专利名称：Hgf制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有HGF ( Hepatic Growth Factor、肝细胞生长因子)的制剂。
背景技术：
HGF为由中村等人发现的、对成熟肝细胞具有最强的生长促进活性的 生理活性肽(例如，参照非专利文献l)，近年来可以通过生物工程技术实 现量产(例如，参照非专利文献2)。对该HGF期待不仅作为对于肝炎、 肝硬化的治疗或预防药，还期待对于肾炎、癌症等的治疗或预防药，此外还 期待适用于抗癌剂的副作用抑制剂、创伤愈合剂等。作为HGF的制剂，专利文献1中公开了在HGF中作为稳定剂含有白蛋 白、人血清、明胶、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等的水溶液制剂。但是， 上述HGF水溶液制剂在保存中存在HGF凝聚、混浊、进行凝胶化的缺点， 此外还存在形成聚合物等物理化学稳定性低、生物活性降低的问题。为了解决该问题，专利文献2中公开了在HGF中作为稳定剂含有精氨 酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等的冷冻干燥 制剂。此外，专利文献3中公开了在HGF中作为稳定剂含有甘氨酸、丙氨 酸、山梨糖醇、甘露糖醇、硫酸葡聚糖等的冷冻干燥制剂。上述冷冻干燥制剂可以在一定程度上达到HGF的稳定化，但是期待稳 定化效果更好的HGF制剂。专利文献l:国际公开WO卯/10651号小册子专利文献2:国际公开WO00/72873号小册子专利文献3:日本特开平9-25241号公报非专利文献1: Biochem. Biophys. Res. Commun., 122， 1450, 1984 非专利文献2: Nature, 342, 440, 1989发明内容本发明的目的在于，提供与现有的HGF制剂相比，即使长期保存也更 稳定的HGF制剂。本发明人为了解决上述课题进行了深入研究结果发现，通过向HGF中 添加蔗糖，阻碍HGF的聚合物生成，得到稳定的HGF制剂，基于此发现进 一步进行研究，至此完成了本发明。即，本发明涉及，[I] HGF制剂，含有HGF和蔗糖，[2]根据上述[1]中所述的HGF制剂，其中，相对于1重量份的HGF,蔗糖的含量为0.01 ~ 9重量份，[3]根据上述[1]或[2]中所述的HGF制剂，其中，进一步含有中性氨基酸， [4]根据上述[3]中所述的HGF制剂，其中，中性氨基酸为丙氨酸， [5]根据上述[1] [4]中的任意一项所述的HGF制剂，其中，进一步含有緩冲剂，[6]根据上述[5]中所述的HGF制剂，其中，緩冲剂为柠檬酸盐， [7]根据上述[1]~ [6]中的任意一项所述的HGF制剂，其中，进一步含有 氯化钠，[8]根据上述[1]或[2]中所述的HGF制剂，其中，除了 HGF和蔗糖之外， 进一步含有中性氨基酸、氯化钠、緩冲剂和表面活性剂，[9]根据上述[8]中所述的HGF制剂，其中，中性氨基酸为丙氨酸，緩冲 剂为柠檬酸盐，表面活性剂为聚山梨醇酯，[10]根据上述[1]~ [9]中的任意一项所述的HGF制剂，其为冷冻干燥制剂，[II] HGF的稳定化方法，其特征在于，向HGF中添加蔗糖抑制HGF聚合物生成，以及[12]根据上述[11]中所述的稳定化方法，其中，相对于1重量份的HGF， 蔗糖的添加量为0.01 ~ 9重量份。本发明的HGF制剂具有即使长期保存，也比现有的HGF制剂更稳定的 效果。
具体实施方式
