专利名称：：醌类化合物Bostrycin及其制备方法与抗肿瘤应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：海洋占地球表面积70%，海洋微生物无论从数量上或是多样性方面都相当丰富，美国"国际海洋微生物普查"项目首席科学家米切尔，索金最近公布，海洋微生物的总量应在5001000万种，远远超出原来20万种的估计，也远远超出全球动植物种类的总和。海洋微生物生活在特殊环境之中，例如高盐度、高压、低营养、低温(特别是深海)或局部高温和无光照以及不同的生物之间的关系等等。在这些所谓生命的极限环境中，海洋微生物己发展出独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了在陆地微生物中未遇到过的代谢产物的生产潜力，因而是多种多样新颖化合物的极好资源。科技界相信，海洋微生物将成为21世纪开发新型医药品的资源。自从1929年从真菌中发现青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰富来源，它们在抗菌，抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂等有重要应用。海洋微生物种类繁多，来源广泛，筛选获得率高，根据John教授在2008年《NaturalProductReports》的报道，2006年发现海洋天然产物新化合物中，海洋微生物是主要来源之一，成为当今国际上研究的热点。红树林生态系是世界上最富多样性、生产力最高的海洋生态系之一。红树林沼泽区有充足的植物材料，有丰富的浮游藻类和浮游生物，这些条件正适合于为微生物的繁殖。在过去的十几年里，红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源，这形成了海洋真菌第二大的生态学亚类。
发明内容本发明的目的在于提供一类来源于海洋红树林内生真菌的醌类化合物Bostrycin。本发明的另一个目的是提供上述醌类化合物Bostrycin的制备方法。本发明的进一步目的是提供上述醌类化合物Bostrycin在制备抗肿瘤药物中的应用。发明人由南海海洋真菌Haloroselliniasp.1403(简称真菌1403)的发酵培养物中提取分离得到化合物Bostrycin,结构分别如下列式所OH(I)本发明所用的真菌1403已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCCNO:M201018,保藏日为2001年4月23日。本发明醌类化合物Bostrycin可从真菌1403的发酵培养液中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下(1)真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的种子培养培养基组成按重量比为葡萄糖0.51.5，酵母提取物0.050.15，蛋白胨0.10.3，琼脂11.5，氯化钠35，水100;制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，3035°C培养57天；(2)真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的发酵培养发酵培养基组成按重量比为葡萄糖515，酵母提取物14，蛋白胨0.54，氯化钠35，水100;将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温2535T:静置12个月；(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；(4)将发酵液加热浓縮至原液体积的1/101/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓縮乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；(5)发酵液浸膏经过柱层析后，收集60%—90%乙酸乙酯/石油醚洗脱液，70%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体醌类化合物Bostiycin本发明经试验证明，醌类化合物Bostrycin能有效抑制多种肿瘤细胞株的生长，可用于制备抗肿瘤药物，可以是药物上可接受的任意一种剂型。与现有抗肿瘤药物相比，本发明具有如下有益效果本发明的醌类化合物Bostrycin来源于海洋真菌，海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得化合物Bostrycin来源丰富、成本低廉；化合物Bostrycin抗肿瘤活性高，应用前景广阔。具体实施例方式实施例l醌类化合物Bostrycin的制备方法a.真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的种子培养培养基按重量比为葡萄糖2，酵母提取物O.l，蛋白胨0.3，琼脂0.5，氯化钠4，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28°C培养6天；b.真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的发酵培养发酵培养基按重量比为葡萄糖15，酵母提取物2.5，蛋白胨8，氯化钠5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温30°C静置l个月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓縮至原液体积的1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓縮乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱。e.发酵液浸膏经过柱层析后，收集80%乙酸乙酯/石油醚洗脱液，70%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体醌类化合物Bostrycin。Bostrycin的试验数据FABMS:337(M+1)，EA(w/%，)C56.56,H4.617。计算直(C16H1608):C57.14，H4.76，mp232°C.IRv/cm-1(KBr):3514，3479,3374,3029,2987，2938,2896,1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200:1208，1138，1082，997,948,864，821，632，554，491.iHNMR(500Mz,CDC13,TMS〕13.35(s，OH-9),12.62(s,OH-10)，6.46(s，H-3),4.77(t，4.5，4.5Hz，H-7，OH),3.92(s,CH3-16),3.54(t，4.5，4.5Hz，H-5)，2.74(d，18Hz,H-8a),2.67(d，18Hz,H-8b)，1.24(s，CHr15).Bc画R(CDCli):183.3(C-4)，176.5(C-1),160.9(C-10),160.9(C-2)，160.2(C-9)，139.5(C-11)，136.8(C-12)，109.8(C-14),109.6(03)，107.3(C-13)，76.3(C-7),69.2(C-6)，68.2(C-5)，56.8(C-16)，34.8(C-8)，25.5(C-15).