治疗阿尔茨海默氏病和痴呆的组合物和方法

专利名称：治疗阿尔茨海默氏病和痴呆的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及治疗或预防阿尔茨海默氏病和/或痴呆的方法。更特别地，本发明涉及 含有对阿尔茨海默氏病和/或痴呆的预防和治疗有用的确定化学物质的组合物的给药方 法。
背景技术：
淀粉样蛋白(Ap)是阿尔茨海默氏病("AD")患者大脑中淀粉样蛋白斑的主要成分。 同样的斑也出现在一些路易体痴呆和包涵体肌炎的变异体中，包涵体肌炎是一种肌肉疾 病。A(3还形成了大脑淀粉样血管病中包裹血管的聚合物。
Ap在淀粉样前体蛋白(APP)的连续分裂之后由P分泌酶和Y分泌酶形成。APP 是由转录物合成的一种膜内在蛋白质，所述转录物衍生自由单基因转录的RNA交替拼 接。在翻译之后，各APP可以被a分泌酶或e分泌酶加上Y分泌酶分裂途径处理形成 成熟的糖基化蛋白加上羧端分裂产物。三个主要的转录物APP-695, -751， -770和一个次 要转录物-714编码AP序列。该肽是AD中观测到的斑的主要成分。a分泌酶分裂在包 含部分APP的A(3中发生，这妨碍了 AP的形成。APP的e和后来的Y分裂导致了 A卩 肽和薄膜成分的形成，其小于由a分泌酶分裂所得到的。
APP中常染色体显性的突变引起遗传性早发阿尔茨海默氏病，这很可能是改变 的蛋白酶解加工的结果。总AP水平或AP恥和Ap42 (其中前者在脑血管斑中更富集， 后者在神经斑中更富集)相对浓度的增加牵涉到家族遗传或单个发生的阿尔茨海默氏病 的发病机理。由于更强的疏水性，AP42是大多数肽的淀粉样蛋白源形式，"淀粉样蛋白 假设"，斑是阿尔茨海默氏病的主要病理，这被大多数研究人员接受，但是这决不是最 后的结论。虽然一些带有APP基因和载脂蛋白E基因变异的亲缘关系已经被确定并且表现 出AD,但是大多数的AD病例与年龄有关并且没有确定的起因。据估计，超过10%的 65岁以上的这类人会显现阿尔茨海默氏病。据估计有450万美国人具有AD，国家在照 顾他们上至少花费1000亿美元。

发明内容
本发明的具体实施方式
大致涉及通过给药某种特定化学物质的给药来预防和治 疗哺乳动物的痴呆。某个具体实施方式
涉及阿尔茨海默氏病的治疗和预防，阿尔茨海默 氏病是哺乳动物痴呆的主要的常规原因之一。然而，本发明被用于治疗和预防其他痴呆 的形成，例如血管性痴呆。
具体实施方式
还涉及延缓阿尔茨海默氏病和痴呆症状的发病。
在一个具体实施方式
中，治疗、预防或延缓阿尔梅海默氏病或痴呆症状发病的方
法包括施用药物有效剂量的锌盐和药物有效剂量的环组氨酸脯氨酸(cycIo-His-Pro)。 在某个具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸在同一组合物中给药。在其他具体实施 方式中，锌盐和环组氨酸脯氨酸在不同组合物中给药。
在上述具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸以不同的剂量给药。在一些具体 实施方式中，锌盐和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:100-约100:1。在一些具体实施方 式中，锌盐和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:10-约100:1。在一些具体实施方式
中，锌 盐和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:6-约5:1。在一些具体实施方式
中，锌盐和环组氨 酸脯氨酸的重量比为约l:15-约20:1。在一些具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸 的重量比为约1:30-约4:1。在一些具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸的重量比为 约1:8-约4:1。在一些具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸的重量比为约1:40-约40:1。
上述锌指的是锌阳离子的量。
在某些具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸以引起了哺乳动物中胰岛素降解
酶血清水平增加的量给药。在某些具体实施方式
中，血清水平增加了约0.001%-约0.5%。 在某些具体实施方式
中，血清水平增加了约0.01%-约1%。在某些具体实施方式
中，血 清水平增加了约O. 1%-约5%。在某些具体实施方式
中，血清水平增加了约1%-约10%。 在某些具体实施方式
中，血清水平增加了约1%-约50%。
在某些具体实施方式
中，锌盐和环组氨酸脯氨酸以引起淀粉样蛋白e的血清水平
降低的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，血清水平降低了约0.001%-约0.5%。 在某个具体实施方式
中，血清水平降低了约0.01%-约1%。在某些具体实施方式
