真杆菌、梭菌制剂及其应用的制作方法

专利名称：：真杆菌、梭菌制剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及真杆菌、梭菌制剂及其应用，具体涉及真杆菌、梭菌单独或组合作为主要活性成份制成补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，及该微生态制剂通过产生丁酸在治疗相关疾病中的应用，属于生物药领域。
背景技术：
：丁酸(酪酸)已经被证实是结肠能量的首选来源，提供肠粘膜70%的能量，促进肠粘膜细胞增殖生长及消化系统发育成熟，同时丁酸也是调节免疫的重要物质，丁酸主要来源于肠道产丁酸菌，因此，肠道产丁酸菌虽然不是肠道中数量最多的有益菌，但确是肠道中最重要的有益菌。目前的微生态制剂主要成份包括双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，但均不能产生丁酸，只是单纯地补充肠道有益菌，产生的乳酸、乙酸等要转化为丁酸才能发挥作用，因此治疗相关疾病疗效不是非常理想。目前市场上销售的产生丁酸的酪酸梭菌微生态制剂还是过路菌，不能在肠道长期定植，停药后4天左右就完全排出体外(闫述翠，万阜昌，蒲春晓，等.酪酸梭菌在小白鼠肠道内的动态变化研究.中国新药杂志，2002，11(4):325-326)，严重影响了疗效的发挥。本发明微生态制剂的最大特点和独创之处在于所选菌种为肠道常住有益菌，能够在肠道长期定植，持续产生丁酸，治疗相关疾病疗效显著，社会意义巨大，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。
发明内容本发明的目的是提供一种补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，该微生态制剂中的主要活性成份产丁酸菌能在肠道长期定植，持续产生大量丁酸，修复肠粘膜，调节免疫，抑制炎症因子过度表达，同时该微生态制剂还能恢复肠道菌群平衡和提高机体及粘膜免疫，有效治疗消化系统疾病、营养吸收障碍性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、变态反应性疾病、手足口病及提高免疫和抗癌。其中所述消化系统疾病包括腹泻、肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肠癌、肿瘤放化疗辅助治疗、腹胀和消化不良、便秘、便臭、便臭中毒综合征、肝胆疾病、病毒性腹泻、喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎、黄疸、口腔溃疡、鹅口疮、促进小儿肠道发育成熟、消化吸收、营养保健和生长发育；所述营养吸收障碍性疾病包括佝偻病；所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎；所述心脑血管疾病包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎、动脉粥样硬化；所述变态反应性疾病包括湿疹；所述提高免疫包括治疗反复呼吸道感染。为了达到上述发明目的，本发明人以对人类及动物健康最重要的肠道常住主要产丁酸菌真杆菌和梭菌为发明研究对象。本发明的微生态制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以采取含真杆菌或梭菌的样本，优选人或动物粪便，更优选健康婴儿粪便，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10—\10—2、10"、10—4，10,10"，10—7梯度稀释，取10—5，10—6，l(T三个稀释梯度，分别涂布于真杆菌或梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37T下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出各菌种的干燥菌粉，然后进行菌种鉴定、产丁酸实验、肠道长期定植实验和毒性试验，将能产生丁酸和无毒性的真杆菌或梭菌干燥菌粉单独或组合按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊和散剂等各种剂型或饲料添加剂。真杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水100mL，胰蛋白胨lg，酵母浸膏0.5g，磷酸氢二钠0.4g，葡萄糖O.15g，可溶性淀粉0.05g，L-半胱氨酸0.02g，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，琼脂1.5g，调pH值7.7，115。C，20分钟高压灭菌。灭菌后在冷却到60。C后加入5mL脱纤维马血，ES溶液4mL。其中ES溶液丙酸钠30%，硫酸链霉素4%，硫酸巴龙霉素2%，硫酸多粘菌素B0.02%。真杆菌液体扩增培养基优选但不局限于绞碎的牛肉500g，蒸馏水1L，1NNaOH25.0mL，用精牛肉或马肉，绞碎去除脂肪和连接组织，混合肉、水和氢氧化钠煮沸，同时搅拌，冷却至室温，略去表面的脂肪并过滤，保留滤液，补充足够的蒸馏水滤液恢复1升原体积。向每100mL滤液中添加蛋白胨2.0g、葡萄糖0.5g、酵母浸膏1.0g、盐酸半胱氨酸0.05g、盐溶液4.0mL,维生素K广溶液O.lmL、5mg/mL氯化血红素溶液0.5mL，调pH至7.2士0.1，在厌氧管内通入97%的氮，3%的氢，盖紧丁基橡胶瓶塞帽，121°C高压灭菌15min。其中1、盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，碳酸氢钠10g，氯化钠2g，加蒸馏水至1000mL;2、氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制:称取氯化血红素0.5g溶于lmol/L氢氧化钠lmL中，加蒸馏水至100mL，121。C高压灭菌15min，冰箱保存；3、维生素K,溶液的配制称取维生素K,lg加无水乙醇99mL,过滤除菌，放冷暗处保存。梭菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水1L，蛋白胨40.0g，Na2HP045.0g，K2HP041.0g，NaCl2.0g，MgS04.lg，葡萄糖2.0g，琼脂25.0g，调pH7.6，116。C灭菌20分钟，待其冷至5(TC左右,加入卵黄液50.0mL，加入终浓度为200"g/mL的硫酸多粘菌素B，加入终浓度200ug/mL的新霉素，充分混匀后，分注于平皿中。梭菌液体扩增培养基优选但不局限于纯化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，NaC15.0g，可溶性淀粉l.Og，半胱氨酸盐酸盐0.5g，醋酸钠3.0g，琼脂0.5g，调pH6.6-7.0，121°C，灭菌15分钟。为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过真杆菌选择性单菌落分离固体培养基和梭菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了真杆菌中的直肠真杆菌和柱状真杆菌，梭菌中的第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌，直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌只是作为本发明实施说明的优选菌种，本发明所述真杆菌和梭菌并不局限于上述四种菌，只要能产生丁酸和无毒性的真杆菌菌种或梭菌菌种均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。其中本发明所述的丁酸梭菌来源于肠道，分离于粪便中，能在肠道长期定植，不同于目前在肠道短暂定植的分离于自然界的丁酸梭菌。本发明所述直肠真杆菌优选但不限于直肠真杆菌(五"^c^7'wm^cto/e)、CGMCC、保存编号2124。本发明所述柱状真杆菌优选但不限于柱状真杆菌(5"^"m'wmqy/z'"c/ra^es)、CGMCC、{呆存编号2302。本发明所述第三梭菌优选但不限于第三梭菌(C/oWnWwwfe^mO、CGMCC、保存编号2304。本发明所述肠道常住丁酸梭菌优选但不限于丁酸梭菌(aoWn'AMmZ)"^Wcmw)、CGMCC、保存编号2303。本发明实施说明中优选使用的直肠真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源该菌分离自山东省胶南市一健康婴儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长3微米，宽0.8微米，短细杆菌，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰白，半透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶一；脂酶一；明胶液化+;过氧化氢酶精氨酸产氨:一；七叶苷水解一；吲哚一；硫化氢一；乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)一；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定纤维二糖+;D-果糖+;D-半乳糖+;葡萄糖+;D-甘露糖+;D-棉子糖+;鼠李糖一；山梨糖+;松三糖+;蔗糖+;海藻糖一；木糖+;麦芽糖+;淀粉+;菊糖+;蜜二糖+;核糖一；甘露醇一；甘油一；七叶灵一；阿拉伯糖+;果糖+。本发明实施说明中优选使用的柱状真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源该菌分离自山东省胶南市一健康婴儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长2-5微米，宽1微米，中长杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈类圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰白，不透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶一；脂酶一；明胶液化+;过氧化氢酶精氨酸产氨一；七叶苷水解+(_);吲哚一；硫化氢V-P试验一；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定纤维二糖+;D-果糖+;D-半乳糖+;葡萄糖+;D-甘露糖+;D-棉子糖一；鼠李糖一；山梨糖—；松三糖一；蔗糖一；海藻糖一；木糖一；葡萄糖酸盐一；麦芽糖一；淀粉一；蜜二糖一；核糖:一；甘露醇一；甘油一。本发明实施说明中优选使用的第三梭菌的细菌学性质1、菌种分离来源该菌分离自山东省胶南市一健康婴儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长3-4微米，宽0.6-l.O微米，直杆菌，革兰氏染色阳性，产芽孢，孢子端生。平板形态菌落圆形，边缘稍不规则，不透明，颜色灰白，表面无光泽。3、生理生化鉴定硫化氢_;吲哚一；明胶液化一；氨一；硝酸盐还原一；卵磷脂酶反应脲酶一；V-P试验_;接触酶一；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定阿拉伯糖+;鼠李糖+;纤维二糖+;D-山梨醇+;D-果糖+;可溶性淀粉+;D-半乳糖+;蔗糖+;葡萄糖+;海藻糖+;菊糖:+;木糖+;乳糖+;葡萄糖酸盐(钠)+;D(+)甘露糖+;麦芽糖+;D-甘露醇+;甘油W(—)；D(+)棉籽糖+;核糖+;松三糖+，蜜二糖+。本发明实施说明中优选使用的肠道常住丁酸梭菌的细菌学性质1、菌种分离来源该菌分离自山东省胶南市一健康婴儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长3.0-6.0微米，宽0.6-1.2微米，直杆或梭状菌，革兰氏染色阳性，产芽孢，孢子次端生。平板形态菌落圆形，边缘不整齐，稍凸，不透明，颜色淡黄，表面无光泽。