专利名称：：用于活性分子给药的壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒的制作方法用于活性分子给药的壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒发明领域本发明涉及纳米颗粒体系，其可用于释放药理学活性分子，尤其可用于将多核苷酸转染入细胞。它针对包含低分子量壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒的体系，和包含它们的药物和化妆品组合物，以及它们的制备方法。
背景技术：
：用于治疗目的的生物活性分子的给药存在许多困难，取决于给药途径以及分子的物理化学和形态学特征。已知主要的缺点出现在不稳定或大尺寸活性分子的给药时。大分子进入有机体内部受生物学屏障的低渗透性限制。此外，由于人和动物体都具有的不同的防御机制使得它们容易被降解。已经证实，将大分子并入纳米尺寸的体系使它们更容易透过上皮屏障并防止它们被降解。因此，能够与所述屏障相互作用的纳米颗粒体系的设计被作为有前途的策略提出，以便实现活性成分通过粘膜的渗透。也已知这些体系穿过外部屏障ii7v生物体内部的能力取决于其尺寸及其组成。与较大尺寸的颗粒相比，小尺寸颗粒会增加转运程度；直径小于1/mi的纳米颗粒符合这种标准。如果它们是由天然的和生物相容的聚合物制备的，那么它们被自然地通过已知的转运机制并且不改变上皮生理学地通过生物体粘膜转运的可能性增加。在这种意义上，壳聚糖已经在纳米颗粒体系的制剂(WO-A-01/32751、WO-A-99/47130、ES2098188)中被用作天然的和生物相容的聚合物，这是由于其向纳米颗粒提供正电荷，这允许了通过阴离子特性的生物学环境的吸收和/或其对带负电荷的生物膜的粘附。用于建立这些体系的另一聚合物是透明质酸，其为存在于结締组织的胞外基质以及眼球的玻璃体和关节腔的滑液中的天然聚合物。它是生物可降解和生物相容的聚合物，不具有免疫原性并具有粘膜粘附性。另外，乙酰透明质酸与存在于多数细胞中的CD44受体相互作用。因此，文献WO89/03207和Benedetti等人的论文Jowma/o/Co^ra〃^/i^/mse13,33-41(1990)示出了按照溶剂蒸发法制备透明质酸微球。此外，文献US6，066,340涉及使用溶剂提取技术获得所述微球的可能性。文献US2001053359提出用于鼻内给药的抗病毒和生物粘附材料的组合，其呈现为由不同材料组成的溶液或微球的形式，所述不同材料包括明胶、壳聚糖或透明质酸等，但不包括其混合物。该微粒通过诸如雾化和溶剂乳化/蒸发的经典技术获得。一旦获得，即通过常规化学交联方法(二醛和二S同)使该微粒硬化。壳聚糖(或其它阳离子聚合物)和透明质酸的组合已经在微米和纳米颗粒体系中被提出，目的在于将透明质酸的粘膜粘附作用与壳聚糖的吸附促进作用结合起来，并增强纳米颗粒与上皮屏障的相互作用和吸附。这种纳米颗粒组合的价值反映在Lim等人，Qw/ra〃.ie/.66,2000，281-292和Lim等人，/"./.」P/wmz.23，2002,73-82的著作中。与前述文件相同，这些微粒是通过溶剂乳化-蒸发技术制备的。文献US6,132,750涉及含有至少一种蛋白(胶原、明胶)的小尺寸颗粒(微米和纳米颗粒)的制备，并涉及它们表面上的多糖(壳聚糖或粘多糖如透明质酸等等)。它们通过与形成酰胺键或酯键及任选的无水键(anhydrousbond)的多官能酰化剂界面交联而形成。文献WO2004/112758涉及用于活性分子给药的纳米颗粒体系，其中纳米颗粒通过包含诸如分子量为125kDa至150kDa的壳聚糖的阳离子聚合物、胶原质或明胶以及透明质酸盐的网状结合物构成。它们通过呈现不同电荷的两种聚合物之间的静电相互作用和交联剂存在下的促离子型交联而形成。然而，与这些体系相关的主要缺点是一旦纳米颗粒被并入生物学环境中时其在所述环境中的^f氐生物降解性能。虽然众所周知，透明质酸或其相应的盐在细胞内被透明质酸酶有效地降解，但是壳聚糖生物降解性能受到高度怀疑而且活性分子的递送不像期望的那样有效。这一事实能够显著降4氐存在于纳米颗粒中的活性分子的释》文的有效性。此外，这些体系中所用的壳聚糖在高于6.6至6.8的pH下不稳定，这降低了其在诸如DNA的生物活性分子的给药时的适用性。在向细胞转染诸如DNA和RNA的核苷酸分子用于基因治疗的情况下，需要能够以尽可能低的毒性和高转染效率有效地将分子引入靶细胞的递送体系。所引入的分子被充分地释放并且尽可能有效地发挥其作用是很重要的。为了让患者接受，包含这些分子的体系应当稳定并且容易给予。因此，亟需发现用于释放活性成分的体系，所述体系允许非常有效地并入生物体系以及生物环境中纳米颗粒迅速地生物降解。此外，这些体系应当容易生产并且在储存和运输时保持稳定。在基因治疗的具体情况下，需要在靶细胞的转染方面尽可能有效并且方便患者的体系。发明概述本发明人已经发现，包含含有分子量小于90kDa的壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒的体系，除了能够有效地締合生物活性分子，还能够允许纳米颗粒在生物环境中有效而且容易地降解，从而有利于活性分子的释放。在体外研究中已经观察到，由于细胞内吞作用以及与细胞膜特异性受体的相互作用，本发明的体系能够实现细胞中纳米颗粒的有效内化。