专利名称：结合il-17a和il-17f的抗体分子的制作方法
结合IL-17A和IL-17F的抗体分子
本发明涉及对IL-17A和IL-17F的抗原决定簇具有特异性的抗体 分子。本发明还涉及该抗体分子的治疗用途及其生产方法。
白介素17( IL-17)，也称为CTLA-8或IL-17A，是促炎细胞因子， 其刺激各种非免疫细胞分泌各种各样的其他细胞因子。IL-17A能够诱 导粘附细胞，如成纤维细胞、角质细胞、上皮和内皮细胞分泌IL-6、 IL-8、 PGE2、 MCP-1和G-CSF，并且还能够诱导ICAM-1表面表达、T 细胞增殖，以及在受照射的成纤维细胞存在下共同培养时，诱导CD34+ 人祖细胞的生长并分化成嗜中性白细胞(Fossiez等，1998， Int. Rev. Immunol 16， 541-551 )。 IL-17A主要由激活的记忆T细胞产生并通 过与遍在分布的细胞表面受体(IL-17R)结合而发挥作用 (Yao等， 1997， Cytokine, 9, 794-800 )。它也可以通过结合IL-17RA和IL-17RC 的复合物而发挥作用(Toy等，2006， J. Immunol. 177(11); 36-39 )。 称为"TH17细胞"的产生IL-17的T细胞涉及某些癌症的发病机理 (Weaver等，2006， Immunity, 24， 677-688; Langowski等，2006， 442， 461-465; Iwakura和Ishigame， 2006， J.CI in.Invest. 116， 5， 1218-1222)。
已经鉴定了多种IL-17的同系物，其在调节炎症反应中具有相似 和不同的作用。对于IL-17细胞因子/受体家族的综述，参见Dumont， 2003， Expert Opin. Ther. Patents, 13， 287-303。 一种这样的同 系物是IL-17F，也称为IL-24和ML-1，其与IL-17A大约55°/。相同， 并且被认为与IL-17A共享相同的受体(Kolls和Linden 2004, Immunity, 21, 467-476; Hymowitz等，2001, EMBO J, 20(19)， 5332-5341; Kuestner爭，2007， Journal of Immunology, 179， 5462-5473)。
IL-17A和IL-17F都可以形成同型二聚体和杂二聚体蛋白，其所有都由激活的人CD4+T细胞产生(Wright等，2007， J Biol Chem. 282 (18)， 13447-13455)。
IL-17可能促进很多由异常免疫反应介导的疾病，如类风湿性关 节炎和呼吸道炎症，以及器官移植排斥和抗肿瘤免疫。IL-17活性抑 制剂是本领域熟知的，例如小鼠IL-17R:人Fc融合蛋白、小鼠可溶性 IL-17R和抗IL-17单克隆抗体已经被用来证明IL-17在各种类风湿性 关节炎模型中的作用(Lubberts等，J. Immunol. 2001 , 167 ， 1004-1013; Chabaud等，Arthritis Res. 2001， 3， 168-177)。此 外，中和多克隆抗体已经被用来减少腹膜粘连的形成(Chung等， 2002， J. Exp. Med, ， 195， 1471-1478 ) 。 WO04/106377中描述了从 大鼠得到的抗人IL-17抗体。WO2006/054059中描述了亲和力为大约 220pM的人源化抗IL-17抗体。W02006/013107中描述了亲和力为大约 188pM的完全人抗IL-17单克隆抗体。WO2006/088833中描述了结合 IL-17F和IL-17A/IL-17F的抗体。額005/010044中描述了特异性结 合IL-17A/IL-17F杂二聚体的抗体。
IL-17F拮抗作用与对抗哞喘的保护作用相关(Kawaguchi等， 2006, J. Allergy Clin. Immunol. 117(4); 795-801 )，并且认为 IL-17F在关节炎病理学中也起着作用(Lubberts 2003， Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (5)， 572-577)。
因此，IL-17A和IL-17F的双重拮抗剂在治疗IL-17介导的疾病 中比单独的拮抗剂更有效。07年9月20日公开的W02007/106769中 描述了结合IL-17A和IL-17F的抗体。
我们已经能够证明分离能够结合IL-17A和IL-17F并且能够中和 IL-17的两个同种型的活性的抗体是可能的。因此，本发明提供了能 够结合IL-17A和IL-17F的抗IL-17抗体。特别地，本发明的抗体能 够特异性地结合IL-17A和IL-17F，即，该抗体不与IL-17的其他同 种型结合。优选地，本发明的抗体还结合IL-17A/IL-17F杂二聚体。 优选地，本发明的抗体中和IL-17A和IL-17F的活性。在一个实施方 案中，本发明的抗体还中和IL-17A/IL-17F杂二聚体的活性。因此，本发明的抗体具有可以抑制IL-17A和IL-17F的生物活性的有利特性。 因此，本发明还提供了这样的抗体在治疗和/或预防由IL-17A或 IL-17F任一种或两种介导的疾病，如自体免疫或炎症疾病或癌症中的 用途。
如在此所用的，术语"中和抗体"描述了例如，通过阻断IL-17A 和IL-17F结合一种或多种受体和通过阻断IL-17A/IL-17F杂二聚体结 合一种或多种受体，能够中和IL-17A和IL-17F的生物信号活性的抗 体。将认识到如在此所用的术语"中和"指的是可以部分或完全降低 生物信号活性。此外，将认识到通过抗体中和IL-17A和IL-17F的程 度可以相同或不同。在一个实施方案中，IL-17A/IL-17F杂二聚体活 性的中和程度与IL-17A或IL-17F活性的中和程度相同，可以相同或 不同。
在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合IL-17A和IL-17F。 特异性结合意思是抗体对IL-17A和IL-17F多肽(包括 IL-17A/IL-17F杂二聚体)的亲和性比其他多肽高。优选，IL-17A和 IL-17F多肽是人。在一个实施方案中，抗体还结合猕猴IL-17F。
IL-17A或IL-17F多肽或表达一种或两种所述多肽的两种细胞混 合物可以用来产生特异性识别多肽的抗体。IL-17多肽(IL-17A和 IL-17F)可以是"成熟"多肽或其生物活性片段或衍生物，优选包括 受体结合位点。优选，IL-17多肽是成熟多肽。可以通过本领域公知 的方法从含有表达系统的遗传工程宿主细胞来制备IL-17多肽或从天 然生物来源收集。在本发明的应用中，术语"多肽"包括肽、多肽和 蛋白。这些可以互换使用，除非另外指出。在一些情况中，IL-17多 肽可以是较大蛋白如融合蛋白的一部分，例如，与亲和性标记物融合。 可以获得对抗这些多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必需的，通过 将多肽给予动物，优选非人动物，使用公知和常规的方案，参见，例 如，Handbook of Experimental Immunology (实验免疫学手册)， D. M. Weir (编辑)，Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986。可以将许多温血动物，如兔子、小鼠、大鼠、绵羊、奶牛或猪免疫。然而，通常优选的是小鼠、兔子、猪和大鼠。
用于本发明的抗体包括完整的抗体及其功能性活性片段或衍生 物，可以是，但不限于，单克隆、多价、多特异性、人源化或嵌合抗
体，结构域抗体，例如，上述任一种的VH、 VL、 VHH、单链抗体、Fab 片段、Fab'和F(ab' )2片段和抗原决定部分结合片段。其他抗体片 段包括国际专利申请WO2005003169、 WO2005003170和WO2005003171 中描述的那些。抗体片段及其生产是本领域公知的，参见，例如，Verma 等,1998， Journal of Immunological Methods， 216， 165-181; Adair 和Lawson， 2005. Therapeutic antibodies. Wey/ei^s -
用于本发明中的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免 疫活性部分，即，含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发 明的免疫球蛋白分子可以是任何种类(例如，IgG、 IgE、 IgM、 IgD和 IgA)或亚类的免疫球蛋白分子。
可以通过本领域已知的任何方法制备单克隆抗体，如杂交瘤技术 (Kohler & Milstein， 1975， Nature, 256:495-497 )、三源杂交瘤 技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983， Immunology Today, 4:72)和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，pp77-96, Alan R Liss， Inc. ， 1985 )。
用于本发明的抗体也可以使用单淋巴细胞抗体法来产生，通过由 例如Babcook， J. 等，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (15): 7843-78481; ,2/02551; WO2004/051268和国际专利申请号 W0 20(H/106377描述的方法克隆和表达由选择用于生产特异性抗体的 单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变结构域cDNA。
人源化抗体是具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR ) 和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子(参见，例如 US5，585，089;窗1/09967 )。
嵌合抗体是已经基因工程化的免疫球蛋白基因编码的那些抗体，使得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段组成。这 些嵌合抗体很可能抗原性较低。可以通过本领域已知的方法制得二价
抗体(Milstein等，1983 ， Nature 305:537-539; W0 93/08829 , Traunecker等，1991， EMBO J. 10:3655-3659 )。多价抗体可以包括 多特异性或可以是单特异性的(参见，例如，W092/22853和 WO05/113605)。
用于本发明的抗体还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示法生 产，并包括Brinkman等(在J. Immunol. Methods, 1995， 182: 41-50) 、 Ames等(J. Immunol. Methods, 1995， 184:177-186)、 Kettlebo面gh等(Eur. J. Immunol. 1994， 24:952-958 ) 、 Persic 等(Gene, 1997 1879-18) 、 Burton等(Advances in Immunology, 1994， 57: 191-280 )和WO90/02809; ,1/10737; W0 92/01047; W0 92/18619; W0 93/11236; W0 95/15982; W0 95/20401和US 5， 698， 426; 5,223,409; 5, 403, 484; 5,580,717 ; 5, 427, 908; 5, 750,753 ; 5,821, 047; 5,571,698 ; 5， 427， 908; 5,516,637; 5, 780,225; 5,658,727; 5,733, 743和5,969, 108中公开的方法。用于生产单链 抗体的技术，如US4， 946，778中所述的那些也适用于产生结合IL-17A 和IL-17F的单链抗体。此外，转基因小鼠，或其他生物体，包括其他 哺乳动物，可以用于表达人源化抗体。
抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等设计的系统来编号。 这个系统在Kabat 等，1987 ， 在Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白的序歹'J ) ， US Department of Health and Human Services, NIH， USA (以下称作"Kabat等 (上文)")中列出。本说明书中使用这个编号系统，除非另外指出。
Kabat残基命名并不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实 际的线性氨基酸序列可能含有比严格的Kabat编号更少或增加的氨基 酸，严格的Kabat编号对应于基础可变结构域结构的结构组分，无论 是框架区还是互补决定区(CDR)的缩短或插入。对于给定的抗体，残 基的正确Kabat编号可以通过抗体序列与"标准"Kabat编号序列的
10同源性残基比对来确定。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35 (CDR-H1)、残基50-65 (CDR-H2)和残基95-102 (CDR-H3)。然而， 根据Chothia( Chothia， C.和Lesk， A. M. J. Mol. Biol. ， 196, 901-917 (1987 ))，相当于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，按 照Kabat编号系统和Chothia的拓朴环定义联合所述，如在此所用的 'CDR-Hl，包括残基26至35。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34 (CDR-L1)、残基50-56 ( CDR-L2 )和残基89-97 (CDR-L3)。
在本发明的一个实施方案中，提供了对人IL-17A和人IL-17F具 有特异性的中和抗体，其包含重链，其中重链可变结构域包含至少一 个如下的CDR:具有SEQ ID N0: 1给出的CDR-H1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 2给出的CDR-H2序列的CDR和具有SEQ ID NO: 3给出的CDR-H3 序列的CDR。
在本发明的另一个实施方案中，提供了对人IL-17A和人IL-17F 具有特异性的中和抗体，其包含重链，其中重链可变结构域的CDR-Hl、 CDR-H2和CDR-H3中的至少两个选自下列序列SEQ ID NO: 1给出的 CDR-H1序列，SEQ ID NO: 2给出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3给出 的CDR-H3序列。例如，该抗体可以包含重链，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 1给出的序列而CDR-H2具有SEQ ID N0:2给出的序列。或者，该 抗体可以包含重链，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 1给出的序列而 CDR-H3具有SEQ IDN0:3给出的序列，或该抗体可以包含重链，其中 CDR-H2具有SEQ ID NO: 2给出的序列而CDR-H3具有SEQ ID NO: 3给 出的序列。为避免疑惑，应理解包括全部排列。
在本发明的另一个实施方案中，提供了对人IL-17A和IL-17F具 有特异性的中和抗体，其包含重链，其中重链可变结构域包含SEQ ID NO: 1给出的CDR-Hl序列，SEQ ID NO: 2给出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3给出的CDR-H3序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了对人IL-17A和IL-17F具有特异性的中和抗体，其包含轻链，其中轻链可变结构域包含至少一个
如下的CDR:具有SEQ ID NO: 4给出的CDR-L1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5给出的CDR-L2序列的CDR和具有SEQ ID NO: 6给出的CDR-L3序 列的CDR。
在本发明的另一个实施方案中，提供了对人IL-17A和IL-17F具 有特异性的中和抗体，其包含轻链，其中轻链可变结构域的CDR-L1、 CDR-L2和CDR-U中的至少两个选自下列序列SEQ ID NO: 4给出的 CDR-L1序列，SEQ ID NO: 5给出的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6给出 的CDR-L3序列。例如，该抗体可以包含轻链，其中CDR-L1具有SEQ ID NO: 4给出的序列而CDR-L2具有SEQ ID N0:5给出的序列。或者，该 抗体可以包含轻链，其中CDR-L1具有SEQ ID NO: 4给出的序列而 CDR-L3具有SEQ IDN0:6给出的序列，或该抗体可以包含轻链，其中 CDR-L2具有SEQ ID NO: 5给出的序列而CDR-L3具有SEQ ID NO: 6给 出的序列。为避免疑惑，应理解包括全部排列。
在本发明的另一个实施方案中，提供了对人IL-17A和IL-17F具 有特异性的中和抗体，其包含轻链，其中可变结构域包含SEQ IDN0:4 给出的CDR-L1序列，SEQ ID N0:5给出的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6 给出的CDR-L3序列。
本发明的抗体分子优选分别包含互补轻链或互补重链。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含重链和轻链， 其中重链可变结构域包含SEQ IDNO: 1给出的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2 给出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3给出的CDR-H3序列，其士轻々*-^* 变结构域包含SEQ ID NO: 4给出的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5给出的 CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6给出的CDR-L3序列。
应认识到可以对本发明提供的CDR进行一个或多个氨基酸置换， 而不显著改变抗体结合IL-17A和IL-17F以及中和IL-17A和IL-17F 活性的能力。本领域技术人员可以容易地测试任何氨基酸置换对结合 和中和的影响，例如通过使用在此所述的方法。因此，本发明提供了 包含一个或多个选自以下的CDR的抗体CDRH-1 (SEQ ID NO: 1 )、CDRH-2 (SEQ ID NO. 2 ) 、 CDRH-3 (SEQ ID NO: 3 ) 、 CDRL-1 (SEQ ID NO: 4) 、 CDRL-2 (SEQ ID NO: 5 )和CDRL-3 (SEQ ID NO: 6 )，其中 一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸置换。还应 认识到可以改变一个或多个CDR的长度，而不显著改变抗体结合 IL-17A和IL-17F以及中和IL-17A和IL-17F活性的能力。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链可变结构 域包含三个CDR，其中CDRH-1的序列与SEQ ID NO: 1给出的序列具有 至少60%的同一性或相似性，CDRH-2与SEQ ID N0:2给出的序列具有 至少60%的同一性或相似性和/或CDRH-3与SEQ ID NO: 3给出的序列 具有至少60%的同一性或相似性。在另一个实施方案中，本发明的抗 体包含重链，其中重链可变结构域包含三个CDR，其中CDRH-1的序列 与SEQ ID NO: 1给出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同 一性或相似性，CDRH-2与SEQ ID NO: 2给出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性和/或CDRH-3与SEQ ID NO: 3给出 的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性。
如在此所用的"同一性"表示比对序列中任何特定位置的氨基酸 残基在这些序列之间是相同的。如在此所用的"相似性"表示比对序 列中任何特定位置的氨基酸残基在这些序列之间是相似类型的。例如， 亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。常常可以彼此取代的其他氨基酸 包括但不限于
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)； 一赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)； 一天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)； -天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和 -半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。 可以容易地计算同 一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology (计算分子生物学)，Lesk， A.M.编辑，Oxford University Press, New York, 1988; Biocomput ing. Informatics and Genome Projects (生物计算信息学和基因组计划)，Smith, D. W.编辑，Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data (序列数据的计算机分析)，Part 1, Griffin, A. M. 和Griffin, H. G.编辑，Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物学中的序歹寸分才斤)，von Heinje， G. ， Academic Press, 1987; 和Sequence Analysis Primer (序歹寸分才斤引物)，Gribskov， M.和Devereux， J.编辑，M Stockton Press, New York, 1991)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链可变结 构域包含三个CDR，其中CDRL-1的序列与SEQ ID NO: 4给出的序列具 有至少60%的同一性或相似性，CDRL-2与SEQ ID N0:5给出的序列具 有至少60%的同一性或相似性和/或CDRL-3与SEQ ID NO: 6给出的序 列具有至少60°/。的同一性或相似性。在另一个实施方案中，本发明的 抗体包含轻链，其中轻链可变结构域包含三个CDR，其中CDRL-1的序 列与SEQ ID NO: 4给出的序列具有至少70°/。、 80%、 90%、 95%或98%的 同一性或相似性，CDRL-2与SEQ ID NO: 5给出的序列具有至少70%、 80%、 90°/。、 95%或98%的同一性或相似性和/或CDRL-3与SEQ ID NO: 6 给出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性。 在一个实施方案中，本发明提供的抗体是单克隆抗体。 在一个实施方案中，本发明提供的抗体是嵌合抗体。 在一个实施方案中，本发明提供的抗体是CDR移植抗体分子，包 含SEQ ID NOS : 1至6提供的一个或多个CDR。如在此所用的，术语 "CDR移植抗体分子"是指其中重链和/或轻链含有移植入受体抗体 (例如人抗体)的重链和/或轻链可变结构域框架的来自供体抗体(例 如鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR (如果期望，包括一个或多个修 饰的CDR)的抗体分子。对于综述，参见Vaughan等，Nature Biotechnology, 1^， 535-539， 1998。在一个实施方案中，不是转移 整个CDR，只有以上描述的任何一个CDR的一个或多个特异性决定残 基被转入人抗体框架中(参见，例如Kashmiri等，2005， Methods, 36， 25-34 )。在一个实施方案中，只有以上描述的一个或多个CDR的特异性决定残基被转入人抗体框架中。在另一实施方案中，只有以
