专利名称：海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因以及海鞘抗菌肽的应用。
技术背景抗菌肽(antimicrobial p印tides)是一类具有抗菌活性的天然 小分子蛋白。自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一 个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在昆虫、两栖类、水产动物， 以及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现 了至少900余种抗菌肽。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成，在机体 抵抗病原入侵方面起着重要的作用，是机体非特异性免疫的重要组成 部分。抗菌肽的抗性谱十分广泛。大多数对细菌尤其对耐药性细菌有较 强的杀灭作用，有些则对某些真菌、原生动物也有杀灭作用。近年研 究还发现，某些抗菌肽还能选择杀伤肿瘤细胞,抑制HBV、 HIV的复制， 从而引起了人们更大的关注。抗菌肽的作用机理特殊，目前流行的观 点是首先，带正电荷的抗菌肽分子与带负电荷的靶细胞膜相接触, 随后通过靶细胞膜所产生的电动势将形成疏水面的抗菌肽二聚体注 入细胞膜，最后多个二聚体或多聚体在一起形成跨膜的离子通道，从而扰乱细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量严重下降，最终使靶细胞死亡。抗菌肽的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。 这一特殊作用机理使微生物不易对其产生抗性。海鞘是一种海洋无脊椎动物，属于脊索动物门，作为古老的原索 动物又处于无脊椎动物和脊椎动物之间。海鞘类是研究脊椎动物先天 性免疫进化的极好的材料，由于海鞘类缺乏在更高级的脊椎动物中存在的免疫球蛋白和T细胞受体而依赖于先天性免疫系统，因此它们的 血细胞在宿主防御中有着重要的作用。近年来，从海鞘的血细胞中提 取了许多的抗菌肽。目前，人们已经从海鞘中发现了多种抗菌肽。根据海鞘抗菌肽一 级结构的不同可分为三大类型。(l)线形螺旋结构的两性抗菌肽分子， 包括Clavanins， styelins， clavaspirin; (2)含有DOPA残基的抗菌 肽分子，包括plicatamide， haloxyamine; (3)含有二硫键的抗菌肽 分子，包括halocidin禾卩dycynthaurin等。Lee等从柄海鞘CS"^eZ3chra)的血细胞中分离出一组由4个a -螺旋抗菌肽组成的家族Clavanins A， B， C，和D。此后又从柄海鞘 咽组织构建的c DNA文库中筛选出 一 种新的C1 avan i n s家族成员 Clavanin E。通过研究表明Clavanins A-E是富含组氨酸，包含23个残 基，C末端酰胺化的抗菌肽。对Clavanins的抗菌活性研究发现它们和其他抗菌肽一样在非常 低的浓度下表现出快速的杀菌效率。在5分钟的孵化后，1.6ug/ml的Clavanin A使E. coli ML-35P的数量减少了一半；同时发现Clavanin C/D的杀菌能力比Clavanin A/B大致要高3 5倍。之后研究表明它们 对其他几种革兰氏阳性和阴性细菌均有显著的抗菌作用，并对几种真 菌如Ca^j'c朋s有抑制效果。在低pH(p^5.5)和高盐(300mmol/L NaCl)条件下对其中的几种微生物仍保持相当的活性。 发明内容本发明的第一个目的在于提供一种海鞘抗菌肽及其前体肽。 本发明的第二个目的在于提供本发明海鞘抗菌肽的编码基因。 本发明的第三个目的在于将本发明的海鞘抗菌肽应用于制备抗 病菌类产品。本发明所选择的海鞘属于中国南海食虫性柄海鞘(S0^/a ， 采自中国南海西沙群岛。本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海柄海鞘咽组织中克 隆得到抗菌肽Clavanin家族成员。中国南海海鞘咽组织cDNA文库的构建首先分离海鞘咽组织， 提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取 cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平 板上挑取单克隆保种。本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到8条EST序列 编码中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin家族成员，申请人将之命名为海 鞘抗菌肽Clavanin H，海鞘抗菌肽Clavanin H为成熟肽，由23个氨 基酸组成，分子量为2.71千道尔顿，海鞘抗菌肽Clavanin H具有典型的抗菌肽一级结构的特征，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，具体如下Val Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe 15 10 15Val His Gly Phe Ser His Val Phe 20该成熟肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96.5%， MALDI-TOF鉴定其分子量正确。