3、生理生化鉴定硫化氢吲哚一；明胶液化一；氨一；硝酸盐还原一；卵磷脂酶反应_;脲酶一；V-P试验一；接触酶一；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定阿拉伯糖+;鼠李糖+;纤维二糖+;D-山梨醇一；D-果糖+;可溶性淀粉+;D-半乳糖+;蔗糖+;葡萄糖+;海藻糖+;菊糖:+;木糖+;乳糖+;葡萄糖酸盐(钠)+;D(+)甘露糖+;麦芽糖+;D-甘露醇+;甘油+;D(+)棉籽糖+;核糖+;松三糖+;蜜二糖+。本发明所述的真杆菌和梭菌指活生物个体。本发明是以有效剂量的上述真杆菌或梭菌单独或组合作为主要药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、灌肠剂等剂型。本发明所述以有效剂量的上述真杆菌或梭菌单独或组合作为主要药物活性成份制成活菌微生态制剂，也可以是上述真杆菌或梭菌单独或组合与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌中的一种或几种或其他活性成份组合制成活菌微生态制剂，以起到协同治疗作用，提高治疗效果。本发明中的微生态制剂在临床上的用量，因患者年龄、体重及症状、用药目的所决定的用药方式和方法、治疗效果及用药时间等因素而不同，正确的用量应该由医师来决定，且应用剂量也是临床医生根据病情很容易掌握和调整的。本发明所指有效剂量是指以上述真杆菌或梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于ix106CFU/g，一般在lX107CFU/g以上，最高可达到lX1012CFU/g或1X1012CFU/g以上。本发明所指有效剂量是指以上述真杆菌或梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于IX106CFU/mL，一般在lX107CFU/mL以上，最高可达到1X1012CFU/mL或IX1012CFU/mL以上。由于本发明首次公开了真杆菌和梭菌在作为主要活性成份制成微生态制剂中的应用，因此含上述真杆菌或梭菌的药剂均属于本发明的保护范围。由于本发明首次公开了直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌在作为主要活性成份制成微生态制剂中的应用，因此含上述直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌的药剂均属于本发明的保护范围。本发明所述的真杆菌或梭菌中的任何一个菌种，包括直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌，在制成任何一种剂型时，均具有治疗上述疾病的作用。任何药剂，如果其组份中含有上述真杆菌或梭菌中的任何一个菌种成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的真杆菌或梭菌中的任何一个菌种，包括直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌可以制成保健品或饮品。将上述真杆菌或梭菌中的任何一个菌种制成的保健品或饮品，如果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的真杆菌或梭菌中的任何一个菌种，包括直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌可以制成兽药或饲料添加剂。将上述真杆菌或梭菌中的任何一个菌种制成的兽药或词料添加剂，则落入本发明的保护范围之内。具体实施例方式药物制备例说明上述已经对真杆菌或梭菌的制备进行说明，这里通过直肠真杆菌活菌散剂、柱状真杆菌活菌散剂、第三梭菌活菌散剂和肠道常住丁酸梭菌活菌散剂为例进行具体说明，其他真杆菌或梭菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。药物制备实施例1口服直肠真杆菌活菌散剂和口服柱状真杆菌活菌散剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取健康婴儿粪便，然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克粪便加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10一\10—2、10—3、10—4，10—5，10—6，10—7梯度稀释，取10—5，10—6，10—7三个稀释梯度，涂布于真杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37。C下培养48小时，选择长势良好的两个单菌落分别接种到真杆菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37X:下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出两个菌种的干燥菌粉，然后进行菌种鉴定，经鉴定为直肠真杆菌和柱状真杆菌。2产丁酸实验将直肠真杆菌和柱状真杆菌菌种分别接种到真杆菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37。C下扩增培养48小时，离心(12000rpm)，取上清液用气相检测代谢产物丁酸含量分别为8mmol/L和8.5皿ol/L，表明均为产丁酸真杆菌。3生理生化鉴定经鉴定均不产生硫化氢、吲哚、氨等有害物质。4毒性试验4.1动物及分组取30只SPF级别小鼠，68周龄，体重1519g，随机分入直肠真杆菌组、柱状真杆菌组和未给药组，每组10只。4.2制备菌液将直肠真杆菌菌粉和柱状真杆菌菌粉用纯化水调制为含菌数均为1X10"CFU/mL的菌液。4.3方法直肠真杆菌组、柱状真杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，直肠真杆菌组每天灌服直肠真杆菌菌液0.5mL，柱状真杆菌组每天灌服柱状真杆菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂6个月，观察体重及毒性反应。4.4结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且直肠真杆菌组、柱状真杆菌组的体重增加显著高于未给药组(P<0.05),表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等肠道产丁酸真杆菌菌种有促进生长发育作用，说明两菌株效果良好，未见中毒反应，结果见表l。表l小鼠体重增加情况服用时间直肠真杆菌组柱状真杆菌组未给药组<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5长期定植实验5.1实验说明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种属于肠道常住产丁酸菌，为进一步验证其定植性，我们做了长期定植实验(具体步骤和方法参考文献Y.K丄ee，RS.Ho,C.S丄ow，etal.PermanentClononizationbyLactobacilluscaseiIsHinderedbytheLowRateofCellDivisioninMouseGut.ApplEnvironMicrobiol,2004,70(2):670-674)。5.2实验方法取直肠真杆菌和柱状真杆菌分别接种在真杆菌液体扩增培养基中，厌氧37°C下培养48小时，10分钟离心收集菌体，菌体用灭菌的PBS缓冲液洗2次，调整菌体细胞密度至107mL。将荧光探针cFDA-SE与菌体细胞等体积混合，避光37。C温浴20分钟；离心终止荧光标记，并用PBS缓冲液洗涤菌体两次以除去未与菌体结合的荧光染料，菌体重悬于PBS缓冲液中。将8周龄BALB/c小鼠分为三组，每组15只，分别灌胃cFDA-SE标记好的(99%标记菌体)直肠真杆菌、柱状真杆菌和枯草芽孢杆菌(过路菌)，1mL。分别于灌胃后的l，2，4，6，7天引颈处死小鼠3只，取大肠，将大肠纵向切开，除去肠道中的食物颗粒和粪便残渣，以lcm肠段加150pL无菌PBS的比例，反复冲洗肠道，收集洗液，通过流式细胞仪检测洗液中带有cFDA-SE标记的阳性菌。5.3实验结果直肠真杆菌组和柱状真杆菌组灌胃1，2，4，6，7天后cFDA-SE标记的阳性菌数逐渐增加，枯草芽孢杆菌逐渐消失，表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌在肠粘膜定植力很强，能够长期定植，见表2。表2各组肠道标记菌平均数<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6制备成散剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种后，经实验检验产丁酸、不产毒素、无毒性和能长期定植，就可将真杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据真杆菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖制成散剂，使活菌数不低于1X107CFU，然后装袋。药物制备实施例2口服第三梭菌活菌散剂和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取健康婴儿粪便，然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克粪便加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10—'、10—2、10—3、l(T4，10—5，10—6，10—7梯度稀释，取10—5，10—6，10—7三个稀释梯度，8(TC水浴13分钟，涂布于梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37。C下培养48小时，选择长势良好的两个单菌落分别接种到梭菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37。C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出两个菌种的干燥菌粉，然后进行菌种鉴定，经鉴定为第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌。2产丁酸实验将第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌菌种分别接种到梭菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37。C下扩增培养48小时，离心(12000rpm)，取上清液用气相检测代谢产物丁酸含量分别为9mmol/L和9.3ramol/L，表明均为产丁酸梭菌。3生理生化鉴定经鉴定均不产生硫化氢、吲哚、氨等有害物质。4毒性试验4.l动物及分组取30只SPF级别小鼠，68周龄，体重1519g，随机分入第三梭菌组、肠道常住丁酸梭菌组和未给药组，每组10只。4.2制备菌液将第三梭菌菌粉和肠道常住丁酸梭菌菌粉用纯化水调制为含菌数均为lX1012CFU/mL的菌液。4.3方法第三梭菌组、肠道常住丁酸梭菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，第三梭菌组每天灌服第三梭菌菌液0.5mL，肠道常住丁酸梭菌组每天灌服肠道常住丁酸梭菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂6个月，观察体重及毒性反应。4.4结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且第三梭菌组、肠道常住丁酸梭菌组的体重增加显著高于未给药组(P<0.05)，表明第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等肠道产丁酸梭菌菌种有促进生长发育作用，说明两菌株效果良好，未见中毒反应，结果见表3。