专利名称：一种长效蛋白质药物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。具体地讲，本发明公布了一种制备长效蛋白质药物的方法， 利用该方法可以对药物蛋白质进行改造，提高其体内的半衰期，延长其体内疗效。
背景技术：
重组蛋白质药物是目前最主要的一类生物技术药物，与小分子化学药物相比，重组蛋白 质药物具有特异性强、副作用小、疗效好等优点，但是蛋白质类药物的缺点也是显而易见的。 蛋白质药物易失活、给药途径单一、体内的半衰期短，对于外源性蛋白质药物，还存在抗原 性的问题。作为生物大分子，每种蛋白质都有其独特的高级结构，蛋白质药物的活性依赖于 其正确的高级结构，任何影响其高级结构的理化因素都可能导致蛋白质药物活性的降低或丧 失，因此，蛋白质药物对存储条件要求较高， 一般为4'C或低温保存。在使用方面，蛋白质药 物还存在着给药途径少、半衰期短等缺点。蛋白质药物一般不能通过口服给药，只能通过皮 下或静脉注射给药，通过皮下或静脉注射而进入体内的蛋白质药物不可避免地会受到体内蛋 白酶的攻击而降解，从而失去活性。另外，作为药物的蛋白质一般分子量相对较小，容易被 肾小球滤过，导致血液中有效药物浓度降低。正是由于这些原因，使得蛋白质药物的体内半 衰期较短，刚给药后，蛋白质药物浓度一过性增高，之后很快降低到有效浓度以下，临床上 为了使血液中蛋白质药物浓度达到有效治疗浓度，必须反复给药，从而导致用药成本增加、 副作用增大、病人的依从性差等问题。为了提高蛋白质药物的生物利用度和疗效，临床上急 需稳定、长效的蛋白质药物。
目前提高蛋白质药物的半衰期和疗效的途径主要有构建更稳定的突变体蛋白、聚乙二醇 修饰和与血清白蛋白融合等。聚乙二醇修饰的蛋白质药物具有很多优点，主要有蛋白质药物 的分子量增加，被肾小球过滤的几率减小，在体内的半衰期延长；由于聚乙二醇的屏蔽作用 使蛋白质免疫原性降低，被蛋白酶降解的几率减小；聚乙二醇化的水解使得蛋白质药物活性 得到恢复，起到类似缓释的作用，从而长时间维持有效的血药浓度。但是蛋白质药物的聚乙 二醇修饰也存在着明显的不足，主要是聚乙二醇的使用导致生产成本增加，聚乙二醇的屏蔽 作用导致蛋白质的活性降低，聚乙二醇修饰的不均一性导致产品质控困难，回收率低，进一 步增加了生产成本。因此，有必要开发新的长效蛋白质药物制备方法。本发明的目的就是建 立一种新的长效蛋白质药物制备方法，可以对蛋白质药物进行长效改造。
发明内容
本发明公开了一种长效蛋白质药物制备方法，该方法的特点是将具有抗体Fc段结合活性 的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接，从而使药物蛋白质在体内具有抗体Fc段结合活性， 改造后的药物蛋白质在体内能够与抗体的Fc段结合，形成大分子复合体，从而增加其半衰期， 维持更持久的体内活性。这种连接了具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)的药物蛋白 质就是一种长效蛋白质药物。
将具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接可以采取生物学方法，也可以采取化学偶联法。
生物学方法的步骤包括构建药物蛋白质和具有抗体FC段结合活性的小肽(或蛋白质) 的融合基因，将融合基因通过酶切、连接方法，或同源重组等方法克隆到表达载体中。用构 建好的融合基因表达载体转化宿主细胞，通过宿主细胞表达融合蛋白并进行分离纯化。该融
合蛋白即为长效蛋白质药物。其中，融合基因的构建可以采用SOE(Gene splicing by over lap extension)法，也可以采用SDL(Gene splicing by directed ligation)法或PCR法。
SOE法构建融合基因实际上是通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接的，基本步 骤为
