专利名称：采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫的制作方法
采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫本申请是1999年1月28日提交的申请号为99802481. 3 (PCT/US 99/01823)， 名为"采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫"的发明专利申请的分案申请。发明领域本发明涉及重组核酸分子和包含例如与基因免疫方案中抗丙型肝炎病毒 的疫苗组分同样有用的药物组合物；涉及诱导抗丙型肝炎病毒感染的免疫应 答的方法；并涉及治疗患有丙型肝炎感染的病人的方法。发明背景丙型肝炎病毒(HCV)，由输血获得的非甲非乙型肝炎的主要病原体，在 美国每年引起了大约150， OOO起的急性病毒性肝炎的新病例。(Choo，等，科 学，1989， 244， 359-362.)在西方国家，有0. 6%至2.0%的流行率，而在世界的 一些不发达地区要高达15%。 (Heintges，等，H印athology， 1997， 26, 521-526.)大约一半的此类感染会演变成和肝硬化以及/或肝癌相关的慢性感 染。(Alter,等，科学，1992， 258， 135-140;和alter,等，新英格兰医学杂 志，1992， 327， 1899-1905).此外，抗丙型肝炎病毒抗体的流行显示，丙型肝炎 病毒的感染是肝细胞癌发展的 一 种独立的危险因素(Colombo, 等，Lancet, 1989， ii, 1006-1008; Saito，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87， 6547-6549; Simonetti,等，An. Int. Med. , 1992， 116, 97—102 ;和 Tsukuma，等，新英格兰医学杂志，1993， 328， 1797-1801).丙型肝炎病毒是一种具有衣壳的正链RNA病毒，长度大约为9， 500核苷 酸，最近被分类为黄病毒属的一个独立种。(Heinz, Arch. Virol. (S叩pl.)， 1992， 4, 163-171.)不同的分离物显示出相当多的核酸序列多样性，导致将 HCV的基因组进一步分成八个基因型。(Simmonds,等，J. Gen. Virol. ， 1993,74， 2391-2399.)在所有的基因型中，病毒基因组都包含一个大的开放阅读框(0RF),编码一条由3010到3033个氨基酸组成的，大约330Kd的多聚蛋白前 体。(Choo,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991， 88， 2451-2455 ; Inchauspe， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991， 88， 10292-10296; Kato，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87， 9524-9528 ; 0kamoto，等，病毒遗传学杂 志，1991, 72, 2697 - 704;禾口 Takamizawa ,等，J. Gen. Virol. ， 1991， 65, 1105-1113.)通过该多聚蛋白前体的蛋白水解加工产生了核心蛋白(C)，衣壳蛋白(El， E2)和非结构(NS2 — NS5)蛋白，从而产生出各种HCV多肽。(Bartenschlager， 等，病毒遗传学杂志，1993， 67， 3835 — 3844; Grakoui，等，病毒遗传学杂 志杂志，1993， 67， 2832 —2843;及Selby，等，病毒遗传学杂志，1993， 74， 1103—1113)。这种蛋白水解是联合采用细胞蛋白酶和病毒编码的蛋白酶进 行催化反应的。NS3基因编码一种丝氨酸蛋白酶，此酶能在几种功能部位切 断转录后的病毒多聚蛋白前体，还可以作为蛋白解旋酶起作用。NS5区域编 码此病毒的脂A依赖的脂A聚合酶。除了转录区域外，HCV基因组还包含一个5'非翻译区域(5'UTR)和一个 3'非翻译区域(3'UTR)。该324至341的5'非翻译区域核酸序列代表了迄今 为止报道过的所有HCV分离物中最保守的核酸序列。(Han，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1991, 88， 1711-1715;禾口 Bukh，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1992, 89,4942-4946).该5，非翻译区域被假定包含了 HCV RNA复制和/ 或翻译的重要调控元件。该5'非翻译区域还包含了数个小的开放阅读框 (0RF)，但现今尚未有证据提示这些开放阅读框被真实翻译。在HCV感染期间涉及肝损伤和病毒清除的细胞免疫机制只是部分的被说 明。在尝试检测慢性HCV感染病人中肝浸润淋巴细胞的潜在致病作用时， Koziel等检验了细胞毒T淋巴细胞(CTL)对这些细胞的反应，并证明HLA I 类限制性的CD8 +细胞毒T淋巴细胞应答针对HCV多肽的结构和非结构区域。 (Koziel，等，病毒学杂志 1993, 67， 7522-7532;和Koziel，等，免疫学杂 志，1992， 149, 3339-3344).其他研究者也注意到在外周血单核细胞群体中存 在细胞毒T淋巴细胞，它能识别慢性HCV感染时的病毒核心上的和其它病毒 相关蛋白上的表位。(Kita,等，Heatol. ， 1993， 18， 1039-1044;和Cerny， 等，Intl. Symp. virol Hepatitis Liver Dis. ， 1993， 83 (abstr. ). ) Botarelli， 等，(Botarelli，等，Gastroenterol. ， 1993， 104, 580-587)禾口 Ferrari,等，(Ferrari, Hepatol. ， 1994， 19， 286-295)发现了针对慢性HCV感染病人体内 得到的HCV的不同区域的几种重组蛋白的HLA II类限制性的CD4 + T细胞介导 的增殖反应。在有效HCV感染中，体液和细胞免疫应答已显示是多克隆、多特异性的。 很可能在持续HCV感染中产生的宿主免疫应答，部分的引了肝细胞损伤。然 而，这些免疫应答不足够广泛或强大，以在慢性HCV感染的病人体内促进病 毒清除和保护性免疫力。(Chisari， J.Clin. Invest., 1997， 99， 1472-1477.) 最近显示，那些从急性HCV感染中恢复的病人能产生很强的对非结构蛋白多 肽CD4 + T细胞增殖反应。(Missale，等，J.Clin. Invest. ， 1996， 98， 706-714; 和Di印older，等，Lancet, 1995， 346, 1006-1007.)更重要的是，HCV特异性 CTL活性的产生是和慢性肝炎个体体内病毒复制的控制相联系的。 (Rehermann,等，J.Clin.Invest. ，996，98， 1432-1440;和 Nelson,等， J, Immunol. ， 1997， 158,1473-1481.)然而，非结构蛋白NS3， NS4和NS5是否有足够的免疫原性能够在体内产 生广泛的、强有力的CTL应答尚不知道。现今还没有通用的、高效的对慢性HCV感染的治疗方法。HCV疫苗策略 的开发是复杂的，不仅是由于HCV分离物的显著的异质性，还由于在一个病 毒分离物中混合了异源基因组。(Martell，等，J. Virol. ， 1992， 66， 3225.)此 外，病毒包含了一个高度可变的衣壳区。有效的治疗仅限于干扰素。 (Carithers， et al， H印atology， 1997， 26, 83S-88S.)事实上，用这种制剂治 疗的病人大约8—10%有反应，并有HCV从肝部的扩散。然而，近来的研究 显示，和那些获得持续性HCV感染的病人比较，从急性HCV感染中恢复的病 人对非结构蛋白产生了充分的CD4 + T细胞增殖反应。(Missale，等， J . Clin. Invest. ， 1996， 98, 706-714;和 Di印older， 等，Lancet, 1995， 346， 1006-1007)直接将DNA注射入动物体内是免疫接种输送特异免疫抗原的一种有前途 的方法。(Barry,等，Bio Techniques, 1994， 16， 616-619 ;Davis，等，Hum. Mol. Genet. ， 1993， II, 1847-1851; Tang,等，自然科学，1992， 356， 152-154 ; Wang, 等 ，J. Virol. ， 1993， 67， 3338-3344; 和 Wolff, 等， 科学 ， 1990， 247， 1465-1468.)该方法已被成功的应用于在鼠和鸡中产生对流感病 毒、在鼠和小牛中对牛疱疹病毒、在鼠中对狂犬病毒产生保护性免疫。(Cox,
等， J. Virol. ， 1993， 67， 5664-5667; Fynan， 等，DNA 和 Cell Biol. ， 1993， 12， 785-789;Ulmer等，科学，1993， 259， 1745-1749;和Xiang等， Virol. ， 1994， 199， 132-140.)在大多数情况中，强而高度多样的抗体和细胞毒 T细胞应答和感染的控制有关。事实上，和那些死病毒的疫苗，不仅能引起 抗急性感染的保护力而且能根除持续性病毒感染的CTL应答的方法比较，不 使用肝脏载体而产生长而持续性的记忆性CTL的可能性，使这种方法特别具 有吸引力。(Wolff，等，科学，1990， 247， 1465-1468;Wolff，等，Hum. Mol. Genet.， 1992， I，363-369; Manthorpe， 等 ，Human GeneTherapy, 1993，4，419-431; Ulmer 等，科学 ，1993，259,1745-1749;Yankauckas，etaal. ,DNA 和 细 胞 生 物 学，1993, 12， 777-783;Montgomery， 等，DNA 和细胞生 物 学，1993， 12， 777-783;Fynan,等，DNA和细胞生物学，1993， 12, 785-789 ; Wang， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1993, 90， 4156-4160; Wang，等，DNA 和 细 胞 生 物 学 ，1993, 12， 799-805;Xiang， 等 ， Virol. , 1994， 199， 132-140 ; Davis,等，Hum. Mol. Genet. ， 1993， II， 1847-1851; Donnelly,等，Nat. Med. ， 1995， I， 583-587; Boyer,等，Nat. Med. ， 1997， 3， 526-532;Tascon，等，Nat. Med. ， 1996， 2， 888-892;禾口 Huygen，等，Nat. Med. 1996, 2， 893-898.)。和融合重组蛋白或多肽相比较，该方法的优点在于能 引起强烈的炎症性的CD4 + T细胞应答和细胞毒T细胞活性，推测是病毒蛋白 在细胞内加工转变成多肽，然后装载在转染细胞的MHC I类分子上，与抗原 递呈细胞相互作用而致。相反的是，用融合蛋白免疫接种主要导致由MHC II 类途径加工的体液免疫应答。由于只有有限数目的表位能刺激宿主的免疫应 答，用合成多肽免疫有几个缺陷之处。相反的，对于感兴趣的DNA构建物编 码的每个蛋白，天然存在的B和T细胞表位都可能是为T细胞受体识别而保 留的，因此可能会产生广泛的体液和细胞免疫应答。(McDonnell,等，N. Engl. J. Med. ， 1996, 334, 42—45.)疫苗接种和免疫接种通常指引入某种无毒的物质，个体的免疫系统能刺 激针对该物质的免疫应答，从而能抵抗病原体的攻击。免疫系统识别入侵的 "外来"组分和物质主要靠识别在个体内正常不存在的蛋白和其它的大分子。 外来的蛋白是免疫应答所针对的目标。PCT专利申请PCT/US90/01348公开了 HCV基因组克隆的序列信息，HCV
病毒蛋白的氨基酸序列以及制造和使用包括抗一HCV疫苗等组分的方法，该疫苗中含有HCV蛋白及其产生多肽。美国专利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和于1994年1月 26日提交的PCT专利申请系列号PCT/US94/00899，其内容全部纳入本文以供 参考。每专利都包含了基因免疫方案的细节。抗HCV疫苗也包括在各件专利 之中。用于保护个体抵抗HCV感染的疫苗的需求仍然存在，保护个体抵抗HCV 感染的方法的需求仍然存在。发明概述本发明涉及重组核酸序列分子，其包含编码HCV非结构区域，如NS3， NS4，或NS5，或它们的组合的核苷酸序列。本发明涉及包含重组核酸分子的药物组合物，该重组的核酸分子含有一 段编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列。编码HCV非结构蛋白的该核苷酸编码 序列和人细胞中的功能性调节元件可操作性相连。该药物组合物还包含有药 学上可接受的运载体或稀释剂，和任选的促进剂(facilitator)，比如丁哌 卡因。该发明涉及免疫HCV易感个体的方法，包含向该个体给药，药物组合物 含有编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的重组核酸分子。该编码HCV非结构 蛋白的核苷酸编码序列与人类细胞中的功能性调节元件可操作性相连。该药 物组合物还包含一种药学上可接受的运载体或稀释剂。对个体施用一定量的 药物使之有效诱导抗HCV感染的保护性免疫应答。本发明涉及治疗患有HCV感染个体的方法，包括相该个体歌谣，药物成 分含有编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的重组核酸分子。该编码HCV非结 构蛋白的核苷酸编码序列序列与人细胞中的功能性调节元件可操作性相连。 该药物组分还包含药学上可接受的运载体或稀释剂。给予个体一定量的药物 使之有效诱导HCV感染的治疗性免疫应答。附图简述