表3小鼠体重增加情况服用时间第三梭菌组肠道常住丁酸梭菌组未给药组开始18.12±0.6318.96±0.4718.54±0.35服用1个月39.65±1.5639.42±1.5134.37±1.52服用2个月45.78±2.4245.89±2.0340.51±2.65服用3个月47.18±3.9647.21±4.0742.86±3.47服用4个月49,52±4.4749.25±4.1845.67±3.97服用5个月51.96±5.5151.87±4.7547.69±5.68服用6个月53.79±4.7553.69±5.2750.84±4.475长期定植实验5.1实验说明第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种属于肠道常住产丁酸菌，为进一步验证其定植性，我们做了长期定植实验(具体步骤和方法参考文献Y.K丄ee,RS.Ho，C.S丄ow，etal.PermanentClononizationbyLactobacilluscaseiIsHinderedbytheLowRateofCellDivisioninMouseGut.ApplEnvironMicrobiol,2004,70(2):670-674)。5.2实验方法取第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌分别接种在梭菌液体扩增培养基中，厌氧37。C下培养48小时，IO分钟离心收集菌体，菌体用灭菌的PBS缓冲液洗2次，调整菌体细胞密度至107mL。将荧光探针cFDA-SE与菌体细胞等体积混合，避光37。C温浴20分钟；离心终止荧光标记，并用PBS缓冲液洗涤菌体两次以除去未与菌体结合的荧光染料，菌体重悬于PBS缓冲液中。将8周龄BALB/c小鼠分为三组，每组15只，分别灌胃cFDA-SE标记好的(99%标记菌体)第三梭菌、肠道常住丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌(过路菌)，lmL。分别于灌胃后的l，2,4，6，7天引颈处死小鼠3只，取大肠，将大肠纵向切开，除去肠道中的食物颗粒和粪便残渣，以lcm肠段加150uL无菌PBS的比例，反复冲洗肠道，收集洗液，通过流式细胞仪检测洗液中带有cFDA-SE标记的阳性菌。5.3实验结果第三梭菌组和肠道常住丁酸梭菌组灌胃1，2，4，6，7天后cFDA-SE标记的阳性菌数逐渐增加，枯草芽孢杆菌逐渐消失，表明第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌在肠粘膜定植力很强，能够长期定植，见表4。表4各组肠道标记菌平均数<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>6制备成散剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种后，经实验检验产丁酸、不产毒素、无毒性和能长期定植，就可将梭菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据梭菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖制成散剂，使活菌数不低于1X107CFU，然后装袋。应用效果实施例说明虽然真杆菌或梭菌有许多菌种，但按上述方法分离的不同菌种具有相同的生物学特性，且主要作用机理基本相同，包括进入肠道分泌大量丁酸、补充肠道有益菌恢复肠道菌群平衡、提高机体和粘膜免疫等，因此本发明选用按上述方法分离的直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌为研究对象，介绍真杆菌和梭菌的应用效果。本
技术领域：
人员按照本发明所述很容易得出按照上述步骤和方法分离的其他真杆菌或梭菌菌种单独或组合具有相同的应用效果，因此本发明只选择通过直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌来揭示真杆菌或梭菌的应用效果为代表，其他菌种的应用效果不再一一叙述说明。实施例1、真杆菌和梭菌对肠粘膜的修复作用研究1材料与方法1.1材料1.1.1药物直肠真杆菌菌液(107CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL);双歧杆菌菌液(107CFU/mL);右旋葡聚糖硫酸钠(DSS，10g/瓶，批号BI03071,Sino-AmericanBiotec);爱尔新蓝(lg/瓶，批号BS0084,Sino-AmericanBiotec)。1.1.2动物SD雄性大白鼠70只，体重80100g，标准2级，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心，证号SCXK(京)2005-0010。1.2方法1.2.1肠粘膜损伤造型和治疗大鼠80只，IO只大鼠作为正常对照组，另70只大鼠用3。/。DSS溶液给空腹大鼠灌胃(lmL/100g)，每天1次，共7天，最后一次从肛门加注DSSlmL/只至直肠内。然后处死其中10只(模型对照组)，剖腹取结直肠，测定结直肠湿重(g/100g.体重)，甲醛固定，用爱尔新蓝溶液染色，肉眼观测溃疡和糜烂部分的点数，用卡尺测量蓝染点的蓝染面积(cm2)，证实UC形成后，将其余60只模型大鼠随机分为6组，每组10只，分别灌胃生理盐水、直肠真杆菌菌液(107CFU/mL)、柱状真杆菌菌液(107CFU/mL)、第三梭菌菌液(107CFU/mL)、肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL)、双歧杆菌菌液(107CFU/mL)，lmL/次，每天2次，共21天。21天后处死全部大鼠，按上法处理结直肠标本，检测相应指标。1.2.2统计学分析各组间的数据差异的统计学显著性检验，用tK"^T7〃t检验，差异显著性界限为p〈0.05。2结果2.1结直肠溃疡(或糜烂)点数与面积用DSS灌胃，加直肠给DSS后可在整个结直肠形成典型的大鼠肠粘膜损伤，尤其结肠下端和直肠的肠标本用爱尔新蓝染色后，肠粘膜可见明显深染的不规则的溃疡点或糜烂点。结直肠溃疡(糜烂)点数及溃疡面积直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组与模型对照组、生理盐水模型对照组或双歧杆菌治疗组比较均有很显著性差异(P<0.01)，而直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组之间无显著性差异(P〉0.05)，直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组和模型对照组治疗前排稀便，偶尔带血，治疗后直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组均排正常便，模型对照组仍然排稀便。见表l。表1各种菌对肠粘膜的修复作用组别溃疡或糜烂点数溃疡或糜烂面积(cm2)正常组00模型对照组4.60±0.620.75±0.15生理盐水模型对照组4.20±0.360.70±0.24双歧杆菌治疗组2.80±0.560.42±0.35直肠真杆菌治疗组1.05±0.650.08±0.02柱状真杆菌对照组1.12±0.350.10±0.05第三梭菌治疗组1.32±0.470.06±0.01肠道常住丁酸梭菌治疗组1.25±0.570.09±0.033结论直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种由于能够分泌丁酸，提供肠粘膜细胞能量，对肠粘膜细胞具有很好的促进增殖作用，能修复受损伤的肠粘膜，改变肠粘膜通透性，促进肠粘膜发育成熟，促进消化吸收，疗效显著好于双歧杆菌等非产丁酸益生菌。因此，直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种可以单独或组合治疗腹泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肿瘤放化疗辅助治疗、病毒性腹泻、坏死性小肠结肠炎等肠粘膜损伤性疾病，促进肠道发育成熟，促进消化吸收，消除腹胀和消化不良及治疗喂养不耐受，促进生长发育和营养保健，对营养吸收障碍性疾病也有很好的治疗作用，包括佝偻病。实施例2、真杆菌和梭菌调节免疫和炎症因子表达的研究1实验材料与方法l.l实验动物雄性SD大鼠，180-220g,购自维通利华实验动物中心，清洁级，合格证号为SCXP(京)(2002)—0003。1.2实验药物美沙拉嗪(200mg/mL);直肠真杆菌菌液(107CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL);双歧杆菌菌液(107CFU/mL)。由青岛东海药业有限公司提供。1.3实验试剂弗氏完全佐剂(sigma)，MTT(sigma);伴刀豆素球蛋白(ConA)(Sigma);脂多糖(LPS)(Sigma);MTT(Sigma)，购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公司；1640培养液(Gibco);牛结肠粘膜蛋白冻干粉(自制)；IL-8ELISA试剂盒(BD);TNF-aELISA试剂盒(Ebioscience);大鼠IgG参考血清；兔抗16大鼠IgG抗血清，外购。2实验方法2.1牛结肠粘膜蛋白冻干粉的制备取新生小牛结肠，刮取牛结肠粘膜，反复冻溶法获取牛结肠粘膜蛋白，纯化浓縮，真空冻干后于4i:保存备用。2.2免疫紊乱性疾病模型的建立取牛结肠粘膜蛋白与完全弗氏佐剂(1:1)制成完全抗原，选用体重在200士20g的SD大鼠，造模大鼠首次每只足跖内注射抗原4mg，于第IO、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg，最后1次注射不加佐剂，至血清抗结肠抗体达到一定效价。第35天模型组大鼠用异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，并分别进行下列处理(处理前禁食24h)，先用2。/。的甲醛溶液1.5mL灌肠，留置lh，用生理盐水洗净后排去。再用抗原液(4mg/mL，不加佐剂)2mL灌肠，留置2h，然后洗净排去。3d后，随机抽取2只模型组大鼠处死，取其结肠标本(肛门向上10厘米)，病理检查确认有充血、水肿、炎细胞浸润、溃疡形成等一系列炎症性肠病的病理变化。2.3动物分组及治疗设正常对照组(10只)。造模成功后，将造模大鼠随机分组，I)模型对照组(IO只)，给予生理盐水灌胃；2)阳性药(美沙拉嗪，200mg/mL)治疗组(10只)；3)直肠真杆菌(107CFU/mL)治疗组(10只)；4)柱状真杆菌(107CFU/mL)治疗组(IO只);5)第三梭菌(107CFU/mL)治疗组(IO只);6)肠道常住丁酸梭菌(10tFU/mL)治疗组(10只)；7)双歧杆菌(107CFU/mL)治疗组(10只)。每次lmL/100g'体重，1次/天，灌胃，连续给生理盐水或治疗药21天。期间每周称一次体重，并持续观察动物一般情况及粪便性状。2.4指标测定给生理盐水或药物至第21天后，断头处死动物，测定模型对照组和6个治疗组结肠湿重指数、粘膜溃疡指数、粘膜损伤指数、肠系膜淋巴细胞转化率、IL-8、TNF-a和IgG等指标。2.4.1结肠湿重指数结肠湿重指数=结肠湿重(g)/100g.体重。2.4.2粘膜溃疡指数将新鲜结肠肠管纵行切开，清除肠内容物，将结肠中上段及结肠下段两部分分别编号，固定在硬纸板上，新鲜标本拍照后，在10%的甲醛液中固定，用卡尺测量结肠粘膜上细条索状或线形出血性病变，以全部病变总长度加以测量。溃疡指数的计算病灶长度小于lmm为1分，1-2mm为两分，2-3腿为3分，3-4mm为4分，如病灶长度大于4mm,将其分为若干段，每段按上法计分，当病灶宽度大于2mm时，其得分加倍。一只动物全结肠各病灶得分的总和为其溃疡指数。2.4.3肠系膜淋巴细胞转化率无菌环境下取大鼠肠系膜淋巴细胞，过200目细胞筛，无菌PBS洗漆两次，1000rpm，5min。用完全1640培养液调整细胞浓度为5X10s个/mL，每孔100ul，接种于96孔圆底细胞板中，同时加ConA(终浓度为3ug/mL)或LPS(终浓度为5ug/mL)，100y1/孔。另设定空白对照孔(未加诱导剂)，37°C、5訓2孵育72h，培养结束前4h，加MTT(5mg/m1)20u1，培养结束后，测定540nm处测定0D值，计算淋巴细胞刺激指数。淋巴细胞刺激指数(SI)二刺激组OD值/未刺激组OD值药物。2.4.4IL-8、TNF-a和IgG断头处死大鼠，取血，4。C静置过夜，3000rpm，20min离心，取上清，分装，放于-2(TC待测。使用ELISA试剂盒，按照说明书，测定大鼠血清中大鼠IL-8及TNF-a的含量。使用单向免疫扩散法测定血清中IgG的含量。