此外，体内研究已经证实本发明的纳米颗粒进入诸如角膜上皮细胞的上皮细胞的能力以及以非常有效的方式递送DNA-质粒从而达到重要转染水平的能力，这使得本发明的体系成为某些疾病的基因治疗的新策略。甚至在纳米颗粒已经预先进行冷冻千燥处理时也观察到了这种转染效率，这使得本发明的体系能够进行储存而不影响其性能和稳定性。取决于组成，本发明的纳米颗粒体系在6.4至8.0的pH下出奇地稳定，这使其能够多方面地用于不同的给药形式，包括鼻内给药、口服给药和局部应用，并且这保证纳米颗粒在7.4的血浆pH下的稳定性。这种稳定性对于"体外"应用中的转染细胞培养物也是至关重要的。因此，本发明的目的涉及用于释放生物活性分子的体系，其包含平均尺寸小于l微米的纳米颗粒，其中纳米颗粒包含a)乙酰透明质酸或其盐；以及b)壳聚糖或其衍生物，其特征在于壳聚糖或其衍生物的分子量小于90kDa。本发明的第二目的涉及上述体系，其还包含生物活性分子。在具体实施方案中，所述生物活性分子选自多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、核酸及其混合物。在本发明的具体实施方案中，纳米颗粒为冻干形式。本发明的第三目的涉及包含如上定义的体系的药物组合物。本发明的另一目的涉及包含如上定义的体系的化妆品组合物。本发明的另一目的涉及如上定义的体系的制备方法，其包含a)制备乙酰透明质酸或其盐的水:容液；b)制备壳聚糖或其衍生物的水溶液；c)向乙酰透明质酸的水溶液中加入网化剂；以及d)在搅拌下混合b)和c)中获得的溶液，纳米颗粒自发形成；其中，任选地，将生物活性分子在纳米颗粒形成之前溶于先前的水溶液b)或c)的任一水溶液中，或者溶于步骤d)中获得的纳米颗粒悬浮液中。在具体实施方案中，这种方法在步骤d)之后还包括另外的步骤，其中纳米颗粒;故冻干。最后，本发明的另一目的涉及如上定义的体系在制备用于基因治疗的药物中的用途。附图简述图1:质粒pGFP在纳米颗粒体系中的包封率。图2:质粒pGFP的持续体外释放。聚合物质量比HA:CS或HA:CS01:2;时间点0.5、1、4和24h;壳多糖酶活性0.105U。图3:向三种不同细胞系(HEK293、NHC和HCE)给予含有重量比为2:1的壳聚糖(CSO)和透明质酸盐(HA)的纳米颗粒时的体外细胞毒性。图4:使用HEK293作为细胞系(lh孵育)，给予含有重量比为2:1的壳聚糖(CSO)和透明质酸盐(HA或HAO)的纳米颗粒时的体外细胞毒性。图5:共焦显微镜图像，显示从含有重量比为2:1的壳聚糖(CS或CSO)和透明质酸盐(HA或HAO)的纳米颗粒向HEK293细月包系递送DNA-质粒pGFP2、4、6、8和10天后的细胞转染效率。图6:从含有重量比为1:1的壳聚糖(CS或CSO)和透明质酸盐(HA或HAO)的纳米颗粒向HEK293细胞系递送DNA-质粒pGFP时的细胞转染效率。图7:共焦显微镜图像，显示孵育后1小时和12小时后的体外细胞摄取。制剂重量比为l:2的HAO:CSO;HAO:CS和HA:CS，加载有1。/。的质粒pGFP。图8:共焦显微镜图像，显示在a)37°C;b)4°C和c)用AbHermes1阻断CD44受体的4°C下，通过使用细胞系HCE的细胞对纳米颗粒的内化。制剂重量比为1:2的HA:CSO。图9:共焦显微镜图像，显示作为时间(2、4和12小时)的函数的纳米颗粒在角膜上皮细胞中的降解。制剂重量比为1:2的HA:CSO和HA:CS。图10:共焦显微镜图像，显示编码的绿蛋白(encodedgreenprotein)在兔角膜上皮细胞中的表达。制剂加载有质粒pEGFP的重量比为1:2的HA:CSO和HA:CS。图11:共焦显微镜图像，显示从含有重量比为1:2和2:1的壳聚糖(分子量为14、31和45kDa)和透明质酸的冻干纳米颗粒中向HEK293细胞系递送DNA-质粒pEGFP4天后的细胞转染效率。发明详述本发明的体系包含纳米颗粒，其结构为乙酰透明质酸和分子量小于90kDa的壳聚糖的网，其中能够并入生物活性分子。该结构通过电相互作用保持在一起，在它们之间基本没有共价键。术语"纳米颗粒"应被理解为通过壳聚糖和乙酰透明质酸之间的静电相互作用和通过所述结合物经由加入阴离子网化剂的促离子型凝胶化而形成的结构。纳米颗粒的不同聚合物组分之间发生的静电相互作用以及随后的网化产生独立的及可观察的特征性物理实体，其平均尺寸小于l/rni，即，平均尺寸为1至999nm。术语"平均尺寸"应被理解为包含在水介质中一起运动的聚合网状结构的纳米颗粒集合的平均直径。这些体系的平均尺寸能够使用本领域技术人员已知的标准方法进行测量，这些方法描述于例如下文的实验部分。本发明的体系的纳米颗粒的平均粒径小于1|^im，即它们的平均尺寸为lnm至999nm,优选为50nm至500nm，甚至更优选为100nm至300nm。颗粒的平均尺寸主要受壳聚糖相对于乙酰透明质酸的比例、壳聚糖脱乙酰基化的程度以及颗粒形成条件(壳聚糖和乙酰透明质酸浓度、网化剂浓度及它们之间的重量比)的影响。纳米颗粒可以具有表面电荷(通过Z电势测量)，其随着纳米颗粒中壳聚糖和乙酰透明质酸的比例而变化。对正电荷的贡献归因于壳聚糖的胺基团，而对负电荷的贡献归因于乙酰透明质酸的羧基。根据壳聚糖/乙酰透明质酸比例，电荷大小可以为-50mV至+50mV。通常受关注的是，表面电荷为正电荷以促进納米颗粒与带负电荷的生物表面、尤其是粘膜表面的相互作用。这样，生物活性分子会有利地在耙组织上起效。