上描述的每一个CDR的特异性决定残基被转入人抗体框架中。
当移植CDR或特异性决定残基时，考虑产生CDR的供体抗体的类 另iJ/类型后，可以使用任何适当的受体可变结构域框架序列，包括小鼠、 灵长类动物和人框架区。优选，根据本发明的CDR移植抗体具有包含 人受体框架区以及一个或多个如上所述的CDR或特异性决定残基的可 变结构域。因此， 一个实施方案中，提供了中和CDR移植抗体，其中 可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
可用于本发明中的人框架区实例是KOL、 NEWM、 REI、 EU、 TUR、 TEI、 LAY和POM(Kabat等，上文)。例如，KOL和NEWM可用于重链， REI可用于轻链，而EU、 LAY和POM同时可用于重链和轻链。或者， 可以Y吏用人种系序列；这些可以从http: 〃vbase， mrc-cpe. ac. uk/获 得。
在本发明的CDR移植抗体中，受体重链和轻链不必需来源于相同 抗体，如果期望，可以包含具有来源于不同链的框架区的复合链。
对于本发明CDR移植抗体的重链，优选的框架区来源于人亚组 VH3序列1-3 3-07连同JH4。因此，提供了包含至少一个非人供体CDR 的中和CDR移植抗体，其中重链框架区来源于人亚组序列1-3 3-07 连同JH4。人JH4的序列如下:(YFDY)WGQGTLVTVSS。YFDY基序是CDR-H3 的一部分，而不是框架4的一部分(Ravetch， JV.等，1981， Cell, 27， 583-591 )。
对于本发明CDR移植抗体的轻链，优选的框架区来源于人种系亚 组VK1序列2-1-(1) L4连同JK1。因此，提供了包含至少一个非人供 体CDR的中和CDR移植抗体，其中轻链框架区来源于人亚组序列VK1 2-1-(1) L4连同JK1。 JK1序列如下:(WT) FGQGTKVEIK。 WT基序是 CDR-L3的一部分，而不是框架4的一部分(Hieter， PA.，等，1982， J. Biol. Chem. ， 257， 1516-1522 )。
同样，在本发明的CDR移植抗体中，框架区也不需要与受体抗体 具有完全相同的序列。例如，可以将不常见的残基转变为对于受体链类别或类型来说更常见的残基。或者，可以改变受体框架区中所选择 的残基，使得它们对应于供体抗体中相同位置发现的残基(参见，
Reichmann等，1998， Nature, 332， 323-324 )。这种改变应该保持 在恢复供体抗体亲和性所必需的最低限度。W0 91/09967中列出了选 择可能需要改变的受体框架区中残基的方案。
优选，在本发明的CDR移植抗体分子中，如杲受体重链具有人VH3 序列1-3 3-07连同JH4，那么除了一个或多个供体CDR外，重链的受 体框架区至少在第94位包含供体残基(根据Kabat等，(上文))。 因此，提供了 CDR移植抗体，其中至少重链可变结构域第94位的残基 是供体残基。
优选，在根据本发明的CDR移植抗体分子中，如果受体轻链具有 人亚组VK1序列2-1-(1) L4连同JK1,那么不转移供体残基，即仅转 移CDR。因此，提供了CDR移植抗体，其中仅仅将CDR转入供体框架中。
供体残基是来自供体抗体的残基，即，最初产生CDR的抗体。 在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链可变结构 域包含SEQ ID N0:9给出的序列(gH9 )。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链可变结 构域包含与SEQ ID NO: 9给出的序列具有至少60%同一性或相似性的 序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链可变结 构域包含与SEQ ID NO: 9给出的序列具有至少70%, 80%, 90%， 95%或 9 8 %同 一 性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链可变结构 域包含SEQ ID N0:7给出的序列(gL7 )。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链可变结 构域包含与SEQ ID NO: 7给出的序列具有至少60%同一性或相似性的 序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链可变结 构域包含与SEQ ID N0: 7给出的序列具有至少70%， 80°/。， 90%， 95%或 9 8 %同 一 性或相似性的序列。
16在一个实施方案中，本发明的抗体包舍重链和轻链，其中重链可
变结构域包含SEQ ID NO : 9给出的序列，其中轻链可变结构域包含 SEQ ID NO: 7给出的序列。
在本发明的另一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链 可变结构域包含与SEQ ID NO: 9给出的序列具有至少60%同一性或相 似性的序列，而轻链可变结构域包含与SEQ ID N0:7给出的序列具有 至少60°/。同一性或相似性的序列。优选，该抗体包含重链和轻链，其 中重链可变结构域包含与SEQ ID NO: 9给出的序列具有至少70°/。， 80%, 90%， 95%或98%同一性或相似性的序列，其中轻链可变结构域包含与 SEQ ID NO: 7给出的序列具有至少70%， 80%, 90%, 95%或98%同一性 或相似性的序列。
如上所述，本发明的抗体分子可以包含具有全长重链和轻链的完 整抗体分子或其片段，如结构域抗体，例如，VH、 VL、 VHH、 Fab、修 饰的Fab、 Fab， 、 F(ab， )2、 Fv或scFv片段。
考虑到所提出的该抗体分子的功能，尤其是可能需要的效应功能 后，可以选择本发明抗体分子的恒定区结构域，如果存在。例如，恒 定区结构域可以是人IgA、 IgD、 IgE、 IgG或IgM结构域。尤其是，当 抗体分子意欲用于治疗用途和需要抗体效应功能时，可以使用人IgG 恒定区结构域，特别是IgGl和IgG3同种型。或者，当 抗体分子意欲 用于治疗目的且不需要抗体效应功能，例如用于简单阻断IL-17活性 时，可以使用IgG2和IgG4同种型。例如，可以使用如Angal等， Molecular Immunology, 1993， 30(1)， 105-108中所述的其中第241 位的丝氨酸已经转变为脯氨酸的IgG4分子。特别优选的是包含这种改 变的IgG4恒定区结构域。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含CL 结构域，k或入。
在优选的实施方案中，本发明提供的抗体是对人IL-17A和IL-17F 具有特异性的中和抗体，其中重链恒定区包含人IgG4恒定区，其中第 241位丝氨酸已经被脯氨酸取代，如Angal等，上文中所述的。因此，本发明提供了其中重链包含SEQ ID NO : 15中给出的序列或由该序列 组成的抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链，其中重链可变结构 域包含与SEQ ID N0:15给出的序列具有至少60%同一性或相似性的序 列。优选，抗体包含重链，其中重链可变结构域包含与SEQ ID NO: 15 给出的序列具有至少70%， 80%， 90%， 95°/。或98%同一性或相似性的序 列。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体分子包含轻链，该轻链包 含SEQ ID NO: 11中给出的序列。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO: 11给出的序列具有至少60%同一性或相似性的序列。优选，抗 体包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO: 11给出的序列具有至少70%， 80%, 90%, 95%或98%同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中重链包含SEQ ID NO: 15给出的序列或由该序列组成，而轻链包含SEQ ID NO: 11给出的 序列或由该序列组成。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链包 含与SEQ ID NO: 15给出的序列具有至少60%同一性或相似性的序列， 而轻链包含与SEQ ID NO: 11给出的序列具有至少60%同一性或相似性 的序列。优选，该抗体包含重链和轻链，其中重链包含与SEQ ID NO: 15 给出的序列具有至少70%, 80%, 90%, 95%或98%同一性或相似性的序 列，其中轻链包含与SEQ ID NO: 11给出的序列具有至少70%, 80%, 90%， 95%或98%同一性或相似性的序列。
本发明还提供了人IL-17A的特定区域或表位和/或人IL-17F的特 定区域或表位和/或人IL-17A/F杂二聚体的特定区域或表位，其与本 发明提供的抗体结合，尤其是包含重链序列gH9 (SEQ ID NO : 9)和 /或轻链序列gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗体。
可以通过本领域已知的任何合适的表位作图方法结合本发明提供 的任何一个抗体来鉴定人IL-17A多肽的特定区域或表位和人IL-17F多肽的特定区域或表位和人IL-17A/F杂二聚体的特定区域或表位。这 种方法的实例包括筛选与本发明抗体结合的来源于IL-17A和IL-17F 的不同长度的肽，最小的片段可以特异性结合含有该抗体识别的表位 序列的抗体。IL-17肽可以合成产生或通过蛋白水解消化合适的IL-17 多肽来制备。可以通过例如质镨分析来鉴定结合该抗体的肽。在另一 个实例中，可使用NMR核磁共振来鉴定由本发明抗体结合的表位。一 旦得到鉴定，如果需要，则可以使用结合本发明抗体的表位片段，如 果需要，用作免疫原来获得结合相同表位的其他中和抗体。
交叉阻断根据本发明的抗体结合的抗体，尤其是包含重链序列 gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗体，可以类 似地用于中和IL-17A和IL-17F活性。因此，本发明还提供了结合人 IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其交叉阻断如上所述任何一个抗体 与人IL-17A和/或人IL-17F和/或人IL-17A/F杂二聚体的结合和/或 通过那些抗体中的任一种交叉阻断其与IL-17A和/或IL-17F和/或人 IL-17A/F杂二聚体的结合。在一个实施方案中，这样的抗体结合如上 所述抗体相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断中和抗体结合 由上文中所述抗体结合的表位接近和/或重叠的表位。在另一个实施方
的表位或与所述表位接近和/或重叠的表位。
可以使用本领域中任何合适的方法来鉴定交叉阻断抗体，例如， 使用竟争性ELISA或BIAcore，其中交叉阻断抗体与人IL-17A和/或 人IL-17F的结合阻止了本发明抗体的结合，或反之亦然。
