发明的另外一个实施形式，本发明的癌抑制剂作为有效成分包含RGC32蛋白质或其等同蛋白质。RGC32基因的碱基序列和RGC32蛋白质的氨基酸序列是已知的(BadeaT.C.,NiculescuFI.,SoaneL，ShinM.L.,andRusH，1998),RGC32的碱基序列在NCBI数据库上的注册号为AF16963,而且，RGC蛋白质的氨基酸序列在同一数据库中的注册号为NP054778。RGC32基因的碱基序列如SEQIDNO:1所示，RGC32蛋白质由SEQIDNO:1的碱基序列的第147至第500的区域所编码，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在本说明书中，所谓"RGC32基因"是指由上述碱基序列所限定的来源于人的基因，所谓"RGC32蛋白质"是指该RGC32基因编码的、上述氨基酸序列所限定的蛋白质。RGC基因也可以是本领域技术人员采用公知的技术从培养细胞等中获得的cDNA，或者，也可以是根据本说明书SEQIDNO:l所述的碱基序列通过PCR法等化学合成的。当通过PCR法获取具有SEQIDNO:1所述的碱基序列的DNA的时候，使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板，使用可以扩增SEQIDNO:l所述碱基序列的一对引物进行PCR扩增。可以将PCR扩增的DNA片段克隆进能够在大肠杆菌等宿主中扩增的适当的载体中。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等等操作对于本领域技术人员来说均是已知的，例如，可以参照分子克隆试验手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989，或CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,JohnWiley&Sons(1987-1997)等记载的方法进行。在本发明中，所谓"RGC32基因的等同基因"是指具有在SEQIDNO:l所述碱基序列中l个至多个碱基缺失、添加或取代的、编码具有癌抑制活性的蛋白质的碱基序列的基因；或者是具有与SEQIDNO:l所述碱基序列在严谨(Stringent)条件下杂交的、编码具有癌抑制活性的蛋白质的碱基序列的基因。此外，RGC32基因的等同基因也包括RGC32基因的片段。上述"在SEQIDNO:1所述碱基序列中1个至多个碱基缺失、添加或取代的碱基序列"表述中，对"l个至多个"的范围并不作特别限定，例如，其意指1个至60个，优选为1个至30个，更优选为1-20个，进一步优选为1至10个，特别优选为1至5个左右。对上述的"癌抑制活性"不作特别限定，优选是指与RGC32蛋白质所具有的癌抑制活性实质相同或更强活性的癌抑制活性(下面的本说明书中的"癌抑制活性"同样表示此含义)。因此，"RGC32基因的等同基因"只要具有上述定义的结构和功能，不拘来源，也可以来源于人以外的哺乳动物，也可以是对来源于人等哺乳动物的基因人工导入变异的基因。但是，当该基因用作后述的癌抑制剂时，从临床安全性的角度考虑，优选为来源于人的基因。上述"具有在SEQIDNO:1所述碱基序列中1个至多个碱基缺失、添加或取代的、编码具有癌抑制活性的蛋白质的碱基序列的基因"可以通过化学合成、基因工程方法或诱发突变等本领域技术人员已知的任意方法进行制备。具体地，利用具有SEQIDNO:l所示的碱基序列的DNA，通过在这些DNA中导入变异即可以获得上述基因。例如，对于具有SEQIDNO:1所示的碱基序列的DNA，可以采用与作为变异原的药剂接触的方法、采用紫外线照射的方法、采用基因工程的方法等等来进行。作为基因工程的方法之一，定点诱变由于可以在特定位置引入特定变异而非常有用，可以参照分子克隆试验手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989，或CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,JohnWiley&Sons(1987-1997)等记载的方法进行。上述"在严谨条件下杂交的碱基序列"是指将DNA作为探针使用、采用集落杂交法(colonyhybridization)、空斑杂交法(pl叫uehybridization)、或者DNA印迹杂交(Southernblot)而得到的DNA序列。例如，可以列举的是以下述方法鉴定获得的DNA:采用将来源于集落或空斑的DNA或该DNA片段固定化的过滤膜，在0.7-1.0M的NaCl存在下，在65"C下进行杂交以后，使用0.1-2XSSC溶液(1XSSC溶液为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65"条件下清洗过滤膜。杂交可以参照分子克隆试验手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989等记载的方法进行。在严谨条件下杂交的DNA可以列举与作为探针使用的DNA碱基序列具有一定程度以上同源性的DNA，例如，具有70%以上，优选80%以上，更优选90%以上，进一步优选93%以上，特别优选95%以上同源性的DNA。