本发明为含有HGF和蔗糖而成的HGF制剂。本发明的有效成分HGF若为^1纯化成可以作为药物使用的程度，则可 以使用通过各种方法制备的HGF。此外，本发明中使用的HGF还可以为5 个氨基酸残基缺失的缺失型(dLeHGF)。作为HGF的制备方法，已知有各种方法，例如，可以从大鼠、牛、马、绵羊等哺乳动物的肝脏、脾脏、肺脏、骨髓、脑、肾脏、胎盘等脏器，血小 板、白血球等血细胞，或血浆、血清等中抽提、纯化来得到。此外，也可以对产生HGF的原代培养细胞、林化细胞进行培养，从培养物(培养上清、 培养细胞等)分离纯化，得到HGF。或者，通过基因工程方法，将编码HGF 的基因整合到适当的载体中，将其插入到适当的宿主中进行转化，可以从该 转化体的培养物得到目标重组HGF (例如，参照Nature, 342, 440, 1989等)。 对于上述宿主细胞不特别限定，可以使用一直以来在基因工程方法中使用的 各种宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、丝状菌、植物或动物细胞 等。更具体地说，作为从生物体组织抽提纯化HGF的方法，例如向大鼠腹 腔内给予四氯化碳，摘除形成肝炎状态的大鼠的肝脏，进行粉碎，通过S-琼脂糖或肝素琼脂糖等的凝胶柱色谱、HPLC等通常的蛋白质纯化法来进行 纯化。此外，可以使用基因重组法，通过将对人HGF的氨基酸序列进行编 码的基因整合到牛乳头瘤病毒DNA等载体中的表达载体，对例如中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞、小鼠C127细胞、猴COS细胞等动物细胞进行转化，由其培养上清得到。对于本发明的蔗糖，将收录在第十五次修改的日本药典中的蔗糖作为稳定剂来适当地使用。相对于1重量份的HGF,蔗糖的添加量优选为0.01 ~9 重量份、特别优选为0.1 5重量份的范围，但下限的更优选的值为0.5重量 份，上限的更优选的值为4重量份、进一步优选的值为3重量份、特别优选 的值为2重量份。本发明的制剂可以采用各种剂型(例如，液体制剂、固体制剂、胶嚢剂、 乳膏剂、喷雾剂等)，优选为通常仅用有效成分HGF和蔗糖或者是它们与 惯用的添加物(载体等) 一起形成水溶性制剂、冷冻干燥制剂等，特别优选 为冷冻干燥制剂。本发明的HGF制剂可以通过形成含有HGF和蔗糖的水溶液来制备水溶 液制剂，此外，可以通过通常的冷冻干燥方法对该水溶液进行冷冻干燥，制 备HGF冷冻干燥制剂。上述水溶液中的蔗糖的含量为0.1重量％以上、优选 为0.5重量％以上，且为9重量％以下、优选为5重量°/。以下、更优选为4 重量％以下、进一步优选为3重量％以下、特别优选为2重量％以下。冷冻 干燥制剂中的蔗糖的含量优选为10~80重量％，特别优选为20~60重量％。 例如，对于冷冻干燥制剂，使HGF溶解在适当的溶剂(例如，灭菌水、注 射用蒸馏水、緩冲液、生理盐水等)中后，以优选为0.1~5重量％、特别优 选为0.5~2重量％的方式添加蔗糖，根据需要加入蔗糖以外的稳定剂、緩冲 剂、表面活性剂、氯化钠等，用过滤器等过滤并进行灭菌，注入到小玻璃瓶 或安瓿中进行冷冻干燥。过滤器优选使用孔径0.22pm以下的灭菌用过滤器。 作为灭菌用过滤器，可以举出例如亍、、-，水7 (注册商标、日本(卩水7株 式会社制)或廿VL卜求7 2 (注册商标、if》卜'J々义林式会社制)等。作 为冷冻干燥方法，可以举出例如通过三单元操作、即在常压下进行冷却冷冻 的冷冻过程、在减压下将不受溶质限制的自由水升华干燥的一次干燥过程、 除去溶质固有的吸附水、结晶水的二次干燥过程而进行的方法。冷冻过程的 冷却温度优选为-60°C ~ - 40°C ， 一次干燥过程的温度优选为-50°C ~ 0°C ，6而且二次干燥过程的温度优选为4°C ~40°C。真空压力优选为0.1Pa~ L5Pa, 特別优选为0.5Pa~ 1.2Pa。冷冻干燥后，恢复干燥库内的压力。作为恢复压 力的方法，优选为将无菌的空气或惰性气体(例如，无菌氮气、无菌氦气等) 送入到库内， 一次恢复压力至约70kPa 100kPa、优选约80kPa ~ 95kPa,接 着恢复压力(二次恢复压力)至大气压的方法。