2.5统计学处理各组间的数据差异的统计学显著性检验，用卜"w^/7〃t检验，差异显著性界限为P〈0.05。3实验结果3.1粪便性状、结肠湿重指数模型对照组大鼠在造型期间排白色粘液性稀便。治疗组大鼠在治疗前也排白色粘液性稀便，治疗21天后均排正常便。美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗21天后结肠湿重指数与模型对照组和双歧杆菌治疗组比较呈显著性降低(P〈0.05)，但美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组大鼠治疗后结肠湿重指数比较无显著性差异，见表l。表1免疫紊乱性模型大鼠结肠湿重指数变化情况(X±s)组别动物数结肠湿重指数(g)AOOg.体重正常对照组100.41±0.03模型对照组100.46±0.05双歧杆菌治疗组100.43±0.06美沙拉嗪治疗组100.37±0.07直肠真杆菌治疗组100.38±0.04柱状真杆菌治疗组100.38±0.05第三梭菌治疗组100.36±0.07肠道常住丁酸梭菌治疗组100.37±0.023.2粘膜溃疡指数(积分)美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗18组和肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗21天后粘膜溃疡指数与模型对照组和双歧杆菌治疗组比较呈显著性减小(P<0.05)，但美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组大鼠治疗后粘膜溃疡指数比较无显著性差异，见表2。表2免疫紊乱性模型大鼠肠粘膜溃疡指数变化情况(7±s)组别动物数粘膜溃疡指数(积分)正常对照组100,00模型对照组1028.7±9.7双歧杆菌治疗组1020.1±6.2美沙拉嗪治疗组1016.4±6.3直肠真杆菌治疗组108.6±3.4柱状真杆菌治疗组108.3±5.2第三梭菌治疗组108.5±4.2肠道常住丁酸梭菌治疗组108.1±5.63.3肠系膜淋巴细胞转化率建立免疫紊乱模型成功后，B淋巴细胞转化率升高，T淋巴细胞转化率降低，美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗21天后与模型对照组和双歧杆菌治疗组比较B淋巴细胞转化率显著降低及T淋巴细胞转化率显著升高(P〈0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组之间比较无显著性差异(P〉0.05)，见表3。表3免疫紊乱性模型大鼠肠系膜淋巴细胞转化率变化情况(X±s),n.,刺激指数(SI)B淋巴细胞转化率T淋巴细胞转化率正常对照组1.15±0.261.03±0.20模型对照组1.84土0.180.59±0.20双歧杆菌治疗组1.42±0.210.87±0.15美沙拉嗪治疗组1.23±0.220.94±0.32直肠真杆菌治疗组1.ll士O.311.02±0.31柱状真杆菌治疗组1.18±0.411.Ol士O.25第三梭菌治疗组1.14±0.190.99±0.18肠道常住丁酸梭菌治疗组1.13±0.291.05±0.263.4血清IL-8和TNF-a含量模型对照组大鼠血清中的IL-8和TNF-a含量比正常对照组的显著升高(P<0.05)，美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗21天后血清IL-8和TNF-a含量与模型对熙组和双歧杆菌治疗组比较呈显著性降低(P〈0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组大鼠治疗后血清IL-8含量和TNF-a比较无显著性差异(P〉0.05)，见表4。表4免疫紊乱性模型大鼠血清IL-8和TNF-a含量变化情况(歹土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3.5血清IgG含量模型对照组大鼠血清中的IgG含量比正常对照组的显著升高(P<0.05)，美沙拉嗪治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗21天后IgG含量与模型对照组和双歧杆菌治疗组比较呈显著性降低(P〈0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组大鼠治疗后血清IL-8含量和TNF-a比较无显著性差异(P〉0.05)，见表5。表5免疫性炎症性肠病大鼠血清IgG含量变化情况(5±s)组别IgG(mg/ml)正常对照组7.5±0.3模型对照组13.9±0.4双歧杆菌治疗组11.8±0.6美沙拉嗪治疗组13.2±0.5直肠真杆菌治疗组7.8±0.6柱状真杆菌治疗组8.2±0.4第三梭菌治疗组8.1±0.3肠道常住丁酸梭菌治疗组7.9±0.24结论各种原因导致的免疫紊乱及其炎症因子升高会引起各种疾病，使肠道敏感性增强、耐受力下降引起肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻；会使肠粘膜损伤，引起溃疡性结肠炎或克罗恩病；会引发自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎；血液中炎症因子升高会引发心脑血管疾病，包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎，肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素8(IL-8)、白介素1P(IL-IP)等炎症性细胞因子促进了动脉粥样硬化及心脑血管疾病的发生和发展，心脑血管疾病患者血清中的TNF-a、IL-8、IL_1P等炎症性细胞因子水平明显高于健康人；会引发变态反应性疾病，包括变态反应性皮肤病，进一步包括湿疹。本研究表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种由于能够分泌丁酸，通过调节核转录因子(NF-KB)的表达，调节免疫平衡、消除免疫异常及抑制TNF-a、IL-8等炎症因子过度表达，有效治疗上述各种免疫紊乱及其炎症因子升高引起的疾病，且效果好于双歧杆菌等非产丁酸益生菌。实施例3、真杆菌和梭菌促进肠道发育成熟的研究1资料与方法1.l资料选择喂养不耐受小儿120例，诊断标准临床出现呕吐、腹胀、胃潴留等胃肠动力障碍表现，喂奶前从胃管内抽出残留奶汁。所有患儿均排除胃肠道先天畸形、机械性肠梗阻、无脑肝肾功能不全及心肌损害。男68例，女52例。按随机数字表将120例小儿分为六组，A组(直肠真杆菌治疗组)、B组(柱状真杆菌治疗组)、C组(第三梭菌治疗组)、D组(肠道常住丁酸梭菌治疗组)、E组(双歧杆菌治疗组)和对照组。每组20例患儿，五组患儿胎龄、性别、体重、病情轻重程度经统计学处理，差异无显著性((P>0.05))，具有可比性。1.2方法所有患儿均给予常规护理，输液泵补液，治疗原发病及胃肠外营养支持等常规综合治疗。A组在常规综合治疗基础上给予口服直肠真杆菌活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含直肠真杆菌为1.0X107CFU/g)口服，1包/次，3次/天，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；B组在常规综合治疗基础上给予口服柱状真杆菌活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含柱状真杆菌为1.0X107CFU/g)口服，1包/次，3次/天，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；C组在常规综合治疗基础上给予口服第三梭菌活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含第三梭菌为1.0X107CFU/g)口服，1包/次，3次/天，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；D组在常规综合治疗基础上给予口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含肠道常住丁酸梭菌为1.0X107CFU/g)口月艮，l包/次，3次/天，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；E组在常规综合治疗基础上给予口服双歧杆菌活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含双歧杆菌为1.0X107CFU/g)口服，1包/次，3次/天，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；对照组常规综合治疗，疗程7天以上。1.3观察指标观察六组腹胀、呕吐、胃潴留和肠鸣音等症状变化，生理性体重下降恢复至出生体重时间，奶量增加情况及记录停用静脉营养达到完全胃肠道营养的时间，有无黄疸并发症及黄疸持续时间，及有无不良反应。1.4疗效判断标准显效治疗35天腹胀、呕吐症状消失，肠鸣音正常，鼻饲奶每隔23小时1次，能耐受，无胃内容物储留；好转治疗57天腹胀、呕吐症状减轻，肠鸣音弱，鼻饲奶每隔23小时l次，胃内容物潴留<1/3;无效治疗7天腹胀、呕吐症状无好转，肠鸣音弱，鼻词奶每隔23小时1次，胃内容物储留〉1/3。显效和好转合计为有效。1.5统计学处理采用SPSS11.0软件进行统计学处理。数据均以Y±s表示，组间比较采用^检验或t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1六组疗效比较A组显效14例，好转6例，总有效率100%;B组显效15例，好转5例，总有效率100%;C组显效16例，好转4例，总有效率100%;D组显效18例，好转2例，总有效率100%;E组显效10例，好转2例，无效8例，总有效率60%;对照组显效5例，好转4例，无效11例，总有效率45%。经统计学检验，A组、B组、C组和D组总有效率显著高于E组和对照组，差异有统计学意义(P〈0.01)，A组、B组、C组和D组之间总有效率差异无统计学意义(P〉0.05)。2.2两组观察指标比较恢复至出生体重时间，达到完全胃肠道营养时间，呕吐和腹胀消失时间，黄疸持续时间，A组、B组、C组和D组与E组和对照组比较，差异有统计学意义(P〈0.05);A组、B组、C组和D组之间比较差异无统计学意义(PX).05)，见表l。表l两组治疗前后观察指标比较GT士s)观察指标A组B组C组D组E组对照组恢复至出生体重时间(天)7.12士1.327.01±■1.237.06±1.566.09±1.819,09±1.4510.85±2.13达到完全胃肠道营12.14±13.03±12.24±12.68±15.38±17.32士养时间1.511.651.231.421.162.16(天)呕吐消失3.26±3.56±3.46±3.15±5.23±7.38±时间(天)1.311.151.291.751.271.49腹胀消失3.65±3.11±3.53±3.75±5.75±7.45±时间(天)1.461.451.281.751.611.57黄疸持续13.46±13.12±13.29±13.76±15.27±19.55±时间(天)1.201.891.181.561.312.413结论本研究表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种由于能够分泌丁酸，提供肠粘膜细胞能量，促进肠粘膜增殖及肠道发育成熟，治疗喂养不耐受疗效显著，并有效治疗呕吐、腹胀。同时，分泌丁酸，降低e-葡萄糖醛酸苷酶的活性，竞争性地阻止结合胆红素分解为非结合胆红素，减少肝肠循环；通过产生丁酸，促进肠蠕动，促进排便，增加胆红素的排出；丁酸能促进肠道内结合胆酸分解为游离胆酸，减少结合胆酸在肠壁的重吸收，有利于消除胆汁淤积，因此縮短黄疸持续时间，有效预防和治疗黄疸。同时，直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种分泌丁酸，促进肠道发育成熟，明显縮短恢复至出生体重时间和达到完全胃肠道营养时间，表明能促进消化吸收和生长发育，具有营养保健作用。且直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种的上述治疗效果显著好于双歧杆菌等非产丁酸菌。