专利名称：骨诱导材料及其制备方法和应用的制作方法
骨诱导材料及其制备方法和应用技术领域：
本发明涉及骨组织修复材料，尤其涉及一种骨诱导材料及其制备方法和应用。背景技术：
骨是仅次于血液最为常见的通过移植来修复的组织。在美国，每年有超过50万例骨移植手术。全球每年在骨科、神经外科和牙科为修复骨缺损进行的骨 移植手术高达220万例。在脊柱外科的应用约占骨移植手术总数的一半。随着 人口的老龄化，需要治疗的脊柱退行性病变病例的激增，骨移植在脊柱外科的 应用正在迅速增加。骨移植是用来治疗超过机体愈合能力的骨缺损和进行推体 间骨性融合的外科方法。在脊柱外科，脊柱手术后都面临维持脊柱稳定的问题； 在手术节段推体间或脊柱后外侧横突间植入骨融合材料是恢复和维持脊柱长期 稳定性的有效方法。推间融合器(interbody fusion cage )和骨移植材料4关合应用 是治疗单节段脊柱退行性病变的推荐术式。推间融合器是推间盘去除后，放置 在相邻推体间来稳定脊柱和恢复推体间高度的中空结构。骨移植材料就放置在 推间融合器中间的空隙，通过骨性愈合连接相邻推体，维持脊柱的长期稳定。目前所使用的骨移植材料有自体骨、同种异体骨和合成骨替代物。自体骨 是骨移植物的金标准，但来源有限，获取时会给机体造成新的损伤;同种异体 骨来源广泛，但有免疫排斥和传播疾病的危险。上述这些不足限制了它们在临 床的广泛应用。为了满足临床需求，不断有新的合成骨替代材料得到开发和利 用。这包括天然材料，多聚物、生物活性陶资和几种促骨生长因子。促骨生长 因子因其强有力的诱导或促进骨生长的能力正受到广泛的研究和应用。其中， 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs )是目前已知唯一能诱导干 细胞成骨分化的最强有力的促进骨发生的生长因子。BMPs水溶液注射到体内成 骨位点会很快被机体清除，达不到有效成骨。BMPs只有与载体组成緩释系统， 维持在局部持续有效释放，才能取得成骨效果。重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2 )和牛可吸附I型胶原海绵(absorbable collagen sponge, ACS )组成 的緩释系统已被美国食品和药品管理局(FDA)批准作为推间融合器的骨诱导 填充材料用于腰推前路手术。BMP-2/ACS緩释系统已被美国枢法莫公司开发成 系列产品，以INFUSE商品名推向市场，与推间融合器(LT-cage) —起用于腰 推前路融合。大量长期的临床研究表明rhBMP-2/ACS緩释系统用于腰推前路融 合明显好于自体骨移植物。这表明BMPs与恰当的载体结合有望取代自体骨成 为新的骨移植金标准。然而，rhBMP-2/ACS緩释系统也存在明显的不足。这种 緩释系统在体内是通过被动的简单扩散来进行释放，存在初始的爆发性释放； 这导致可控緩释效果并不显著，活性因子的大量使用和浪费，以及成骨范围不 宜局限。由于解剖位置的关系，rhBMP-2/ACS緩释系统在腰推使用并没有明显 的并发症；但在其他部位时并发症的发生率相当高，表现为广泛软组织血胂， 异位成骨压迫重要结构和骨过度吸收。这些并发症都归因于BMP-2的过量释放。 因此，当前急需解决的问题是寻找新的载体材料，使BMPs通过材料降解而产 生主动可控释放，降低或消除并发症的发生，拓广BMPs在骨科的应用领域。 中国专利文献CN02114509.1虽然^^开了 一种以动物纤维蛋白为载体的骨修复材 料，但是该材料仍存在缺陷，它不能保护BMPs免受抑制和降解，不能有效提 升BMPs的生物活性。
发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一种骨诱导材料，能微量、高效和平 稳地緩释BMPs,并有效提高BMPs的生物活性，只需较少量BMPs,就可维持 BMPs有效长期释i文。本发明要解决的技术问题之二是提供一种骨诱导材料的制备方法。本发明要解决的技术问题之三是提供本发明骨诱导材料在骨移植中的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现 在本发明的一个方面，提供了一种骨诱导材料，包括骨诱导因子和载体， 所述骨诱导因子包含骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),所述载体主要由纤维蛋白原(fibrinogen),纤维结合蛋白(fibronectin)、肝素、纤维蛋白稳定因子(fXIII因子)、凝血酶及氯化 钙经相互作用形成凝胶基质，所述骨诱导因子通过与肝素的结合被包埋于该凝 胶基质中。