上述的所谓"具有与SEQIDNO:1所述碱基序列在严谨条件下杂交的、编码具有癌抑制活性的蛋白质的碱基序列的基因"，如上所述，可以在一定杂交条件下通过采用集落杂交法、空斑杂交法、或者DNA印迹杂交(Southernblot)而进行。在本发明中，所谓"RGC32蛋白质的等同蛋白质"是指具有在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中1个至多个氨基酸的缺失、取代和/或插入的、具有癌抑制活性的氨基酸序列的蛋白质。或者是指具有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性、具有癌抑制活性的氨基酸序列的蛋白质。上述"在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中1个至多个氨基酸的缺失、取代和/或插入的氨基酸序列"的表述中，对"l个至多个"的范围并不作特别限定，例如，其意指1个至20个，优选为l个至10个，更优选为l-7个，进一步优选为1至5个，特别优选为1至3个左右。上述所谓"与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性的氨基酸序列"，是指该氨基酸序列与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的同源性至少为70%以上，优选为80%以上，更优选为90%以上。RGC32蛋白质可以是天然来源的蛋白质，也可以是化学合成的蛋白质，还可以是经基因重组技术制备的重组蛋白质。从相对容易操作和可以大量制备的角度考虑，优选为重组蛋白质。天然来源的蛋白质可以从表达该蛋白质的细胞或组织中适当组合蛋白质的分离、纯化方法而进行分离。化学合成的蛋白质例如可以按照Fmoc(9-笏甲氧羰基法)、tBoc(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。而且，也可以利用市场上销售的各种多肽合成仪合成本发明的蛋白质。重组蛋白质则通过将含有编码该蛋白质的碱基序列(例如SEQIDNO:1所示的碱基序列)的DNA导入到适当的表达系统中而进行生产。另外，对于含有在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中1个至多个氨基酸的缺失、取代和/或插入的氨基酸序列的蛋白质、或者含有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质而言，本领域技术人员根据作为编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的DNA序列的例示之一的SEQIDNO:1所示的碱基序列信息，可以适当地制备或获得。本发明的癌抑制剂的优选实施方式是作为有效成分，包含有将上述RGC32基因或其等同基因导入载体中而获得的重组载体。作为载体可以使用病毒载体或动物细胞表达用载体，优选使用病毒载体。作为病毒载体可以列举逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体等。其中，由于逆转录病毒载体在感染细胞以后病毒基因组整合到宿主染色体中，从而可以使导入到载体中的外源基因稳定、长期地表达，所以特别优选使用逆转录病毒载体。动物细胞表达用载体例如可以采用pCXN2(Gene，108,193-200，1991)或PAGE207(特开平6-46841号公报)或其变体等。将上述重组载体导入到适当的宿主中进行转化，培养得到的转化体即可以生产上述重组载体。当重组载体为病毒载体时，导入该载体的宿主细胞可以采用具有病毒生产能力的细胞，例如，C0S-7细胞、CHO细胞、BALB/3T3细胞、HeLa细胞等等。逆转录病毒的宿主可以使用WCRE、WCRIP、MLV等；腺病毒载体及腺病毒伴随载体的宿主可以是来源于人胎儿肾脏的293细胞等。病毒载体向动物细胞的导入可以采用磷酸钙法等。而在重组载体是动物细胞表达用载体的时候，用来导入该载体的宿主可以使用大肠杆菌K12株、HB101株、DH5oc株等，大肠杆菌转化是本领域技术人员公知的。将得到的转化体分别在合适的培养基、培养条件下培养。例如，大肠杆菌转化体的培养可以使用含有对生长发育必需的碳源、氮源、无机物以及其它物质的pH5-8左右的液体培养基来进行。培养通常在15-43'C下培养约8-24小时左右。此时，在培养结束以后，可以通过通常的DNA分离纯化方法制得目的重组载体。另外，动物细胞转化体的培养例如可以使用包含约5-20%胎牛血清的199培养基、MEM培养基、DMEM培养基等培养基进行培养。培养基的pH优选为约6-8。培养通常在30-4(TC下培养约18-60小时左右。此时，由于含有该载体的病毒粒子释放于培养上清中，可以经病毒粒子浓縮、氯化铯离心纯化法、聚乙二醇沉淀法、过滤浓縮法等等制备目的重组载体。本发明的癌抑制剂中，作为有效成分包含RGC32基因或其等同基因的癌抑制剂(下面称为基因治疗剂)，可以将作为有效成分的RGC32基因或其等同基因与基因治疗剂中通常使用的基剂一起混合而制得。而且，当将RGC32基因或其等同基因重组入病毒载体中时，制备含有重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂一起混合。