实施例4、真杆菌和梭菌对肠癌的预防作用研究1实验方法选体重为18-20g的雌性昆明种小鼠120只，随机分为直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组、双歧杆菌治疗组和对照组(每组20只)，实验时间为20周。致癌剂为1，2-二甲肼(symmetrical1，1-dimethylhydrazine，DMH)，为白色粉状结晶，每次临注射前以无菌生理盐水配成0.4%溶液，并用NaHC03将其pH调至6.5。每周给小鼠腹腔注射DMH20mg/kg(即0.4XDMH溶液0.05ml/10g)一次，连续20周。于腹腔注射DMH1周后，饮水中添加右旋葡聚糖苷钠(DSS)，浓度为20g/L，连续饮用7天。腹腔注射DMH的同时，直肠真杆菌菌液(107CRJ/mL)，柱状真杆菌菌液(107CFU/mL)，第三梭菌菌液(107CFU/mL)，肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL)，双歧杆菌菌液(107CFU/mL)，0.5mL/次，1次/天，连续20周。对照组，腹腔注射D願的同时，生理盐水灌胃，0.5mL/次，l次/天，连续20周。2实验结果实验结束的第20周后，用乙醚将小鼠麻醉致死后，打开腹腔，观察肠道变化。结果表明对照组20只小鼠，大肠肠壁出现小结节，肠道铍褶减少或消失，肠道质地坚硬，100%生成了肠癌；双歧杆菌治疗组有14只小鼠大肠肠壁出现小结节，肠道皱褶减少或消失，肠道质地坚硬，70%生成了肠癌；直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组均有6只小鼠大肠肠壁出现小结节，肠道皱褶减少或消失，肠道质地坚硬，30%生成了肠癌，显著低于对照组和双歧杆菌治疗组。3结论本实验表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种由于能够分泌丁酸，丁酸是一种去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，调控P"等多种基因的表达，终止肠癌细胞生长，诱导肠癌细胞成熟分化，诱导肠癌细胞凋亡，能有效预防癌变、防止肠癌复发和扩散转移，能明显预防溃疡性结肠炎的癌变，预防率达到了70%，因此可以制成相关剂型，用于预防肠癌，尤其用于预防结或直肠息肉、血吸虫病、细菌性痢疾、阿米巴、克罗恩病及溃疡性结肠炎等肠道慢性疾病发生癌变，维护人类肠道健康。大部分肠癌患者都死于手术后的复发和转移，因此丁酸梭菌也可以用于肠癌手术后预防复发和转移，同时手术后服用可以促进伤口的愈合，可以抑制有害菌、抗炎预防感染，可以提高机体免疫力。实施例5、真杆菌和梭菌治疗肠癌的实验研究1实验方法BALB/c小鼠120只，取动物皮下传代的小鼠结肠癌C26瘤组织，以生理盐水按l:3的比例稀释成悬液，按0.2ml/只接种于小鼠腋窝皮下，然后将小鼠随机分为直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组和双歧杆菌治疗组和模型对照组(每组20只)。直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组和双歧杆菌治疗组分别在接种72小时、144小时后于瘤组织内注射菌液(107CFU/mL)0.lmL/只。对照组分别在接种72小时、144小时后于瘤组织内注射生理盐水0.lmL/只。实验第12天测量各组动物的肿瘤体积，观察抑瘤率。2实验结果直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组瘤重与模型对照组和双岐杆菌治疗组比较显著性降低(P〈0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组比较无显著性差异(P〉0.05)，见表l。表1真杆菌和梭菌的抗癌作用研究组别瘤重(mg)模型对照组1.10±0.12双歧杆菌治疗组0.75±0.13直肠真杆菌治疗组0.25±0.06柱状真杆菌治疗组0.23土0.08第三梭菌治疗组0.28±0.10肠道常住丁酸梭菌治疗组0.24±0.053结论本实验表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住25丁酸梭菌等梭菌菌种由于能够分泌丁酸，具有显著的抗癌作用，目前研究表明丁酸是一种抗癌剂。因此，直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种可以单独或组合治疗或辅助治疗肠癌及其他癌症。实施例6、真杆菌和梭菌对实验性腹泻小鼠的止泻作用研究1材料与方法BALB/C小鼠，雄性，体重(20土l)g，标准2级。直肠真杆菌菌液(l()7CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL);双歧杆菌菌液(107CFU/mL)。由青岛东海药业有限公司提供。将小鼠随机分为直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组和双歧杆菌治疗组和对照组(每组20只)，单笼饲养。造型前1天动物禁食给水，随后用氨苄青霉素钠(加生理盐水配制)0.15g灌胃，0.5mL/只，2次/天，引起小鼠腹泻，排水样或糊状便。将小鼠分别用菌液灌胃，0.5mL/次，2次/天，空白对照组给等体积生理盐水，连续3天。造型前和治疗后取新鲜大便作粪便菌群分析。2结果2.1止泻作用直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭茵治疗组的止泻作用显著好于模型对照组和双歧杆菌治疗组(P〈0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组比较无显著性差异(P〉0.05)，见表l。表1真杆菌和梭菌的止泻作用研究<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2.2肠道菌群分析结果表明真杆菌和梭菌对肠道有益菌具有显著的促增殖作用(P<0.05)，能快速恢复肠道菌群平衡，见表2。表2肠道菌群分析(Logu)CFU.g-1，n=10)组别1^t干0(KV培养基)字liff^(MRS培养基)双l^^干胃(TPY培养基)正常对照组9,00±0.628.32±0.4210.13±0.35造型后6.12±0.426.01±0.567.54±0.41空白对照组6,56±0.326.48±0.338.42±0.52直肠真杆菌治疗组10.32±0.589.01±0,3610.23±0.48柱状真杆菌治疗组9.78±0.298.26±0.489.98±0.12第三梭菌治疗组10.16士0,168.65±0.2910.08±0.32肠道常住丁酸菌治疗组9,96±0.598,79±0.2110.15±0.613结论本实验表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种对腹泻有显著的治疗作用，效果好于双歧杆菌(P<0.05)。且能促进肠道有益菌增殖，快速恢复肠道菌群平衡，证明对抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肿瘤放化疗辅助治疗、便秘、便臭等肠道菌群失调性疾病具有很好的治疗和预防作用，同时揭示对冷凉泻、喝酒泻和肠易激综合征也有显著治疗作用。实施例7、真杆菌和梭菌对实验性便秘小鼠的治疗作用研究1材料与方法BALB/C小鼠，雄性，体重(20±1)g，标准2级。直肠真杆菌菌液(107CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL)。由青岛东海药业有限公司提供。将小鼠随机分为直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组、模型对照组和正常对照组(每组10只)，单笼饲养。除正常对照组外，其余各组造型前1天动物禁食给水，随后口服给予50mg/Kg复方地芬诺酯片诱发便秘。将小鼠分别用菌液灌胃，0.5mL/次，2次/天，模型对照组和正常对照组给等体积生理盐水，2次/天，连续3天。2结果直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组对便秘的治疗作用显著好于模型对照组(P<0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组比较无显著性差异(P〉0.05)，见表l。表1真杆菌和梭菌的对便秘的治疗作用研究组别首次排便时间(分)大便例数大便重量(g)正常对照组143.80±60.5339.4±3.200.87±0.08模型对照组285.67±78.2311.2±5.410.21±0.03直肠真杆菌治疗组152.32±45.6332.5±4,320.69±0.11柱状真杆菌治疗组156.41±87.2535.4±6.240.72±0.07第三梭菌治疗组149.65±52.3436.2±5.230.71±0.13肠道常住丁酸梭菌治疗组151.21±85.2434.7±4.560.70±0.093结论由于直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种进入肠道能够分泌大量丁酸，促进肠道蠕动，并能快速恢复肠道菌群平衡，改善肠道微环境，恢复肠道正常功能，因此有效治疗便秘和便秘型肠易激综合征。实施例8、真杆菌和梭菌对便臭和便臭中毒综合征的治疗作用1方法用HP-6890气相色谱仪，在知情同意的情况下，测定20例志愿者粪便中的口引哚及粪臭素含量。即取新鲜粪便0.5g精确称重后，置50mL三角瓶中，加乙醇20mL超声提取20分钟，滤过，加入内标液(0.l%p-Is叩ropylphenol)3mL，定容至25mL量瓶中，测定时，取4ul溶液注入色谱柱(HP-I丽OWAX玻璃毛细管柱，30mX0.53mm、填充17。/。SiliconeSE-30)进行分析。测定条件是，柱温度200°C;进样口温度23(TC，检测器温度26(TC，载气流量N290mL/min;比流量58mL/min;空气流量60mlVmiru20例志愿者，男IO，女IO，年龄25—55岁，随机分为直肠真杆菌治疗组(口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，含直肠真杆菌为1.0X107CFU/g)、柱状真杆菌治疗组(口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，含柱状真杆菌为1.0X107CFU/g)、第三梭菌治疗组(口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，含第三梭菌为1.0Xl()7CFU/g)和肠道常住丁酸梭菌治疗组(口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，含肠道常住丁酸梭菌为1.0X107CFU/g)，在相同正常饮食情况下，饭后分别服用各制剂，每次3袋，一天3次，连用14天。服药前后，采粪便测定吲哚和粪臭素的含量，进行统计分析。2结果给药后人体粪便中的吲哚和粪臭素的含量，均明显下降(P<0.05)，见表l。28表l真杆菌和梭菌消除便臭的作用研究组别fi引哚(ug/g)粪臭素("g/g)直肠真杆菌治疗组治疗前361.8±120,7301.1±125.7治疗后242.9±152.4180.5±102.5柱状真杆菌治疗组治疗前358.2±125.4312.5±163.5治疗后235.sim-5195.2±115.3第三梭菌治疗组治疗前365.3298.9±111.2治疗后254.1±162.0186.5±123.5肠道常住丁酸梭菌治疗组治疗前359.8±134.2308.7±132.1治疗后243.5±135.7187.6±122.23结论直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种能明显降低吲哚和粪臭素等肠道毒素含量，有效消除便臭及便臭中毒综合征，养颜美容，并能减轻肝脏负担，可作为肝胆疾病的辅助治疗药物。实施例9、真杆菌和梭菌提高免疫力研究1材料与方法BALB/C小鼠，雄性，体重(20±1)g,标准2级。直肠真杆菌菌液(107CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL);左旋咪唑(50mg/Kg)。由青岛东海药业有限公司提供。