优选的，所述纤维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为1~10:1;所述纤维结 合蛋白与肝素的摩尔比为1-10:1。优选的，所述骨诱导因子为骨形态发生蛋白，该蛋白与肝素的质量比为1: 1 ~50,所述骨形态发生蛋白是从动物骨中提取的天然骨形态发生蛋白或是用基 因工程方法生产的重组骨形态发生蛋白。优选的，所述纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白原的比例关系为每lmg纤维 蛋白原对应0.3 ~ 1.2 IU的纤维蛋白稳定因子。在本发明的另一方面，提供了一种骨诱导材料的制备方法，包括如下步骤(1) 将包含骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子的骨诱导因子作为 组分I,配制含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液 作为组分II;(2) 配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III;(3) 将组分II加入组分I,以溶解诱导因子；(4) 将组分III加入组分II和I的混合溶液，以形成骨诱导因子緩释系统。 优选的，所述步骤(1)的组分I为骨形态发生蛋白。优选的，所述步骤(l)的纤维蛋白原在组分II中的浓度为4~ 120mg/ml。 优选的，所述步骤(2)的凝血酶在组分III中的浓度为40 ~ 800 IU /ml，所述 氯化钙在组分III中的浓度为35 ~ 45umol/ml。优选的，所述组分II和III的PH值为6.8 ~ 9。优选的，所述步骤(3)中将组分II加入组分I之后，在33°C ~ 37。C水浴中i文 置15~30分钟。优选的，所述步骤(4)中将组分III加入组分II和I的混合溶液之后，放入培养箱孵育1~2小时。在本发明的另 一方面，还提供了本发明骨诱导材料在骨移植中的应用。 本发明骨诱导材料为BMPs緩释系统，该緩释系统由纤维蛋白原和纤维结合蛋白溶液在凝血酶和纤维蛋白稳定因子的作用下形成彼此共价交联凝胶体系；在同一反应体系中BMPs和肝素相结合，而肝素因与纤维结合蛋白有高亲 和力而连接到该凝胶体系，这样BMPs被牢固包埋在凝胶基质中形成緩释系统。 本发明提供的骨诱导材料是模拟组织修复早期临时基质而构建的，纤维蛋白原、 纤维结合蛋白和肝素是组织修复早期临时基质的主要成分，也代表组织修复早 期临时基质的结构，fXIII因子是形成这种组织修复早期临时基质所必需的；纤 维蛋白原、纤维结合蛋白和肝素在起始组织修复过程中发挥重要作用，肝素和 BMPs结合，肝素不但把BMPs包埋在基质结构中，还保护BMPs免受抑制和降 解，提升BMPs的生物活性。本发明由緩释系统组成的骨诱导材料有以下优点 1)使BMPs通过主要由细胞介导的材料降解而产生主动缓释。2)BMPs的緩释 微量、高效、平稳，无初始的爆发性释放，只需较少量BMPs，就可维持BMPs 有效长期释》文。3)肝素有保护BMPs免受降解的作用，且还能与BMPs抑制蛋 白结合，阻止BMPs被灭活，有效提高BMPs的生物活性。4)由于BMPs緩慢 释放所形成的浓度梯度范围窄，成骨局限。5)纤维蛋白和纤维结合蛋白所形成 的支架结构是组织修复过程的早期临时基质，这种基质有利于细胞的粘附和侵 入，加速成骨过程。6)与rhBMP-2/ACS緩释系统相比，本发明緩释系统的BMPs 的释放率可通过改变緩释系统的构成参数进行调节，以满足不同移植位点的需 要。7)这种緩释系统的临床应用十分方便，只需2-3分钟的一步反应就可完成。 8)该BMPs緩释体系与其他骨修复技术(例如组织引导再生技术)相结合对于 骨缺损的修复也具有巨大的应用价值。本材料是模拟组织修复早期临时基质构建的，纤维蛋白原、纤维结合蛋白 和肝素是组织修复早期临时基质的主要成分，也代表组织修复早期临时基质的 结构，DQII因子是形成这种组织修复早期临时基质所必需的。纤维蛋白原、纤 维结合蛋白和肝素在起始组织修复过程中发挥重要作用。肝素和BMPs结合， 肝素不但把BMPs包埋在基质结构中，还保护BMPs免受抑制和降解，提升BMPs 的生物活性本发明的骨诱导材料不仅克服了 rhBMP-2/ACS緩释系统可能导致的严重并 发症问题，而且具有更好的骨传导和骨诱导能力。本发明骨诱导材料因其活性 成分BMPs用量少，成本降低，具有很好的社会效益和市场竟争力。
图1所示是本发明含有肝素结合BMP緩释系统的纤维蛋白-纤维结合蛋白 基质示意图。