小玻璃瓶的封盖优选在一次 恢复压力后进行。稳定剂可以仅使用蔗糖，但是也可以与蔗糖一起适当地使用作为现有的 稳定剂的甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸等氨基酸，肝素、硫酸 葡聚糖等多糖类，山梨糖醇、甘露糖醇等糖醇等。其中，优选为氨基酸，特 别优选为氨基酸中的甘氨酸、丙氨酸等中性氨基酸。对于这些蔗糖以外的稳 定剂的添加量不特别限制，例如，对于使用甘氨酸、丙氨酸等中性氨基酸时 的添加量，相对于蔗糖1重量份，优选为0.01 ~ 50重量份、更优选为0.1~ 20重量份。作为稳定剂，与蔗糖一起并用中性氨基酸等现有的稳定剂，从而与仅使 用蔗糖的情况相比可以进 一 步提高稳定性。作为本发明中使用的緩冲剂，可以举出例如磷酸緩沖液、柠檬酸緩冲液 等。緩沖剂具有调整再溶解后的水溶液的pH、保持HGF的溶解性的作用。 緩冲剂优选再溶解后的水溶液的pH为4.5 ~ 6.5的緩冲剂。作为优选的緩冲 剂，可以举出柠檬酸緩冲液，特别优选的緩沖剂可以举出柠檬酸钠緩冲液。 该柠檬酸緩冲液还有助于再溶解后的水溶液中的HGF的稳定化。对于緩冲 剂的添加量，优选为使制备冷冻干燥制剂时的即将冷冻干燥前的水溶液中的 浓度为1 ~ 100mM的范围。作为本发明中使用的表面活性剂，可以举出例如聚山梨醇酯20、聚山 梨醇酯80、普流罗尼F-68、聚乙二醇等，还可以并用两种以上。特别优选 的表面活性剂为聚山梨醇酯类表面活性剂，尤其优选为聚山梨醇酯80。由 于HGF易吸附到作为容器材质的玻璃或树脂等中，通过添加这种表面活性 剂，可以防止再溶解后的HGF对容器的吸附。对于表面活性剂的添加量，优选为制备冷冻干燥剂时的即将冷冻干燥前的水溶液中的浓度为0.001-2.0 重量％的范围。氯化钠具有保持HGF的溶解性的作用。即，例如在实施例中使用的重 组HGF的情况下，随着氯化钠的添加重组HGF的溶解度提高，特别是 300mM以上时溶解性显著提高。氯化钠的添加量虽然受到渗透压力比的限 制，但可以为表现出通常使用的注射剂的渗透压力比的量。特別优选形成为 作为医用或动物药用注射剂的渗透压力比所容许的渗透压力比1~3的量。 通常，制备冷冻干燥制剂时的即将冷冻干燥前的水溶液中的氯化钠浓度优选 为150~ 1000mM。在本发明中，还可以含有制剂化所需的其它的添加剂，例如助溶剂、抗 氧化剂、无痛剂、等渗剂等。如上得到的本发明的制剂、例如冷冻干燥制剂，可以在使用时以HGF 浓度0.1 40mg/ml的方式溶解在注射用蒸馏水中，用作注射液。进一步地， 还可以作为含有冷冻干燥制剂的乳膏剂、喷雾剂等外用剂。实施例以下利用实施例对本发明进行说明，但是本发明不净皮这些实施例所限 定。而且，在本实施例中，作为HGF使用5个氨基酸缺失型HGF。 HGF的 聚合物的面积百分率(％)(以下，称为聚合物含量(％))使用通过高效 液相色i普(HPLC)定量的值，由下述式1求得。式1聚合物含量(％) = ^^^x100AM+AA式中，AM表示HGF峰面积，AA表示聚合物峰面积。 (HPLC条件)色谱柱凝胶过滤色谱柱(商品名Superdex 200 10/300、 7 7弋厶"4才廿4工^久社制)流动相将58.44g氯化钠、2.94g柠檬酸三钠二水合物、O.lg聚山梨醇酯80溶解在水中，形成1L的液体作为A液。将58.44g氯化钠、2.10g种檬 酸一水合物、O.lg聚山梨醇酯80溶解在水中，形成1L的溶液作为B液。 向A液中加入B液，将pH调整至6.0后，用0.45pm的过滤器(商品名 Millcup-HV、孔径0.45nm、 ； ！J求7社制)过滤，使用前进行脱气。在室 温下保存，2周以内使用。