然而，在某些情况下，为了保证纳米颗粒肠胃外给药后的稳定性，中性电荷可能更适合。由于氢键、疏水和受体亲和力相互作用的存在，负电荷也能够受到关注以便向粘膜表面给药。壳聚糖壳聚糖是来自曱壳质(聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)的天然聚合物，其中N上乙酰基的重要部分已通过水解反应除去。脱乙酰化程度优选大于40%，更优选大于60%。在一变体中，其为60%至98%。其具有氨基多糖结构及阳离子性质。其包含通式(I)的n个单体单元的重复10其中n是整数，以及m个单元具有乙酰化的胺基团。n+m的和表示聚合度，即壳聚糖链中单体单元的数目。用于生产本发明纳米颗粒的壳聚糖的特征在于，其具有低分子量，这应被理解为具有分子量为小于90kDa、优选为1kDa至卯kDa的如上文所述的壳聚糖或其衍生物。在优选实施方案中，壳聚糖的分子量优选为1kDa至75kDa，更优选为2kDa至50kDa，甚至更优选为2kDa至30kDa。尤其优选约2kDa至约15kDa的范围。具有这样的分子量的壳聚糖可通过本领域技术人员公知的方法获得，如使用不同比例的NaN02使壳聚糖聚合物氧化还原。还能够使用壳聚糖的衍生物作为其替代，这应被理解为为了增加壳聚糖的溶解性或增加其粘附性质而将其中一个或多个羟基基团和/或一个或多个胺基团进行修饰的分子量小于卯kDa的壳聚糖。这些衍生物包括乙酰化的、烷基化的或磺化的壳聚糖、巯基化的衍生物等等，如Robert,C/n'"ViC/iemWo;(f壳素化学,Macmillan，1992，166中所述。优选地，当使用衍生物时，其选自O-烷基醚、O-酰基酯、三曱基壳聚糖、被聚乙二醇修饰的壳聚糖等等。其它可能的衍生物为盐，如柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐等等。在任何情况下，本领域技术人员了解如何识别能够在壳聚糖上进行而不影响制剂的稳定性和商业可行性的》务饰。具有低于90kDa的分子量的壳聚糖或其衍生物的使用与本发明的体系尤其相关，这是因为含有它的纳米颗粒一旦被引入生物环境中能够被有效除去，达到生物活性分子的更有效递送。乙酰透明质酸乙酰透明质酸是广泛分布于结締组织、上皮组织和神经组织的粘多糖。它是胞外基质的主要组分之一，通常明显地促进细胞增殖和迁移。乙酰透明质酸是包含二糖结构的重复的线性聚合物，所述二糖结构通过D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺的交替加成而形成，通过交替的/3-1，4和/3-1，3糖苷键连接在一起，如式(II)所示其中整数w代表聚合度，即乙酰透明质酸链中二糖单元的数目。两种糖在空间上都与葡萄糖相关，/3构型的葡萄糖允许其所有的大基团(羟基、羧酸酯部分和相邻糖上的异头碳)处于空间上有利的平伏位置，而所有小的氢原子都占据空间上较不利的轴向位置。用于生产本发明的纳米颗粒的乙酰透明质酸的分子量为2kDa至160kDa。在本发明的具体实施方案中，乙酰透明质酸是分子量为2kDa至50kDa、优选2kDa至10kDa的J氐聚物。高分子量的乙酰透明质酸可以商购，而较低分子量的乙酰透明质酸能够通过例如使用透明质酸酶使高分子量乙酰透明质酸碎裂获得。本说明书中使用的术语"乙酰透明质酸，，包括透明质酸或其共轭碱(透明质酸盐)。该共轭碱能够是透明质酸的碱性盐，其包括诸如钠、钾、钙、铵、镁、铝和锂盐的无机盐以及诸如碱性氨基酸盐的有机盐。在本发明的优选实施方案中，碱性盐是透明质酸的钠盐。乙酰透明质酸是天然的亲水多糖，无毒、生物可降解而且生物相容它具有粘膜粘附性，而且与细胞膜中存在的CD44受体特异性结合，从而有利于其与细胞的相互作用。在本发明的变体中，体系中乙酰透明质酸/壳聚糖的重量比为2:1至1:10，优选2:1至l:2重量:重量。不推荐较低的壳聚糖比例，因为会产生聚集体或聚合物溶液。无论纳米颗粒的组成(壳聚糖-乙酰透明质酸比例和乙酰透明质酸的分子量、多聚物或低聚物)如何，将纳米颗粒尺寸保持在1微米以下，优选500nm以下，更优选300nm以下。在一实施方案中，其为250nm以下，更优选200nm以下。该尺寸允许纳米颗粒透过诸如角膜上皮细胞的上皮细胞，并递送生物活性分子。本发明的体系的纳米颗粒通过壳聚糖-乙酰透明质酸体系在网化剂存在下的促离子型凝胶化而形成，所述网化剂允许离子凝胶化，有利于纳米颗粒的自发形成。在具体实施方案中，网化剂是阴离子盐。优选地，网化剂为三聚磷酸盐，更优选使用三聚磷酸钠(TPP)。网化方法非常简单并且是本领域技术人员已知的，如发明背景中描述的那样。本发明的壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒提供了具有高生物活性分子締合容量的体系，无论生物活性分子是在纳米颗粒内还是吸附于其上。无论乙酰透明质酸的分子量和壳聚糖-乙酰透明质酸重量比如何，纳米颗粒都显示出高于卯％的活性分子締合效率。因此，本发明的另一方面涉及还包含生物活性分子的如上所述的体系。术语"生物活性分子"涉及任何用于处理、治疗、预防或诊断疾病或用于改善人和动物的生理和心理健康的物质。根据本发明，无论其溶解性特征如何，乙酰透明质酸和壳聚糖的纳米颗粒都适合并入生物活性分子。締合容量会取决于所并入的分子，但是概括地说，无论对于亲水分子和具有高度疏水性的分子，締合容量都会很高。