上述基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钠和无机盐的混合物等的盐溶液、甘露糖醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、表面活性剂等助剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式调制为注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备为使用时溶解的制剂。本发明中的基因治疗剂可以在由常用方法制备的脂质体悬浊液中添加RGC32基因、冻结后融化而制得。制备脂质体的方法有薄膜震荡法、超声波法、反相蒸发法、表面活性剂去除法等。优选在超声波处理脂质体悬浮液以后添加基因，这样可以提高基因的包装效率。包封有基因的脂质体可以直接或悬浮在水、生理盐水等中而静脉给药。上述基因治疗剂的给药形态可以是通常的静脉内、动脉内等的全身给药，或者也可以是相对于癌原病灶或预想的转移部位进行局部注射或经口给药等局部给药方式。当给与基因治疗剂时，也可以采取对插管技术、基因导入技术、或者外科手术等进行组合的给药形式。虽然上述基因治疗剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成人每日给与重组基因的重量在l吗/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内。优选为从10吗/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。给药次数不作特别限定。本发明的癌抑制剂中，含有有效成分为RGC32蛋白质或其等同蛋白质的癌抑制剂(下面称为蛋白质制剂)以含有作为有效成分的RGC32蛋白质或其等同蛋白质和制剂用添加剂(例如载体、赋形剂等)的药物组合物的形式提供。对上述蛋白质制剂的形式不作特别限定。经口给药的制剂例如可以列举片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、液剂、糖浆剂等；非经口给药的制剂例如可以列举注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、粘膜吸收剂、经皮吸收剂等等。上述蛋白质制剂的给药途径不作特别限定。可以是经口给药或非经口给药(例如肌肉给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药等的粘膜给药或吸入给药等等)的任意一种。虽然上述蛋白质制剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成人每日在0.001pg/kg体重至1000^ig/kg体重左右的范围内。优选为从0.001pg/kg体重至100pg/kg体重左右的范围内。对给药次数不作特别限定。可以将上述癌抑制剂(包含基因治疗剂和蛋白质制剂两种形式)以其有效量向人或哺乳动物给药从而用于抑制癌症。也可以将上述癌抑制剂以其有效量向人或哺乳动物给药从而用于预防或治疗癌症。本说明书中所说的"癌抑制"意指具有防止癌的发生、转移、着床的预防作用、以及具有抑制癌细胞增殖、通过縮小癌来阻止癌症的发展、使症状改善等的治疗作用的包括这两方面的最广泛的含义，任何情形下均不作限定性的解释。作为本发明的癌抑制剂的适用对象的癌的具体例子可以列举为例如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、输尿管肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳房癌、肝癌、胰腺癌、睾丸癌、上颌癌、舌癌、唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、白血病、真性多血症、神经胚细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附件癌、皮肤转移癌、皮肤黑色素瘤等等，但是，并不仅仅限于这些。上述中尤其优选的适用对象是脑肿瘤。(2)采用RGC32基因的癌诊断方法
技术领域：
：本发明的癌诊断方法可以列举癌的恶性程度的诊断方法、筛选本发明的癌抑制剂的适用对象的癌症的诊断方法等。本发明的癌诊断方法包括对检体试样中的RGC32基因进行分析的工序，所述分析使用包含RGC32基因全部或一部分的DNA或RNA。这里，所谓"RGC32基因的一部分"意指在SEQIDNO:1所示RGC32基因的碱基序列中例如由约10-30个连续碱基序列组成的寡核苷酸。所谓检体试样可以采用疑似肿瘤的组织切片、血液、淋巴液、咳痰、肺清洗液、尿、便、组织培养上清等等。上述所谓"筛选本发明的癌抑制剂的适用对象的癌症的检测"是指检测在组织中是否存在本发明的癌抑制剂可以进行有效的作用的癌。通过使用包含RGC32基因全部或一部分的DNA或RNA作为引物或探针来分析检体试样中RGC32基因来进行癌诊断。这里，所谓"分析RGC32基因"具体地是指基因组DNA中该基因缺失的检测或基因表达量异常的检测。在基因变异的检测中，当将上述DNA或RNA用作引物时，例如，将选择的2种序列作为引物，通过PCR法扩增由检体试样制备的DNA的部分序列，确认其是否存在，或者可以直接确认扩增产物序列，或者将其重组入各种质粒载体以后确认其序列。另外，可以使用包含上述RNA序列的探针通过Northern杂交或RT-PCR(反转录PCR)法进行基因表达量异常的检测。(3)使用RGC32蛋白质抗体或使用其片段的癌诊断方法