图1A是一示意图，显示HCV的单一大开放阅读框，它编码大约3011 — 3030个氨基酸的多聚蛋白前体。该蛋白前体被宿主信号和病毒蛋白酶切割成
不同的结构和非结构蛋白，如箭头所示。图IB显示HuH-7细胞瞬时转染和 sp2/0细胞稳定转染后的非结构蛋白表达的示范性放射自显影图。1， 3， 5泳 道是模拟DNA转染的细胞，用作阴性对照(Mock); 2， 4和6泳道显示了特异 条带，NS3在大约70， NS4在大约30， NS5大约125KD。 7 — 10泳道显示了分 别转染了含有NS3， NS4，和NS5基因的核酸构建物的SP2/0细胞。7和9泳 道代表由稳定表达HCV—核心蛋白，作为阴性对照(SP2 — 10)的细胞得到的细 胞裂解物，而8和10泳道代表NS3和NS5的特异性表达。图2A是一 柱状图，显示一代表性的以DNA为基础免疫接种引起的对NS3， NS4和NS5的体液免疫应答；血清抗体水平由一 ELISA法测定(每组n=5). 图2B是一柱状图，显示一在体外用特异或非特异性重组蛋白刺激3日后测得 的代表性的t细胞增殖。图2c， 2d，和2e为柱状图，显示在体外刺激48小 时后测得的代表性的细胞因子IFN — y， IL一2和IL一4分别在上清液中的分 泌水平。图3A和3B是柱状图，显示在不同的效应细胞和靶细胞比例下 (100:1,30:1， 10:1，3:1)分别对NS3禾卩NS5作出的代表性的细胞毒T细胞 (CTL)反应.图3C是柱状图，显示针对稳定转染靶细胞谱线的代表性铬释放实验。图4A是一表格，显示评价CTL活性的肿瘤模型的代表性结果。图4B是 一照片，自左自右显示接种了 l)模拟丽A，并以SP2/NS5-21细胞攻击； 2)pApNS5，以SP2/NS5-21细胞攻击；3) pApNS5，以SP2-19细胞攻击；(稳定 表达HCV核心蛋白)；以及4)用重组NS5蛋白腹膜接种三次，并被SP2/NS5-21 细胞攻击的动物该发明的优选例描述根据本发明，提供了对HCV感染进行预防性/或治疗性免疫，或治疗个体 的方法。重组核酸分子被接种入个体内，该重组核苷酸分子包含编码HCV非 结构蛋白，如NS3， NS4，或NS5，或它们的组合的核苷酸编码序列。由该重 组核酸基因构建物编码的蛋白由个体的细胞表达，并作为免疫原性靶子，诱 导针对它的抗HCV的免疫应答。引起的免疫应答是广泛的，除体液免疫应答 外，细胞免疫的两个途径都被激活。该发明的方法可用来赋予预防性和治疗 性免疫力。该发明的方法除用于人类外，亦可用于哺乳动物以进行生物医学
研究。因此，该发明的方法既可用于个体免疫抵抗HCV攻击，亦可用于治疗HCV感染个体。本文所用的词组"HCV非结构蛋白"是指HCV非结构蛋白NS3， NS4和 NS5，以及它们的等价物。等价蛋白包括保留本文所述的生物活性的NS3， NS4 和NS5肽链片段。此外，术语HCV非结构蛋白意指相应的来自其它的HCV分 离物，(序列上可能有变化)的HCV非结构蛋白。该领域一般技术人员能容 易的鉴定其它HCV分离物的非结构蛋白。需理解的是，当编码相同的氨基酸 时，密码子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代 而产生的保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。需理解的是， 词组"HCV非结构蛋白"也包括了融合蛋白，该融合蛋白包括非结构蛋白， 以及它的治疗和预防性的活性片段。本文所用的词组"基因构建物"指包含编码HCV非结构蛋白的核苷酸编 码序列的重组核酸分子，以及起始和终止信号，它们和包括启动子、聚腺苷 酸化信号，能指导在疫苗接种个体细胞中表达的调控元件可操作性相连。在 某些实施例中，基因构建物更包含有增强子，Kozak序列(GCCGCCATG;SEQID N0:1)，和至少一个HCV 5'UTR片段。本文所用的词组"基因疫苗"指包括有一个基因构建物的药物制剂。基 因疫苗包含有用于刺激对HCV的预防性和/或治疗性免疫应答的药物制剂。本文所用的词组"核酸"指DNA，脂A，或由它们形成的嵌合体。根据本发明，将基因构建物引入个体细胞中并在其中表达，从而产生至 少一种HCV非结构蛋白。更好的是，本发明的基因构建物的调控元件能指导 哺乳动物细胞中的表达，尤其是人类细胞中的表达。该调控元件包括启动子 和聚腺苷酸信号。此外，其它元件，如增强子和Kozak序列，亦可包含在基 因构建物中。当被细胞摄取后，本发明的基因构建物可以在细胞中作为染色体外功能 性分子存在或整合入细胞的染色体DNA中。核酸，例如DNA，可以被引入细 胞，在细胞中以质粒的形式作为独立的基因材料存在。另外，可以整合到染 色体中的线状核酸分子也可导入细胞。当将核酸引入细胞时，可加入促进核 酸整合到染色体上的试剂。在DNA分子中亦可加入有助于促进整合的DNA序 列。此外，RNA也可以接种入细胞。也可考虑将基因构建物以线状微型染色 体包括着丝粒、端粒和复制起始点的形式提供。
根据本发明，基因构建物包含具有编码HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的重组核酸分子。在一些优选例中，重组核酸分子包括了编码NS3的核苷 酸编码序列。在另一些优选例中，重组核酸分子包括了编码包括NS4在内的 HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。在另一些优选例中，重组核酸分子包括 了编码包括NS5在内的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。在另一些优选例 中，重组核酸分子包括了编码包括NS3， NS4，和NS5在内的任一HCV非结构 蛋白组合的核苷酸编码序列。在一些优选例中，该重组核酸分子包括了编码包括HCV NS3， NS4， NS5 蛋白的片段或它们的组合的HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列。这些片段包 括，但不限于，含有相应非结构蛋白的10， 25， 50， 75， 100， 150, 200， 250， 300， 350， 400， 450， 500， 550， 600， 650， 700， 750， 800， 850， 900， 950，或1000个氨基酸的片段。此外，这些片段可以包含蛋白羧基端一部分、 胺基端一部分、或它们两者之间的任一部分。该领域技术熟练的研究人员可 以容易地制备HCV非结构蛋白的免疫原性片段、或含有任一组合的非结构蛋 白的免疫原性片段的融合蛋白。因此，可以考虑，使含有编码HCV非结构蛋 白的核苷酸编码序列的重组核酸分子含有比整个HCV非结构基因产物少的序 列，而基本上不改变疫苗效率。还可考虑，在该核苷酸编码序列中替换至少 一个或多个核苷酸而不影响该蛋白的氨基酸序列。此外还可考虑可在整段蛋 白中制造至少一个或多个保守性的氨基酸替代，而不实质减弱HCV非结构蛋 白的免疫原性的活力。