中，血
6清水平降低了约0. 1%-约5%。在某些具体实施方式
中，血清水平降低了约1%-约10%。 在某些具体实施方式
中，血清水平降低了约1%-约50%。
在某些具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约4 mg/kg/天的剂量给与哺乳 动物。在一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约1.5mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约4mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约0.4mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约O. l-约2mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约2-约4mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约1-约10 mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约3-约8mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约4-约7mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约7-约10 mg/kg/天 的剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约0丄8 mg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约1-约1.5 mg^g/天的剂量给与哺乳动物。
在上述任何具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸可以以约0.007-约1.4 mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.01-约5mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.01-约2mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约2-约7mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约3-约5mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约7-约10 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.5-约2 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.2-约4mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.8-约3 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约l-约6mg/kg/天的剂量给 与哺乳动物。
在上述任何具体实施方式
中，甲状腺激素或作为甲状腺激素一种形式的甲状腺素 也可以施用于治疗、预防或延缓阿尔茨海默氏病症状的发病。在某些具体实施方式
中， L-甲状腺素以约O.l -约15 pg^g/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.001 -约0.010昭/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.001 -约O.l pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中， L-甲状腺素以约0.05 -约l pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.03 -约0.2 pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.04 -约4 pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲 状腺素以约0.08-约0.5 pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状 腺素以约0.001 -约30 ng/kg/天的剂量给与哺乳动物。
在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素可以在锌盐或环组氨酸脯氨酸不存在时给药 用于治疗、预防或减少阿尔茨海默氏病症状的发病。在这些具体实施方式
中，L-甲状腺 素可以以药物有效剂量施用。在一些具体实施方式