将小鼠随机分为直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组、左旋咪唑治疗组、模型对照组和正常对照组(每组10只)，单笼饲养。除正常对照组外，采用皮下注射25mg/Kg氢化可的松造模。将小鼠分别用菌液灌胃，0.5mL/次，2次/天，左旋咪唑治疗组，50mg/Kg，2次/天，模型对照组和正常对照组给等体积生理盐水，2次/天，连续21天。末次给药后，印度墨汁法检测鼠血的碳粒廓清指数(K值)和吞噬指数(a值)，同时考察鼠胸腺指数(g/10g.B.W)的变化。2结果直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组和左旋咪唑治疗组与模型对照组相比，显著提高免疫力(P<0.05)，但直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组和肠道常住丁酸梭菌治疗组比较无显著性差异(P〉0.05)，见表l。表l真杆菌和梭菌对免疫力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>3结论本实验表明直肠真杆菌和柱状真杆菌等真杆菌菌种及第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌等梭菌菌种能显著提高免疫力，因此肿瘤患者可以应用真杆菌或梭菌提高免疫力，尤其放化疗免疫力降低时，作为辅助治疗药物；真杆菌和梭菌，能够修复肠粘膜，快速恢复肠道菌群平衡，并能提高免疫力抗病毒，因此能有效治疗病毒性腹泻；真杆菌和梭菌通过提高免疫力，对口腔溃疡、鹅口疮、手足口病和反复呼吸道感染也有显著的治疗作用，并可作为肝胆疾病的辅助治疗药物。实施例10、真杆菌和梭菌对肠易激综合征治疗作用研究1对象与方法1.1观察对象选择20052007年就诊的按1999年提出的罗马II诊断标准诊断明确的肠易激综合征(IBS)患者随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组。1.2观察治疗前后症状的改善情况。1.3安全性评价治疗中认真观察可能与治疗药有关的不良反应，记录发生时间、症状及持续时间、处理结果。1.4统计学分析采用SAS统计分析软件，数据分别用百分率或均数士标准差表示，治疗前后的差异显著性测验，用;^检验和精确概率法，或t检验，差异的显著性水平为P<0.05。2结果各组均30例患者，详细疗效观察结果如下2.1口服直肠真杆菌活菌散剂治疗肠易激综合征30例疗效观察结果2.1.1临床资料男性13例，女性17例，平均年龄38.8岁，平均病程18.9月。IBS分型，腹泻为主型12例，便秘为主型15例，腹泻便秘交替型3例。2.1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天，疗程60天。2.1.3疗效观察结果肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较30例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(P<0.05)，见表l。表l肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较症状治疗前(例数)治疗后(例数)※显著性检验(P值)腹泻120P<0.05便秘150P<0.05腹泻+便秘30P<0.05腹痛150P<0.05腹胀80P<0.05腹部不适71P<0.05※用卡方检验或精确概率法2.2口服柱状真杆菌活菌散剂治疗肠易激综合征35例疗效观察结果2.2.1临床资料男性18例，女性17例，平均年龄43.5岁，平均病程21.9月。IBS分型，腹泻为主型25例，便秘为主型6例，腹泻便秘交替型4例。2.2.2给药方法口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天，疗程60天。2.2.3疗效观察结果肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较，35例IBS患者的腹汚和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(P<0.05)，见表2。表2肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>※用卡方检验或精确概率法2.3口服第三梭菌活菌散剂治疗肠易激综合征38例疗效观察结果2.3.1临床资料男性18例，女性20例，平均年龄38.4岁，平均病程25.9月。IBS分型，腹泻为主型20例，便秘为主型10例，腹泻便秘交替型8例。2.3.2给药方法口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于1.0Xl()7CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天，疗程60天。2.3.3疗效观察结果肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较，38例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(P<0.05)，见表3。表3肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较症状治疗前(例数)治疗后(例数)※显著性检验(P值)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>※用卡方检验或精确概率法2.4口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗肠易激综合征35例疗效观察结果2.4.1临床资料男性18例，女性17例，平均年龄36.4岁，平均病程23.8月。IBS分型，腹泻为主型15例，便秘为主型15例，腹泻便秘交替型5例。2.4.2给药方法口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天，疗程60天。2.4.3疗效观察结果肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较，35例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(P<0.05)，见表4。表4肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较症状治疗前(例数)治疗后(例数)※显著性检验(P值)腹泻150P<0.05便秘150P<0.05腹泻+便秘50P<0.05腹痛120P<0.05腹胀131P<0.05腹部不适101P<0.05※用卡方检验或精确概率法3结论肠易激综合征是一组包括腹痛、腹部不适、排便习惯改变和大便性状异常等表现的临床综合征，非器质性疾病。冷凉、喝酒性腹泻是指受凉、食用冷凉食物或喝酒后出现的腹泻、腹痛、腹部不适等症状或以上症状加重，在临床上诊断为腹泻型肠易激综合征，属于腹泻型肠易激综合征的一种。目前医学研究表明IBS(包括冷凉泻和喝酒泻)是由于肠道免疫功能紊乱，炎症因子过度表达，使肠道耐受力下降，敏感性增强导致的。真杆菌和梭菌由于能够分泌丁酸，调节免疫平衡，抑制炎症因子过度表达，增强肠道耐受力，降低敏感性，恢复肠道正常功能，有效治疗IBS、冷凉泻和喝酒泻。实施例11、真杆菌和梭菌对口腔溃疡的治疗作用研究1对象与方法1.1病例资料经常复发的口腔溃疡患者20例，男10例，女10例，平均年龄39岁。溃疡复发史310年，每例患者平均每年复发6次以上。口腔溃疡发作时，随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组5例口腔溃疡患者，观察治疗口腔溃疡和预防口腔溃疡复发的疗效。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。33口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。以上疗程均为2周。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后溃疡面积、疼痛程度和服用2周口腔溃疡的复发时间。1.4治疗口腔溃疡疗效评定标准(周平秀，孟祥勇.联合用药治疗复发性阿弗他溃疡的临床观察.华北煤炭医学院学报，2006，8:81-82)显效3天内溃疡愈合或明显縮小，疼痛消失；有效5天内溃疡愈合或明显縮小及疼痛消失；无效溃疡愈合或明显縮小均在7天后。1.5预防口腔复发评定标准显效口腔溃疡发作，服用2周药物后，3个月内未复发。有效口腔溃疡发作，服用2周药物后，2个月内未复发。无效口腔溃疡发作，服用2周药物后，2个月内复发。2结果2.1治疗效果所有患者均在5天内溃疡愈合、疼痛消失，四组治疗口腔溃疡有效率均为100%。2.2预防口腔溃疡复发效果所有患者服药2周后，随访3个月，口腔溃疡均未复发，四组预防口腔溃疡复发有效率均达到了100%。且未发现任何副作用。3结论口腔溃疡是最常见的口腔粘膜疾病之一。有人偶尔发生，有人频繁发作，还有人从口腔溃疡开始，最终发展到白塞氏病综合症并导致了口腔肿瘤，专家们在临床中发现复发性口腔溃疡的患者患口腔鳞癌发病率有逐年增高的趋势。对口腔溃疡的治疗方法虽然很多，但基本上都是对症治疗，目的主要是减轻疼痛，很难完全控制复发，传统医学认为要想完全避免其复发，可能性不大，而本发明的药物用途通过恢复肠道菌群平衡，增强粘膜免疫功能，使治疗和控制口腔溃疡复发成为现实。并通过口服治疗口腔溃疡，解决了大部分治疗口腔溃疡的药物是局部用药，用药不方便的难题，且没有任何副作用。实施例12、真杆菌和梭菌治疗克罗恩病疗效观察1对象与方法1.1病例资料经临床、结肠镜、组织学或X线钡餐等检查诊断为克罗恩病患者，共20例，男9例，女11例，平均年龄38岁，均具有腹痛、腹泻等症状。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组5例患者。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。以上疗程均为68周。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后腹痛、腹泻等临床症状和炎症的改善情况。1.4治疗克罗恩病疗效评定标准(参照2000年中华医学会消化病学分会修订的对炎症性肠病诊断与治疗规范的建议)临床缓解经治疗后临床症状消失，X线或结肠镜检查发现炎症趋于稳定；有效经治疗后临床症状减轻，X线或结肠镜检查发现炎症减轻；无效经治疗后临床症状、X线、内镜及病理检查结果无改善。2结果治疗后，20例患者临床症状和炎症均有不同程度的改善。直肠真杆菌组有3例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了临床缓解；2例腹痛、腹湾、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。柱状真杆菌组有2例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了临床缓解；3例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。第三梭菌组有2例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了临床缓解；3例腹痛、腹污、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。肠道常住丁酸梭菌组有2例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了临床缓解；3例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。四组间疗效比较无显著性差异(P〉0.05)3结论克罗恩病是炎症性肠病的一种，属于过度免疫反应引起的自身免疫性疾病，炎症因子过度表达，真杆菌和梭菌由于能够分泌免疫调节剂丁酸，调节免疫恢复正常，抑制炎症因子过度表达，并能修复肠粘膜，对克罗恩病具有显著的治疗作用，且没有任何毒副作用。实施例13、真杆菌和梭菌治疗溃疡性结肠炎疗效观察1对象与方法1.1病例资料经临床、结肠镜、组织学或X线钡餐等检査诊断为溃疡性结肠炎患者，共40例，男18例，女22例，2668岁，平均年龄46.4岁。