在一个实施方案中，提供了结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗 体，其交叉阻断重链包含序列gH9 (SEQ ID N0 : 9)和轻链包含序列 gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗体与人IL-17A和人IL-17F的结合。在一个 实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体抑制包含重链序列gH9 (SEQ ID NO: 9 )和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗体与IL-17A和IL-17F 的结合，对IL-17A的抑制高于80°/。，优选高于85%，更优选高于90%， 甚至更优选高于95%，对IL-17F的抑制高于80%，优选高于85%，更
19优选高于90%，甚至更优选高于95%。
在一个实施方案中，提供了结合人IL-17A和IL-17F的中和抗体， 其交叉阻断重链包含序列gH9(SEQ IDN0: 9)和轻链包含序列gL7(SEQ ID NO: 7 )的抗体与人IL-UA、人IL-17F和人IL-17A/F杂二聚体的 结合。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体抑制包含重链 序列gH9 (SEQ ID NO : 9)和轻链序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗体 与IL-17A、 IL-17F和IL-17A/F杂二聚体的结合，对IL-17A的抑制高 于80%，优选高于85%,更优选高于90%，甚至更优选高于95%，对IL-17F 的抑制高于80%，优选高于85%，更优选高于90%,甚至更优选高于95%, 对IL-17A/F的抑制高于80%，优选高于85%,更优选高于90%,甚至 更优选高于95%。
在一个实施方案中，提供了结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗 体，其交叉阻断重链包含序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和轻链包含序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗体与人IL-17A、或与人IL-17F或人IL-17A/F 杂二聚体的结合。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体抑
制包含重链序列gH9 ( SEQ ID NO : 9 )和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 ) 的抗体与IL-17A或IL-17F或IL-17A/F的结合，该抑制高于80%，优 选高于85%,更优选高于90%，甚至更优选高于95%。
可替换地或另外地，可以通过包含重链序列gH9 (SEQ ID NO: 9) 和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗体来交叉阻断根据本发明该方面 的中和抗体与人IL-17A和人IL-7F的结合。因此，还提供了结合人 IL-17A和人IL-17F的中和抗体，通过包含重链序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗体交叉阻断其与人IL-17A 和人IL-17F的结合。在一个实施方案中，通过包含重链序列gH9(SEQ ID NO: 9)和轻链序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗体抑制了本发明的该 方面提供的中和抗体与人IL-17A和人IL-17F的结合，该抑制高于 80%，优选高于85%，更优选高于90%，甚至更优选高于95%。
在另一个实施方案中，提供了结合人IL-17A和人IL-17F的中和 抗体分子，通过包含重链序列gH9(SEQ IDNO: 9)和轻链序列gL7 ( SEQID NO: 7)的抗体交叉阻断了其与人IL-17A、人IL-17F和IL-17A/F 杂二聚体的结合。在一个实施方案中，通过包含重链序列gH9(SEQID NO: 9)和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗体抑制了本发明的该方面 提供的中和抗体与人IL-17A、人IL-17F和人IL-17A/F杂二聚体的结 合，该抑制高于80%，优选高于85%，更优选高于90%，甚至更优选高 于95%。
因此，还提供了结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体分子，通 过包含重链序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和轻链序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 ) 的抗体交叉阻断了其与人IL-17A或人IL-17F或人IL-17A/F杂二聚体 的结合。在一个实施方案中，通过包含重链序列gH9 (SEQ ID NO: 9) 和轻链序列gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗体抑制了本发明的该方面提供的 中和抗体与人IL-17A或人IL-17F或人IL-17A/F杂二聚体的结合，该 抑制高于80%，优选高于85%,更优选高于90%,甚至更优选高于95°/。。
本发明任一方面的抗体分子优选具有高结合亲和性，优选纳摩尔， 甚至更优选皮摩尔。将认识到根据本发明的抗体对人IL-17A的结合亲 和性不同于相同抗体对人IL-17F和/或IL-17A/F杂二聚体的结合亲和 性。在一个实例中，本发明的抗体分子对IL-17A的亲和性高于对 IL-17F的亲和性。在一个实例中，本发明的抗体分子对IL-17A的亲 和性是其对IL-17F的结合亲和性的至少10倍。在一个实例中，本发 明的抗体分子对IL-17A的亲和性是其对IL-17F的结合亲和性的至少 50倍。在一个实例中，本发明的抗体分子对IL-17A的亲和性是其对 IL-17F的结合亲和性的至少100倍。在一个实例中，本发明的抗体分 子对IL-17F的亲和性高于对IL-17A的亲和性。在一个实例中，本发 明的抗体分子对IL-17A的亲和性和对IL-17F的亲和性相同。在一个 实例中，本发明的抗体分子对IL-17A具有皮摩尔的亲和性，而对 IL-17F具有纳摩尔的亲和性。在一个实例中，本发明的抗体分子对 IL-17F具有納摩尔的亲和性，而对IL-17A具有皮摩尔的亲和性。在 一个实例中，本发明的抗体分子对IL-17A和IL-:HF都具有纳摩尔的 亲和性。在一个实例中，本发明的抗体分子对IL-17A和IL-17F都具有皮摩尔的亲和性。
优选，本发明的抗体分子对IL-17A具有优于10nM的结合亲和性。 在一个实施方案中，本发明的抗体分子对IL-17A具有优于500pM的亲 和性。在一个实施方案中，本发明的抗体分子对IL-17A具有优于100pM 的亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体分子对IL-17A具有优于 20pM的亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体对IL-17A具有16pM 的亲和性。
优选，本发明的抗体分子对IL-17F具有优于10nM的结合亲和性。 在一个实施方案中，本发明的抗体分子对IL-17F具有优于2nM的亲和 性。在一个实施方案中，本发明的抗体对IL-17F具有1. 75nM的亲和 性。
优选，本发明的抗体分子对IL-17A/F杂二聚体具有优于10nM的 结合亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体分子对IL-17A/F杂二 聚体具有优于500pM的结合亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗 体分子对IL-17A/F杂二聚体具有优于150pM的结合亲和性。在一个实 施方案中，本发明的抗体分子对IL-17A/F杂二聚体具有116pM的结合 亲和性。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子对猕猴IL-17F具有优于 2nM的结合亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体分子对猕猴 IL-17F具有1. 03nM的结合亲和性。
的抗体的亲和性。因此，本发明还涉及本发明抗体分子的变体，其对 IL-17A和或IL-17F具有提高的亲和性。可以通过很多亲和性成熟方 案获得这种变体，包括使CDR突变(Yang等，J. Mol. Biol. ， ^1， 392-403， 1995 )、链改组(Marks等，Bio/Technology， i^， 779-783， 1992 )、使用大肠杆菌突变林(Low等，J. Mol. Biol. ， ， 359-368，
1996 )、 DNA改组(Patten等，Curr. Opin. Biotechnol，多，724-733，
1997 )、噬菌体展示(Thompson等，J. Mol. Biol.，里，77-88, 1996 )和有性PCR( sexual PCR ) ( Crameri等，Nature,巡，288-291，1998 ) 。 Vaughan等(上文)讨论了这些亲和性成熟的方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子中和IL-17A和IL-17F活 性，例如，在实施例中描述的体外试验中。在一个实施方案中，本发 明提供了对人IL-17A和IL-17F具有特异性的中和抗体，其在小于5nM 的浓度下能够抑制50% 0. 8nM人IL-17A的活性，在小于12nM的浓度 下能够抑制50% 4. 2nM人IL-17F的活性，用IL-17A或IL-17F诱导 的从海拉细胞的IL-6释放来度量所述抑制活性。在一个实施方案中， 抑制50% IL-17A的抗体浓度小于3nM。在一个实施方案中，抑制50% IL-17F的抗体浓度小于llnM。在一个实施方案中，该试验中使用的人 IL-17A和人IL-17F是重组人IL-17A和IL-17F。在一个实施方案中， 中和抗体是人源化或完全人的抗体。
如果期望，本发明使用的抗体可以缀合一个或多个效应分子。将
分子连接形成可二连接本发明抗体的单;虫部分:'在期望获得连接效应
分子的抗体片段的情况下，这可以通过标准化学或重组DNA程序来制 备，其中抗体片段直接连接或通过偶联剂连接效应分子。缀合这样的 效应分子与抗体的技术是本领域公知的(参见，Hellstrom等， Controlled Drug Delivery (受控药物传送)，第2版，Robinson等， 编辑，1987， pp. 623-53; Thorpe等，1982， Immunol. Rev. ， 62: 119-58 和Dubowchik等,1999， Pharmacology and Therapeutics (药理学 和治疗学)，83， 67-123 )。特定的化学方法，包括，例如，W0 93/06231、 W0 92/22583、 W0 89/00195、 W0 89/01476和WO03031581中所述的那 些。或者，在效应分子是蛋白或多肽的情况下，可以使用重组DNA程 序实现连接，例如，如WO 86/01533和EP0392745中所述的。
如在此所用的的术语效应分子包括，例如，抗肿瘤剂、药物、毒 素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在 的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、 RNA及其片段、放射性核素，特 别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，如 焚光化合物或通过NMR或ESR光镨术可检测到的化合物。效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒剂，包括对细胞有害