这些分子可以包括多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、核酸及其混合物。在本发明的优选实施方案中，生物活性分子是多核苷酸、优选DNA-质沣立，如pEGFP、pBgal和pSEAP。在另一优选实施方案中，生物活性分子是诸如肝素的多糖。本发明的另一目的是包含前述定义的纳米颗粒体系的药物组合物。药物组合物的实例包括用于口服、经颊、舌下、局部、眼部、鼻内或阴道给药的任何液体组合物(即本发明的纳米颗粒的混悬液或分散液)，或凝胶、软膏、乳膏或香膏形式的用于其局部、眼部、鼻内或阴道给药的任何组合物。在本发明的变体中，组合物用于眼科给药。在这种情况下，纳米颗粒表面带正电荷，使得纳米颗粒通过其与带负电荷的粘膜和角膜上皮细胞表面的相互作用，为药物提供在眼表面上的较好吸收。相对于体系的总重量，在纳米颗粒中并入的活性成分的比例可以达到高达40%重量比。然而，在每一情况下，合适的比例会取决于待并入的活性成分、其应用的适应症和递送效率。在并入诸如DNA质粒的多核苷酸作为活性成分的具体情况下，其在所述体系中的比例会是1%至40%重量比，优选5%至20%。在并入诸如肝素的多糖时，包含在体系中的这种成分的百分数会是1%至40%，优选10%至30%。本发明的另一目的涉及包含前述定义的纳米颗粒体系的化妆品组合物。这些化妆品组合物包括任何液体组合物(纳米颗粒的悬浮液或分散液)或包含本发明的体系并且以凝胶、乳膏、软膏或香膏形式用于其局部给药的任何组合物。在本发明的变体中，化妆品组合物还可以并入虽然没有任何治疗效果但是具有作为化妆品剂的性质的亲脂性和亲水性活性分子。在可以并入纳米颗粒中的活性分子中，能够列举的是软化剂、防腐剂、芳香物质、抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头屑剂、脱色剂、抗皮脂溢剂、染料、防晒霜、紫外光吸收剂、酶、芳香物质，等等。在另一方面，本发明涉及包含如上所述的纳米颗粒的本发明的体系的制备方法。所述方法包括，一方面，制备浓度优选为0.1mg/mL至5mg/mL的乙酰透明质酸水溶液，另一方面，制备浓度优选为0.1mg/mL至5mg/mL的壳聚糖水溶液。网化剂的并入通过溶于乙酰透明质酸水溶液而进行，浓度优选为0.01mg/mL至1.0mg/mL。随后，在搅拌下混合含有乙酰透明质酸和网化剂以及含有壳聚糖的两种水溶液，从而在水悬浮液中自发产生纳14米颗粒。任选地，将生物活性分子溶于含有壳聚糖的水溶液中或者含有乙酰透明质酸和网化剂的水溶液中，以^更并入纳米颗粒内部。在另一实施方案中，一旦形成纳米颗粒，能够将活性分子溶于水悬浮液中以便吸附在纳米颗粒表面上。在该方法的变体中，当生物活性分子表现出亲脂性时，在将其并入前述定义的任一水溶液之前，将其溶解于小体积的比例优选约1:1的水和诸如乙腈的可与水混溶的有机溶剂的混合物中，然后将所述混合物加入至前述水溶液之一，使得终溶液中有机溶剂的重量比浓度总是小于10%。在这样的情况下，必须将有机溶剂从体系中除去，除非它是药物可接受的。本发明的壳聚糖-乙酰透明质酸纳米颗粒的制备方法还能够包括另外的步骤，其中所述纳米颗粒被冻干。从药学观点来看，能够以冻干形式获得纳米颗粒很重要，因为这改善了它们储存期间的稳定性并减小了待操作产品的体积。可以将壳聚糖-乙酰透明质酸纳米颗粒在1%至5%浓度的诸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖的低温防护剂存在下冻干。事实上，本发明的纳米颗粒具有另外的优势，即冻干前后的粒径没有显著改变。换句话说，该纳米颗粒具有能够被冻干和重新悬浮而不改变其特征的优势。已经证实本发明的体系是高效的载体，能够与上皮细胞相互作用并具有很大的容量以促进多核苷酸向细胞的转染。该体系包含的纳米颗粒能够并入细胞遗传材料如基于核酸的分子、寡核苷酸、siRNA或多核苷酸，优选编码所关注蛋白的质粒DNA,从而使它们成为基因治疗的潜在载体。在具体实施方案中，质粒DNA是pEGFP或pSEAP。在三种不同的细胞系如HEK293(人胚肾细胞系)、HCE(人角膜上皮细胞系)和NHC(正常人结膜细胞系)中的体外研究以及在某些动物的眼上皮细胞中的体内研究已经表明，本发明的体系中包含的纳米颗粒显示非常低的细胞毒性，并且它们能够通过细胞内吞作用和与细胞膜上特异性受体的相互作用被细胞内化。随后通过乙酰透明质酸的生物降解和壳聚糖的清除和生物降解而进行的纳米颗粒的降解允许DNA-质粒以非常有效的方式递送，达到高而长时间的转染水平，例如超过25%的转染的细胞长达10天。当在纳米颗粒制剂中使用低分子量(10kDa)乙酰透明质酸时，获得了最佳的转染水平。另外，在已经对纳米颗粒进行冻干(冷冻干燥)处理时，也观察到了这种转染效率。令人惊讶地，虽然壳聚糖在高于6.6至6.8的pH下不溶，但本发明的纳米颗粒体系在6.4至8.0的pH下也是稳定的。这使得纳米颗粒体系可以多方面地用于不同的给药形式，包括鼻内、口服和局部给药。它还确保纳米颗粒在7.4的血浆pH下的稳定性。此外，这种稳定性对于将纳米颗粒应用到稳定的细胞系培养物或应用到难以"在体内"转染的稳定培养物而言也受到关注。因此，本发明的另一目的涉及本发明的体系在制备用于基因治疗的药物中的用途。在具体实施方案中，它包含含有基因的多核苷酸，所述基因能够在所治疗患者的细胞中功能表达。在这种意义下，待使用本发明的体系治疗的疾病的某些实例是具有抗VEGF反义的黄斑变性、表皮水泡症和嚢性纤维化。