技术领域：
：本发明的癌诊断方法包括对检体试样中的RGC32蛋白质的量进行分析的工序，所述分析使用抗RGC32蛋白质的抗体或其片段。本方法中所使用的抗RGC32蛋白质的抗体(下面称为RGC32抗体)可以以RGC32蛋白质的全部或一部分作为抗原、按通常的方法制备而成。所谓"RGC32蛋白质的一部分"是指由SEQIDNO:2所示RGC32蛋白质的氨基酸序列中例如至少6个连续的氨基酸、优选至少约8-10个氨基酸、进一步更优选至少约11-20个氨基酸组成的多肽。作为抗原的RGC32蛋白质的全部或一部分的制备方法可以是生物学方法或化学合成方法中的任意一种。可以通过将上述抗原多次接种于小鼠、豚鼠、兔等动物的皮下、肌肉内、腹腔内、静脉内等，充分免疫以后，从该动物采血、进行血清分离来制备多克隆抗体。可以通过将用上述抗原进行免疫的小鼠的脾细胞和市售的小鼠骨髓瘤细胞通过细胞融合制得杂交瘤以后，从该杂交瘤的培养上清或给与该杂交瘤的小鼠腹水中制得单克隆抗体。通过采用按上述方法制得的RGC32蛋白质抗体或其片段可以分析检体试样中RGC32蛋白质的表达量。测定可以使用免疫印迹法(immuneblot)、酶联免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光抗体法、免疫细胞染色等等免疫学方法、或者蛋白质印迹(westernblot)法等等。这里，所谓"RGC32蛋白质抗体的片段"是指该抗体的单链抗体片段(scFV)等。检体试样可以采用疑似肿瘤的组织切片、血液、淋巴液、咳痰、肺清洗液、尿、便、组织培养上清等等。当测定的检体试样中的RGC32蛋白质的表达量降低的时候，其显示在检体组织或细胞中RGC32基因的表达被抑制，可以筛选作为本发明的癌抑制剂的适用对象的癌。下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不特别限定于以下这些实施例。实施例(1)试验材料来源于神经胶质瘤的细胞株有A-172、AM-38、Becker、GB-1、KALS-1、KINGS-1、KNS-42、KNS-60、KNS誦81、KNS-89、KS-1、Marcus、NMC-G1、no.10、no.11、SF126、T98G、U-251MG、YH陽13、YKG-1，获自于日本医药基础研究所(JCRB)。U-373MG、U-87MG、SaOS2获自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。宫颈癌的HeLaTet-On细胞获自于Clontech公司。大肠癌细胞株HCT116(p53+/+)禾口HCT116(p53-A)由BertVogelstein博士友情馈赠。将这些细胞株在10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100|ig/ml链霉素存在下在DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium)培养基中进行培养。来源于临床检体的35人的星形细胞肿瘤样本获自于东京医科齿科大学医院脑神经外科。其使用得到了各患者的同意并得到各组织的伦理委员会的认可。根据苏木精-曙红染色的发病时期分类按世界卫生组织(WHO)的标准进行。在35个肿瘤样本中，8种被认为是较低级别的弥漫性星形细胞瘤(II级)，8种属于间变性星形细胞瘤(III级)，19种属于多形性胶质母细胞瘤(GBM,IV级)。表1总结了来源于神经胶质瘤的细胞株的组织信息。表1来源于神经胶质瘤的22种细胞株<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*衍生自各细胞的原发癌的组织学亚型(2)通过表达分析微阵列法分离神经胶质瘤来源的细胞中的低表达基因对于阵列CGH方法，采用MCGCancerArray-800(SaigusaK.,etal.，CancerSci.96,676,2005)，对来源于22种神经胶质瘤来源的细胞进行DNA扩增和缺失基因的筛选。此时在13号染色体长臂上观察到了高频的半合性缺失。因此，采用来源于正常人脑和Marcus细胞的RNA，用能够观察人的30，000个基因表达量的AceGeneHumanoligochip30K(DNA芯片研究所)进行信使RNA的表达分析，探索13号染色体长臂中的低表达基因。采用Oligo(dT)12-18引物制备出加入了氨酰-dUTP(Ambionlnc.)互补链DNA(complimentaryDNA)以后，与对氨酰基具有反应性的Cy3(Marcus)、Cy5(正常人脑，AmershamBioscience)进行结合反应从而进行标记。杂交以后，用GenePix4000B(AxonInstruments)测定信号以后，用GenePixPro6.0软件(AxonInstruments)进行分析。表2表示出了在13号染色体长臂中存在的基因中，和正常人脑相比在Marcus细胞中表达降低的基因。