本发明的海鞘抗菌肽，为如下(a)或(b)或(c)或(d)所述 的多肽(a) 具有序列表中SEQ ID NO: 3所述的氨基酸序列，即海鞘抗 菌肽Clavanin H;(b) (a)所述氨基酸序列的保守性变异多肽；(c) (a)所述氨基酸序列的活性衍生物；(d) 将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。上述(c)所述海鞘抗菌肽，优选海鞘抗菌肽Clavanin H的C末端酰胺化修饰物。本发明的海鞘抗菌肽可以是通过化学合成、基因重组表达获得的 产物。本发明的海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽，其氨基酸序列如序列 表中SEQ ID NO: 2所示，具体如下Met Lys Thr Thr lie Leu lie Leu Leu lie Leu Gly Leu Gly lie 15 10 15Asn Ala Lys Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Lys Val 20 25 30Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val35 40 45His Gly Phe Ser His Val Phe Gly Asp Asp Gin Gin Asp Asn Gly50 55 60Lys Phe Tyr Gly His Tyr Ala Glu Asp Asn Gly Lys His Trp Tyr65 70 75Asp Thr Gly Asp Gin80编码海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽的多核苷酸序列如序列表 中SEQ ID N0:1所示，具体如下atgaaaacaa caattttgat tcttctcata ctgggacttg gcatcaatgc aaaatctctg 60 gaggaaag朋aatcggagga agagaaagta ttccgctacc ttggcaaaat tattcatcat 120 gttggcaatt ttgtacatgg ttttagccac gtgttcggcg acgaccaaca agataatgga 180 aagttttatg gccactacgc agaagacaat ggcaagcatt ggtatgatac cggggatcaa 240 taa 243本发明的多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a) 编码海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽的多核苷酸；(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。本发明的多核苷酸，优选具有序列表中SEQ ID NO'.l所述的核苷酸序列的多核苷酸。本发明获得的中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯化的Clavanin H在50nM时即能抑制部分致病细菌和真菌。因此，本发明的海鞘抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括词料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
图1是中国南海海鞘咽组织cDNA文库的EST序列长度分布统计图。图2是本发明的中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H的分子筛分 离图谱；图3为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H分子筛分离后阴离子 交换分离图；图4为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H阴离子分离后HPLC分 离图；图5为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H纯化后MALDI-T0F鉴 定图。图6为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病 菌生长实验的实验结果。
具体实施方式
实施例一中国南海海鞘咽组织cDNA文库的构建及EST序列分析总RNA的提取和cDNA合成分离中国南海海鞘咽组织，参照GibcoBRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。文库构建采 用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit试齐!j盒，并利用试剂盒本身附带的引物、载体、限制性内切酶等进行实验。取 1 ii g海鞘咽组织总RNA以SMART III寡聚核苷酸片断 (5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3，)和CDSIII/3， PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)加N—iN-3，)进行逆 转录合成第一链，得到10tU cDNA第一链产物。海鞘咽组织cDNA文库的构建和鉴定取cDNA 1. 5^1用于连接反 应，反应体系5pl，转化其中1^1，取5ul转化液分别涂板，取300ul 转化液用于摇总库菌落。