1、 为药物蛋白质基因(基因I )设计上、下游引物primed和primer2，为具有抗体Fe 段结合活性的小肽或蛋白质基因(基因II)设计上、下游primer3和primer4，其中primerl 和primer4为常规引物，而primer2的3'端序列为基因I常规引物，其5'端序列则为基因II正 义链5'末端互补序列。同理，primer3的3'端序列为基因II的常规引物，其5'端序列则为基 因I反义链5'末端互补序列。
2、 将基因I、 II分别进行PCR扩增，产物分别为基因I的正义链A、反义链B，基因II 的正义链C、反义链D。
3、 将两种PCR产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对形成杂交链。
4、 在DNA聚合酶I作用下，A和D链互为引物和模板，合成出包含基因I和基因II的 融合基因。
SDL法构建融合基因的基本步骤为
1、 为药物蛋白质基因(基因I )设计上、下游引物primerl和primer2，为具有抗体Fc 段结合活性的小肽或蛋白质基因(基因n)设计上、下游primer3和primer4，其中primerl 和primer4为常规引物，而primer2的3'端序列为基因I常规引物，5'端序列则包含一种限制 性内切酶A的酶切位点；同理，primer3的3'端序列为基因II的常规引物，5'端序列则包含 一种限制性内切酶B的酶切位点。而限制性内切酶A和B切割靶序列后形成的粘性末端应互 补。
2、 将基因I、 II分别进行PCR扩增，回收扩增产物。将基因I扩增产物用限制性内切酶 A酶切，将基因II扩增产物用限制性内切酶B酶切。
3、 将酶切后的两种基因纯化、回收，然后在DNA连接酶的作用下将基因I和基因II通 过其互补的粘性末端相连接，形成融合基因。
PCR方法构建融合基因
通过PCR构建融合基因的方法主要适用于将药物蛋白质基因与小肽基因融合。由于小肽 基因小，可以将小肽基因序列设计到PCR引物中。通过PCR扩增药物蛋白质基因时，小肽 基因就被融合到药物蛋白质基因的上游或下游，从而得到药物蛋白质与小肽的融合基因。
将具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白质相连接的另外一种方法就是化学偶联法。其基本步骤为将^W白J^和具有抗体，C殺结合活性的小肽(或蛋白质)按 照一定的比例(摩尔比为l: 1~1: 20)振荡混匀，边搅拌边逐滴加入偶联剂。加毕，再搅拌 5 10min，然后在室温下继续反应2 3h。之后，采用层析技术将偶联了小肽的药物蛋白质 和未偶联小肽的药物蛋白质分开，偶联了小肽的药物蛋白质即为长效蛋白质药物。
利用化学偶联法制备长效蛋白质药物时，应根据具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白 质)的性质选用不同的偶联剂。常用作偶联剂的有碳化二亚胺类、戊二醛、二异氰酸化合物 和二卤化二硝基苯等。这些偶联剂使具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)与药物蛋白 质在-COOH、 -\112或-811等基团部位发生结合。
在本发明的实施例中，提供了一种通过生物学方法制备长效人粒细胞集落刺激因子的步 骤，具体包括采用两步PCR方法构建hG-CSF与小肽VETWKTSRISIF的融合基因，将该 融合基因用五coR I和5a附H I双酶切后连接到pBV220表达载体中，转化大肠杆菌DH5a， 选取序列正确的克隆诱导表达hG-CSF-小肽融合蛋白，采用阴离子交换柱和分子筛层析等纯 化方法将hG-CSF-小肽融合蛋白进行纯化。
用本方法制备的长效人粒细胞集落剌激因子保留了原有生物学活性，作用时间明显延长， 可有效避免聚乙二醇修饰带来的生产成本增加、蛋白质的活性降低、产品质控困难，回收率 低等缺点。
图l.hG-CSFtagl融合基因的构建
图2. pBV-G-CSFtagl表达载体的酶切鉴定
1: DL2000 marker; 2: DL15000 marker; 3: pBV-G-CSFtagl重组质粒酶切图谱；
图3 hG-CSF和hG-CSFtagl的诱导表达 1: hG-CSFtagl的诱导表达； 2: hG-CSF的诱导表达； M:蛋白质分子量标准；