中，该剂量引起淀粉样蛋白P斑的血 清水平的减少。在一些具体实施方式
中，该剂量引起哺乳动物甲状腺素血清水平的增加。 在一些具体实施方式
中，血清水平比哺乳动物原有甲状腺素血清水平增加了约2-300%。 在一些具体实施方式
中，血清水平比哺乳动物原有甲状腺素血清水平增加了约50-250%。 L-甲状腺素可以在相关其他具体实施方式
中在不存在上述任何量的锌或环组氨酸脯氨 酸时给药。
在某些具体实施方式
中，其它甲状腺激素的衍生物可以与锌盐和环组氨酸脯氨酸 一起或者不存在或锌盐和环组氨酸脯氨酸时给药。在一些具体实施方式
中，L-三碘甲腺 原氨酸以药物有效剂量给与哺乳动物以治疗、预防、或延缓阿尔茨海默氏病或痴呆症状 的发病。
附图简要说明
附

图1是图示人神经瘤细胞上T3作用的西部吸印技术。
附图2图示了正常小鼠中APPmRNA表达水平上T4的RT-PCR分析。
附图3图示了附图2RT-PCR分析的相对强度。
附图4是实验中所用huAPP小鼠切半脑的提取物的西部吸印技术。
附图5显示了 huAPP小鼠脑冷冻切片的显微镜影像。A显示了使用单克隆抗体
6E10的AP染色。B显示了海马的硫磺素S染色。C显示了使用苏木精染色剂的在皮层
中的GFAP阳性星细胞。
附图6图示了用T4和代替疗法治疗huAPP(R1.40)小鼠的Ap卯和A|342的减少。 附图7图示了用T4治疗的huAPP小鼠中减少的鼠双微基因2(mdm2)基因表达。附图8图示了使用T3在小鼠的鼠双微基因2 (mdm2)基因第一内含子中pGL3 启动因子表达上的处理效果。
附图9图示了野生型p53对APP构成的负向调控。
附图10图示了用T4处理的huAPP转基因小鼠和对照动物的Morris水迷宫试验结果。
附图11图示了甲状腺激素处理可以阻滞转录因子复合物Smad3、 Smad4、 Spl 与反应元件的结合从而预防APP蛋白的翻译。
附图12图示了 CHP和Zn在huAPP小鼠A(34()和Ap42的溶质和薄膜水平上的作用。
附图13图示了 CHP和Zn在IDE活性上的反应时间和相对效应。
附图14图示了 CHP和Zn处理的huAPP小鼠的可溶的和不溶的A&o和Ap42的减少。
附图15图示了 T4处理的huAPP转基因小鼠和对照动物的Morris水迷宫试验结果。
具体实施例方式
阿尔茨海默氏病(AD)神经病理学通过含有斑的淀粉样蛋白卩(AP)与由神精丝和 高度磷酸化T蛋白组成的神经原纤维缠结而表征。在很多研究中，已经证实AP已经被 证实可引起神经中毒，并且表现出与AD伴随的记忆丧失的开始有很大关系。抛开任何 特殊理论的束缚，推测认为减少AP斑的负载可以减少该疾病相关的病理学的和认知的 困难。A(3水平可以通过一种或多种方法控制，包括，但不限于，调节淀粉样前体蛋白 (APP)的基因表达，调节APP过程以形成AP，和控制或引发Ap分解。
具体实施方式
的某些部分涉及药物组合物在治疗、预防、或延缓哺乳动物AD和 /或痴呆症状的发病上的用途。在一个具体实施方式
中，药物组合物包含以下一种或多种 (1)甲状腺激素或(2)锌盐和环组氨酸脯氨酸(CHP)。该组合物还可以用于治疗、预防、或 延缓代谢病的发病。在此对这些组合物及其给药方法进一步说明。
虽然发明者没有归结到任何一个单独理论，但是我们相信，甲状腺激素对哺乳动 物的处理可以导致APP基因中经由假定负向反应元件对APP基因表达的下调。此外， 我们相信，锌和CHP引起了胰岛素降解酶(IDE)活性的增强，从而引发了Ap降解的 增强。这样的疗法可以单独使用或作为结合疗法用于AD或痴呆的治疗。因此，两种生
9物学安全的治疗策略得以形成，其可以减少Ap的形成，增强A(3在体内的内缘代谢， 和/或改善病人的记忆。
在一些具体实施方式
中，这些药物组合物的成分可以包含于"精制的"形式。所 用术语"精制的"指的是相对于天然获取的形式，例如从前列腺中获取，这些成分是提 纯形式的。精制的成分可以通过浓縮其天然来源成分或通过化学合成的方法获得。因此, 术语"精制的"的使用并不必然暗示这些成分与其他成分之间是完全离开的，或者甚至 基本上是离开的。然而，"精制的"成分在自然状态中相对于其浓縮物是提纯的。
甲状腺激素、锌盐、和/或CHP的组合物的给药方法可以通过任何的方式完成。 在一些具体实施方式
中，其通过服用片剂、硬或软胶囊、粉剂、丸剂、饮剂、或锭剂完 成。合适的口服剂型的制备可以包括，但是不限于，对于本领域技术人员熟知的那些。 用于口服的组合物可以根据任何的方式制备，并且该组合物可以包含一种或多种添加剂 例如甜味剂、风味剂、着色剂、和/或防腐剂以提供药物学上的美观的和可口的药剂。片 剂和胶囊合适的辅料包括惰性稀释剂，例如红花油、卵磷脂、纤维醇、大豆起酥油、明 胶、阿拉伯胶、甘油、氧化肽和大豆油。胶囊的包衣可以是明胶或可溶性聚合物，这是 本领域所公知的。片剂和胶囊适用于根据每日给药疗法口服给药。
此外，所述方法还可以包括以单次剂量或多倍剂量给与组合物。 一些具体实施方 式中还包括以分段的方式给与组合物的成分，或以在其他成分施用前将一种或多种成分 混合并且给与的方式给药。