隔日记数平板的单菌落数分别为805， 695 和1052个。因此双链cDNA7ul可获得的cDNA文库克隆数为 (805+695+1052) *1050*7*5/3*5*1. 5=4. 170*106 (个)。随机挑取46 个单克隆，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物PCR扩增，结 果显示，重组率超过98% (45/46)，大部分的插入片段大于500bp (41/46)，平均插入片段长度为700bp。从平板上随机挑取六板单克隆 摇菌、保种、提取质粒、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX 在线同源比对，SEQT00L、 ClustalX 1.83程序分析测序结果。测序 结果显示柄海鞘平均插入片段长度为544bp。以上结果显示本申请人构建的海鞘咽组织cDNA文库在文库重组 子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。从 图1中可见在500-600bp， 700-800bp和800_900bp处存在高丰度的 EST序列，而本发明所克隆的南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的EST 序列长度正位于500-600bp之间。实施例二海鞘抗菌基因Clavanin H序列的测定和分析南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的序列来自实施例一中国南海海鞘咽组织cDNA文库中所克隆到的8条高度同源的EST序列，海鞘 抗菌基因Clavanin H属于高表达基因，约占所有EST序列的4%，以 5号板D12号克隆为例对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA用工具软件SEQTOOL对其碱基序列进行分析， 并获得其最大开放读码框，长度240bp (不包含终止密码子)，编码 80个氨基酸残基的前体肽，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1 所述，80个氨基酸残基的前体肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所述。进一步分析显示，该前体肽的第l-29位氨基酸残基为其 信号肽区域，其第29位残基为赖氨酸，可认为是标准蛋白质水解信 号，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开，故确定Clavanin H成熟 肽的氨基酸序列为VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF，即序列表中SEQ ID N0:3所述的氨基酸序列。由于Clavanin H前体肽中信号肽区和成熟 肽区与所有已经报道的抗菌肽Clavanin家族有明显的相似性，故海 鞘抗菌肽Clavanin H为新的Clavanin家族成员。实施例三海鞘抗菌肽Clavanin H的分离纯化取海鞘咽组织，剪碎后用50mmol/L Tris-Cl， pH8. 6+100mmol/L NaCl萃取，用G25Fine (i. d2. 6*100cm)分离，以萃取缓冲液洗脱， 280nm检测，可见四个紫外吸收峰如图2所示；收集第2峰上Q S印harose fast flow分离，NaCl梯度洗脱，获得5个洗脱峰如图3 所示。收集第1峰上C18反相柱分离，乙腈梯度洗脱，收集保留时间 为45. 7min的峰如图4所示。分离纯化的海鞘抗菌Clavanin H，经 飞行时间质谱分析，分子量为2. 71千道尔顿如图5所示。这与根据 所克隆的基因推测的表达序列VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF的理论分 子量2. 71千道尔顿一致。实施例四海鞘抗菌肽基因Clavanin H的重组表达本实验釆用组氨酸缺陷型毕赤酵母GS115作为宿主菌，采用分泌性表达载体pPICZaA构建重组表达系统。选择SacI内切酶线性化重组 载体pPICZctA，然后将带有相应酶切位点的抗菌肽Clavanin H基因通 过T4 DNA连接酶与线性化载体连接，再将其转化到大肠杆菌DH5a中， 利用Zeocin抗性的低盐LB平板筛选阳性转化子。挑单菌落接种培养， 抽提质粒进行酶切验证和测序。制备毕赤酵母菌株GS115的感受态细胞。取80ml感受态细胞与10 ugSacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，进行电击转化.30'C温 育l h后，将菌液涂在含有100ug/ml Zeocin抗生素的YPD固体培养基 平板上.30°C恒温培养2 4天，筛选出阳性菌落。同时，将Sacl线性 化的pPICZaA空白质粒转化酵母GS115菌株作为空白对照。将鉴定得到的阳性重组酵母菌分别加入到10ml YPDA培养基中， 在3(TC恒温培养，进而利用甲醇作为诱导物，对重组目的蛋白 Clavanin H进行诱导表达，并经超滤和阳离子交换层析纯化。实施例五海鞘抗菌肽Clavanin H的抑菌活性实验海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病菌实验。试验中选择乳室发炎肿大、皮肤发红、温热、乳汁排出不畅、稀薄带黄色并混 有絮状物和凝乳块等表现明显奶牛乳房炎症状的奶牛乳汁。