病程最短的6个月，最长15年，平均4年。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组10例患者。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，34次/天。以上疗程均为8周。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后腹痛、腹泻、粘液便、血便等临床症状和肠粘膜的改善情况。1.4治疗溃疡性结肠炎疗效评定标准(参照2000年中华医学会消化病学分会修订的对炎症性肠病诊断与治疗规范的建议)完全缓解经治疗后临床症状消失，结肠镜检查发现粘膜大致正常；有效经治疗后临床症状基本消失，结肠镜检查发现粘膜轻度炎症或假息肉形成；无效经治疗后临床症状、内镜及病理检査结果无改善。2结果治疗后，40例患者临床症状和炎症均有不同程度的改善。直肠真杆菌组有8例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了完全缓解；2例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。柱状真杆菌组有6例腹痛、腹湾等临床症状消失，达到了完全缓解；4例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。第三梭菌组有7例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了完全缓解；3例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。肠道常住丁酸梭菌组有7例腹痛、腹泻等临床症状消失，达到了完全缓解；3例腹痛、腹泻、炎症减轻，治疗有效，总有效率100%。四组间疗效比较无显著性差异(P>0.05)2.3不良反应治疗过程中未发现任何不良反应。3结论溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种，病变主要局限于肠粘膜，属于过度免疫反应引起的自身免疫性疾病，炎症因子过度表达，使肠粘膜出现溃疡，真杆菌和梭菌由于能够分泌免疫调节剂丁酸，调节免疫恢复正常，抑制炎症因子过度表达，并能修复肠粘膜，对溃疡性结肠炎具有显著的治疗作用，且没有任何毒副作用。实施例14、真杆菌和梭菌治疗类风湿性关节炎疗效观察1对象与方法1.1病例资料经临床明确诊断为类风湿性关节炎的患者，共20例，平均年龄41岁，病史在2年10年。临床症状为关节肿胀、疼痛、晨僵或有关节摩擦音。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组5例患者。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g),由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。以上疗程均为1224周。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后关节肿胀、疼痛、晨僵或关节摩擦音的改善情况。1.4疗效评定标准(按国家中医药管理局1994年发布的《中医病证诊断标准》)。痊愈关节疼痛肿胀消失、晨僵消除；好转关节疼痛肿胀消失，偶有痛感，晨起稍有僵硬；无效关节疼痛肿胀、晨僵同治疗前。2结果用口服直肠真杆菌活菌散剂治疗5例中，痊愈3例，好转2例，无效0例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服柱状真杆菌活菌散剂治疗5例中，痊愈2例，好转3例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服第三梭菌活菌散剂治疗5例中，痊愈4例，好转1例，无效0例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗5例中，痊愈3例，好转2例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。3结论类风湿性关节炎属于自身免疫性疾病，目前治疗类风湿性关节炎的药物很多，但均存在各种副作用制约临床的应用，有的副作用甚至可以导致死亡，尤其类风湿性关节炎患者需要长时间服药，病人很难耐受副作用。真杆菌和梭菌通过调节免疫和炎症因子表达、预防感染等多个方面发挥作用，疗效显著，且没有任何毒副作用，病人可以长时间服用，并且真杆菌和梭菌除可以制成药品外，还可以制成保健品或饮品应用治疗类风湿性关节炎。实施例15、真杆菌和梭菌治疗强直性脊柱炎疗效观察1对象与方法1.1病例资料经临床明确诊断为强直性脊柱炎的患者，共20例，平均年龄38岁，病史在1年13年。临床症状为腰脊疼痛，遇寒加重，脊柱僵硬，俯仰不利，或有双髋部痛，双腿活动受限，畏寒肢冷，乏力多汗。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组5例患者。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，2次/天。以上疗程均为1224周。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后腰脊疼痛、双髋部痛等临床症状的改善情况。1.4疗效评定标准根据全国中西医结合研究会风湿类疾病专业委员会1987年8月讨论修订的疗效标准制定。显著好转经治疗后受累部位疼痛消失，活动功能改善或恢复正常，血沉恢复正常，X线示骨质病变有改善或无发展，恢复日常劳动；好转受累部位疼痛减轻，活动范围增大，血沉降低；无效经治疗3个疗程(90天)以上，受累部位症状无改善。2结果用口服直肠真杆菌活菌散剂治疗5例中，显著好转4例，好转1例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服柱状真杆菌活菌散剂治疗5例中，显著好转3例，好转2例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服第三梭菌活菌散剂治疗5例中，显著好转4例，好转1例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。用口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗5例中，显著好转3例，好转2例，无效O例，总有效率100%，且未见任何不良反应。3结论强直性脊柱炎病程长、病情重，需要长时间吃药，尚无根治的办法，目前治疗主要缓解症状，保持良好姿势和减缓病情进展。目前治疗药物虽很多，但均存在各种副作用制约临床的应用，有的副作用甚至可以导致死亡，因此目前疗效好和没有副作用的药物是临床最需要的。目前认为强直性脊柱炎是遗传因素和肠道因素相互作用所致，是肠道感染和肠粘膜通透性增加等因素在遗传因素的基础上引起免疫异常诱发强直性脊柱炎发病和使病情进展。真杆菌和梭菌一方面，调节免疫恢复正常和下调炎症因子表达，缓解症状；另一方面，分泌丁酸修复肠粘膜，改变肠粘膜通透性，恢复肠道健康，消除强直性脊柱炎发病和病情进展的诱发因素。疗效显著，且没有任何毒副作用，病人可以长时间服用，并且真杆菌和梭菌除可以制成药品外，还可以制成保健品或饮品应用治疗强直性脊柱炎。实施例16、真杆菌和梭菌治疗与预防手足口病疗效观察1对象与方法1.1病例资料按手足口病诊断标准明确诊断为手足口病的40例患者，男28例，女12例，平均年龄1.5周岁，最大3周岁。病例均发热，37.540°C。手足口均有米粒至绿豆大小的圆形、椭圆形的疱疹。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组10例患者，观察真杆菌和梭菌对手足口病的治疗效果。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0Xl()7CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。以上疗程均为4天。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后体温、皮疹和饮食情况。1.4治疗手足口病疗效评定标准(刘素琴.更昔洛韦治疗婴幼儿手足口病的疗效.实用儿科临床杂志，2006，21(24):1731-1732)显效体温正常，皮疹基本消退，饮食正常；好转体温下降，皮疹部分消失，能少量进食；无效体温、皮疹或饮食无改善。显效及好转为有效，同时观察不良反应。2结果2.1治疗效果直肠真杆菌组，显效8例，好转2例，总有效率100%。柱状真杆菌组，显效6例，好转3例，无效1例，总有效率90%。第三梭菌组，显效9例，好转1例，总有效率100%。肠道常住丁酸梭菌组，显效7例，好转3例，总有效率100%。各组间总有效率无统计学差异(P〉0.05)2.2不良反应临床观察未见任何不良反应。3结论由于手足口病多发生于婴幼儿，这与婴幼儿肠粘膜未发育成熟，通透性高，肠道菌群屏障也不完善和免疫力低等有关，真杆菌和梭菌进入肠道能分泌大量丁酸，修复肠粘膜，促进肠粘膜发育成熟，同时建立完善的肠道菌群屏障和提高机体和粘膜免疫，在治疗和预防感染手足口病方面疗效显著，本次选择病例都是婴幼儿，但可以预见到治疗3周岁以上的儿童或成人手足口病同样有效，所需要的剂量是临床医生根据病情和年龄能很容易掌握的。同时，根据真杆菌和梭菌的临床疗效和作用机理，可以很容易预见到手足口病暴发流行时，口服真杆菌和梭菌制剂可以预防感染手足口病，降低手足口病的发病率。实施例17、真杆菌和梭菌治疗伪膜性肠炎疗效观察1对象与方法1.1病例资料按伪膜性肠炎诊断标准明确诊断为伪膜性肠炎的20例患者，男15例，女25例，平均年龄38周岁。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组和口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组，每组5例患者，观察真杆菌和梭菌对伪膜性肠炎的治疗效果。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。以上疗程15天。1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后腹泻、肠粘膜修复、病菌消失情况。2结果2.1经15天治疗后，20例患者全部治愈，症状消失，便检艰难梭菌转阴，肠镜检查粘膜病灶消失。2.2不良反应临床观察未见任何不良反应。3结论伪膜性肠炎是由于大量使用抗菌药后，引起肠道菌群失调，合并艰难梭菌感染后导致肠粘膜损伤，引起伪膜。本发明所述真杆菌和梭菌，由于能够分泌大量丁酸，修复受损肠粘膜，及抑制有害菌，促进有益菌生长，快速恢复肠道菌群平衡，并能提高免疫力，因此对伪膜性肠炎具有显著的治疗作用。实施例18、真杆菌和梭菌对鹅口疮治疗作用疗效观察1对象与方法1.1病例资料按鹅口疮诊断标准明确诊断为鹅口疮的50例患者，男35例，女15例，平均年龄l周岁。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组、口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组和对照组，每组10例患者，观察真杆菌和梭菌对鹅口疮的治疗效果。1.2给药方法口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。对照组予局部涂抹1020万U/mL制霉菌素鱼肝油混悬液，2次/天。以上疗程均为15天。1.3疗效判定症状消失，口腔白膜消失，粘膜恢复正常。2结果各个治疗组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，见表l。表l鹅口疮疗效比较<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3结论鹅口疮是由白色念珠菌所致的口腔粘膜炎症。白色念珠菌可在健康人消化道寄生，当腹泻、使用广谱抗生索或激素、营养不良和机体免疫力下降时可使正常菌群失调而发病，本发明所述真杆菌和梭菌由于能够提高免疫力、恢复菌群平衡、促进营养物质吸收和抗炎，对鹅口疮具有显著的治疗作用。实施例19、真杆菌和梭菌对湿疹的治疗作用疗效观察1对象与方法1.1病例资料按湿疹诊断标准明确诊断为湿疹的100例患者，男75例，女25例，平均年龄1.2周岁。