它尤其可用于糖尿病性视网膜病和黄斑变性。它还能够用于以瞬时转化模式治愈伤口。最后，由于其高转染效率，含有合成或天然多核苷酸的本发明的体系和组合物能够用于转染靶细胞，优选瘤的或"正常的"哺乳动物细胞，以及干细胞或细胞系。因此，它是用于细胞的基因操作的有用工具。在这种意义下，本发明还涉及本发明的体系在细胞的基因操作中的用途。它优选用于体外或离体递送核酸。在一实施方案中，核酸是能够与互补mRNA特异性碱基配对并防止mRNA翻译和相应蛋白产生的反义寡核苷酸，如干扰RNA(iRNA)或小干扰RNA(siRNA)。根据另一方面，本发明涉及本发明的纳米颗粒在并入和递送核酸中的用途。这样的递送针对包含如下的靶细胞诸如哺乳细胞的真核细胞、细胞系、干细胞、原代细胞系，并且能够在体外或离体引起转染或细胞转化。因此，根据这一方面，本发明涉及用于转染真核细胞的试剂盒，其包含本发明的纳米颗粒和适合的稀释剂和/或细胞清洗缓冲液。下文描述了某些示例性实施例，其揭示本发明的特征和优势，但是，不应当将它们解释成限制如在权利要求中定义的本发明的目的。实施例作为下文详述的实施例的通用方法，已经从尺寸、z电势(或表面电荷)和封装效率的角度表征了纳米颗粒。X^"为、有已经用光子相关光谱法(PCS;ZetaSizer;Nanoseries,Nano-ZS;MalvernInstruments,UK)进行测量，获得纳米颗粒集合的平均尺寸值。Z^,已经用激光多普勒测速法(LDA;ZetaSizer,Nanoseries,Nano-ZS，MalvemInstruments,UK)测量。为了测定电泳迁移率，将样品在Milli-Q水中稀释。举合放,通过凝胶电泳和能够对游离的p-DNA精确定量的PicoGreen⑧评价。实施例中所用的壳聚糖(ProtasanUPCI113)来自NovaMatrix-FMCBiopolymer。用NaN02在不同重量比(CS/NaN020.01、0.02、0.05、0.1)下对这种壳聚糖进行氧化还原以获得具有11kDa、14kDa、31kDa、45kDa和70kDa的低分子量的壳聚糖。这些值通过具有光散射检测器的SEC"尺寸排阻色谱"测得。实施例中所用的乙酰透明质酸是透明质酸的钠盐。分子量为160kDa的乙酰透明质酸来自Bioib6ricaS.A.，分子量低于10kDa的乙酰透明质酸通过用透明质酸酶4吏160kDa的乙酰透明质酸碎裂并使溶液通过10kDa的过滤器获得。三聚磷酸钠来自SigmaAldrich，Co.，DNA-质粒pEGFP、pBgal和pSEAP来自Elim.BiopharmaceuticalCorp.,所用的其余产品来自SigmaAldrich。下列缩写已在实施例中使用CS:分子量为125kDa的壳聚糖CSO:具有10kDa至12kDa、14kDa、31kDa、45kDa和70kDa17的低分子量的壳聚糖HA:分子量为160kDa的透明质酸钠HAO:分子量低于10kDa的低分子量透明质酸钠TPP:三聚磷酸钠PBS:磷酸盐緩冲液HBSS:hans平^f盐溶液实施例1纳米颗粒的制备通过促离子型凝胶化方法获得由不同比例的壳聚糖(CSO，具有11kDa、14kDa、31kDa、45kDa和70kDa的不同分子量)和透明质酸钠(HA或HAO)制成的、其中并入DNA-质粒(pEGFP、pBgal或pSEAP)的纳米颗粒。制备了两种水溶液，一种在milli-Q水中含有0.625mg/mL的CSO，另一种含有0.625mg/mL的HA或HAO、0.025mg/mL的TPP和5%至20%重量比的相应质粒DNA。对于含有1:2比例的透明质酸盐:壳聚糖的纳米颗粒，在磁力搅拌下将0.75ml的第一水溶液与0.375ml的第二溶液混合，从而自发产生悬浮于水中的纳米颗粒。对于含有1:1比例的透明质酸盐:壳聚糖的纳米颗粒，在^兹力搅拌下将0.75ml的第一水溶液与0.75ml的第二溶液混合，从而自发产生悬浮于水中的纳米颗粒。对于含有2:1比例的透明质酸盐:壳聚糖的纳米颗粒，在磁力搅拌下将0.75ml的第一水溶液与1.5ml的第二溶液混合，从而自发产生悬浮于水中的纳米颗粒。对于对比研究，按照与如上所述相同的方法用相同比例的壳聚糖和透明质酸盐制备含有CS(分子量为125kDa)代替CSO的纳米颗粒。从表I能够看出，纳米颗粒尺寸维持在250nm以下。然而，Z电势值取决于壳聚糖和透明质酸盐比例，在增加纳米颗粒中的透明质酸盐含量时正电势减少(表1)。表I:作为壳聚糖分子量函数的纳米颗粒的尺寸和Z电势值CS/CSO:HA重量比<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例2封装效率测定和持续的体外释放于搅拌下将根据实施例1中所述的方法制得的纳米颗粒(那些含有10kDa至12kDa的CSO或含有CS的纳米颗粒)在緩冲的介质中于37°C將育一段足够允许质粒释放的时间。在不同的时间通过凝胶电泳测定释放量。当在乙酸盐緩冲液中孵育纳米颗粒时，没有观察到质粒释放的产生(图1)。另外，无论透明质酸盐的分子量和壳聚糖-透明质酸盐重量比如何，纳米颗粒都显示出高于85%的締合效率。还有可能加入用于降解构成该纳米颗粒基质的聚合物的特异性酶(例如壳聚糖酶，0.105U酶/170iiL制剂)，以-便降解该纳米颗粒体系从而促进所封装的分子的释放。图2显示在纳米颗粒降解后，质粒在1小时内全部释放。