图4 hG-CSF和hG-CSFtagl对NFS-60细胞的增殖刺激作用
图5正常小鼠给予hG-CSF和hG-CSFtagl后血液白细胞数量的变化
图6小鼠化疗后给予hG-CSF和hG-CSFtagl后血液中白细胞数量恢复情况
具体实施例方式
以下实施例用于详细说明本发明及其效果，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这 些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 但所作的类似的改动或修改同样落在本申请权利要求书所限定的范围之内。
实施例l长效人G-CSF表达载体的构建
根据文献报道，选用与人、鼠IgG Fc段具有结合活性的多肽序列VETWKTSRISIF。按 照hG-CSF基因序列设计特异性引物，之后通过PCR扩增，使此多肽编码序列与hG-CSF基因形成融合基因，再将融合基因克隆承r原,达载体彿V'2i (5中。设计的PCR引物序列为 上游引物F: 5'-ATAGAATTCATGACACCATTAGGCTCTG-3'(五coRI) 下游引物Rl: 5'- AATGCGGCTGGTTTTCCAGGTTTCCACGGGCTGGGCAAGGTG -3' 下游引物R2:5'- ATTGGATCCTTAAAAAATGCTAATGCGGCTGGTTTTCCAG -3' (5awH
I)
具体步骤如下
融合基因的获得以携带hG-CSF基因的pBV220-G-CSF表达载体为模板，以上游引物F 和下游引物R1进行第一次PCR，回收第一次PCR产物，以回收的PCR产物为模板，再以上 游引物F和下游引物R2进行第二次PCR扩增，回收第二次PCR产物，即hG-CSFtagl融合 基因(图1)。将第二次PCR产物和pBV220表达载体分别用BamH I和￡coR I进行双酶切， 用回收试剂盒回收酶切产物，将双酶切后的PCR产物和pBV220表达载体用T4DNA连接酶 在16'C水浴中连接过夜。将连接产物转化大肠肝菌DH5a感受态细胞，在LB-Amp平板上筛 选阳性克隆，扩增并提取质粒，用5amH I和五coR I进行双酶切鉴定(图2)，将重组质粒 送北京奥科生物技术有限公司进行测序鉴定，重组质粒命名为pBV-hG-CSFtagl。测序结果表 明，hG-CSF基因和VETWKTSRISIF小肽的编码基因融合为一个基因，序列完全正确。
实施例2: hG-CSFtagl的诱导表达
将序列正确的pBV-hG-CSFtagl质粒转化DH5a宿主菌，铺LB Amp+平板，在该平板上长 出的克隆即为阳性克隆。挑取阳性克隆，37'C培养过夜。次日，将工程菌接入LBAmp+液体 培养基，在30。C摇床上培养至菌体密度OD6QQ达到0.4~0.6，然后转入42。C摇床诱导表达4 小时，取菌体进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，hG-CSFtagl的表达量占菌体总蛋白的30% (图 3) 。 hG-CSF在同样条件下诱导表达。
实施例3:包涵体的制备及裂解
菌体收集和包涵体制备4'C， 6000rpm离心8min，收集hG-CSFtagl工程菌菌体沉淀，置 于-2(TC冰箱中保存。次日，将在-20'C保存的菌体在室温下解冻后，置于冰浴中超声处理， 条件为电流350mA,脉冲20sxl0次(每次间隔ls)，然后将超声后的菌体于12 000 rpm， 4'C离心 15min，收集沉淀即包涵体。
包涵体的洗涤将包涵体分别用20 mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)、 1M NaCl、lmM EDTA、 0.1% TritonX-100分别进行洗涤，之后12000rpm、 4°C离心15min，收集沉淀。然后再将沉 淀用2M尿素洗涤一次，之后离心收集沉淀即包涵体。
包涵体的裂解将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml含1%巯基乙醇的8M 尿素(溶解于20mMTris-HCl)的比例将包涵体裂解过夜。次日，将裂解液在室温下10000rpm 离心15min，收集裂解上清。