表2由于在染色体13q的缺失而导致表达降低的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*)Cy-3标记Marcus荧光强度/Cy-5标记正常人脑样本荧光强度为了测定包含13号染色体长臂的RGC32的基因的信使RNA的表达量、以及为了测定通过表达分析微阵列法在13号染色体长臂观察到表达量降低的MRP63、ALOX5AP、RGC32、F10基因的信使RNA的表达量，以正常人脑作为对照，对来源于神经胶质瘤的22个细胞株进行RT-PCR(图1)。作为RT-PCR表达量的对照，使用了表达量很难随细胞种类、条件而变化的GAPDH。虽然对RGC32基因以及MRP63、ALOX5AP、F10基因进行了表达分析，但是特别观察到在22株中有21株的RGC32基因的表达显著降低。对35种星形细胞肿瘤(Astrocytoma)样本进行病理学分类，对照采用GAPDH，进行RGC32基因的定量RT-PCR。对8种较低级别的弥漫性星形细胞瘤(II级)、8种间变性星形细胞瘤(III级)、19种多形性胶质母细胞瘤(GBM，IV级)分别进行Student'st-test，结果发现，从II级到IV级，RGC32基因的表达与病理学恶性程度之间呈显著负相关(图2A，p=0.003)。而且，针对代表性的癌抑制基因p53基因的点突变的有无与RGC32基因的表达按每一病理学分类进行了比较(图2B)，其结果显示，p53基因的点突变与级别无关地均会存在，没有显著性差异，但在具有p53基因点突变的细胞株中RGC32基因的表达量显示显著降低的倾向。(3)强制表达p53基因的细胞中的RGC32基因的表达使用其中p53基因不发挥作用的U-373MG细胞株，使其感染表达p53基因的腺病毒，观察RGC32基因的表达。以人(3-半乳糖苷酶(Ad-lacZ)作为对照，在用表达p53(Ad-p53)的病毒分别感染不同的细胞以后，用RT-PCR测定RGC32基因的信使RNA的表达量(图3A)。对照采用GAPDH。p21基因已知是属于随着p53基因的表达而表达上升的基因，经确认，RGC32基因也与p21基因同样地，在被表达p53基因的腺病毒感染以后表达上升。另外，在感染人(5-半乳糖苷酶(Ad-lacZ)的细胞中，没有发现p21基因和p53基因的同时表达上升。(4)DNA细胞中RGC32基因、蛋白质的表达使用具有内源性p53基因的大肠癌细胞株HCT116(p53+/+)与不具有内源性p53基因的大肠癌细胞株HCT116(p53-/-)两者，向细胞中添加1(ig/ml的引发DNA损伤的抗癌剂阿霉素(ADR)以后，用Western印迹法(图3B的上段部分)测定p21、p53蛋白质的表达量、以及用RT-PCR法测定RGC32基因的信使RNA的表达(图3B)。己经公知，通过向细胞给与DNA损伤可以使p53基因、p21基因二者同时表达上升，但是仅在具有正常的p53蛋白质的HCT116细胞(P53+/+)中观察到了该蛋白质的诱导。而且，在添加ADR以后，也仅在具有正常的p53蛋白质的HCT116细胞(p53+/+)中观察到了p21基因、RGC32基因的信使RNA的表达上升。由此结果可以确认，RGC32基因通过正常的p53蛋白质而表达上升。(5)RGC32基因DNA上的p53蛋白质的结合位点确认了RGC32基因的基因组DNA上的碱基序列。研究了由20碱基对左右组成的P-53蛋白质结合位点的存在，确认了具有80%以上的同源性(el國DeiryWSetal.,Nat.Genet.1,45,1992)的10个p53蛋白质的结合位点(图3C)。分别命名为RGC32-RE1至RGC32-RE10。(6)通过报告阵列(reportarray)测定RGC32基因的启动子区域的转录促进效果对RGC32基因的基因组DNA上的10个p53蛋白质的结合位点RGC32-RE1至RGC32-RE10，用萤火虫荧光素酶测定发光物的方法确认启动子活性。在不具有p53基因的SaOS2细胞中，使用pGL3载体(promega)将荧光素酶基因置于下游区，作为启动子分析区域，将包含RGC32-RE1至RGC32-RE10的构建体重组入表达野生型p53蛋白质的载体(p-CMV-Tag3-p53)、作为对照的表达p53变异蛋白质的载体(pCMV-Tag3-p53Mut)和没有p53基因的载体(pCMV-Tag3-mock)，测定酶活性。结果显示，只有RGC32-RE2仅在野生型p53蛋白质表达时荧光素酶活性上升(数据未示出)。然后，将寡核苷酸5'-AGGCgAGTTT-aag-cAGCTTGTCC-3，连接1次或重复连接2次而合成RGC32-RE2的序列作为启动子插入pGL3载体的，并与pCMV-Tag3-p53、pCMV-Tag3隱p53Mut(R273H)、pCMV-Tag3-mock分别同时导入到SaOS2细胞中，36小时以后，测定荧光素酶活性(图4)。在来源于p21基因的p53共有结合位点(ConsensusBindingSite,CBS)的情形中，在表达野生型p53蛋白质的载体存在下荧光素酶活性水平上升，同样地，在RGC32-RE2、特别是2次连接形成的RGC32-RE2X2的情况中，荧光素酶活性相对于对照也显示出60倍的提高，从而证实该序列在p53蛋白质依赖性中发挥启动子区域的作用。(7)通过染色质免疫沉淀法(ChIP)确认启动子DNA的存在ChIP分析采用ChIP分析试剂盒(UpstateBiotechnology)。