在本发明的一些优选例中，重组核酸分子包含具有HCV 5'UTR最后9 个核苷酸，HCV5'UTR最后25个核苷酸，HCV5'UTR最后50个核苷酸，HCV 5'UTR最后75个核苷酸，HCV 5'UTR最后100个核苷酸，HCV 5'UTR最后 150个核苷酸，HCV 5' UTR最后200个核苷酸，HCV 5' UTR最后250个核苷酸， 以及HCV 5'UTR最后300个核苷酸的5'UTR片段。在一些优选例中，基因 构建物含有整个HCV 5'UTR。在一些优选例中，基因构建物含有HCV5'UTR 的最3'端的9个核苷酸。 一个优选例中的整个HCV 5' UTR是GCCAGCCCCC GATTGGGGGC GACACTCCAC CATAGATCAC TCCCCTGTGA GGAACTACTG TCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCATGGCG TTAGTATGAG TGTCGTGCAG CCTCCAGGAC CCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAG GACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCC GCGAGACTGC
TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT GCCTGATAGG GTGCTTGCGA GTGCCCCGGG AGGTCTCGTA GACCGTGCAC C (SEQ ID N0: 2)DNA分子的基因表达所需的调控元件包括启动子，初始密码子，终止 密码子，聚腺苷酸信号。此外，基因表达常需增强子。这些元件需和编码HCV 非结构蛋白的的序列可操作性连接，还需要在接种的个体中具操作性。起始 密码子和终止密码子通常被视为编码HCV非结构蛋白的核苷酸序列的一部 分。使用的启动子和聚腺苷酸信号必须在个体细胞中具有功能性。为使蛋白 的生产达到最大，可选择给予该构建物的细胞中非常适合基因表达的调控元 件。此外，可选择能在细胞中最有效转录的密码子。在本领域具有一般技能 的研究人员能构建在哺乳动物，尤其是人类细胞中具有功能性的DNA构建物。用于实现本发明的启动子的实例，尤其是生产人类用的基因疫苗的启动 子的实例，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)的启动子，鼠乳房瘤病毒(MMTV) 的启动子，人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV的长最后重复序列(LTR) 的启动子，白血病(moloney)病毒，ALV (禽白血病(moloney)病毒)，巨 细胞病毒(CMV)，如CMV的立即早期启动子，EB病毒(EBV) ， Rous肉瘤病 毒(RSV)，以及来自人类基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血 色素、人肌酸素以及人金属硫蛋白的启动子。用于实现本发明的聚腺苷酸信号的实例，尤其是生产人类用的基因疫苗 的聚腺苷酸信号的实例，包括但不限于猿猴病毒40 (SV40)和LTR的聚腺 苷酸信号。具体使用的SV40聚腺苷酸信号是在pCEPa质粒(Invitrogen，San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸信号。除基因表达所需的调控元件外，在基因 构建物中还可含有其它的元件。这些其它的元件包括增强子。增强子可从下 列组中选择但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及 病毒增强子如CMV， RSV和EBV的增强子。可向基因构建物提供哺乳动物复制起始点，以使之保持染色体外的状态， 从而在细胞中产生此构建物的多个拷贝。质粒pCEP4. pREP4 (San Diego, CA) 包含有EB病毒的复制起始点和无需整合，能产生高拷贝游离型复制的核酸抗 原EBNA—1编码区。接种途径包括，但不限于肌内，腹膜内，真皮内，皮下，静脉注射， 动脉内，眼内和口服，以及透皮或采用吸入法或栓剂。优选给药途径包括肌 内，腹膜内，真皮内和皮下注射。在采用和粘膜免疫力相关组织中存在的物 质免疫接种后，编码HCV非结构蛋白的基因构建物的输送能赋予粘膜免疫力。 因此，在一些实施例中，此基因构建物通过在个体口腔中的口腔前庭接种来 输送。基因构建物可通过包括，但不限于传统注射，无针注射设备，或"显 微粒子轰击基因枪，，(microprojectile bombardment gene guns)纟合予。]t匕 外，基因疫苗亦可用多种方法导入从个体上取出的细胞中。这些方法包括 比如，体外转染，电穿孔法，显微注射以及显微粒子轰击。在基因构建物被 细胞摄取后，可将细胞重新植回个体。可考虑，本来无免疫原性的细胞掺入 了基因构建物后可以植入个体，即使被接种的细胞原来来自另一个个体。根据本发明的一些优选例，基因构建物采用无针注射器接种入个体。根 据另一些优选例，基因构建物同时用无针注射器通过真皮内，皮下注射和肌 肉注射来接种入个体。无针注射器是广为人知并广泛可得的。该领域的一般 技术人员能够按照本文的指导，用无针注射器来将基因物质传递给个体的细 胞。无针注射器非常适合向所有的组织传递基因物质。它们尤其对相皮肤和 肌肉细胞传递遗传物质有效。在一些优选例中，无针注射器可以用来将含有 DNA分子的液体推至个体的皮肤表面。该液体以足够的速度推动，由于对皮 肤的冲击力，液体穿透皮肤表面，渗入到下面的皮肤和肌肉组织。因此，基 因构建物同时被接种入真皮，皮下和肌肉。在一些优选例中，为了向器官细 胞引入核酸分子，无针注射器可用来将基因物质传递给其它器官的组织。根据本发明，基因疫苗含有1纳克至1000毫克的核酸，宜选是DNA。在 一些优选例中，该疫苗含有10纳克至大约800毫克的核酸。在一些优选例中， 该疫苗含有0. 1至大约500毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有1至 大约350毫克的核酸。在一些优选例中，该疫苗含有25至大约250毫克的核 酸。在一些优选例中，该疫苗含有大约IOO毫克的核酸。该领域熟练技术人 员能容易地配制所需量核酸的疫苗。按照接种模式来配置本发明的基因疫苗。该领域中一般技术人员可以容 易地配制含有基因构建物的药物组合物。本发明的药物组合物包含有的编码 NS3， NS4，或NS5，或它们的组合的单一基因构建物。另外，本发明的药物 组合物包含有编码NS3， NS4，或NS5，或它们的组合的多个基因构建物。另 外，本发明的药物组合物包含有编码NS3， NS4，或NS5的片段，或它们的组 合的单一或多个基因构建物。此外，本发明的药物组合物包含编码所有或任一NS3， NS4，或NS5蛋白片段的融合蛋白的单一基因构建物。在某些例子中， 等渗的配方被采用。通常，等渗添加剂可包括氯化钠，葡聚糖，甘露糖醇， 山梨醇和乳糖。在某些例子中，可采用等渗溶液例如磷酸缓冲液。稳定剂包 括凝胶和白蛋白。在一些优选例中，在配方中添加血管收縮剂。本发明的药 物制备需是无菌无热源质提供的。