一种对于治疗、预防或延缓哺乳动物AD或痴呆发病有用的组合物包括甲状腺激 素。如这里所述，"甲状腺激素"是个广义词，其使用时包括但是不限于其常规含义， 并且包括上下文中的L-甲状腺素(T4)和L-三碘甲腺原氨酸。在一个具体实施方式
中， 每个片剂和胶囊(或者其他形式的递送形式)包含L-甲状腺素。L-甲状腺素是3:5,3':5'四 碘甲腺原氨酸(通常縮写为T4)，并且其是甲状腺滤泡细胞分泌的主要激素。在一些具体 实施方式中，甲状腺素以约1-约300 ng/天的剂量给药。在一些具体实施方式
中，甲状 腺素以约l-约100pg/天的剂量给药。在一些具体实施方式
中，甲状腺素以约30-约150 pg/天的剂量给药。在一些具体实施方式
中，甲状腺素以约50-约100ng/天的剂量给药。 在一些具体实施方式
中，甲状腺素以约25-约50pg/天的剂量给药。然而，如这里进一 步所述，精确的剂型和剂量可以改变。在这样的例子中，甲状腺素可以以约0.1-约3.0 jag/kg/天的剂量给药，包括约0.1, 0.2, 0.3， 0.4, 0.5， 0.6， 0.7， 0.8, 0.9， 1, 1.1， 1.2， 1.3， 1.4,1.5， 1.6,1.7,1.8， 1.9， 2， 2.1， 2.2， 2.3， 2.4, 2.5， 2.6,2.7， 2.8,或2.9 p/kg/天。在一些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.1-约15 pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。 在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.001-约0.010 Mig/kg/天的剂量给与哺乳动物。 在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.001-约0.1吗/kg/天的剂量给与哺乳动物。在 某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.05-约lpg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-甲状腺素以约0.03-约0.2 pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具 体实施方式中，L-甲状腺素以约0.04-约4pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实 施方式中，L-甲状腺素以约0.08-约0.5 ng/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施 方式中，L-甲状腺素以约0.001-约30 p^kg沃的剂量给与哺乳动物。
如本领域技术人员所认知的，甲状腺素(T4)可以转化为三碘甲腺原氨酸(T3)， 三碘甲腺原氨酸(T3)是哺乳动物中更具活性的短时起效的形式。在血液中或周缘组织 中，T4通过酶转化作用转化为T3。 T3是更具活性的甲状腺激素形式，并且在不同的 细胞核组织中与有核甲状腺激素受体结合。与具有数天长半衰期的T4相比，T3具有很 短的半衰期(数小时)，并且在一次剂量后更快的从我们血液中消失。因此，T4处理 使得身体可以在需要时以生理学调节的形式将T4转化为T3。
在另一个具体实施方式
中，甲状腺激素可以以三碘甲腺原氨酸(T3)给药以治疗 哺乳动物的AD或痴呆。在一些具体实施方式
中，T3以约0.1-约30pg/天的剂量给药。 在一些具体实施方式
中，T3以约0.5-约20pg/天的剂量给药。在一些具体实施方式
中， T3以约0.8-约10 ng/天的剂量给药。在一些具体实施方式
中，T3以约1-约5 pg/天的 剂量给药。在一些具体实施方式
中，T3以约2-约7pg/天的剂量给药。然而，如这里进 一步所述，精确的剂型和剂量可以改变。在其他具体实施方式
中，T4和T3的组合治疗 比单独T4治疗有更多的优点。
在一些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约0.1-约15 pg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约0.001-约0.010 pg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约0.001-约0.1 pg/kg/ 天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约0.05-约1 Hg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约0.03-约0.2 ^g/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以约 0.04-约4pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨酸以 约0.08-约0.5pg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在某些具体实施方式