将2X1()6个HCT116(p53+/+)和HCT116(p53-/-)接种于10cm的培养皿中，添加终浓度为lng/ml的ADR，24小时以后，用1%的甲酰胺处理10分钟，将细胞回收于包含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche公司产品)的200^1的SDS细胞裂解缓冲液中。进行超声波处理，将DNA长度破碎为200-1000bp。将上清液用鲑鱼精子DNA/蛋白琼脂糖(proteinagarose)进行处理，使用抗p53抗体(Ab-6;OncogeneResearchProducts)或者作为对照使用抗FLAG抗体(M2;Sigma)，在4"C下进行免疫沉淀16个小时。将沉淀物溶解于5(^1的Tris—EDTA中，以l)il作为模板，进行PCR，检测各自的p53结合位点。结果观察到，只有在HCT116(p53+/+)经ADR处理以后的、经抗p53抗体免疫沉淀的物质中存在启动子序列(图5，p21、RGC32—RE2)。由此可以看出，在细胞内，实际DNA损伤应答时，在RGC32一RE2上也可以观察到通过p53蛋白质的对启动子序列的应答。(8)向神经胶质瘤细胞导入RGC32基因引起的癌原性降低研究了向神经胶质瘤细胞导入RGC32基因对细胞增殖活性带来的影响、在贴壁依赖性条件下克隆能力是否发生变化等。首先，制备了向在氨基N末端添加myc肽的pCMV载体(Stratagene)中插入RGC32全长cDNA的插入基因载体(pCMV-Tag3-RGC32)，并且作为对照，制备了无插入基因的空载体(pCMV-Tag3-mock)。将其导入没有RGC32基因表达的U—87MG细胞中。导入基因48小时以后，采用细胞裂解液按Western印迹方法观察myc蛋白质的表达。结果，与预想的相同，只有在导入了pCMV-Tag3-RGC32的细胞中确认了pRGC32—Myc融合蛋白的存在(图6,A上)。将在G418存在下培养3周的培养物固定在另外一个培养皿中，用结晶紫进行染色，计数集落数。同空载体对照比起来，由于使RGC32基因表达，其显著地降低了集落个数(图6，A下)。(9)向神经胶质瘤细胞导入RGC32基因引起的增殖能力下降对于向神经胶质瘤细胞导入RGC32基因对细胞增殖活性带来的影响，研究了增殖速度是否有变化。将pCMV-Tag3-RGC32、pCMV-Tag3-mock导入没有RGC32基因表达的U—87MG细胞中。在G418存在下培养3周，建立了表达myc—RGC32的细胞以及阴性对照细胞。对于这些细胞的增殖速度，利用活细胞中的线粒体脱氢酶将四氮唑盐(WST—1)转换为甲瓒(formazan)色素，用色素检测细胞数(同仁化学研究所细胞计数试剂盒一8)(图6B)。在96孔板接种l乂103个细胞，进行培养，相比对照细胞(空白)，由于RGC32蛋白质的表达，克隆1、克隆2都在培养3天的期间明显可见细胞增殖降低。由该结果可以看出，RGC32蛋白质在细胞内表达具有抑制细胞增殖的作用。迄今已知的癌抑制基因蛋白质抑制细胞增殖、诱导细胞死亡，从而保护生物体免被癌侵袭，RGC32蛋白质的功能是作为癌抑制基因产物在发挥作用。(10)瞬时表达细胞的RGC32蛋白质集结部位分析为了表达具有Myc抗原的RGC32蛋白质，在8孔载玻片上将pCMV-Tag3-RGC32导入104个的U-87MG细胞，然后，24小时以后，用冷丙酮-甲醇(1:1)进行固定。在封闭液(加入了3%BSA的磷酸盐缓冲液，PBS)和抗Myc抗体(1:200)以及抗(3-微管蛋白抗体(1:200，Sigma)中反应2小时。然后，与FITC标记的来源于羊的抗小鼠IgG(1:400，MBL)以及Alexa594标记的来源于羊的抗兔IgG(1:1000，MolecularProbes)反应1小时。为了进行细胞核对比染色，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色。用ECLIPSEE800荧光显微镜(尼康)进行观察(图7)。除了细胞周期上的分裂期(M期)以外，在间期(interphase)瞬间表达的RGC32蛋白质在细胞质上广泛分布，特别是可以显著观察到在核膜上的分布。在M期时，在前期(pr叩hase)观察到分布于中心体(centrosome)，从前中期(prometaphase)至中期(metaphase)观察到了最大染色强度。在末期(telophase)和胞质分裂(cytokinesis)时的细胞中，观察到在中心体中有低(表达)水平的RGC32蛋白质。由此可以证明，RGC32蛋白质主要是在中心体中发挥作用的蛋白质。(11)RGC32蛋白质对细胞周期的影响的观察将RGC32cDNA与绿色荧光蛋白(GFP)基因同时插入pTRE2hyg，构建表达载体(pTRE2-GFP-RGC32)，建立HeLaTet-On细胞(Clontech)。同时，采用只含有GFP的载体(pTRE2-GFP)构建了作为对照的细胞。添加强力霉素(Dox)以后，采用细胞裂解液用抗GFP抗体(MBL)按Western印迹法确认GFP蛋白质的存在。在10cm培养皿中，接种104个上述细胞，24小时以后，添加Dox(10吗/ml)后再培养24小时。用70%冷乙醇固定细胞以后，用RNA酶A处理，进行碘化丙啶染色，用FACS(fluorescenceactivatedcellsorting,FACSCaliburHG(Becton-Dickinson)进行荧光测定。用BDCellQuestPro(Becton-Dickinson)进行分析(图8)。