(例如，杀灭)的任何试剂。实例包括combrestatins、多拉司他汀、 epothilones、 星形孢菌素、maytansinoids、 spongistatins、 根霉 素、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉酚、细胞松弛素B、 短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、 长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素 二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、 l-去氢睾酮、糖皮质激素、 普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系 物。
效应分子还包括但不限于抗代谢物(例如，氨曱蝶呤、6-巯基嘌 呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氛烯咪胺)、烷化剂(例 如，二氯甲二乙胺、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮 芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、 链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯化二氨亚铂(II) (DDP)顺铂)、 蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin )(以前是(daunomycin ) 和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(dactinomycin )(以前是 actinomycin)、博莱霹素、光辉霉素、氨茴霉素(AMC)、刺孢霉素 或多卡米星)和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
其他效应分子可以包括螯合放射性核素，如min和，、Lu177、铋 213、锎252 、铱192和鴒187铼188;或药物，如但不限于，烷基磷酸胆碱、 拓朴异构酶I抑制剂、紫杉烷和苏拉明。
其他效应分子包括蛋白、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于蛋白 水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白、多肽和 肽包括但不限于免疫球蛋白，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒A、假 单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白，如胰岛素、肿瘤坏死因子、cc-干扰 素、p-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或組织纤溶酶原 激活物、血松形成剂或抗血管生成剂，例如，制管张素或内皮抑制素， 或生物反应调节物，如淋巴因子、白细胞间介素-1 (IL-1)、白细胞 间介素-2 (IL-2)、白细胞间介素-6 (IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落
24刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子
(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应分子可以包括例如用于诊断中的可检测物质。可检测物 质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、 放射性核素、正电子放射金属(用于正电子发射层析成像)和非放射 性顺磁性金属离子。关于可以缀合抗体用作诊断的金属离子，通常参 见美国专利No. 4， 741， 900。合适的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、
P -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫 氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白； 合适的发光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括荧光素酶、莹 光素和水母发光蛋白；和合适的放射性核素包括125I、 131I、 mIn和"Tc。
在另一个实例中，效应分子可以提高抗体在体内的半衰期和/或降 低抗体的免疫原性和/或提高抗体穿过上皮屏障递送到免疫系统。该类 型合适的效应分子实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋 白结合化合物，如W005/117984中描述的那些。
在效应分子是聚合物的情况下，它通常可以是合成的或天然存在 的聚合物，例如，任选取代的直链或支链聚烷撑、聚亚烷基或聚乙二 醇聚合物或分支或不分支的多糖，例如，同型或异型多糖。
可以存在于上述合成聚合物上的特定的任选取代基包括一个或多 个羟基、曱基或甲氧基。
合成聚合物的特定实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、 聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)， 如单甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或 其衍生物。
在此所用的"衍生物"意欲包括反应性的衍生物，例如，巯基-选择性的活性基团，如马来酰亚胺等。反应性基团可以直接连接或通 过衔接片段连接聚合物。将认识到这种基团的残基在有些情况下会作为抗体片段和聚合物之间的连接基形成产物的一部分。
聚合物的大小可以根据需要而变化，但是平均分子量通常为
500Da至50000Da，优选5000至40000Da，更优选20000至40000Da。
尤其可以基于产品的预定用途来选择的聚合物大小，例如，局限于特 定組织如肿瘤的能力或延长循环半衰期的能力(对于综述，参见 Chapman, 2002， Advanced Drug Del ivery Reviews， 54， 531-545 )。 因此，例如，在产物意欲离开循环并穿过组织，例如用于治疗肿瘤的 情况下，使用小分子量聚合物可能是有利的，例如，大约5000Da的分 子量。对于产物保留在循环中的应用，使用较高分子量的聚合物可能 是有利的，例如，具有20000Da至40000Da范围的分子量。
特别优选的聚合物包括聚烷撑聚合物，如聚(乙二醇)，或尤其是 甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且特别具有约15000Da至约40000Da 范围的分子量。
在一个实例中，将本发明中使用的抗体与聚(乙二醇)(PEG)部分连 接。在一个特别的实例中，该抗体是抗体片段并可以通过位于抗体片 段中的任何可利用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团例如任何游离氨 基、亚氨基、硫醇基、羟基或羧基与PEG分子连接。这种氨基酸可以 天然存在于抗体片段中或可以使用重组DM方法而工程化至片段中 (参见，例如，US 5， 219， 996; US 5, 667,425; W098/25971 )。在一 个实例中，本发明的抗体分子是修饰的Fab片段，其中修饰是将一个 或多个氨基酸添加至其重链C末端以允许连接效应分子。优选，另外 的氨基酸形成修饰的绞链区，该区含有可以连接效应分子的一个或多 个半胱氨酸残基。多个位点可用于连接两个或多个PEG分子。
优选通过位于抗体中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接 PEG分子。与修饰的抗体片段连接的每个聚合物分子可以与位于片段 中的半胱氨酸残基的硫原子共价连接。共价键通常将是二硫键或尤其 是硫-碳键。在硫醇基用作适当激活效应分子的连结点的情况下，例如， 可以使用疏醇选择性衍生物，如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活 的聚合物可以用作制备如上所述的聚合物修饰的抗体片段的原料。激活的聚合物可以是含有硫醇反应性基团的任何聚合物，如a -卣素羧酸 或酯，例如，碘乙酰胺，酰亚胺，例如，马来酰亚胺，乙烯基砜或二 石充化物。这种原料可购得(例如从Nektar，以前的Shearwater Polymers Inc., Himtsville， AL， USA)或可以从可购得的原料^f吏用 常规化学步骤制备。特定的PEG分子包括2OK甲氧基-PEG-胺(可从 Nektar, 以前的Shearwater; Rapp Polymere; 和SunBio获得)和 M-PEG-SPA (可从Nektar，以前的Shearwater获得)。
在一个实施方案中，该抗体是PEG化的修饰Fab片段，即，具有 与其共价连接的PEG (聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544中公开 的方法[请参阅 "Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications"(聚(乙二醇)化学，生物技术和 生物药物应用，1992， J. Milton Harris (编辑)，Plenum Press, New York," Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications"(聚(乙二醇)化学和生物应用)，1997, J. Milton Harris和S. Zalipsky (编辑)，American Chemical Society, Washington DC和"Bioconjugation Protein Coupl ing Techniques for the Biomedical Sciences"(用于生物药物科学的生物缀合蛋白连接 技术)，1998， M. Aslam和A. Dent, Grove Publishers， New York, Chapman, A. 2002， Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]。在一个实例中，PEG与绞链区的半胱氨酸连接。在一个 实例中，PEG修饰的Fab片段具有与修饰绞链区中单个硫醇基共价连 接的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以与马来酰亚胺基团共价连接， 并且赖氨酸残基上的每个胺基可以连接分子量为大约20， 000 Da的甲 氧基聚(乙二醇)聚合物。因此与Fab片段连接的PEG的总分子量可以 是大约40， 000 Da。
在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-17A和IL-17F具有特 异性的中和抗体，其是修饰的Fab片段，具有包含SEQ ID NO: 9给出 序列的重链和包含SEQ ID NO. 7给出序列的轻链，并且在其重链C末 端具有含与效应分子连接的至少 一个半胱氨酸残基的修饰绞链区。优
27选，效应分子是PEG和使用(W098/25971和W02004072116 )中所述的 方法连接，由此赖氨酰马来酰亚胺基与重链C末端的半胱氨酸残基连 接，并且赖氨酰残基的每个氨基与分子量约20， 000 Da的甲氧基聚(乙 二醇)残基共价连接。因此与抗体连接的PEG的总分子量可以是大约 40， OOODa。
在另一个实例中，效应分子可以与抗体片段连接，使用国际专利 申请WO 2005/003169、 WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的 方法。
本发明还提供了编码本发明抗体分子的重链和/或轻链的分离 DNA序列。优选，该DNA序列编码本发明抗体分子的重链或轻链。本 发明的DNA序列可以包括合成的DNA,例如化学方法生产的，cDM、 基因组DNA或其任何组合。