此外，应当强调，一旦所封装的质粒辟皮释放，其构造和结构被完美地保持。实施例3体外细胞毒性分析由实施例1中获得的纳米颗粒悬浮液，尤其是含有10kDa至12kDa的低分子量壳聚糖的那些纳米颗粒悬浮液，制备不同的系列溶液，使之具有不同的纳米颗粒浓度，以便评价作为剂量的函数的细胞活力。该研究在三种不同的细胞系中进行-HEK293(人胚肾细胞系)-HCE(人角膜上皮细胞系)-NHC(正常人结膜细胞系)。进行MTS检测，其中评价相对于100%(其被认为是仅加入培养基的培养物)的细胞活力。该细胞必须在试验的前一天以每孔300.000个细胞的量涂板。然后加入培养基并用PBS洗涤细胞培养物两次。之后，将纳米颗粒悬浮液加入至细胞培养物并加入HBSS直至达到1000|iL的体积。将细胞在37°C下孵育1小时然后用HBSS或PBS洗涤。随后，加入MTS试剂(由新的四唑盐化合物溶液组成的反应剂；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧曱氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐)(120pL/孔)并于3h后在490nm下读板。该试剂在临用前制备。所测定的纳米颗粒的剂量为160pg/cm2、80|ug/cm2、40^g/cm2、20ng/cm2、10(ig/cm2和5|ig/cm2。可以看出[图3]，细胞毒性水平取决于细月包系。概括地说，本发明的纳米颗粒具有非常低的毒性[图4]。实施例4纳米颗粒转染效率的体外研究为了证明纳米颗粒体系的转染效率，在与实施例3中所用的相同细胞系中进行体外研究。根据之前在实施例1中描述的方法制备了含有10kDa至12kDa的CSO以及HA或HAO的纳米颗粒。对于对比研究，仍然使用含有CS(Mw=125kDa)的纳米颗粒。该细胞必须在试-睑开始前24h以每孔300.000个细胞的量涂板。然后加入培养基并用PBS洗涤细胞培养物两次。之后，向每孔加入300)iLHBSS。随后，加入纳米颗粒悬浮液，其量为使得每孔被加入1pg的pDNA。将细胞在37°C下孵育5小时，然后用HBSS或PBS洗涤并加入更多的培养基。在下一天及每次测量表达水平之前更换该培养基。从转染后的第二天开始，以及在10天的时间内每2天定量蛋白表达水平。定量用荧光显微镜以及随后通过PhotoshopElements进行的图像处理进行。从图5和图6能够观察到，与含有分子量为125kDa的壳聚糖的纳米颗粒相比，含有低分子量壳聚糖(CSO:10kDa至12kDa)的纳米颗粒显示出更高且持续更长的转染水平，其为25%以上转染的细胞、长达10天。实施例5体外细胞摄取分析为了证明纳米颗粒向细胞体系的内化，用细胞系HEK293进行体外研究。制备纳米颗粒，使得它们能够在共焦显微镜中可见。因此，预先将透明质酸钠用荧光素标记。分析了下列纳米颗粒制剂HAO:CSO[10kDa至12kDa];1:2比例的HAO:CS和HA:CS,加载有1%的质粒。试验之前24小时将约300.000细胞/孔涂板。随后，将培养基吸出，然后用PBS洗涤，最后将纳米颗粒加入至培养物，用HBSS补足直至体积达到200fxL。将细胞培养物孵育1或2小时。细胞孵育之后，用碘化丙啶将细胞核染色并制备样品以便在共焦显微镜下观察。从图7能够看出，在孵育后的l小时之后，在细胞质中观察到荧光，与纳米颗粒制剂无—关，因此纳米颗粒被细胞有效地内化。当用低分子量(IOkDa至12kDa)壳聚糖纳米颗粒[CSO:HAO]处理细胞培养物时，标记的纳米颗粒位于细胞内及细胞核周水平下的液泡中。这种细胞内定位指出了这些纳米颗粒作为基于核酸的生物分子的细胞内递送载体的潜力。实施例6纳米颗粒与CD44受体的相互作用在该实施例中，评价了纳米颗粒在与受体CD44相互作用后是否能够被内化，所述受体CD44是乙酰透明质酸的特异性受体。根据实施例1制备纳米颗粒，除了透明质酸盐预先用荧光素胺标记。制剂是1:2比例的HA:CSO[10kDa至12kDa]。在该研究中使用细胞系HCE，将所述细胞在不同的温度(4。C和37。C)下孵育。从图8a)和b)能够看出，纳米颗粒被细胞内化，因为质粒和透明质酸盐能够在细胞内水平下观察到。在37。C下，纳米颗粒通过内吞和/或与CD44的相互作用而内化，而在4。C下，这些纳米颗粒只有在与受体CD44相互作用时才内化。此外，在其中一项试验中，受体CD44被AbHermesl阻断。如图8c)所示，在4°C下能够观察到纳米颗粒不内化，因为如我们之前所提到的那样，在该温度下内化仅由于与受体的相互作用。实施例7纳米颗粒与眼上皮细胞相互作用以及在细胞内降解的效率的体内研究为了评价纳米颗粒与眼粘液的相互作用，根据实施例1制备纳米颗粒，其包含1:2比例的HA:CSO[10kDa至12kDa]和HA:CS的制剂，除了透明质酸盐预先用荧光素(HA-fl)标记。将HA-fl的溶液用作对照。纳米颗粒通过离心浓缩，随后在milliQ水中重新悬浮，纳米颗粒浓度为3mg/mL。将0.3mg纳米颗粒滴注入2kg兔的眼中。每10分钟进行4次25|aL的滴注。将动物在滴注后的2、4或12小时后处死，然后剥离角膜和结膜。在共焦显农i镜下观察新鲜组织。从图9能够看出，在角膜和结膜细胞内检测到了与纳米颗粒相应的强烈焚光信号。此外，观察到荧光强度随时间而降低，这对于包含分子量为10kDa至12kDa的壳聚糖的纳米颗粒更明显。