具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明的骨诱导材料包括骨诱导因子和载体，所述骨诱导因子包含骨形态 发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，优选的，本发明骨诱导因子为骨形态发 生蛋白，该骨形态发生蛋白是从动物骨中提取的天然骨形态发生蛋白或是用基 因工程方法生产的重组骨形态发生蛋白，本发明优选重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)，该基因工程产品具有高纯度、高生物活性和品性稳定的特点。所 述载体主要由纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素、纤维蛋白稳定因子、凝血酶 及氯化钙经相互作用形成凝胶基质，所述骨诱导因子通过与肝素的结合被包埋 于该凝胶基质中。载体形成的具体过程如下纤维蛋白原在凝血酶的作用下裂 解为纤维蛋白单体，纤维蛋白单体多聚化，形成凝胶网络结构；另一方面仅III 因子在凝血酶的作用下裂解为具有活性的DCIII因子(factor XIIIa),活性FXIII 因子在Ca^的作用下，凭借其谷氨酰胺转移酶的活性，使纤维蛋白单体彼此共 价交联形成稳定网络结构。纤维结合蛋白分子有许多各种底物粘附位点，底物 包括纤维蛋白、肝素、胶原和整合素等。在纤维结合蛋白分子氨基端的谷氨酰 胺残基是活化DQII因子的谷氨酰胺转移位点，通过此位点把纤维结合蛋白分子 和各种其他蛋白分子共价相交联，这包括纤维蛋白、纤维蛋白原以及纤维结合 蛋白分子自身。肝素与纤维结合蛋白有高度亲和性，而肝素又能直接与BMP-2 结合，因此通过肝素能将BMP-2包入载体中(见附图1),并且所述肝素有助于 保持BMP-2的活性，在肝素存在条件下，BMP-2的降解受到抑制，在培养液中 其半衰期可延长20倍。在本发明中，所述纤维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为1~10:1;所述纤 维结合蛋白与肝素的摩尔比为1~10:1;所述骨形态发生蛋白与肝素的质量比为 1:1~50。所述纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白原的比例关系为每lmg纤维蛋白原对应0.3 ~ 1.2 IU的纤维蛋白稳定因子。
本发明的骨诱导材料模拟组织修复早期临时基质形成而构建，纤维蛋白原、 纤维结合蛋白和肝素是组织修复早期临时基质的主要成分，也代表组织修复早 期临时基质的结构，DQII因子是形成这种组织修复早期临时基质所必需的。纤 维蛋白原、纤维结合蛋白和肝素在起始组织修复过程中发挥重要作用。纤维蛋 白原和纤维结合蛋白所形成的三维支架结构为细胞粘附和迁移进损伤位点提供
了暂时的基质。这种支架结构在细胞侵入期间通过高度局限的蛋白水解性降解 而得到重塑。侵入细胞的表面有纤溶酶原激活物的受体，当受体与纤溶酶原激 活物结合时，会在该处细胞表面激活纤溶酶原，产生纤溶酶，从而降解纤维蛋 白。这种作用方式可以把纤溶酶原的激活高度局限化，导致局限性纤维水解， 而不是整块基质降解。支架结构所结合的肝素借助静电力作用把rhBMP-2牢固 包埋在基质当中。肝素酶能使肝素结合的rhBMP-2从基质释放。研究已证明纤 维蛋白凝胶基质经修饰含有肝素结合位点，能够以主动方式而不是被动方式释 放肝素结合的rhBMP-2。这种主动释放有赖于细胞介导的纤溶酶和肝素酶的作 用。
实施例1
rhBMP-2 i爰释系统在应用时临时制备，由下述三种组分依次混合而成。组 分I是rhBMP-2冻干粉；组分II是含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和 XIII因子的溶液，PH9.0,其中，纤维蛋白原在组分II中的浓度为120mg/ml， 所述纤维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为10:1,所述纤维结合蛋白与肝素的 摩尔比为10:1，在组分II中，每lmg纤维蛋白原对应加入1.2 IU的XIII因子； 组分III是含有凝血酶和氯化钧的溶液，PH9.0,所述凝血酶在组分m中的浓度 为800IU/ml，所述CaCl2在组分IH中的浓度为45umol/ml。在制备时，将组分 II加入组分I，并置于37。C水浴中溶解15分钟，以充分溶解rhBMP-2冻干粉， 该rhBMP-2与肝素的质量比为1:50，然后再加入组分III，快速摇匀，放入培养 箱，在37。C、 5%<:02的条件下，孵育1~2小时，以形成凝胶。当用于治疗单 节段脊柱退行性病变或骨缺损时，将该包含rhBMP-2的凝胶基质载体取出放入 推间融合器当中，进行植入；对于非节段骨缺损，可直接将包含rhBMP-2的凝 胶基质载体放入缺损处；对于节段骨缺损，包含rhBMP-2的凝胶基质载体先放入组织引导再生膜当中，再植入骨缺损处，外加内固定。