柱温25 °C流量0.5ml/分钟才羊品液注入量25pL分析时间60分钟检测器吸光光度计冲全测波长280nm取样冷却器5分钟对于分子量标记，向1个凝月交过滤标准(目录号151-1901、 Bio-Rad 公司制)小玻璃瓶中加入500|iL水，使其溶解，用少量试液调整用过滤器(商 品名Ultrafree-MC、孔径0.45nm、 S卩求7社制)过滤，在2。C 8。C下 保存，3个月以内使用。此外，下述实施例和试验例中使用的稀释用緩沖液如下制备。 (稀释用緩冲液的制备)将1.1688g氯化钠、2.94g柠檬酸三钠二水合物、0.3g聚山梨醇酯80溶 解在超纯水中，形成总量1L液体作为A液。将1.1688g氯化钠、2.10g柠檬 酸一水合物、0.3g聚山梨醇酯80溶解在超纯水(使用超纯水制备装置(商 品名MilliQ Gradient、；、卩水7社制)制备，以下相同)中，形成总量1L 液体作为B液。向A液中加入B液，将pH调整至6.0，形成稀释用緩冲液 ")。将17.53g氯化钠、2.94g柠檬酸三钠二水合物、O.lg聚山梨醇酯80溶 解在超纯水中，形成总量1L液体作为C液。将17.53g氯化钠、2.10g柠檬 酸一水合物、O.lg聚山梨醇酯80溶解在超纯水中，形成总量1L液体作为D液。向C液中加入D液，将pH调整至6.0，形成稀释用緩冲液(2)。 [实施例1]向稀释用緩冲液(1 )中以成为10mg/mL的方式添加5个氨基酸缺失型 HGF(以下，仅称为HGF),以成为0.5重量％浓度的方式添加蔗糖，由此得到下述表1的组成的溶液。 [表l]成分浓度HGF1 Omg/ml柠檬酸三钠二水合物10mM氯化钠300mM聚山梨醇酯800.03重量％蔗糖0.5重量％将得到的上述溶液每2mL无菌地分注到小玻璃瓶(())23x43mm)中。用 橡胶塞半封盖小玻璃瓶，排列在托盘上，放入冷冻干燥机(卜'J才T只夕一； 共和真空技术抹式会社制)，在下述表2记载的条件下实施冷冻干燥。而且， 表中的-表示使温度变化。[表2]冷冻过程一次干燥过程二次干燥过程温度(。c )10— - 50-50- 50— - 20-20-20 — 2020真空度(Pa)—-1111时间65833.5811冷冻干燥结束后，向卜IJ才T7夕一库内送入无菌氮气，恢复压力(库内压力88.0kPa; —次恢复压力)，全封盖橡胶塞后用无菌氮气将卜！i才 7只夕一库内压力恢复至大气压(二次恢复压力)，取出小玻璃瓶后，快速 用盖子密封小玻璃瓶。如此得到本发明的HGF冷冻干燥制剂。本HGF冷冻干燥制剂中的蔗糖的含量，相对于1重量份的HGF为0.5 重量份，相对于HGF冷冻干燥制剂为26.3重量％。 [实施例2]对于蔗糖的添加浓度为1.0重量％，除此之外与实施例1同样地进行，得到HGF冷冻干燥制剂。对于本HGF冷冻干燥制剂中的蔗糖的含量，相对于1重量份的HGF为 1重量份，相对于HGF冷冻干燥制剂为41.7重量％。[实施例3]蔗糖的添加浓度为2.0重量％，除此之外与实施例1同样地进行，得到 HGF冷冻干燥制剂。对于本HGF冷冻干燥制剂中的蔗糖的含量，相对于1重量份的HGF为 2重量份，相对于HGF冷冻干燥制剂为58.8重量％。[实施例4]蔗糖的添加浓度为1.0重量％，而且以5mg/mL的浓度添加丙氨酸，除 此之外与实施例1同样地进行，得到HGF冷冻干燥制剂。对于本HGF冷冻干燥制剂中的蔗糖的含量，相对于1重量份的HGF为 1重量份，相对于HGF冷冻干燥制剂为34.5重量％。[比较例1]添加剂以20mg/mL的浓度添加丙氨酸来替代蔗糖，除此之外与实施例 1同样地进行，得到HGF冷冻干燥制剂。 [比较例2]不添加蔗糖，除此之外与实施例1同样地(以下，称为基本处方)进行， 得到HGF冷冻干燥制剂。 [试验例1]将上述实施例和比较例记载的冷冻干燥制剂保存在5(TC下，1周后取 样，用稀释用緩冲液(2)稀释以使蛋白质浓度为5mg/mL,使用HPLC定 量后，由上述式1算出聚合物含量(％)。其结果如下述表3所示。