本发明的基因构建物可以用能提高基因构建物的吸收和/或表达的药剂 配制或联合接种，该药剂本文称为促进剂(facilitator)，它与基因构建物 的摄取和表达有关的细胞，以及当在缺少这些药剂时接种相同的基因疫苗时 出现的细胞有关。这些药剂和将它们与基因构建物联合接种的方案在美国专 利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和与1994年1月26日PCT专 利申请系列号PCT/US94/00899中有描述。这类药剂的例子包括CaP04， DEAE， 葡聚糖，脂质，胞外基质活性酶；皂角苷；凝集素；雌激素化合物和类固醇 激素；羰化低级烷，二甲基亚砜(画S0);尿素；苯甲酸酯酰替苯胺；脒； 氨基甲酸乙酯和局部麻醉药家族的盐酸盐。此外，基因构建物可包裹在脂质/ 聚阳离子复合物中或与该复合物联合接种。一种优选的促进剂(facilitator) 是丁哌卡因。这些组分可以方便的以单位剂量给予，并可用药学领域中熟知 的任何方法制备。例如 Remington' s Phamaceutical Sciences (Mack Pub.Co. ，Easton,PA， 1980)，所描述的方法。该文公开的内容全部纳入本文作 参考。在实施例中，提供了以下的用编码HCV三种不同非结构蛋白的质粒作DNA 疫苗接种，显示能刺激免疫系统二部分能强烈抗原特异性免疫应答。三次免 疫接种后，所有动物都产生了可检测的抗体反应。在这点上，这些非结构蛋 白和以前用结构性HCV核心结构蛋白的研究相比，是好得多的刺激体液免疫 应答的抗原。(Tokushige,等，Hepatology， 1996, 24, 14-20 ;和Geissler, 等，J.Immunol.， 1997,158， 1231-1237.)在优选例中，对非结构蛋白的体 液免疫可以用加入能活化抗原递呈细胞的化合物来增强，比如，表达细胞因 子的质粒，如 IL 一 2禾P GM — CSF 。 ( Geissler，等，J. Immunol., 1997,158,1231- 1237;和Xiang， Immunity, 1995， 2,129-135.)所有的三 种编码NS3， NS4， NS5的质粒都证明了产生了具有优势THl表型的炎症性CD4 + 丁细胞。此外，产生强而特异的008+0^应答主要是针对裂解病毒产生的^3，
NS5。以前已显示能在动物模型系统中诱导抵抗各种病原体的保护力。 (Tascon，等，Nat. Med. , 1996， 2， 888-892;和Huygen，等，Nat.Med. ， 1996， 2， 893-898.)而且，要确定DNA疫苗产生的CTL应答是否能保护动物，防止以编 码NS5蛋白的cDNA稳定转染的同系SP2/0肿瘤细胞的肿瘤形成。结果大约 60%的小鼠受到保护避免了肿瘤形成，表明该免疫接种方式在体内产生了高 水平的CTL活性，另外，与用模拟DNA或重组NS5蛋白免疫接种的动物相比， 在患肿瘤的那些动物中，肿瘤重量显著下降。这个模型也证明了在动物模型 中评估抗黄病毒非结构蛋白的高水平细胞免疫应答作为衡量抑制肿瘤生长的 指标的能力。本文公开的结果证明，用编码HCV非结构蛋白的基因构建物来进行DNA 为基础的免疫接种，如本文所述，可用于患有HCV感染的个体的治疗性处理， 以及可用与抗HCV预防性疫苗。本发明将通过以下实施例作进一步描述，以试图阐明本发明。这些实施 例并不意味，或被解释成，限制所公开述的范围。实施例实施例l:设计并构建HCV表达载体将编码单个非结构蛋白的基因与采用工程改造后的起始和终止密码子克 隆入一表达质粒，由CMV启动子和RSV增强子(pAp031)驱动。包括选择性 标记的该表达载体(pcDNA3)也被用来产生稳定的SP2/0转染细胞系。(见 图1A)。作为病毒基因的来源，采用命名为pBRTM/HCVl，覆盖全长HCV开放阅读 框的质粒克隆入本发明的表达载体中。(Grakoui，等，J. Viol. , 1993， 67,1385-1395)此文公开内容全部纳入本文以供参考。另外，编码HCV的核 酸序列可从基因文库(GenBank)的登录号X61596和D16435来获得，其公开 内容全部纳入本文。构建物pAp031-NS3， pAp031-NS4, pAp031-NS5是在插入 了工程化的起始和终止密码子以及限制性酶切位点后的PCR克隆，采用以下 弓l物.-对NS3: 5'- GGTCTAGATT GATGGCGCCC ATCACGGC -3' (Xba I) (SEQ ID NO:3),5'— CACACGCGTT CACGTGACGA CCTCCAGGT —3， (Mlu I)(SEQ ID NO:4)， 对于NS4:5' GGTCTAGATG AGCACCTGGG TGCTC -3' (Xba I) (SEQ ID N0:5),5'-CCAGGATCCT CAGCATGGAG TGGTACA -3' (B柳Hl) (SEQ ID NO:6),以及对NS5:5'-TCAGTCTAGA ATGTCCGGCT CCGGCTCCTG GCTAAGGGA -3， (Xba I) (SEQ ID NO:7)，5'- AGCTACGCGT TCACCGGTTG GGGAGGAGGT -3' (Mlu I) (SEQ ID NO:8)。 在使用高精度的PCR系统(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)进行 PCR扩增后，将cDNA片段插入含有RSV增强子元件的质粒表达载体PAp031 中，由CMV启动子(Apollon，Malvern， PA)驱动。使构建物在DH5ot细胞中生长， 而后质粒DNA用2x氯化铈离心或使用无内切酶的缓冲液系统(Santa Clara，CA)的Qiagen Giga试剂盒纯化。非结构基因的插入物的检验可用标 准方法来进行序列分析。要建立作为CTL试验的靶细胞的NS3， NS4， NS5的稳定表达细胞系，将 非结构蛋白编码基因片段克隆入带有新霉素选择性标记的pc面A3和 pcDNA3. I Zeo(-)表达载体中(Invitrogen, San Diego)。首先，NS3禾P NS5的 Xba I禾卩Mlu I片段被亚克隆至Litmus-38载体(New, England Biolabs, MA) 的Nhe I/Mlu I位点，然后用EcoR I和Sal I切开，分别重新连接入pcDNA3 和pcDNA3.工Zeo(-)的EcoR I/Xho I多重克隆位点。含有NS4的Xba I和BamHl 片段被重新连接入Litmus-20 (New, England Biolabs),用Kpn I和EcoR I 再次切开，然后重新连入pcDNA3载体。质粒被命名为pcDNA3 — NS3， pcDNA3 —NS4禾口 pcDNA3. 1/Zeo (1)-NS5。该领域技术人员，若有编码任一HCV非结构蛋白的DNA顺序，就能设计 引物来制备本发明的任一基因构建物。另外，可进行核苷酸碱基替代，而不 影响引物的结合。另外，为了克隆或连接目的，可制备带有内切核酸酶限制 性位点的引物，已为本领域熟练技术人员所知道。因此该领域熟练技术人员 能通过设计适当的引物，并进行PCR扩增来制备本发明的基因构建物。将PCR 产物连入一表达载体中。包含HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列的质粒如上所述，将各自含有的 HCV非结构蛋白的核苷酸编码序列置于CMV启动子和RSV增强子元件的转录 控制下。实施例2:体外表达测定此质粒构建物横跨基因插入物的序列，分别在体外瞬时转染后的 HuH-7细胞中，和稳定转染后的SP2/0耙细胞中确认蛋白质的表达。发现NS3 为70， NS4为30，而NS5为125kD的蛋白条带在细胞内被表达，但未分泌入