实施例4: hG-CSFtagl的纯化与复性
准备4.0cmxl00cm层析柱，装入Sephacryl S-100至90cm，然后，用20mM Tris-HCl ，8M (pH8.0)尿素溶液平衡。平衡完毕，将包涵体按柱体积的3%上样，进行分子筛层析，收集 目的蛋白峰。以牛血清白蛋白为标准测蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用20mMTris-HCl ,8M (pH8.0)尿素溶液顿璺蛋白浓度至，4004eO^g/'ml，然后用含有lmM氧化型谷 胱甘肽和lmM还原型谷胱甘肽的20mM Tris-HCl(pH8.0)稀释4倍，使蛋白终浓度在100pg/ml 左右，4'C条件下放置过夜。次日，将复性蛋白溶液对20mM Tris-HCl (pH8.0)缓冲液充分 透析，用于后续纯化。
准备一支2.6cmx20cm层析柱，装入DEAE Sepharose Fast Flow凝胶，柱高15cm，之后 用20mM Tris-HCl (pH8.0)平衡。将复性的蛋白上样于已平衡的DEAE柱中，上样完毕， 用20mMTris-Ha (pH8.0)洗至基线。之后，用含0.15M NaCl的20mM Tris-HCl (pH8.0) 洗脱目的蛋白峰，收集洗脱峰。将收集的目的蛋白峰用lOmM乙酸-乙酸钠(pH4.0)透析3 次，此即为纯化后的hG-CSFtagl蛋白。
实施例5: hG-CSFtagl的体外活性测定
用MTT法，采用G-CSF依赖细胞株NFS-60细胞测定G-CSF和hG-CSFtagl的活性。 将NFS-60细胞在含有10ng /ml的G-CSF和10%牛马血清的1640培养液中培养至数量 合适后，收集细胞，之后，用RPMI-1640培养液洗3遍，以去除培养液中残存的G-CSF。然 后，用含10%胎牛血清的培养液将NFS-60配成细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔 板，每孔体积100pl。分组为G-CSF组，hG-CSFtagl和不加G-CSF的阴性对照组。将各组细 胞在5%(202、 37'C培养箱中培养3天。检测前4小时每孔加入5mg/ml的MTT溶液(pH7.4 PBS的配制)20pl。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加15(Hil DMSO, 振荡IO分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收 值，记录结果。结果表明，hG-CSF和hG-CSFtagl均能维持NFS-60细胞的存活与增殖， hG-CSFtagl的活性比hG-CSF的活性略低(图4)，这可能与两种蛋白质定量差异或复性效 率不同造成的，也可能小肽标签对G-CSF的活性有些微的影响。
实施例6: hG-CSFtagl的体内长效性测定1
将实验小鼠按照随机均衡的原则分为二组，每组6只，分别是G-CSF组和hG-CSFtagl 组。给药方案为，第O天给予G-CSF和hG-CSFtagl,按照lmg/kg给药，给药1次。然后， 每天进行白细胞计数，观察各组动物白细胞数量的变化情况(图5)。
从图5可以看出，首先，hG-CSF和hG-CSFtagl在给药后在第3天开始，两组动物的白 细胞数都有了较大幅度的提高，而且，hG-CSF组提升的更快，最先达到峰值，而hG-CSFtagl 组的白细胞升离是平稳的。说明在动员骨髓干细胞产生粒细胞方面，hG-CSF可能起效更快。 但是hG-CSF-tagl能够平稳升高粒细胞，说明hG-CSF-tagl在体内能够维持相对稳定的药物 浓度，对于刺激粒细胞产生的作用是温和并且持续的；在达到最高值之后，在下降速度方面， hG-CSF组下降很快，于第一峰值后第3天降低到最低值，但是hG-CSF-tagl组于峰值第4天 才降到最低值，并且粒细胞数量的降低是缓慢而平稳的，这在一定程度上说明，rhG-CSF-tagl 在动物体内的代谢是缓慢的、平稳的，有一定的缓释作用。