中，L-三碘甲腺原氨 酸以约O.OOl-约30 ng/kg/天的剂量给与哺乳动物。在一个进一步的具体实施方式
中，还可以使用增强哺乳动物甲状腺激素血清水平 的药物。T4可以通过身体自然生成并且通过酶的作用转化为T3。因此， 一种处理包括 施用增强哺乳动物T4或T3血清水平的药物。例如，碘的施用可以引起哺乳动物T4产 物的增加。因此，这样的药物可以用来增强哺乳动物甲状腺激素的血清水平。
其他的对于治疗、预防或延缓哺乳动物AD或痴呆发病有用的化学物质包括锌和 环组氨酸脯氨酸。早期的研究已经显示包含锌和环组氨酸脯氨酸的药物组合物对于其他 适应症的治疗有效，如美国专利U.S. 5,834,032和7,144,865中公开的，其公开的内容 在此全部结合以作参考。
如这里所指的，锌的数值代表了锌盐锌成分的大多数或者浓度。本发明有用的锌 盐的例子包括氯化锌和硫酸锌。环组氨酸脯氨酸(这里也称为"CHP")是L-组氨酸和 脯氨酸的环状形式，它刺激肠内锌的输送和细胞内锌的吸收。血浆组氨酸-脯氨酸富含 的糖蛋白包含罕见的组氨酸-脯氨酸串联，并且在血浆中相对比较丰富。这样的糖蛋白 在细胞内锌的转运过程中起到了作用。虽然CHP是促甲状腺激素释放激素(TRH)的代谢 产物，但是CHP可由不同的生物化学源合成，包括组氨酸-脯氨酸富含的糖蛋白。CHP 的摄入降低了鼠和人类的食物摄入。
在上述具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸可以以不同的量给药。在一些具体 实施方式中，锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:100-约100:1。在一些具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:10-约100:1。在一些具体实施方式
中，锌和环 组氨酸脯氨酸的重量比为约l:6-约5:1。在一些具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸 的重量比为约l:15-约20:1。在一些具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为 约l:30-约4:1。在一些具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:8-约4:1。 在一些具体实施方式
中，锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:40-约40:1。上述锌指的 是锌阳离子的量。
在一个具体实施方式
中，组合物可以包含约l-约500mg量的锌离子，优选地约 10-约200 mg，更优选地约20-约100 mg。在一个具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸可 以在相同或者不同组合物中以约0.5-约100mg的量存在，更优选地约10-约50m。在 另一个具体实施方式
中，所施用药物组合物中环组氨酸脯氨酸的量可以为约0.5-约100 mg，更优选地约10-约70mg。
在某些具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约4mg/kg/天的剂量给与哺乳 动物。在一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约1.5mg/kg/天的剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约0.4mg/kg/天的剂量给 与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约O. l-约2mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约2-约4mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约1-约10 mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约3-约8mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约4-约7mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约7-约10 mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约0.01-约0丄8mg/kg/ 天的剂量给与哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，锌盐的锌阳离子以约1-约1.5mg/kg/ 天的剂量给与哺乳动物。