实施例2MTT还原法检测醌类化合物Bostrycin抗肿瘤活性试验l.材料1.1四脞盐(MTT):用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4,5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide,SIGMA)终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4"C避光保存。1.2靶细胞的制备人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7，人神经胶质瘤细胞株LN18、U87M和LN444，人肝癌细胞株HepG2，鼠肝癌细胞株Hepl-6，人前列腺癌细胞株PC-3，鼠黑色素瘤细胞株B16-F10以及人正常鼻咽细胞NP69和人正常乳腺细胞MCF-10A的复苏与培养。a.从液氮罐中取出人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7，人神经胶质瘤细胞株LN18、U87M和LN444,人肝癌细胞株HepG2，鼠肝癌细胞株Hepl-6，人前列腺癌细胞株PC-3，鼠黑色素瘤细胞株B16-F10以及人正常鼻咽细胞NP69和人正常乳腺细胞MCF-10A的冻存管，迅速置入37'C水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；b.加全培养液至10mL，lOOOrmp离心5s，弃上清；C.重复以上操作一次；d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5%C02，37'C培养；e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。1.3细胞计数a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10mL;b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；c.调整细胞数至1X105/mL;1.4化合物Bostrycin的配制取一定量的化合物Bostrycin加入到全培中，调整浓度为500吗/mL，超声乳化，过滤除菌，4。C保存。2.试验方法a.96孔板各孔加入人乳腺癌细胞MDA-MB435和MCF7，人神经胶质瘤细胞LN18、U87M和LN444,人肝癌细胞HepG2，鼠肝癌细胞Hepl-6，人前列腺癌细胞PC-3，鼠黑色素瘤细胞B16-F10以及人正常鼻咽细胞NP69和人正常乳腺细胞MCF-10A100jiL(1X105/mL)，5%C02，37。C培养4hr。b.加入不同浓度受试对象100jiiL，对照加全培100nL，继续培养48hr。c.加入MTT(5mg/mL)各10|iL，继续培养4hr。d.去除培养液。每孔加入DMSO100(iL，轻轻振荡5—10min，使颗粒溶解。e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。f.计算抑制率肿瘤细胞杀伤率％=X100%g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得ICso值以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC50值3.试验结果验结果显示化合物Bostrycin均能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7，人神经胶质瘤细胞株LN18、U87M和LN444，人肝癌细胞株HepG2，鼠肝癌细胞株Hepl-6，人前列腺癌细胞株PC-3，鼠黑色素瘤细胞株B16-F10，对人正常鼻咽细胞NP69有细胞毒性(IC5Q9.83)，但是对人正常乳腺细胞MCF-10A毒性较小(IC5047.91686MM)，说明对乳腺肿瘤细胞和正常乳腺细胞有一定的选择性，有ICs。值(nM)见表l。表l、Bostrycin的体外细胞毒试验结果(IC5。iiM)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、醌类化合物Bostrycin，其结构式如式(I)。2、权利要求1所述醌类化合物Bostrycin的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的种子培培养基组成按重量比为葡萄糖0.51.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.10.3，琼脂11.5'氯化钠35，水100;制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，3035°C培养57天；(2)真菌Haloroselliniasp.1403CCTCCNO:M201018的发酵培养:发酵培养基组成按重量比为葡萄315，酵母提取物14，蛋白胨0.54，氯化钠35，水100;将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温2535"C静置12个月；(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；(4)将发酵液加热浓縮至原液体积的1/101/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓縮乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；(5)发酵液浸膏经过柱层析后，收集60%_90%乙酸乙酯/石油醚洗脱液，70%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体醌类化合物Bostrycin。3、权利要求1所述醌类化合物Bostrycin在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种醌类化合物Bostrycin及其制备方法与抗肿瘤应用。本发明发现了从一种新的海洋真菌Haloroselliniasp.1403中分离的醌类化合物Bostrycin具有潜在药用价值。海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得醌类化合物来源丰富、成本低廉；醌类化合物抗肿瘤活性高，应用前景广阔。文档编号A61K31/122GK101544556SQ200810028618公开日2009年9月30日申请日期2008年6月6日优先权日2008年6月6日发明者佘志刚,岚刘,吴玉珩,庞冀燕,林永成,瞿东方,蔡小玲,洁袁,郑明英,陈省平,顾振东,立鲁,黎孟枫申请人:中山大学;广东肇庆星湖生物科技股份有限公司