这表明这些纳米颗粒以某种方式在细胞内被吸收或降解。已知透明质酸酶在眼组织中负责乙酰透明质酸的降解。这些结果表明低分子量壳聚糖在细胞内水平下也以高效率降解，这证实了使用分子量小于90kDa的壳聚糖以便实现生物活性分子在上皮细胞内有效递送的优点。实施例8纳米颗粒转染眼组织的效率的体内研究为了测定本发明的纳米颗粒在体内转染眼组织的能力并测定这些载体递送眼科基因的效能，将根据实施例7所述方法制备的加栽有10%pGFP的纳米颗粒以下列剂量局部给予2kg正常的清醒兔25、50和100iigpGFP/目艮。每IO分钟给予15pL该制剂(对于较高剂量，给予50+50iuL，留出30分钟的中间时期以避免制剂流出)。将动物处死，然后剥离角膜和结膜。在转染后的2、4和7天后在共焦显微镜下观察编码的绿蛋白在离体角膜和结膜上皮细胞中的表达。从图10能够观察到，含有低分子量壳聚糖(CSO)的纳米颗粒在较低剂量下产生较高的转染水平，并因此用来评价基因表达的持续时间。在转染后的第4天和第7天仍然对绿色角膜细胞拍摄照片。通过评价250gSprague-Dawley大鼠的摘除眼中的基因表达而进一步确证了这些结果。在这种情况下，使用相同的纳米颗粒制剂，除了ppgal在纳米颗粒体系中以10%的比例加载。将2.5iLig纳米颗粒以5^L的体积给予大鼠，48小时后将其处死并摘除眼，固定在多聚曱醛中，最后用X-gal进行染色以便使蛋白的表达可见。这些结果提供了由低分子量壳聚糖和乙酰透明质酸制成的纳米颗粒进入角膜上皮细胞并在这些细胞内降解，从而以非常有效的方式递送DNA-质粒并达到重要转染水平的能力的证据。因此，这些纳米颗粒可以代表基因治疗的新策略，在这种具体情况下用于治疗某些眼科疾病。实施例9壳聚糖和透明质酸纳米颗粒的冻千通过加入不同的低温防护剂(1%和5%重量比的蔗糖、海藻糖和葡萄糖)并冷却至-80。C，(第一和第二干燥在-50。C下进行)，对根据实施例1获得的纳米颗粒，尤其是含有重量比2:1的CSO:HA和CSO:HAO并加载有占聚合物总重7%的质粒的那些纳米颗粒进行冻干(冷冻干燥)处理。随后，将该制剂在水中重新悬浮并测定粒径。如表II所示，所有制剂都适当地重新悬浮，产生最初的纳米颗粒体系。表II:在低温防护剂(蔗糖、海藻糖和葡萄糖)存在下冻干并在水中重新悬浮后的纳米颗粒尺寸(n^2)。壳聚糖分子量llkDa;CSO:HA重量比为2:1纳米颗粒体系j氐温防护剂低温防护剂的量(％;p/v)冷冻干燥处理后的尺寸(nm)蔗糖5%1%156174CSO11kDa-HA海藻糖5%1%129135葡萄糖5%1%152160蔗糖5%1%131170CSO11kDa-HAO海藻糖5%1%148121葡萄糖5%1%131189随后，进行了另一冻干研究，但使用具有不同分子量的壳聚糖以便了解在纳米颗粒体系的冻干和重新悬浮中分子量的影响如何。在这种情况下所用的透明质酸盐分子量为160kDa并且CSO:HA比例为1:2和2:1。表III:在葡萄糖存在下冻干并在水中重新悬浮后的纳米颗粒尺寸(n=2)。壳聚糖分子量llkDa、14kDa、31kDa、45kDa和70kDa;CSO:HA重量比为2:1和1:2_<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表III所示，无论壳聚糖分子量(llkDa、14kDa、31kDa、45kDa或70kDa)和CSO:HA重量比(2:l或l:2)如何，所有体系都适当地重新悬浮，尺寸维持在纳米范围内。实施例10不同pH下的纳米颗粒稳定性在含有CSO:HA和CSO:HAO(MwCSO:11kDa)的纳米颗粒体系冻干并重新悬浮后，将它们在不同pH的緩冲液中稀释。从表IV能够看出，纳米颗粒体系的稳定性随着每一体系的组成而变化。例如，含有CSO:HA的纳米颗粒在pH7.4和8.0是稳定的，而含有CSO:HAO的纳米颗粒在pH6.4和8.0是稳定的。然而，令人惊讶的是两种体系在pH8.0下都稳定，因为已知壳聚糖在高于6.6至6.8的pH下不溶。因此，由于它们在不同pH下的稳定性，该纳米颗粒体系可以多方面地用于DNA给药。表IV:在低温防护剂(蔗糖、海藻糖和葡萄糖)存在下冻干后在水中重新悬浮并于37°C下在6.4、7.4和8.0的不同pH緩冲液中储存的纳米颗粒的尺寸。纳米颗粒体系低温防护剂pH7.4pH6.4pH8.0初始尺寸(nm)30min(nm)初始尺寸(證)30min(nm)初始尺寸(nm)30min(nm)CSO11kDa-HA蔗糖5%海藻糖5%葡萄糖5%31134726738574431410129751288388547604319246217221267252308蔗糖5%7981482134191361501CSO11kDa-海藻糖5%9431242168154378473HAO葡萄糖5%5001148131129285302此外，用不同的CSO:HA比例(2:1、1:1、l:2)选择分子量为45kDa和70kDa的壳聚糖分析了纳米颗粒的稳定性。如表V所示，无论CSO:HA重量比如何，该纳米颗粒在pH7.4和8.0下都是稳、定的。表V:冻干并在37°C孵育后纳米颗粒在pH7.4和8.0的緩沖液中的稳定性(n-2)纳米颗粒体系緩沖液的pH时间(min)CSO:HA重量比2:11:11:2尺寸(nm)尺寸(腿)尺寸(nm)7.40CSO70kDa-30343330HA8.0018713830330341CSO45kDa隱7.4030471492388472276481HA8.0030477541386512367322而且，从表VI能够看出，纳米颗粒尺寸至少一周内在pH8下维持在纳米范围内。