专利名称：嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法
技术领域：
本发明专利涉及一种嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法，获得嗅干细胞分化后
的成熟神经细胞，用于中枢神经系统病变或损害细胞移植临床治疗。
背景技术：
已有报道进行了不同干细胞的体外诱导分化研究，尝试在体外诱导分化后进行细胞移植，
但嗅干细胞的诱导分化研究尚少见报道。
发明内容
为了克服中枢神经系统病变或损害细胞移植等临床治疗上的难题，本发明专利提供了一 种嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法。本方法为嗅神经干细胞的诱导方法，获得嗅 干细胞分化后的成熟神经细胞，使人胚嗅干细胞应用于中枢神经系统损伤的移植临床治疗成 为可能。
本发明专利解决其技术问题所采用的技术方案是体外分离培养人胚嗅鞘细胞并收集培 养上清液，建立人胚嗅粘膜神经干细胞，获得稳定传代的嗅干细胞后，将干细胞培养基更换 为嗅鞘细胞培养上清，同时设定干细胞培养基组、无血清组和半量嗅鞘细胞上清组。五天后 固定细胞，用巢蛋白(Nestin)、微管蛋白(Tubulin)、微管相关蛋白(MAP2)、神经胶质 酸性蛋白(GFAP)多种抗体作免疫细胞荧光染色，对阳性细胞进行形态学鉴定。
本发明专利的有益效果是，为嗅神经干细胞的诱导方法，在体外诱导分化后获得嗅干细 胞分化后的成熟神经细胞，使人胚嗅干细胞应用于中枢神经系统损伤的移植临床治疗成为可 能。
具体实施例方式
(一) 收集妇产科流产和引产的无明显发育障碍的胎儿，分别分离、获取嗅鞘细胞和原代嗅神 经干细胞。
(二) 试剂培养基(DMEM/F12)，细胞因子(B27)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细 胞生长因子(FGF)，谷氨酰胺，胶原蛋白酶。
(三) 沿死亡胎儿眉弓上开颅，移去脑组织，暴露前颅底，取下嗅球见筛板、鸡冠，于筛板周 边切开颅底骨板向鼻腔方向切取两侧鼻腔外侧壁的上、中鼻甲及相对应的鼻中隔中上部 分，取下标本放入培养基中清洗数遍以洗去嗅黏膜上的血液，剪碎后加入少量的基础培 养基，用弯头吸管将剪碎的组织移入15毫升离心管中，力t!5毫升基础培养基，用粗弯头吸 管上下吹打使之成为组织悬液，离心5min 1000转弃上清；如此重复2次，加入胶原蛋白酶0.5ug /ml用吸管吹匀，放入3'C水浴锅中，消化15min后用吸管轻轻吹打静置lmin吸出 上清，加入(含10%胎牛血清)培养基的离心管中，如此重复3次基本可以将组织消化为 单细胞悬液，将消化终止后的悬液收集一起离心，D/F12清洗3次，用内含表皮生长因子 的条件培养基传代培养至少20次以上。
(四) 将多次收集的嗅鞘细胞培养基进行0.22 P m纤维素膜过滤除菌后替换嗅神经干细胞培养 基观察至第5天并进行免疫荧光染色分析。
(五) 光镜下前三天观察细胞与对照组无明显变化，第4天和第5天可见细胞突起增多、增殖减 慢。免疫荧光染色观察GFAP染色阳性细胞比例明显增加，巢蛋白、微管蛋白阳性细胞降 低。
权利要求
1.一种嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法。其特征是观察嗅鞘细胞培养上清液对嗅干细胞诱导作用，获得嗅干细胞分化后的成熟神经细胞，用于中枢神经系统病变或损害细胞移植临床治疗。
2. 根据权利要求l所述的嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法。其特征是体外分离 培养人胚嗅鞘细胞并收集培养上清液，建立人胚嗅粘膜神经干细胞，获得稳定传代的嗅干 细胞后，将干细胞培养基更换为嗅鞘细胞培养上清，同时设定干细胞培养基组、无血清组和半量嗅鞘细胞上清组。五天后固定细胞，用Nestiii (巢蛋白)、Tubulin (微管蛋白)、 MAP2 (微管相关蛋白)、GFAP (神经胶质酸性蛋白)多种抗体作免疫细胞荧光染色， 对阳性细胞进行形态学鉴定。
3. 根据权利要求l所述的嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法。其特征是用于中枢 神经系统病变或损害细胞移植临床治疗。
全文摘要
一种嗅鞘细胞培养上清液诱导嗅干细胞分化方法，收集妇产科流产和引产的无明显发育障碍的胎儿，分别分离、获取嗅鞘细胞和原代嗅神经干细胞。在体外诱导分化后使人胚嗅干细胞应用于中枢神经系统损伤的移植临床治疗成为可能。
文档编号A61K35/48GK101591641SQ200810110779
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者包建玲, 张秀东, 王洪美, 黄红云 申请人:北京市虹天济神经科学研究院