培养基°对HuH-7人肝癌细胞系，通过磷酸钙方式以多种构建物瞬时转染，以评 估HCV非结构蛋白的表达水平。简单的说，用35硫一甲硫氨酸和半胱氨酸以 代谢法标记4小时后，以改良过的RIPA缓冲液(0. 15M NaCl， 1%NP_40， 50mM Tris,O. 5。/oDOC和1%SDS)配制细胞裂解液。细胞裂解液先用马血清预澄清， 然后，通过与多克隆抗血清WU 110(NS3)， W148/151(NS4)和WU 115(NS5)预温 育过夜使之与琼脂糖凝胶A 结合。(Grakoui， 等，J. Virol. ， 1993,67, 1385-1395，全部纳入本文以供参考)在用SDS — PAGE 分离蛋白后，将电泳胶晾干，然后放射自显影。NS5蛋白表达亦可用蛋白印 迹和用鼠单克隆抗体进行免疫荧光分析来确定(Biogenesis, Sandown， NH)。 要产生表达NS3， NS4和NS5的稳定转染细胞系，用含有感兴趣的病毒基因插 入物的pcDNA3质粒电穿孔转染同系的BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。将 在G418选择下能生长的细胞用有限稀释(0.3细胞/ L)法克隆，并用上述 的方法筛选。pcD3和pcD3. 1质粒分别含有新霉素或叶霉素(Zeomycin)抗性基因， 被用来克隆HCV非结构基因和产生稳定的同系的靶细胞系。用这些构建物瞬 时转染HuH-7细胞，并用卩一半乳糖苷酶试验控制转化效率后，在无甲硫氨酸 和胱氨酸的培养基中饥饿细胞30分钟，并用35硫一甲硫氨酸和胱氨酸标记4 小时。用对非结构蛋白特异性的多克隆兔血清免疫沉淀细胞裂解物，使之被 琼脂糖凝胶A珠捕获，用SDS — PAGE电泳，然后放射自显影分析。1， 3， 5 泳道是模拟DNA转染的细胞，作为阴性对照(模拟)。2， 4和6显示了约NS3 70， NS4 30， NS5 125kD的特异性条带。(7—10泳道)SP2/0细胞被pcD3 为基础的含有NS3， NS4和NS5的构建物转染，在抗生素选择后，将细胞经有 限稀释(0.3细胞/孔)法克隆，扩增，用放射性标记或免疫沉淀对NS3分析， 或如上所述用蛋白印迹法对NS5进行分析。第7和第9泳道代表作为阴性对 照(SP2 — 19)的稳定表达HCV —核心蛋白的细胞中得到的细胞裂解液，，8 和10泳道为NS3和NS5的特异表达。这些细胞被用作体外刺激和作为CTL试 验的耙细胞。实施例3:免疫方案雌性BALB/c ( h-2d )小鼠在标准无病原体条件下在麻省总医院(Massachusetts General Hospital)的动物设施中培养。小鼠从Charles River实验室(Wilmington, MA)获得，在6至20周龄时用于体内研究。将总 量为lOOpg的质粒DNA (以100|il的0. 9%的氯化钠溶液配制)注射2和3 次，在5个不同位点上注射入小鼠的股四头肌。每隔14天，在另一条腿上加 强注射。作为所有免疫学实验的阳性对照，将5jag的配于完全弗氏佐剂(CFA) 的重组NS3， NS4，和NS5非结构蛋白(Mikrogen， Munich)在第0日经腹膜 注射入小鼠，并用等量的以0. 05%的SDS配的蛋白在4周和8周后作加强注 射。作为这些实验的阴性对照，使用空白质粒载体和重组的乙型肝炎病毒表 面抗原(HbsAg) (Energix， Smith Kline Beecham， Philadelphia)。 所有小鼠 在最后一次免疫后10日后被处死。实施例4:体液免疫应答的测定 用已建立的ELISA法测定每只免疫动物血清中的抗NS3， NS4和NS5的 抗体水平。简单的说，用上述的重组蛋白包裹微量滴定板(Falcon， Microtest IIIM Flexible Assay Plate) ， 4。C过夜。(0. 5pg/孔)。20。C用胎牛血清封 闭2小时后，在板中加入l: 50的鼠血清，2(TC培养另一小时。用含有O. 05% 的Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)洗涤4次后，加入l: 2000稀释度的，用 辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体(Amersham， Arlington Heights, IL)。培养1 小时后，洗涤滴定板，加入底物显色，在自动阅读机上读数。三次免疫接种后，用ELISA试验在所有免疫动物中发现了针对所有3种 非结构蛋白的特异性抗体反应。用模拟DNA (见图2A)免疫的小鼠中未检测 到抗原特异性免疫应答。作为阳性对照，小鼠用与完全弗氏佐剂(CFA)结合 的重组NS3， NS4和NS5非结构蛋白三次腹腔内接种后，如预料的，显示了强 烈的体液免疫应答(数据未显示)。图2A显示了对以DNA为基础的免疫产生的对NS3， NS4和NS5的体液免 疫应答。用ELISA法(每组n=5)测定血清抗体水平。对照包括用BSA和模 拟免疫小鼠的血清包裹的孔。作为阳性对照的小鼠用重组蛋白腹膜内免疫(数 据未显示)。图2B显示在用特异性或非特异性的重组蛋白体外刺激3日后测 定的T细胞增殖情况。细胞与tf'—胸苷一起培育18小时然后收集。Acpm用 扣除背景活性(如不加抗原培养)的方法测定。和lpg的重组NS3蛋白培 育的细胞有毒性，因此未见增殖。用和CFA联合的重组蛋白免疫的小鼠有5 到10倍的更强反应(数据未显示)。实施例5:淋巴细胞增殖以及细胞因子释放分析用异氟烷(Aerrane， Anaquest，NJ)麻醉小鼠，并收集脾细胞。用0.83 %的NHX1/0. 17M Tris pH7.4， 25。C培养5分钟，以除去红细胞。脾细胞洗 涤两次，用96孔圆底滴定板以每孔5xl()5细胞，200^1含有10%FBS和2 —巯 基乙醇的完全DMEM(极限必须培养基)(Mediatech， Washington, DC) —式3 份培养。用重组非结构蛋白(NS3， NS4和NS5) (Mikrogen， Munich)在不同浓 度下O，O. 01,0. 1和l|ag/ml)刺激。作为阴性对照，用重组HCV —核心蛋白或 HbsAg蛋白(Energix)在相同浓度下刺激效应细胞。在刺激3日后，加入3H — 胸苷(lpgCi/孔)。再培养细胞18小时，收集后测定掺入DNA的3H—胸苷。 掺入的放射活性用背景活性修正(Acpm)。为检测细胞因子的释放，将效应 细胞按上述培养，用商业试剂盒按照厂商说明(Endogen， Boston, MA)测定 培养上清液中的IL一2， IL一4以及干扰素y水平。为了检査对非结构蛋白的细胞介导的免疫应答，收集脾细胞并用重组抗 原或用体外稳定转染的细胞系表达的抗原再刺激。