实施例2
rhBMP-2緩释系统在应用时临时制备，由下述三种组分依次混合而成。组 分I是rhBMP-2冻千粉；组分II是含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和 Xin因子的溶液，PH8.5,其中，纤维蛋白原在组分II中的浓度为60mg/ml，所 述纤维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为5:1,所述纤维结合蛋白与肝素的摩尔 比为5:1 ，在组分II中，每lmg纤维蛋白原对应加入0.65 IU的XIII因子；组分 III是含有凝血酶和氯化钓的溶液，PH8.6，所述凝血酶在组分III中的浓度为450 IU /ml,所述CaCl2在组分III中的浓度为40umol/ml。在制备时，将组分II加入 组分I，并置于35 °C水浴中溶解25分钟，以充分溶解rhBMP-2冻干粉，该rhBMP-2 与肝素的质量比为1:25，然后再加入组分m,快速摇匀，放入培养箱，在37。C、 5%<:02的条件下，孵育1 2小时，以形成凝胶。当用于治疗单节段脊柱退行性 病变或骨缺损时，将该包含rhBMP-2的凝胶基质栽体取出放入推间融合器，进 行植入；对于非节段骨缺损，可直接将包含rhBMP-2的凝胶基质载体it/v缺损 处；对于节段骨缺损，包含rhBMP-2的凝胶基质载体先放入组织引导再生膜当 中，再植入骨缺损处，外加内固定。
实施例3
rhBMP-2 H释系统在应用时临时制备，由下述三种组分依次混合而成。组 分I是rhBMP-2冻干粉；组分II是含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和 XIII因子的溶液，PH6.8,其中，纤维蛋白原在组分II中的浓度为4mg/ml,所 述纤维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为1:1,所述纤维结合蛋白与肝素的摩尔 比为1:1,在组分II中，每lmg纤维蛋白原对应加入0.3 IU的XIII因子；组分 III是含有凝血酶和氯化钙的溶液,PH6.9,所述凝血酶在组分III中的浓度为40 IU /ml,所述CaCl2在组分in中的浓度为35umol/ml。在制备时，将组分II加入组 分I,并置于33。C水浴中溶解30分钟，以充分溶解rhBMP-2冻干粉，该rhBMP-2 与肝素的质量比为1:1，然后再加入组分m,快速摇匀，放入培养箱，在37。C、 5%(302的条件下，孵育1 2小时，以形成凝胶。当用于治疗单节段脊柱退行性 病变或骨缺损时，将该包含rhBMP-2的凝胶基质载体取出放入推间融合器，进 行植入；对于非节段骨缺损，可直接将包含rhBMP-2的凝胶基质载体放入缺损处；对于节段骨缺损，包含rhBMP-2的凝月組质载体先放入组织引导再生膜当 中，再植入骨缺损处，外加内固定。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可按上述实施例的相同步骤，用于治疗 骨缺损、皮肤等软组织缺损。
实施例4
rhBMP-2緩释系统在应用时临时制备，由下述三种组分依次混合而成。组分 I是rhBMP-2冻干粉；组分II是含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和XIII 因子的溶液，PH8.0，其中，纤维蛋白原在组分II中的浓度为90mg/ml，所述纤 维蛋白原与纤维结合蛋白的摩尔比为5:1,所述纤维结合蛋白与肝素的摩尔比为 3:1,在组分II中，每lmg纤维蛋白原对应加入1.0 IU的XIII因子；组分III是 含有凝血酶和氯化钩的溶液，PH8.0,所述凝血酶在组分III中的浓度为40 IU /ml, 所述CaCl2在组分III中的浓度为40umol/ml。在制备时，将组分II加入组分I， 并置于33 °C水浴中溶解30分钟，以充分溶解rhBMP-2冻干粉，该rhBMP-2与 肝素的质量比为1:3，然后再加入组分III，快速摇匀，放入培养箱，在37。C、 5。/。C02的条件下，孵育1 2小时，以形成凝胶。当用于修复大鼠颅骨临界缺损 时，将该包含rhBMP-2的凝胶基质载体取出进行植入。同时还设立三个对照组， 分别是组I空白对照；组II纤维蛋白月交加rhBMP-2，缺纤维结合蛋白和肝素， 其余与实验组相同；组III纤维蛋白/纤维结合蛋白胶体加rhBMP-2，缺肝素， 其余与实验组相同。实验结果，实验组好于对照组；对照组中，组III最好，组 II次之。都具有统计学意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若千变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