其结果显示，相比于对照细胞(16.53%)，G2/M期的细胞含量在GFP-RGC32表达细胞中较高(24.87%)。由此可以看出，RGC32蛋白质对细胞周期有增加G2/M期细胞的效果。(12)RGC32蛋白质表达引起的延长G2/M期的效果将对数增长期的2禾中HeLaTet-On细胞(GFP-RGC32，GFP)在10cm培养皿中接种106个细胞，24小时以后，将终浓度为10mM的胸苷(Sigma)加入5%胎牛血清(FBS)的培养液中，37。C下培养15小时。用PBS清洗3次，然后在通常的培养液中培养9小时，进一步再在终浓度为10mM的胸苷(Sigma)的存在下，培养15小时，PBS清洗3次以后，在通常的培养液中在Dox(10吗/ml)存在下培养不同时间(最长为24小时)。将这些细胞用FACS进行分析(图9)。结果显示，相比于GFP细胞，GFP-RGC32细胞中在添加Doxl0小时以后G2/M期的细胞含量较高，因此，RGC32蛋白质的表达导致了G2/M期的延长。(13)RGC32蛋白质与Plkl磷酸化酶相互作用的验证由于RGC32蛋白质表达，G2/M期向Gl期的变化被推迟，由于在M期RGC32蛋白质分布在中心体，所以研究了其是否与有丝分裂的蛋白磷酸化酶进行结合。首先，将经过不同的Dox处理时间的HeLaTet-On细胞(GFP-RGC32，GFP)的细胞裂解液在广谱蛋白酶抑制剂混合物(protease-inhibitorcocktail)存在下溶解于NP-40缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,lmMEDTA,0.5%NonidetP-40,2mMNa3V04,lOOmMNaF,lOmM焦磷酸钠十水合物(sodiumdiphosphatedecahydrate))。用抗P1K1(polo-likekinase1)抗体(zymedLaboratories)、抗细胞周期蛋白B1(cyclinBl)抗体(Upstate)、抗Aurora-B激酶抗体(Abeam)、抗Aurora-A激酶抗体(由佐谷秀行转让)、以及作为对照的抗P-肌动蛋白抗体按常规方法进行Western印迹分析(图IO)。结果显示，只有Plkl的分解延迟，RGC32蛋白质使其延迟从而延长了G2/M期。进一步，将添加Dox24小时后的HeLaTet-On细胞(GFP-RGC32，GFP)用NP-40缓冲液溶解以后，用抗GFP抗体在4X:下、处理2小时，然后用ProteinASepharose在4'C下、处理1小时。将其用NP-40缓冲液冲洗5次，用抗Plkl抗体按Western印迹法进行分析(图11)。其结果显示，仅在GFP-RGC32中观察到了由结合在被免疫沉淀的GFP上的RGC32蛋白质所导致的Plkl的结合。进一步，又研究了RGC32蛋白质对Plkl的蛋白磷酸化酶活性的影响。将全长RGC32cDNA插入pET-23d(Novagen)载体(pET-23d-RGC32)，在BL21-CodonPlus(DE3)(Stratagene)大肠杆菌中生产重组的结合His6的RGC32蛋白质。用Ni-NTAsuperflowaffinityresin(Qiagen)纯化以后，在PBS液中进行透析。在脱磷酸化a-酪蛋白(Sigma)的存在下，将y-"P]ATP在4°C下、在Raf缓冲液(20mMTris-HCl(PH7.4)、10mMMgCl2、O.lmMEGTA、25mMKC1、lmM二硫苏糖醇)中加入人重组Plkl(Invitrogen)和重组的结合有His6的RGC32蛋白质，保温30分钟。加入2^1的6xSDS上样缓冲液，SDS-PAGE以后用放射自显影仪(Autoradiography)检测出信号(图12)。结果发现，检测出Plkl磷酸化了RGC32(在RGC32中的Thr82和Thrl13中存在Plkl磷酸化的目标序列)，还证实了RGC32蛋白质抑制Plkl所致的a-酪蛋白的磷酸化。由此可以看出，RGC32通过与Plkl结合而抑制其磷酸化酶活性，同时，通过延迟Plkl的分解而延迟G2/M期。(14)结论(a)通过阵列CGH(arrayCGH)法的筛选，在22种来源于神经胶质瘤的细胞中报告了DNA的半合性缺失基因的筛选结果，组合表达分析数据的结果可以确认，在RGC32基因上观察到高频的异常。(b)在神经胶质瘤的临床检体中发现了RGC32基因的表达与其病理学分类上的恶性程度呈显著地负相关。而且发现，在p53基因存在点突变的检体中，观察到了RGC32基因的表达量存在下降的趋向。(c)明确了RGC32基因的表达受p53基因产物的正向控制(调控)。(d)在没有RGC32蛋白质的癌细胞中使RGC32蛋白质表达，由所产生的贴壁依赖性增殖能力的降低、细胞增殖速度的降低的结果可以看出，RGC32蛋白质具有癌抑制基因产物的作用。(e)RGC32蛋白质在核分裂期仅局限于中心体部位，与Plkl磷酸化酶相互作用，使其酶活性降低、分解延迟，从而参与核分裂中的G2/M期的细胞周期控制。