编码本发明抗体分子的DNA序列可以通过本领域技术人员公知的 方法获得。例如，可以按照需要从确定的DNA序列或基于相应的氨基 酸序列来合成编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列。
编码受体框架序列的DNA是本领域技术人员普遍可获得的并且可 以根据它们的已知氨基酸序列容易地合成。
DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成所需的DNA 序列。如果需要，可以使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
SEQIDN0:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18中提供了合适序列的实例。SEQ ID NO: 18 中的核苷酸1-57个SEQ ID NO: 14中的核苷酸1-60编码来自鼠抗体 B72. 3的信号肽序列 (Whittle等，1987， Protein Eng. 1(6) 499-505 )，将其分裂来产生本发明的中和抗体分子。
本发明还涉及含有本发明的一个或多个DNA序列的克隆或表达载 体。因此，提供了包含编码本发明抗体的一个或多个DNA序列的克隆 或表达栽体。优选，克隆或表达载体分别包含编码本发明抗体分子轻 链和重链的两个DNA序列。优选，根据本发明的载体包含SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 18给出的序列。SEQ ID NO: 18中的核苷酸1-57和SEQ ID NO: 14中的核苷酸1-60编码来自小鼠抗体B72. 3的信号肽序列 (分别是SEQ ID NO: 16中的残基1-19和SEQ ID NO: 12中的1-20)， 最优选将其分裂来获得本发明的中和抗体分子。
可以构建栽体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人 员公知的。在这方面，参考 "Current Protocols in Molecular Biology"(分子生物学中的通用方案)，1999， F. M. Ausubel (编 辑)，Wiley Interscience ， New York 和 Cold Spring Harbor Publishing生产的Maniatis Manual。
还提供了包含一个或多个克隆或表达栽体的宿主细胞，该载体包 含编码本发明抗体的一个或多个DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体 系统可以用于表达编码本发明抗体分子的DNA序列。可以使用细菌， 例如，大肠杆菌，和其他微生物系统，或也可以使用真核生物例如哺 乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CH0、骨髓 瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了生产根据本发明的抗体分子的方法，包括在适于 引起从编码本发明抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养含有本发明 栽体的宿主细胞，和分离该抗体分子。
该抗体分子可以只包舍重链或轻链多肽，而在这样情况下，只需 要重链或轻链多肽编码序列来用于转染宿主细胞。对于包含重链和轻 链的产物的生产，可以用两个载体转染细胞系，第一个载体编码轻链 多肽，而第二个载体编码重链多肽。或者，可以使用单个载体，该栽 体包含编码轻链和重链多肽的序列。
由于本发明抗体可用于治疗和/或预防病理情况，本发明还提供了 包含本发明抗体分子并结合一种或多种药物学上可接受的赋形剂、稀 释剂或栽体的药物或诊断组合物。因此，提供了根据本发明的抗体用 于制备药物的用途。该组合物通常以无菌药物组合物的一部分提供， 该药物组合物通常包括药物学上可接受的栽体。本发明的药物组合物 可以另外包含药物学上可接受的佐剂。本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的 抗体分子连同一种或多种药物学上可接受的赋形剂、稀释剂或栽体一 起添加和混合。
抗体分子可以是药物或诊断组合物中唯一的活性成分或可以伴有
其他活性成分，包括其他抗体成分，例如抗TNF、抗IL-1P、抗T细 胞、抗IFNy或抗LPS抗体，或非抗体成分，如黄噤呤。
该药物组合物优选包含治疗有效量的本发明抗体。如在此所用的 术语"治疗有效量"是指治疗、改善或预防目标疾病或病情所需，或 呈现出可检测的治疗或预防作用所需的治疗剂量。对于任何抗体，可 以在细胞培养试验或在动物模型中初步估计治疗有效量，通常在啮齿 类、兔、狗、猪或灵长类动物中。该动物模型也可以用于测定合适的 浓度范围和给药途径。然后这种信息可用于确定在人类中的有效剂量 和给药途径。
对于人患者的精确治疗有效量将取决于疾病状况的严重性、患者 的一般健康状况、患者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频 率、药物联合、对治疗的反应敏感性和耐受度/反应。该含量可以通过 常规实验确定并且在临床医师的判断之内。通常，治疗有效量为 0. 01mg/kg至50mg/kg，优选0. lmg/kg至20mg/kg。药物组合物可以 方便地以每剂含有预定量本发明活性剂的单位剂型存在。
该组合物可以单独给予患者或可以联合其他试剂、药物和激素给 予(例如同时、按序或分开)。
本发明抗体分子给予的剂量取决于所治疗病情的性质、存在的炎 症程度和取决于该抗体分子是用于预防还是治疗现有的病情。
剂量的次数将取决于抗体分子的半衰期及其作用的持续时间。如 果抗体分子具有短半衰期(例如2至10小时)，需要每天给予一剂或 多剂。或者，如果抗体分子具有半长衰期(例如2至15天)，仅需要 给予每天一次、每周一次乃至每1个月或2个月一次的剂量。
药物学上可接受的栽体本身不应该诱导产生对接受该组合物的个 体有害的抗体并且不应该有毒。合适的载体可以是大的、緩慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨 基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可以使用药物学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴 酸盐、磷酸盐和疏酸盐，或有机酸盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐 和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药物学上可接受的载体可以另外含有液体，如水、
盐水、甘油和乙醇。另外，辅料，如润湿剂或乳化剂或pH緩冲剂可以 存在于这样的组合物中。这样的载体能使该药物组合物配制成片剂、 丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，用于由患 者摄取。
优选的给药形式包括适于非肠道给药的形式，例如通过注射或输 注，例如通过快速浓注或连续输注。在产品用于注射或输注的情况下， 可以釆用含油或含水载体中的悬浮液、溶液或乳浊液的形式，并且可 以含有配制剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体 分子可以是干燥形式，在使用前用合适的无菌液体重建。
一旦配制，本发明的组合物可以直接给予患者。待治疗的患者可 以是动物。然而，优选该组合物适于给予人患者。
本发明的药物组合物可以通过许多途径给予，包括但不限于口腔、 静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮下(例如， 参见W0 98/20734 )、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴 道内或直肠途径。也可以使用无痛皮下喷射器给予本发明的药物组合 物。通常，治疗组合物可以制备成可注射的，液体溶液或悬浮液。也 可以制成适于注射前以溶于或悬浮于液体栽体的固体形式。
通常通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或递送至组织 间隙来实现组合物的直接递送。还可以将组合物给予受损处。剂量治 疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
将认识到组合物中的活性成分将是抗体分子。正因为如此，它在 胃肠道易于降解。因此，如果组合物通过胃肠道途径给予，该组合物 将需要含有保护抗体不被降解的试剂，但其一旦被胃肠道吸收则释放该抗体。
药物学上可接受栽体的深入讨论可在 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明顿氏药物科学)(Mack Publishing Company, N. J. 1991 )中获得。
还设想了通过使用基因治疗给予本发明的抗体。为了实现这一点， 将在合适的DNA成分控制下的编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列 导入患者种，使得从DNA序列表达该抗体链并在原位装配。
本发明还提供了用于控制炎性疾病的抗体分子。优选，该抗体分 子可用于减轻炎性过程或预防炎性过程。
本发明还提供了用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或 与升高的IL-17A和/或IL-17F水平相关的病理失调的本发明的抗体分 子。优选，病理情况选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫性的)、 与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、津喘、盆腔 炎、阿尔茨海默氏病、克罗恩氏病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、 Peyronie氏疾病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、4艮屑病、脉 管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫 介导的中枢和外周神经系统的炎性障碍，如多发性硬化和吉-巴综合 征、其他自体免疫障碍、胰腺炎、外伤(手术)、移植抗宿主疾病、 移植排斥、癌症(实体肿瘤，如黑素瘤、肝胚细胞瘤、肉瘤、鳞状细 胞癌、移行细胞癌、卵巢癌和血液系统恶性肿瘤，尤其是急性髄性白 血病、慢性粒性白血病、胃癌和结肠癌)、心脏病，包括缺血性疾病， 如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、 骨关节炎、牙周炎和胃酸过少。
本发明还提供了用于治疗或预防疼痛的根据本发明的抗体分子。
本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子用于制造治疗或预防 由IL-17A和/或IL-17F介导的或与升高的IL-17A和/或IL-17F水平 相关的病理失调的药物的用途。优选病理失调是类风湿性关节炎或多 发性硬化。
本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子在制备治疗或预防疼痛的药物中的用途。
本发明的抗体分子可以用于期望降低IL-17A和/或IL-17F在人或 动物体中的作用的任何疗法中。IL-17A和/或IL-17F可以在体内循环 或可以以出乎意料的高水平局部存在于体内的特定部位，例如炎症部 位。
优选根据本发明的抗体分子用于控制炎性疾病、自体免疫疾病或 癌症。
本发明还提供了治疗患有由IL-17A和/或IL-17F介导的疾病或处 于这种风险中的人或动物患者的方法，该方法包括将有效量的本发明 的抗体分子给予患者。
根据本发明的抗体分子也可以用于诊断，例如涉及IL-17A和/或 IL-17F的病况的体内诊断和成像。
在下面参照附图的实施例中，仅通过说明进一步描述了本发明，
其中-.