表VI:纳米颗粒在pH=8.0的磷酸盐緩冲液中的稳定性(n二2)纳米颗粒体系CSO:HA重量比pH8.0初始尺寸(nm)1周后的尺寸(nm)2:1203477CSO45kDA-HA1:12563861:2156322实施例11冻干纳米颗粒在细胞系HEK293中的体外转染研究为了了解我们的纳米颗粒体系在其冻干后是否具有转染细胞培养物的能力，在细胞系HEK293中分析了加载有7%质粒pEGFP的CSO和HA的不同制剂(剂量1|ugpEGFP)。该实施例中所用的壳聚糖的分子量为14kDa、31kDa和45kDa,CSO:HA的重量比为2:1和1:2。将这些制剂预先在1%(w/V)的葡萄糖的存在下冻干并重新悬浮。荧光显微镜拍摄的照片(图ll)显示细胞内存在焚光蛋白，因此它们表明含有CSO和HA的冻干纳米颗粒体系具有转染能力。这些照片是在使制剂与细胞接触后4天拍摄的。权利要求1.用于释放生物活性分子的体系，其包含平均尺寸小于1微米的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含a)乙酰透明质酸或其盐；以及b)壳聚糖或其衍生物，其特征在于所述壳聚糖或其衍生物的分子量小于90kDa。2.如权利要求l所述的体系，其中所述壳聚糖或其衍生物的分子量为1kDa至75kDa。3.如权利要求1或2所述的体系，其中所述壳聚糖或其衍生物的分子量为2kDa至50kDa，更优选2kDa至15kDa。4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的体系，其中所述乙酰透明质酸或其盐的分子量为2kDa至160kDa。5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的体系，其中所述乙酰透明质酸/壳聚糖重量比为2:1至1:10,优选为2:1至l:2w:w。6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的体系，其中所述乙酰透明质酸是透明质酸的钠盐。7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的体系，其中所述纳米颗粒通过网化剂网化。8.如权利要求7所述的体系，其中所述网化剂是三聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠。9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的体系，其中所述纳米颗粒的平均尺寸为1nm至999nm，优选50nm至500nm,更优选约100nm至约300nm。10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的体系，其还包含选自多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、核酸及其混合物的生物活性分子。11.如权利要求IO所述的体系，其中所述生物活性分子是基于核酸的分子、寡核苷酸、siRNA或多核苷酸，优选DNA-质粒。12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的体系，其中所述纳米颗粒为冻干形式。13.包含权利要求1至12中任一权利要求所定义的体系的药物组合物。14.冻干形式的权利要求13所述的药物组合物。15.适合于眼科给药的形式的权利要求13所述的药物组合物。16.包含权利要求1至12中任一权利要求所定义的体系的化妆品组合物。17.如权利要求16所述的化妆品组合物，其还包含选自软化剂、防腐剂、芳香物质、抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头屑剂、脱色剂、抗皮脂溢剂、染料、防晒霜、紫外光吸收剂和酶的化妆品剂。18.权利要求1至12中任一权利要求所述的体系的制备方法，其包括a)制备乙酰透明质酸或其盐的水溶液；b)制备壳聚糖或其衍生物的水溶液；c)向所述乙酰透明质酸或其盐的溶液中加入网化剂，以及d)在搅拌下混合b)和c)中获得的所述溶液，所述纳米颗粒自发形成；19.如权利要求18所述的方法，其中在所述纳米颗粒形成之前将生物活性分子溶于所述水溶液b)或c)的任一水溶液中。20.如权利要求18所述的方法，其中将生物活性分子溶于步骤d)中获得的所述纳米颗粒悬浮液中。21.如权利要求18至20中任一权利要求所述的方法，其在步骤d)之后还包括另外的步骤，其中所述纳米颗粒被冻干。22.权利要求1至12中任一权利要求所述的体系在制备用于基因治疗的药物中的用途。全文摘要本发明涉及纳米颗粒体系，其可用于递送药理学活性分子，尤其可用于将多核苷酸转染入细胞。它包含低分子量壳聚糖和乙酰透明质酸的纳米颗粒。文档编号A61K9/51GK101448489SQ200780018825公开日2009年6月3日申请日期2007年5月23日优先权日2006年5月24日发明者安娜·伊莎贝尔·维拉贝纳,玛·何赛·阿隆索费尔南德斯,玛利亚·德拉弗恩特弗莱瑞,玛利亚·贝戈欧安娜·赛周瑞申请人:先进离体细胞技术有限公司