序列表<110>富士胶片株式会社国立大学法人东京医科齿科大学<120>癌抑制剂<130>FI-070874-59<150>JP2006-204601<151>2006-07-27<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>895<212>DNA<213>Homosapiens<400>1gcggccgcgtcgaccggcgcggctggagcgcagcgccgaagggactggcagggctgaagt60gtgcgggacagcaagcccccgaatagccccggctgccacctcgcaggacccaaggccacg120cgcgccgggcccagctgagccgcctcatgaagccgcccgcggaggacctgtcggacgcgc180tgtgcgagtttgacgcggtgctggccgacttcgcgtcgcccttccacgagcgccacttcc2403ctacg3gg3gcacctggsgcgc3tg33gcggcgc3gcagcgccagtgtcagcg3C3gca300gcggcttcagcgactcggagagtgcagattcactttataggaacagcttcagcttcagtg360atg333a3Ctgaattctcc33C3gactct3cccc3gctcttctctctgccactgtc3ctc420ctcagaaagctaaattaggagacacaaaagagctagaagccttcattgctgatcttgaca480aaactttagcaagtatgtgaaacaagaagttctgggtcctttcatcataagggagaagct540tcagaaagttccgaggacctgctaaaatcagctactagaatctgctgccagaggggacaa600agacgtgcactc3accttctacc3ggccsctctcsggctcacctt3a33tC3gcccttg36G0tcccatttctgggcaatttagacagtgaaactgactttgtttacctgcttgcagcatatt720aga3C3g3cgatcc3tgcta3t3ttgt3ttttctcttaa33C3t3gctttcctgt3attt780aaagtgcttttatgaaaatatttgtaattaattatatatagttggaaatagcagtaagct840ttcccattataatatatttttgtatacaaataaaatttgaactgaacctcgtgcc895<210>2<211>117<212>PRT<213>Homosapiens<400>2MetLysProProAlaGluAspLeuSerAspAlaLeuCysGluPheAsp15105AlaValLeuAlaAspPheAlaSerProPheHisGluArgHisPheHis202530TyrGluGluHisLeuGluArgMetLysArgArgSerSerAlaSerVal354045SerAspSerSerGlyPheSerAspSerGluSerAlaAspSerLeuTyr505560ArgAsnSerPheSerPheSerAspGluLysLeuAsnSerProThrAsp65707580SerThrProAlaLeuLeuSerAlaThrValThrProGinLysAlaLys85卯95LeuGlyAspThrLysGluLeuGluAlaPhelieAlaAspLeuAspLys100105110ThrLeuAlaSerMet11权利要求1.一种含有RGC32基因或其等同基因的癌抑制剂。2.权利要求1所述的癌抑制剂，所述基因或其等同基因被重组入载体中。3.权利要求2所述的癌抑制剂，所述载体是病毒载体或动物细胞表达用质粒载体。4.权利要求3所述的癌抑制剂，所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、或慢病毒载体。5.权利要求1所述的癌抑制剂，所述基因或其等同基因被包封入脂质体中。6.—种含有RGC32蛋白质或其等同蛋白质的癌抑制剂。7.—种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32基因进行分析的工序，所述分析使用包含RGC32基因全部或一部分的DNA或RNA。8.权利要求7所述的方法，所述分析是基因变异的检测或基因表达量异常的检测。9.一种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32蛋白质进行分析的工序，所述分析使用抗RGC32蛋白质的抗体或其片段。10.权利要求9所述的方法，所述分析是蛋白质表达量异常的检测。全文摘要由于本发明新发现癌抑制基因而提供一种含有该基因的癌抑制剂以及使用该癌抑制基因诊断癌症的方法。即，提供一种含有RGC32基因或其等同基因的癌抑制剂；一种含RGC32蛋白质或其等同蛋白质的癌抑制剂；一种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32基因进行分析的工序，所述分析使用包含RGC32基因全部或一部分的DNA或RNA；一种癌诊断方法，所述方法包括对检体试样中的RGC32蛋白质进行分析的工序，所述分析使用抗RGC32蛋白质的抗体或其片段。文档编号A61K48/00GK101199860SQ200710139900公开日2008年6月18日申请日期2007年7月27日优先权日2006年7月27日发明者三枝邦康,井本逸势,稻泽让治申请人:富士胶片株式会社;国立大学法人东京医科齿科大学