如用3H—胸苷掺入法所测 定(见图2B)的那样，不同抗原浓度的所有非结构蛋白都诱导了实质性的淋 巴细胞增殖。用重组蛋白腹膜免疫，作为产生最大刺激的方法，对所有三种 蛋白产生了强至5到10倍的淋巴细胞增殖速率(数据未显示)。DNA为基础 的免疫后测定的细胞因子分布图显示具有高水平y —干扰素(图2C)和IL一 2 (图2D)分泌入细胞培养基的Tl应答。相反的，在用编码HCV非结构蛋白 的基因进行基因免疫后，只检测到很少的IL一4产生(图2E)。图2C， 2D以及2E显示了体外刺激48小时后检测到的分泌入培养上清液 中的细胞因子。编码NS3， NS4和NS5的DNA构建物诱导了 TJ —型的细胞因 子分布。为了比较，显示了用重组蛋白(n二4)腹膜免疫小鼠三次的结果。作 为阴性对照，用重组HbsAg免疫小鼠。实施例6:细胞毒T一淋巴细胞活性将免疫小鼠脾细胞以含有10%FCS和2 —巯基乙醇的完全DMEM悬浮 (5x10—5M)并在体外刺激5日后分析细胞毒活性。以5U/ml的浓度一次加入 重组小鼠IL一2，将反应细胞(4xl07)与2xl(T个经照射的(10， 000rad)同
系的稳定表达全长NS3或NS5蛋白(SP2/NS3 — 3， SP2/NS5 — 21)的SP2/0细 胞共培养。5日后，收集细胞毒效应淋巴细胞群，用5'Cr标记的SP2/NS3 — 3 或SP2/NS5 — 21，在96孔圆底滴定板中进行4小时51Cr释放试验。亲代SP2/0 或表达HCV核心蛋白的SP2—19被用作裂解液的抗原特异性和背景活性的对 照。CTL活性试验以效应淋巴细胞对靶细胞(E: T)分别为100: 1， 30: 1， 10: 1以及3: 1的比例进行。用含有杂交瘤上清液GK1.5(抗CD4，大 鼠)；3. 155(抗CD8，大鼠)的抗CD4 +或CD8 +单克隆抗体，在4。C，培育效应 细胞30分钟，洗涤，然后37。C与补体(l:5稀释度的低毒性兔补体(Cedarlane Laboratories, Ontario, Cananda)) —起培育，进行T细胞缺损试验。由于CTL应答是从感染细胞中消除病毒，因此用51Cr释放实验来分析免 疫小鼠脾细胞裂解稳定转染并表达NS3和NS5蛋白的同系SP2/0小鼠骨髓瘤 靶细胞的能力。体外刺激5日后，NS3和NS5免疫的小鼠显示了强而特异性 的细胞毒T细胞应答，而对作为靶细胞特异性对照的SP2/0或SP2—19 (稳 定表达HCV核心蛋白)只观察到低活性(表3A和表3B)。为说明产生特异 性裂解的细胞的表型，将脾细胞和CD8 +或CD4 +反应活性的单克隆抗体 (inAbs)在补体存在下共培养，CD8 +细胞介导的细胞毒活性见表3C。我们无 法建立稳定表达NS4蛋白的SP2/0细胞系，因此对该HCV非结构蛋白未测量 CTL活性。图3显示了细胞毒T细胞(CTL)在不同的效应细胞对靶细胞的比例(100: 1， 30: 1， 10: 1， 3: 1)的情况下对NS3 (A)和NS5 (B)的反应。脾细胞 与被照射的稳定的NS3和NS5表达的小鼠骨髓瘤细胞在体外共培养5天 (n=5)。然后，进行4小时5'Cr释放实验来测定对稳定转染的耙细胞系的CTL 活性。扣除对SP2/0或SP2—19 (表达HCV核心蛋白)的背景活性以揭示特 异性裂解值。图3C显示了 T细胞缺损实验(n=3)，将细胞与抗CD8 +或CD4 +单克隆抗体一起在冰上培育30分钟，然后与补体37。C培育30分钟。对照 细胞不和补体以及抗CD8 +或抗CD4+的单克隆抗体一起培育。测定了作为非 相关阴性对照细胞系，即稳定转染了 HCV核心蛋白表达构建物的SP2—19细 胞的背景活性。实施例7:体内细胞毒T淋巴细胞活性的评估CTL实验极难进行，因为直到现在也无人能够建立用于CTL活性测定的，
表达非结构蛋白的稳定细胞系。将小鼠用模拟DNA或pApNS5载体肌肉(i.ra.) 免疫三次。一些动物还用重组NS5蛋白或两者的组合腹膜免疫。重组蛋白(5iig 腹膜内注射)作为NS5 — 4 (aa2622-2868)和NS5-12 (aa2007-2268)的大肠杆 菌表达蛋白(Mikogen， Munich, Germany)，涵盖了 HCV — NS5a和HCV — NS5b部分 区域(大约NS5全长的50%)的混合物提供。用多种质粒构建物或重组蛋白 最后一次免疫的一周后，洗涤2xl06的稳定表达NS5的同系SP2/0衍生细胞， 在200^1的PBS中重悬浮，并作右侧皮下接种。SP2/0细胞表达HCV NS5 (SP2/NS5 — 21)或HCV核心蛋白SP2/19。在这个动物模型中，在皮下接种 15天后评价肿瘤形成，测定患肿瘤的动物数和肿瘤的重量。
只有40X的用模拟DNA免疫，并用表达NS5的小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/NS5 一21)攻击的小鼠在15日后生成了肿瘤。另外，以肿瘤重量的测定来确定肿 瘤的大小，与用模拟丽A或重组NS5蛋白免疫的小鼠，或用同样的表达不同 的HCV结构蛋白(HCV核心蛋白)的，作为对照的同系SP2/0细胞系免疫的 小鼠比较，肿瘤尺寸要小些(图4A和4B)。事实上，90—100%的用模拟DNA 免疫，并用SP2—19细胞攻击的小鼠显示出肿瘤的形成，因此显示了在该小 型动物模型中的CTL活性的特异性。强调用完全弗氏佐剂配的重组NS5蛋白 来免疫不能保护动物避免形成肿瘤，这一点很重要。为了评估DNA为基础的 免疫和重组蛋白疫苗联合的效果，用二者同时免疫一组动物，产生了防御存 在对肿瘤形成的部分保护力，但这种方法不如用编码NS5蛋白的DNA免疫动 物三次那样有效。
图4A显示用评价CTL活性的一种肿瘤模型获得的代表性结果。小鼠用 pApNS5或模拟DNA (lOO)ag)肌肉注射，或用重组NS5蛋白腹膜内注射(5pg) 免疫三次。最后一组动物接受了联合DNA免疫和重组蛋白。用SP2NS5 — 21或 SP2—10细胞进行肿瘤攻击15日后，长出肿瘤的小鼠的数量以及肿瘤的重量 被测定。图4B，自左至右，显示了用模拟DNA免疫，并用SP2/NS5 — 21细胞 攻击的动物；用pApNS5免疫，并用SP2/NS5 — 21攻击的动物；用pApNS5免 疫，并用SP2—19 (稳定表达HCV核心)攻击的动物；以及用重组NS5蛋白 腹膜内注射三次，并用SP2/NS5 —21细胞攻击的动物。在第一、三和第四组 动物的右体侧上有大肿瘤形成，而第二组没有，它是用pApNS5免疫，并用稳 定表达NS5的小鼠骨髓瘤细胞系攻击的。
序列表
<110>总医院有限公司(THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION)
<120〉采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
〈130> 003095F1
<150> US 60/073， 156 <151〉 1998-01-30
〈160〉 8
<170〉 Patentln version 2.0
<210〉 1
<211> 9
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<220〉