实施例7: hG-CSFtagl的体内长效性测定2
将实验小鼠按照随机均衡的原则，分为三组，每组5只，分别是醋酸氨缓冲液对照组， hG-CSF组和hG-CSFtagl组。给药方案为，第O天给予环磷酰氨，剂量为200mg/kg，给药一次。1， 2， 3天分别进行白细胞itf^在第》夭，*^组,—别给予醋酸氨缓冲液(HAc)、hG-CSF、 hG-CSFtagl，按照lmg/kg给药，给药1次。然后，每天进行白细胞计数，观察各组动物白细 胞数量恢复情况(图6)。
由图6看出，hG-CSF组和hG-CSFtagl组，在给药后第1天白细胞数目就有了显著的提 高，并且在持续的几天内， 一直在增高，这说明hG-CSF和hG-CSFtagl对升高白细胞是非常 有效的。
由hG-CSF组和hG-CSFtagl组的对比可以看出，hG-CSFtagl组小鼠的白细胞在第10天 还维持较高水平，而hG-CSF组小鼠的白细胞已经降低到HAc模型对照组水平。
hG-CSF组在建模后第11天白细胞降至最低值，之后逐渐恢复到正常值。而hG-CSFtagl 组，白细胞一直在升高，第ll天达到最高值，之后4天仍使白细胞数目维持在较高水平上， 比hG-CSF的疗效至少长5天。
总体分析，hG-CSFtagl的药效长达10天，而hG-CSF组的药效仅为5天，hG-CSFtagl 的药效是hG-CSF组的近2倍。
权利要求
1、一种长效蛋白质药物，其特征为在药物蛋白质上连有一段小肽(或蛋白质)，该段小肽(或蛋白质)具有抗体Fc段结合活性。
2、 如权利要求1所述的长效蛋白质药物，其特征为在人粒细胞集落刺激因子的C末端连接 有一段具抗体Fc段结合活性的小肽VETWKTSRISIF。
3、 如权利要求l所述长效蛋白质药物的制备方法，其特征为将药物蛋白质与具有抗体Fc段 结合活性的小肽(或蛋白质)相连接，形成偶联蛋白。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征为所用连接方法为生物学方法，步骤包括-(1) 构建药物蛋白质和具有抗体Fc段结合活性的小肽(或蛋白质)的融合基因；(2) 将融合基因通过酶切、连接方法，或同源重组等方法克隆到表达载体中；(3) 用构建好的融合基因表达载体转化宿主细胞；(4) 选取序列正确的阳性克隆诱导表达融合蛋白；(5) 分离纯化融合蛋白。
5、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征为融合基因的构建采用SOE(Gene splicing by over lap extension)法、SDL(Gene splicing by directed ligation)、法或PCR 、法。
6、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征为所用连接方法为化学偶联法，步骤包括(1) 将药物蛋白质和具有抗体FC段结合活性的小肽(或蛋白质)按照摩尔比l: 1 1: 20振荡 混匀，边搅拌边逐滴加入偶联剂；(2) 加毕，再搅拌5 10min，然后在室温下继续反应2 3h;(3) 采用层析技术将偶联了小肽的药物蛋白质和未偶联小肽的药物蛋白质分离。
7、 根据权利要求6所述的制备方法，其特征为所用偶联剂选自碳化二亚胺类、戊二醛、二异 氰酸化合物或二卤化二硝基苯。
全文摘要
本发明公开了一种制备长效蛋白质药物及其制备方法，属于生物技术领域。具体地讲，本发明是通过对蛋白质药物进行改造，使之具有结合抗体Fc段的活性。改造后的蛋白质药物在血液中能够结合抗体的Fc段，从而与抗体形成大分子复合体，提高其体内的半衰期。由于半衰期的延长，改造后的蛋白质药物具有更持久的体内活性。
文档编号A61K47/48GK101623501SQ200810132699
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月9日 优先权日2008年7月9日
发明者傅一鸣, 王清明, 范国才, 陈吉中 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所