权利要求
1.一种骨诱导材料，包括骨诱导因子和载体，其特征在于，所述骨诱导因子包含骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，所述载体主要由纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素、纤维蛋白稳定因子、凝血酶及氯化钙经相互作用形成凝胶基质，所述骨诱导因子通过与肝素的结合被包埋于该凝胶基质中。
2. 根据权利要求1所述的骨诱导材料，其特征在于，所述纤维蛋白原与纤维结 合蛋白的摩尔比为1~10:1。
3. 根据权利要求1所述的骨诱导材料，其特征在于，所述纤维结合蛋白与肝素 的摩尔比为1 ~ 10:1。
4. 根据权利要求1所述的骨诱导材料，其特征在于，所述骨诱导因子为骨形态 发生蛋白，该蛋白与肝素的质量比为1: 1~50。
5. 根据权利要求1或4所述的骨诱导材料，其特征在于，所述骨形态发生蛋白 是从动物骨中提取的天然骨形态发生蛋白或是用基因工程方法生产的重组 骨形态发生蛋白。
6. 根据权利要求1所述的骨诱导材料，其特征在于，所述纤维蛋白稳定因子与 纤维蛋白原的比例关系为每lmg纤维蛋白原对应0.3 ~ 1.2 IU的纤维蛋白 稳定因子。
7. —种骨诱导材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1) 将包含骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子的骨诱导因子作为 组分I，配制含有纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素和纤维蛋白稳定因 子的溶液作为组分II;(2) 配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分m;(3) 将组分II加入组分I，以溶解诱导因子；(4) 将组分III加入组分II和I的混合溶液，以形成骨诱导因子緩释系统。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(l)的组分I为骨形 态发生蛋白。
9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(l)的纤维蛋白原 在组分II中的浓度为4 ~ 120mg/ml。
10. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的凝血酶在组 分III中的浓度为40 ~ 800 IU /ml，所述氯化钓在组分III中的浓度为35 ~ 45umol/ml。
11. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述组分n和in的PH值为6.8 ~ 9。
12. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所迷步骤(3)中将组分II加 入组分I之后，在33。C 37。C水浴中放置15~30分钟。
13. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中将组分III加 入组分II和I的混合溶液之后，放入培养箱孵育1 ~ 2小时。
14. 权利要求1所述的骨诱导材料在骨移植中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种骨诱导材料，包括骨诱导因子和载体，所述骨诱导因子包含骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，所述载体主要由纤维蛋白原、纤维结合蛋白、肝素、纤维蛋白稳定因子、凝血酶及氯化钙经相互作用形成凝胶基质，骨诱导因子通过与肝素的结合被包埋于该凝胶基质中。本发明还公开了骨诱导材料的制备方法及应用。本发明的骨诱导材料，能微量、高效和平稳地缓释骨形态发生蛋白，并显著提高骨形态发生蛋白的生物活性。
文档编号A61L27/26GK101249278SQ20081006586
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者刘伟强, 强 敖, 韩大庆 申请人:深圳清华大学研究院