<223>人.T.序列的描述合成序列 <400〉 1
gccgccatg 9
<210> 2 <211> 341 <212〉 DNA <213〉 人工序列
〈220〉
<223〉人工序列的描述合成序列
〈400〉 2
gccagcccccgattgggggcgacactccaccatagatcactcccctgtgaggaactactg60
tcttcacgcagaaagcgtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggac120
cccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccag180
gacgaccgggtcctttcttggatcaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgccccc240
gcgagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagg300
gtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtagaccgtgcacc341
<210〉 3
<211〉 28
<212〉 DNA 〈213〉 人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述合成序列
<400〉 3ggtctagatt gatggcgccc atcacggc 28
<210> 4 <211〉 29 <212〉腿 <213〉 人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 4
cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt 29
<210〉 5
〈211〉 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
〈223〉人工序列的描述合成序列 <400> 5
ggtctagatg agcacctggg tgctc 25
<210〉 6
<211〉 27
<212〉 DNA <213〉 人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 6
ccaggatcct cagcatggag tggtaca 27
<210> 7
<211> 39
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<223〉人T.序列的描述合成序列 <400〉 7
tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga 39
<210〉 8 〈211〉 30 <212〉 DNA <213〉 人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 8
agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt
权利要求
1.一种重组核酸分子，其特征在于，它包含编码丙型肝炎非结构蛋白NS4的核苷酸序列，其中所述重组核酸不编码NS2蛋白。
2. 如权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和 人类细胞中有功能性的调控元件可操作性相连，所述有功能性的调控元件选 自启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及任选的丙型肝炎病毒5'UTR。
3. 如权利要求2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述启动子是巨细 胞病毒启动子，所述增强子是Rous肉瘤病毒增强子。
4. 一种包含权利要求1中所述核酸分子的重组宿主细胞。
5. —种药物组合物，其特征在于，包含a) 如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列 和人类细胞中功能性的调控元件可操作性相连，所述有功能性的调控元件选 自启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及任选的丙型肝炎病毒5'UTR;以及b) 药物接受载体或稀释剂。
6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述启动子是巨细胞 病毒启动子，所述增强子是Rous肉瘤病毒增强子。
7. 如权利要求5所述的药物组合物，它还包含促进剂。
8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述促进剂是丁哌卡因。
9. 权利要求1所述的重组核酸分子的用途，用于制备在未感染丙型肝炎 病毒的人体中诱导对丙型肝炎病毒的免疫应答的药物。
10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫应答包括细胞应答。
11. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫应答包括体液应答。
12. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述重组核酸分子存在于 包含有药物接受载体或稀释剂的药物组合物里。
13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含促 进剂。
14. 如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述促进剂是丁哌卡因。
15. 权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备对丙型肝炎病毒易感的人免疫的药物。
16. 如权利要求15所述的用途，其特征在于，在给予所述药物组合物的 部位给予丁哌卡因。
17. 权利要求1所述的重组核酸分子的用途，其特征在于，用于制备对丙型肝炎病毒易感的人免疫的药物。
18. 权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗丙型肝炎病毒感染的药物。
19. 如权利要求18所述用途，其特征在于，在给予所述药物组合物的 部位给予所述人丁哌卡因。
全文摘要
本发明公开了一种编码丙型肝炎非结构蛋白的核酸分子(包括具体公开的DNA序列)。还公开了药物组合物，它包含编码NS3、NS4和NS5，或它们组合的核苷酸序列的丙型肝炎非结构蛋白的核酸分子，该核酸分子和人体细胞内功能性的调控元件可操作性相连。还公开了对丙型肝炎病毒易感或被感染的个体进行免疫的方法，该方法包括施用这些药物组合物。
文档编号A61K48/00GK101126095SQ20071013989
公开日2008年2月20日 申请日期1999年1月28日 优先权日1998年1月30日
发明者J·万德斯, J·恩克 申请人:总医院有限公司