图1:
a )抗体CA028 —0496的轻链V区(SEQ ID NO: 7 ) b )抗体CA028-0496的重链V区(SEQ ID NO: 9 ) c)抗体CA028-496的CDRHl( SEQ ID NO: 1 )， C醒2( SEQ ID NO: 2)，
C麵3 ( SEQ ID NO: 3 ) ， CDRL1 ( SEQ ID NO: 4 ) ， CDRL2 ( SEQ ID NO: 5 )，
CDRL3 ( SEQ ID NO: 6 )。
d )抗体CA028-496的轻链(SEQ ID NO: 11 )。 e )抗体CA028 — 496的重链(SEQ ID NO: 15 )。 f )编码抗体CA028-496的轻链并包括信号序列的DNA (SEQ ID
NO: 14 )。
g)编码抗体CA028 — 496的重链并包括信号序列的DNA (SEQ ID NO: 18)。
图2
a )抗体CA028 — 0496 (图例中称为Ab#496 )对人IL-17A诱导的从海拉细胞产生IL-6的作用。
b)抗体CA028-0496 (图例中称为Ab#496 )对人IL-17F诱导的从 海拉细胞产生IL-6的作用。
Z W橫斧#一妓才法
使用大肠杆菌菌林INVaP ( Invitrogen)转化和常规培养生长。 DM限制和修饰酶得自Roche Diagnostics Ltd.和New England Biolabs。使用Maxi质粒纯化试剂盒(QIAGEN，目录号12165)进行 质粒制备。使用ABI Prism Big Dye终止测序试剂盒(目录号4304149 ) 进行DNA测序反应并在ABI 3100自动测序仪(Applied Biosystems) 上运行。使用AutoAssembler程序(Appl ied Biosystems)分析数据。 寡核苷酸得自Invitrogen。使用IgG装配ELISA确定IgG的浓度。
重组IL-17A和IL-17F购自R&D Systems。
通过使用GS连接物连接IL-17A和IL-17F来产生重组IL-17A/F
杂二聚体。杂二聚体具有以下序列(SEQ ID NO: 19)。
MGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKIISSDYYNRSTSPWNLHRN PVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRN正SRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEWQAQCRNL
Q
重组猕猴IL-17F (SEQ ID NO: 20)
CVTPV工HHVQ
通过Entelechon GmbH化学合成编码IL-17A/F杂二聚体的DNA 序列，并在Ndel/Xhol位点亚克隆至pET43. la中。使用引入NdeI和Xhol限制位点的引物通过PCR扩增编码cyno IL-17F的DNA序列。将 PCR产物与pCR4Blunt-T0P0连接并且在消化和在Ndel/Xho1位点上与 pET43. la连接之前验证序列。
使用编码IL-17同种型的pET43. la DNA来转染BL21 (DE3)细胞 并将选择的羧节青霉素抗性克隆在含有2%葡萄糖和50pg/ml羧千青 霉素的2TY培养液中在37C下生长过夜。然后将培养物稀释并在相同 的培养基中生长至0. 5-0. 7的OD綱，用lmM IPTG诱导并在37C下再 生长4-5小时。
通过离心收集细胞并从细胞制得包含体。将包含体溶解于50mM Tris-HCl、 5M盐酸胍、50mMNaCl、 lmM EDTA、 2mM还原型谷胱甘肽、 0. 2mM氧化型谷胱苷肽(pH8. 5)中。通过将溶解的蛋白质逐滴加入上 述不含盐酸胍的緩冲液中使IL-17蛋白重折叠，使用强烈搅拌。选择 最终的体积，使得最终的蛋白浓度不超过0. lmg/ml。
如果需要，用10mMMES pH6进行緩冲液交换之前，将重折叠的蛋 白溶液浓缩。然后将蛋白施加至用20mMMES pH6平衡的Sepharose SP HP柱上。用超过10柱体积的MESpH6中的0-500mM线性梯度NaCl洗 脱蛋白。对于IL-17F，梯度延伸至600mM NaCl。为了进一步纯化IL-17， 收集来自Sepharose SP HP柱的相关级分，浓缩并用20mM CAPSO (pHIO)稀释，并施加至用20mM CAPSO平衡的Mono Q柱上。用超过 20柱体积的20mM CAPSO中的0-250mM线性梯度NaCl洗脱蛋白。收集 含有IL-17的级分并使用1M MES pH6中和。
实施例1:中和抗IL-17抗体的产生
用重组人IL-17 (购自R&D systems)免疫雌性Sprague Dawly 大鼠。大鼠接受100 弗氏佐剂中20 IL-17的四次免疫。使用 WO04/051268中所述的方法分离结合人IL-17的抗体225。分离抗体 225重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的基因并且通过 逆转录PCR克隆后测序。
使用人V区受体框架并通过改变该框架区的供体残基数量来设计一系列的人源化VL和VH区。设计八个移植VL区(gLl-8 )和9个移 植VH区(gHl-9),并通过寡核苷酸装配和PCR诱变构建基因。
将轻链移植序列亚克隆至人轻链表达载体pKH10, 1中，其含有编 码人C-k恒定区(Km3同种异型)的DNA。将重链移植序列亚克隆至 人Y -4表达栽体pVhg4P FL中，其含有编码含铰链稳定突变S241P的 人Y-4恒定区的DNA (Angal等，上文)。将质粒共转染至CH0细 胞中，并且在IL-17结合和中和测试中筛选所产生抗体的活性。根据 制造商的说明书使用Lipofectamine 2000程序(InVUrogen，目录 号11668 )进行CH0细胞的转染。
基于表达、亲和性和中和潜能选择了最佳的移植物(gL7gH9)， 并命名为CA028-0496。该抗体的V区序列对于轻链(gL7 )和重链(gH9 ) 各自显示于图1 (a)和(b),以及SEQ ID NO: 7和9中。
重链受体框架是人种系序列VH3 1-3 3-07，框架4来自人JH区 种系JH4的这个部分。轻链受体框架是人种系序列VK1 2-l-(l)L4， 框架4来自人JK区种系JK1的这个部分。
实施例2:抗体CA028-0496中和IL-17、 IL-17F和IL-17A/F杂 二聚体
海拉细胞
测试了抗体CA028 —0496对抗海拉细胞中人重组IL-17和人重组 IL-17F的潜能，并与抗体CDP435相比较(W006/054059 )。海拉细胞 获自ATCC的细胞库(ATCCCCL-2)。将细胞生长于补充10%胎牛血清、 青霉素、庆大霉素和谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) 中。将lxl(T个细胞涂布于96孔平底组织培养平板中。将细胞孵育 过夜并在测试緩冲液中洗涤一次。在固定浓度的人TNF-oc存在下孵育 人IL-17A ( 25ng ml—1)或人IL-17F ( 125ng m1—1)，用抗体CA028一0496 或抗体CDP435预先孵育该混合物。然后将细胞因子加抗体加入孵育过 夜的海拉细胞中。细胞培养物上清液中IL-6的产生与加入细胞中的 IL-17A/IL-17F含量成比例。通过ELISA测量人IL-6水平并通过与已知的人IL-6标准浓度相比较来定量。
数据(图2a和2b)表明抗体CA028-0496有效地中和了人重组 IL-17A，并且对人IL-17F具有一定的活性。来自这些实验的数据表明 抗体CA028 — 0496对人重组IL-17( 25ng m1—1 )产生了 43/ng/ml的IC5。, 对重组IL-17F ( 125ng mr1)产生了 1477ng/ml的IC5。。
因此，抗体CA028 — 0496在该测试中对人重组IL-17 (0.78nM)产 生了 0. 29M的IC5。，对人重组IL-17F( 4. 16nM)产生了 10. 18nM的IC5。 (计算基于每个IgG，假定145，000的分子量为平均的IgG4，并假定 IL-17A和IL-17F是二聚体)。
人小胶质细胞
将人小胶质细胞(TCS Cellworks )涂布于平底96-孔平板中5， 000 个细胞/孔，总体积为100jil，并且放置24小时，使其连接塑料。在 该，在10ng/ml人重组TNFa存在和不存在下，将滴定度(5、 1、 0.2 和0. 04 ia g/ml )的人重组IL-17A、人重组IL-17F、猕猴重组IL-17F 和人重组IL-17A/F杂二聚体加入孔中，重复三份。对照孔不含有刺激 物，含有单独的IL-17A ( 100ng/ml )、单独的TNF ot以及IL-17A和 TNFa—起。以110p l/孔的总体积将所有细胞因子加入，使总的孔体 积为210ja 1。在涉及抗体的实验中，以相同的方式涂布细胞。24小时 后，在相同的时间加入抗体和细胞因子，以获得总的200 ^ 1终体积中 所述的终浓度。
在37t:再孵育24小时后，收集上清液并在-20iC冷冻直至分析。 为了分析，将上清液稀释1/10，并根据制造商的说明使用人IL-6MSD 试剂盒测量IL-6。
发现测试的所有IL-17同种型在该测试中是有活性的，特别是在 TNFa的存在下。
在TNFa存在下测试抗体CA028-0496对抗人小胶质细胞中的人重 組IL-17A、人重组IL-17F、猕猴重组IL-17F和人重组IL-17A/F杂二 聚体的潜能，并使用上述方法与对照抗体和IL-17A特异性抗体相比
37较。
对照抗体对任一种所测试的细胞因子的活性没有作用。
抗体CA028 —0496具有对抗所有三种细胞因子IL-17、 IL-17F和 IL-17A/F的抑制活性，包括猕猴IL-17F,而IL-17A特异性抗体只具 有对抗IL-17A和IL-17A/F杂二聚体的抑制活性。
实施例3:抗体CA028-0496(人IgG4恒定区)对IL-17A和IL-17F 的亲和性
<吏用BIAcore 3000 ( BIAcore AB )进4亍BIA ( Biamolecular Interaction Analysis )。所有实验均在25匸下进行。Fc片段特异性 的Affinipure Fc片段山羊抗人IgG (Jackson ImmunoResearch )通 过胺类偶联化学作用以"6000反应单位UU)的捕获水平固定在CM5 探测芯片上。HBS-EP緩冲液(10mM HEPES pH 7. 4， 0. 15MNaCl， 3 mM EDTA， 0. 005%表面活性剂P20， BIAcore AB)用作运行緩冲液，流速 10jiL/分钟。注射10 抗体CA028-0496 ( 1. 81mg/ml )用于由固定 的抗人IgG-Fc捕获。在以30 p L/min流速从50nM至nM以下的双倍稀 释，对捕获的CA028-0496滴定人IL-17A和IL-17同种型。通过注射 30)aL 40 mM HC1，接着一次5 |i L 5mM NaOH,重新产生表面。