[表3]添加剂(浓度)聚合物含量(％)实施例No蔗糖丙氨酸冷冻干 燥前保存开始 时(最初)50。C-1周实施例1+ (0.5重量％)—0.470.611.90实施例2+ ( 1.0重量％)—0.480.581.29实施例3+ (2.0重量％)_0.480.560.92实施例4+ ( 1.0重量％)+ ( 5mg/mL )0.440.560.90比库交例1一+ ( 20mg/mL )0.500.632.32比4交例2—-0.550.846.12由表3可知，向基本处方中添加了蔗糖或者蔗糖与丙氨酸的本发明的 HGF制剂与基本处方或者向基本处方中添加了丙氨酸的HGF制剂相比，聚,. 合物含量显著得到抑制。[试验例2]向稀释用緩冲液(20mM柠檬酸緩冲液、1M氯化钠、0.01重量°/。聚山 梨醇酯80)中以成为10mg/mL的方式添加HGF,以0重量％浓度、1重量 %浓度、5重量％浓度、10重量％浓度或20重量％浓度添加蔗糖制备样品溶 液1 ~ 5各50pL。各样品溶液直至供于测定冷冻了约24小时。将冷冻的各 样品溶液再熔解，通过动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS )法测 定HGF的分子量(约84kDa)分布。测定装置使用蛋白质溶液专用的 Protein-Solution公司制Dyna-Pro。测定温度设定为4°C。本底(background) 使用不含有HGF的稀释用緩冲液(各50pL)。各样品溶液中的HGF的分 子量的多分散度(Pd%)表示在表4。[表4]HGF ( mg/mL )蔗糖(重量％)Pd%样品溶液110022.8样品溶液210121.7样品溶液310513.6样品溶液4101032.3样品溶液5102028.512由表4可知，在以1重量％或5重量％添加蔗糖的样品溶液2和样品溶 液3中，Pd。/。值非常小，表示HGF的分子量分布为单分散(单一形态)。 样品溶液l、 4和5中，HGF的分子量分布峰为宽峰，暗示含有具有不同分 子量的物质。此外，样品溶液4和5中，在高分子侧出现另一个峰，在样品 溶液5中，还进一步出现表示含有大量低分子物质的峰。产业上的可利用性根据本发明，可以提供作为药物有用的保存稳定性优异的HGF制剂。
权利要求
1、一种HGF制剂，含有HGF和蔗糖。
2、 根据权利要求1所述的HGF制剂，其中，相对于1重量份的HGF, 蔗糖的含量为0.01 ~ 9重量份。
3、 根据权利要求1或2所述的HGF制剂，其中，进一步含有中性氨基酸。
4、 根据权利要求3所述的HGF制剂，其中，中性氨基酸为丙氨酸。
5、 根据权利要求1 ~4中的任意一项所述的HGF制剂，其中，进一步含有缓冲剂。
6、 根据权利要求5所述的HGF制剂，其中，緩沖剂为柠檬酸盐。
7、 根据权利要求1 ~6中的任意一项所述的HGF制剂，其中，进一步含有氯化钠。
8、 根据权利要求1或2所述的HGF制剂，其中，除了 HGF和蔗糖之 外，进一步含有中性氨基酸、氯化钠、緩冲剂和表面活性剂。
9、 根据权利要求8所述的HGF制剂，其中，中性氨基酸为丙氨酸，緩 沖剂为柠檬酸盐，表面活性剂为聚山梨醇酯。
10、 根据权利要求1 ~9中的任意一项所述的HGF制剂，其为冷冻干燥 制剂。
11、 一种HGF的稳定化方法，其特征在于，向HGF中添加蔗糖抑制 HGF聚合物生成。
12、 根据权利要求11所述的稳定化方法，其中，相对于1重量份的HGF, 蔗^f唐的添加量为0.01 ~ 9重量4分。
全文摘要
本发明提供含有HGF和蔗糖的HGF制剂。本HGF制剂具有即使长期保存也稳定的优点。
文档编号A61K47/26GK101578106SQ20088000164
公开日2009年11月11日 申请日期2008年2月21日 优先权日2007年2月22日
发明者安达喜一, 花田敬吾 申请人:克霖固鲁制药股份有限公司