随机分入口服直肠真杆菌活菌散剂治疗组、口服柱状真杆菌活菌散剂治疗组、口服第三梭菌活菌散剂治疗组、口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂治疗组和对照组，每组20例患者，观察真杆菌和梭菌对湿疹的治疗效果。1.2给药方法对照组用尿素软膏涂患处，每日3次，IO天为一疗程。治疗组在对照组的基础上，加用口服直肠真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含直肠真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服柱状真杆菌活菌散剂，500mg/袋，(含柱状真杆菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服第三梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含第三梭菌活菌数不低于l.OX107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。口服肠道常住丁酸梭菌活菌散剂，500mg/袋，(含肠道常住丁酸梭菌活菌数不低于1.0X107CFU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3袋/次，3次/天。以上疗程均为10天。1.3疗效判定显效用药10天内皮疹治愈；有效用药10天内皮疹大部分消退；无效用药10天皮疹未消退或增多。2结果治疗组与对照组比较，经统计学处理，P<0.05，有显著性差异，说明本发明所述真杆菌和梭菌治疗湿疹有效，见表l。表1真杆菌和梭菌治疗湿疹疗效比较<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>3结论湿疹属于变态反应性疾病，是肠道菌群紊乱引起的免疫紊乱，导致的皮肤损伤。本发明所述真杆菌和梭菌由于能够分泌丁酸，调节免疫平衡，并能恢复肠道菌群平衡，对变态反应性疾病具有很好的治疗作用，尤其对变态反应性皮肤病，包括湿疹疗效显著。实施例20、真杆菌和梭菌对动脉粥样硬化(AS)大鼠细胞因子和血脂的调节作用研究1材料与方法1.1实验动物、药品和试剂雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，180-220g，购自维通利华实验动物中心，清洁级，合格证号为SCXP(京)(2002)_0003。直肠真杆菌菌液(107CFU/mL);柱状真杆菌菌液(107CFU/mL);第三梭菌菌液(107CFU/mL);肠道常住丁酸梭菌菌液(107CFU/mL);双歧杆菌菌液(107CFU/mL);由青岛东海药业有限公司生产。大鼠TNF-a、IL-ie、IL-10ELISA试剂盒。1.2大鼠AS模型的建立大鼠在腹腔注射维生素D3(60万单位/Kg)后，给予高脂饲料(3%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%的白糖，10%猪油，81.3%基本词料)喂养8周，可形成典型的AS病变。1.3分组及给药方法将大鼠随机分成7组，即正常对照组、模型对照组、双歧杆菌治疗组、直肠真杆菌治疗组、柱状真杆菌治疗组、第三梭菌治疗组、肠道常住丁酸梭菌治疗组，每组6只。除正常对照组喂饲基础饲料外，其余各组均在腹腔注射维生素D3后给予高脂饲料，同时药物治疗组给予菌液灌胃，每次lmL/100g(体重)，l次/天。正常对照组和模型对照组给予同体积的水。8周后，腹腔注射水合氯醛麻醉，取主动脉血进行指标测定。1.4指标测定1.4.1TNF-a、IL-13、IL-10测定按4mL/g组织的比例加入生理盐水，用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液3000r/min离心10min后吸取上清，采用ELISA法测定，按试剂盒说明进行。1.4.2按常规方法测定血清血脂参数，包括总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。2结果2.1TNF-a、IL-1P、IL-10与正常对照组比较，模型对照组动脉中TNF-a、IL-1P、IL-10水平均显著升高(P<0.01);本发明所述真杆菌和梭菌可显著降低动脉中TNF-a、IL-1P水平，显著增加IL-10水平(P<0.01)，且效果好于双歧杆菌(P<0.05)见表1。表1真杆菌和梭菌对AS大鼠TNF-a、IL-1P、IL-10的影响(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>2.2血清血脂参数模型对照组TC、TG显著高于正常对照组(P<0.05)，模型对照组HDL-C显著低于正常对照组(P<0.05);本发明所述真杆菌和梭菌治疗后与模型对照组相比TC、TG显著降低(P<0.05),HDL-C显著升高(P<0.05)，且效果好于双歧杆菌(P<0.05)，见表2。表2丁酸梭菌对AS大鼠TC、TG、HDL-C的影响(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>3结论动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病发病的主要病理基础，而高血脂症又是动脉粥样硬化的主要诱因。AS与其他的炎症性疾病如类风湿关节炎、牛皮癣、哮喘和炎症性肠疾病相似，伴有炎症免疫反应异常，TNF-a、IL-8、IL-1P等炎症性细胞因子过度表达，加速了AS的发生和发展，进而加速了心脑血管疾病的发生和发展。研究表明高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎等心脑血管疾病患者TNF-Q、IL-13等炎症性细胞因子水平均显著升高。TNF-a作为一个细胞凋亡的胞内信号能诱导血管内皮细胞凋亡、促进血浆内皮素(ET-1)的产生而加重血管壁的损伤，并且有促进白介素6(IL-6)分泌的作用，还可控制脂溶酶活性，抑制脂蛋白酶(LPL)活性，抑制斑块局部LPL的产生，从而不利于脂质溶解，而易于沉积在血管壁，促进动脉硬化形成，导致各种心脑血管疾病的发生。TNF-a能诱发心肌炎，减低心功能和通过坏死或凋亡引起心肌细胞坏死，引起心绞痛和心律失常等。心脑血管疾病患者IL-13的阳性检测率随着TNF-a检测率的升高也相应升高，TNF-a、IL-ie两种细胞因子通过相互诱导、相互作用，共同参与了高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎等心脑血管疾病的病理生理过程，从而引发心脑血管疾病的发生和发展。IL-10是一种具有强免疫调节作用的抗炎细胞因子，在心脑血管疾病中发挥保护作用。本发明所述真杆菌和梭菌通过分泌丁酸，能使异常的细胞因子表达恢复正常或得到改善，对阻止炎症性细胞因子对心脑血管及细胞的损害起到了很好的作用，能有效预防、治疗心脑血管疾病。血脂主要是指血清中的胆固醇和甘油三酯。无论是胆固醇含量增高，还是甘油三脂的含量增高，或是两者皆增高，统称为高脂血症。高脂血症是发生动脉粥样硬化、心脑血管疾病及微循环障碍的重要因素。临床资料表明，心脑血管疾病的发生率随血清胆固醇和甘油三酯的浓度升高而增加。降血脂可以明显减少冠心病危险是无可置疑的事实，血清胆固醇降低1%，冠心病危险性降低2%。因此，高脂血症的及早发现和积极治疗对心脑血管病的防治有着极为重要的意义。高密度脂蛋白(HDL)的功能之一是运输内源性胆固醇至肝脏处理，故有抗动脉粥样硬化作用。在检查中，通过检查HDL-C的含量间接反映HDL的水平。动脉粥样硬化时HDL-C降低，表明HDL降低。本发明所述真杆菌和梭菌通过降低TC、TG和升高HDL达到降低血脂的作用，从而有效预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病及微循环障碍。46本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年07年28日、2006年12月15日、2007年8月2日和2007年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所邮编100080)保藏，共六个下述微生物菌种，但本发明所述的双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、真杆菌和梭菌并不局限于这六种微生物菌种。(1)分类命名短双歧杆菌^/^fo^cten'ww6"ve，保存编号0313.6。(2)分类命名枯草芽孢杆菌^^7/^swZ^fe，保存编号1887。(3)分类命名直肠真杆菌五^acfen'wmrecto/e，保存编号2124。(4)分类命名柱状真杆菌五"6acten'wmc_y//"drazVfey，保存编号2302。(5)分类命名第三梭菌C/o^WwmteW&w，保存编号2304。(6)分类命名丁酸梭菌C/o^Www^&n'cMw,保存编号2303。上述六个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。权利要求1、补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，其特征在于该微生态制剂是用一种或一种以上的真杆菌发酵后作为主要活性成份制成的制剂，或用一种或一种以上的梭菌发酵后作为主要活性成份制成的制剂，或用一种或一种以上的真杆菌与一种或一种以上的梭菌单独或混合发酵后组合作为主要活性成份制成的制剂。2、按权利要求1所述微生态制剂，其特征在于有效剂量的真杆菌和梭菌单独或组合作为主要活性成份制成药品组合物、保健品、饮品、兽药和饲料添加剂。3、按权利要求l所述应用，其特征在于真杆菌、梭菌指活的生物个体。4、按权利要求l所述应用，其特征在于真杆菌优选但不限于直肠真杆菌和柱状真杆菌，梭菌优选但不限于第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌。5、按权利要求4所述肠道常住丁酸梭菌，其特征在于所述丁酸梭菌能在肠粘膜长期定植，分泌酪酸。6、按权利要求2所述应用，其特征在于真杆菌优选但不限于直肠真杆菌CGMCC2124株和柱状真杆菌CGMCC2302株，梭菌优选但不限于第三梭菌CGMCC2304株和肠道常住丁酸梭菌CGMCC2303株。7、按权利要求l所述微生态制剂，其特征在于在制备治疗消化系统疾病、营养吸收障碍性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、变态反应性疾病、提高免疫力、抗癌组合物中的应用。8、按权利要求7所述应用，其特征在于消化系统疾病包括腹泻、肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肠癌、肿瘤放化疗辅助治疗、腹胀和消化不良、便秘、便臭、便臭中毒综合征、养颜美容、肝胆疾病、病毒性腹泻、喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎、黄疸、口腔溃疡、鹅口疮、促进小儿肠道发育成熟、消化吸收、营养保健和生长发育。9、按权利要求7所述应用，其特征在于营养吸收障碍性疾病包括佝偻病。10、按权利要求7所述应用，其特征在于自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎。11、按权利要求7所述应用，其特征在于心脑血管疾病包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎、动脉粥样硬化。12、按权利要求7所述应用，其特征在于变态反应性疾病包括变态反应性皮肤病，进一步包括湿疹。13、按权利要求7所述应用，其特征在于提高免疫力包括治疗反复呼吸道感染。14、按权利要求1所述微生态制剂，其特征在于在制备治疗手足口病组合物中的应用。全文摘要本发明涉及真杆菌、梭菌制剂及其应用，具体涉及真杆菌、梭菌单独或组合作为主要活性成份制成补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，及该微生态制剂通过产生丁酸在治疗相关疾病中的应用，属于生物药领域。文档编号A61P37/00GK101496819SQ20081000503公开日2009年8月5日申请日期2008年1月31日优先权日2008年1月31日发明者崔云龙,张海强,李洪福,王发合申请人:青岛东海药业有限公司;北京东方百信生物技术有限公司;北京天施康医药科技发展有限公司