实验组为 5ml上述奶牛乳汁与浓度为0. 5mg/ml的海鞘抗菌肽Clavanin H等体积震荡混合30分钟，对照组为5ml上述奶牛乳汁与灭菌生理盐水等 体积震荡混合30分钟。将上述混合溶液分别涂布到LB固体培养基上， 观察奶牛乳房炎致病菌生长情况。从图6中可以看出，加入有抗菌肽 的奶牛乳汁中，乳房炎致病菌没有生长(左侧平板)，而对照组(右 侧平板)则有大量乳房炎致病菌生长。说明抗菌肽有杀灭乳房炎致病 菌的作用。本发明的海鞘抗菌肽Clavanin H能抑制部分致病细菌和真菌。 因此，本发明的海鞘抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，如饲料添 加剂、兽药、防腐剂、抗菌药物等。序列表<110〉深圳市圣西马生物技术有限公司〈120〉海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用〈160〉 3〈170〉 Patentln version 3.1<210> 1 <211〉 243 〈212〉 DNA〈213>中国南海柄海鞘 〈400> 1atgaaaacaa caattttgat gaggaaagaa aatcggagga gttggcaatt ttgtacatgg aagttttatg gccactacgc taa(Styela clava)tcttctcata ctgggacttg agagaaagta ttccgctacc ttttagccac gtgttcggcg agaagacaat ggcaagcattgcatcaatgc aaaatctctg 60 ttggcaaaat tattcatcat 120 acgaccaaca agataatgga 180 ggtatgatac cggggatcaa 240243〈210> 2〈211〉 80〈212〉 PRT〈213〉 中国南海柄海鞘(Styela clava)<400〉 2Met Lys Thr Thr lie Leu lie Leu Leu lie Leu Gly Leu Gly lie Asn1015Ala Lys Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Lys Val Phe Arg202530Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val His Gly Phe354045Ser His Val Phe Gly Asp Asp Gin Gin Asp Asn Gly Lys Phe Tyr Gly505560His Tyr Ala Glu Asp Asn Gly Lys His Trp Tyr Asp Thr Gly Asp Gin65707580〈210> 3 <211> 23 <212> PRT<213> 中国南海柄海鞘(Styela clava) 〈400> 3Val Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val 15 10 15His Gly Phe Ser His Val Phe 20
权利要求
1.一种海鞘抗菌肽，为如下(a)或(b)或(c)或(d)所述的多肽(a)具有序列表中SEQ ID NO3所述的氨基酸序列；(b)(a)所述氨基酸序列的保守性变异多肽；(c)(a)所述氨基酸序列的活性衍生物；(d)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。
2. 根据权利要求1所述的海鞘抗菌肽，其特征在于为(a) 所述多肽的c末端酰胺化修饰物。
3. —种海鞘抗菌肽的前体肽，具有序列表中seq id n0:2所述 的氨基酸序列；
4. 一种多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a) 编码权利要求3所述多肽的多核苷酸；(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
5. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于具有序列表 中seq id n0:1所述的核苷酸序列。
6. 权利要求1或2所述的海鞘抗菌肽在制备抗病菌类产品上的 应用，所述抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂和医药产品。
全文摘要
本发明为一种海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用。本发明的海鞘抗菌肽为海鞘抗菌肽Clavanin H，或其保守性变异多肽，或其活性衍生物，或经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的海鞘抗菌肽Clavanin H衍生的多肽。本发明的海鞘抗菌肽的前体肽具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。本发明的海鞘抗菌肽应用于制备抗病菌类产品，如饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
文档编号A61K38/17GK101250222SQ20081006576
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者李永新, 皮灿辉, 苏向东, 黄毓茂 申请人:深圳市圣西马生物技术有限公司