使用BIAevaluation软件(3. 2版本)按照标准程序双重参照和 分析背景扣除结合曲线。从拟合算法测定动力参数。
对抗体CA028 — 0496结合IL-17A测定的亲和值为16pM。对IL-17F 为1750pM。抗体CA028-0496不结合其他IL-17同种型(IL-17B、 C、 D和E)。因此，抗体CA028-0496特异性地结合IL-17A和IL-17F。
实施例4:抗体CA028-0496 (鼠IgGl恒定区)对IL-17A、猕猴 IL-17F和IL-17A/F杂二聚体的亲和性
使用BIAcore 3000 (BIAcore AB )进行BIA (Biamolecular Interaction Analysis)。
所有实验在25t:进行。Fc片段特异性的Affinipure F(ab， )2片段山羊抗鼠IgG (Jackson ImraunoResearch)通过胺类偶联化学作用 以《 6000反应单位(RU )的捕获水平固定在CM5探测芯片上(Biacore AB) 。 HBS-EP緩冲液(10mM HEPES pH 7. 4, 0. 15MNaCl， 3 mM EDTA， 0. 005%表面活性剂P20, BIAcore AB)用作运行緩冲液，流速10uL/ 分钟。注射10 n L 4 iu g/mL抗体CA028 —0496用于由固定的抗鼠IgG-Fc。 在以30juL/分钟流速从25nM至nM以下的双倍稀释，对捕获的 CA028-0496滴定人IL-17A、 cyno IL-17F和杂二聚体A/F。通过以10 pL/分钟的速率注射10jaL 40 mM HC1，接着注射5 |u L 5mM NaOH，重 新产生表面。
使用BIAevaluation软件(3.2版本)按照标准程序分析双重参 照的背景扣除结合曲线。由拟合算法确定动力学参数。
抗体CA028一0496对IL-17A具有21pM的亲和性，IL-17A/F杂二 聚体为116pM。对猕猴IL-17F为1030pM。
当然能理解仅通过实施例描述了本发明，决不意味着限制本发明， 并且在以下权利要求范围内可以进行细节的改动。本发明的每个实施 方案的优选特征也针对加以必要的变化的每个其他实施方案。将本说 明书中引用的全部出版物，包括但不限于专利和专利申请，在此引入 本文作为参考，如同每个单独出版物具体和单独指出被引入本文作为 参考，如同充分阐明一样。
权利要求
1.结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体。
2. 根据权利要求1的中和抗体，其还结合人IL-17A/F杂二聚体。
3. 根据权利要求1或权利要求2的中和抗体，其对IL-17F具有 优于2nM的结合亲和性。
4. 根据权利要求l-3任一项的中和抗体，其对IL-17A的结合亲 和性是其对IL-17F的结合亲和性的至少10倍。
5. 根据权利要求l-4任一项的中和抗体，其对IL-17A具有优于 100pM的结合亲和性。
6. 根据权利要求1至5任一项的中和抗体，其在小于5nM的浓度 下能够抑制50%的0. 8nM人IL-17A的活性，在小于12nM的浓度下能 够抑制50%的4. 2nM IL-17F的活性，用IL-17A或IL-17F诱导的从海 拉细胞的IL-6释放来度量所述抑制活性。
7. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其包含重链，其中重 链的可变结构域包含如下CDR中的至少一个具有SEQ ID NO: 1给出 的CDR-HI序列的CDR，具有SEQ ID NO: 2给出的CDR-H2序列的CDR 和具有SEQ ID NO: 3给出的CDR-H3序列的CDR。
8. 根据权利要求7的中和抗体，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO: 1给出的CDR-H1序列，SEQ ID NO: 2给出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3给出的CDR-H3序列。
9. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其包含轻链，其中轻 链的可变结构域包含如下CDR中的至少一个具有SEQ ID NO: 4给出 的CDR-Ll序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5给出的CDR-L2序列的CDR 和具有SEQ ID NO: 6给出的CDR-L3序列的CDR。
10. 根据权利要求7或权利要求8的中和抗体，另外包含轻链， 其中轻链的可变结构域包含如下CDR中的至少一个具有SEQ ID NO: 4 给出的CDR-L1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5给出的CDR-L2序列的 CDR和具有SEQ ID NO: 6给出的CDR-L3序列的CDR。
11. 根据权利要求9或权利要求10的中和抗体，其中轻链的可变 结构域包含SEQ ID NO: 4给出的CDR-L1序列，SEQ ID NO: 5给出的 CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6给出的CDR-L3序列。
12. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其中重链的可变结 构域包含三个CDR,并且CDRH-1的序列与SEQ ID NO: 1给出的序列具 有至少60%的同一性或相似性，CDRH-2的序列与SEQ ID N0:2给出的 序列具有至少60%的同一性或相似性和CDRH-3的序列与SEQ ID NO: 3 给出的序列具有至少60%的同一性或相似性。
13. 根据权利要求12的中和抗体，另外包含轻链，其中轻链的可 变结构域包含三个CDR，并且CDRL-1的序列与SEQ ID N0:4给出的序 列具有至少60%的同一性或相似性，CDRL-2的序列与SEQ ID NO: 5给 出的序列具有至少60%的同一性或相似性和CDRL-3的序列与SEQ ID NO: 6给出的序列具有至少60%的同 一性或相似性。
14. 根据权利要求7至11任一项的抗体，其中重链包含SEQ ID NO: 9给出的序列。
15. 根据权利要求7至11任一项的抗体，其中轻链包含SEQ ID NO: 7给出的序列。
16. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，具有包含SEQ ID NO: 9 给出的序列的重链和包含SEQ ID NO: 7给出的序列的轻链。
17. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其中轻链的可变结 构域包含与权利要求16抗体的轻链可变结构域具有至少80%同一性或 相似性的序列，并且其中重链的可变结构域包含与权利要求16村体的 重链可变结构域具有至少80%同一性或相似性的序列。
18. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，具有包含SEQ ID N0:15给出的序列的重链和包含SEQ ID NO: 11给出的序列的轻链。
19. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其中重链和轻链与 权利要求18抗体的相应重链和轻链至少80%相同或相似。
20. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其结合人IL-17A 和/或人IL-17F和/或IL-17A/F杂二聚体上与权利要求16的抗体相同的表位。
21. 结合人IL-17A和人IL-17F的中和抗体，其交叉阻断权利要 求16的抗体与人IL-17A和/或人IL-17F和/或IL-17A/F杂二聚体的 结合和/或由权利要求16的抗体交叉阻断其与人IL-17A和/或人 IL-17F和/或IL-17A/F杂二聚体的结合。
22. 根据权利要求1-21任一项的抗体，其中抗体是完整的抗体或 其功能活性片段或衍生物。
23. 根据权利要求22的抗体，其中抗体片段是结构域抗体，Fab， Fab， ， F(ab， )2， scFv或其表位结合片段。
24. 根据权利要求23的抗体，其中抗体或其片段是CDR-移植抗 体或完全人抗体。
25. 根据权利要求l-24任一项的抗体，其中抗体或其片段与一个 或多个效应分子缀合。
26. 由权利要求16的抗体结合的人IL-17A上的表位。
27. 由权利要求16的抗体结合的人IL-17F上的表位。
28. 由权利要求16的抗体结合的人IL-17A/F杂二聚体上的表位。
29. 编码根据权利要求1至24任一项的抗体的重链和/或轻链的 分离DNA序列。
30. 含有根据权利要求29的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。
31. 根据权利要求30的载体，其中该载体含有SEQ ID N0:14和 SEQ ID NO: 18给出的序列。
32. 包含一个或多个根据权利要求30或权利要求31的克隆或表 达载体的宿主细胞。
33. 用于产生权利要求1至24任一项的抗体的方法，包括培养权 利要求32的宿主细胞和分离抗体。
34. 包含根据权利要求1至24任一项的抗体，并结合药物学上可 接受的赋形剂、稀释剂或栽体中的一种或多种的药物组合物。
35. 根据权利要求34的药物组合物，另外含有其他活性成分。
36. 根据权利要求1至24任一项的抗体或根据权利要求34或权 利要求35的药物组合物，用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介 导的病理失调，或与IL-17A或IL-17F升高的水平相关的病理失调。
37. 根据权利要求1至24任一项的抗体在制造用于治疗或预防由 IL-17A和/或IL-17F介导的病理失调，或与IL-17A或IL-17F升高的 水平相关的病理失调的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及对IL-17A和IL-17F的抗原决定簇具有特异性的抗体分子，抗体分子的治疗用途和产生所述抗体分子的方法。
文档编号A61P37/06GK101589061SQ200780043116
公开日2009年11月25日 申请日期2007年10月18日 优先权日2006年10月18日
发明者A·G·波普尔韦尔, R·亚当斯, S·E·拉佩奇 申请人:Ucb医药有限公司