在上述任何具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸可以以约0.007-约1.4 mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.01-约5mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.01-约2mg/kg/天的 剂量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约2-约7mg/kg/天的剂 量给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约3-约5mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约7-约10 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.5-约2mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.2-约4mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约0.8-约3 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。在一些具体实施方式
中，环组氨酸脯氨酸以约l-约6mg/kg/天的剂量给 与哺乳动物。
在一些人类处理的具体实施方式
中，每个片剂或胶囊在除药物学上可接受的辅料 以外优选地含有约1-约200 mg的锌，优选地约5-约50mg的锌，以及约0.5 -约200 mg 的CHP。因此，优选的锌阳离子和CHP的用量比为约l:100-约100:0.5。可以相信的是， 具有这些成分比例的组合物在治疗广泛的哺乳动物方面是有效的。
另一种对治疗、预防或延缓哺乳动物AD或痴呆发病有用的组合物包括1)甲状 腺激素和2)锌和CHP。在一个具体实施方式
中，治疗、预防、或减少哺乳动物AD或 痴呆的方法包括至少每天一次将包含甲状腺激素、锌阳离子和阴离子、以及环组氨酸脯 氨酸的药物组合物给与哺乳动物。然而，甲状腺激素、锌盐、和环组氨酸脯氨酸还可以 以两种或多种组合物给药。在某些具体实施方式
中，甲状腺激素以药物有效剂量给药以
13引起哺乳动物血清水平的增加，并且锌和环组氨酸脯氨酸以药物有效量给药以引起哺乳 动物IDE血清水平的增加。在一些具体实施方式
中，增加的甲状腺激素血清水平是甲状
腺机能正常的。在其他具体实施方式
中，增加的甲状腺激素血清水平是甲状腺机能亢进 的。
对于其他组合物来讲，甲状腺激素、锌、和CHP可以以上述的量给药。在一些
具体实施方式
中，甲状腺激素以约1-约100 pg/天的剂量给与哺乳动物；锌阳离子以约
1-约100 mg /天的剂量给与哺乳动物；以及环组氨酸脯氨酸以约0.5-约50 mg/天的剂量 给与哺乳动物。然而，对于个体治疗，这些值可以根据上面所述的范围而不同。在一些具体实施方式
中，组合疗法可以导致使用量减少。
上述与任何其他具体实施方式
，包括其他方法和组合物，相关的任何量都可以用 于形成使用甲状腺激素、锌盐、和环组氨酸脯氨酸的治疗。
这里所述的药物组合物对于AD和/或痴呆的治疗是有用的。特别地，AD可以通 过给与足以增强记忆的量的组合物被治疗。此外，这里所述的药物组合物对于代谢综合 症的治疗是有用的。
虽然其他与这里所述的那些相似或相当的原料或方法可以用于本发明的实践或 检验，但是现在将对优选的方法和原料进行说明。
伊微叙二z;基湊乙縦微柳置要丝
抛开任何特殊理论的束缚，我们相信，甲状腺激素是二乙基溴乙酰胺的形成所需
的。然而，甚至在看似甲状腺激素正常的患者中，中枢神经系统(CNS)特殊的甲状腺 功能减退与AD临床相关。此外，自身免疫性甲状腺炎和唐氏症(DS)之间存在遗传相 关，同显现AD症状的DS患者的相关性最强。因此，这表现出甲状腺激素和AD神经 病理学的直系亲缘关系。
作为大脑中甲状腺激素激活型的补充，T3,主要通过摄取并且通过脱碘酶2型 (D2)对T4的细胞内脱碘作用生成。脱碘酶3型(D3)催化T4和T3的转化以形成 它们各自的惰性代谢产物，反转T3和T2。细胞外大脑区域的溶质移动到脑脊液(CSF) 中。CSF池中的总T3水平在AD患者中是降低的(AD患者为57.7ng/dL ，正常为148.9)， 而CSF反转T3水平是显著增加的(AD患者为12.6 ng/dL ，正常为6.1)，这表明，AD 大脑中D3活性可能增加了。 TGFP，在AD中是正向调控的，其肯定调节了 D3基因。 因此，由于受损大脑内的甲状腺激素代谢，局部的甲状腺功能减退甚至可能出现在看似 甲状腺机能正常的患者中。此外，反转T3是D2的竞争性抑制剂，而D2则会导致AD
14中大脑活性T3水平的有效降低。因此，全身正常表现的患者中局部甲状腺功能减退可 能会引起AD大脑中Ap斑的增加。
现在出现的是，APP基因中的负向甲状腺激素效应元件可能会存在，并且可以被 用来降低活体内的AP表达。此外，我们注意到，当动物甲状腺机能减退时，APP基因 表达会增加从而超过正常的甲状腺机能水平。由于观察到AD患者中枢祌经系统中局部 的甲状腺机能减退，从而推测通过脱碘酶3型使T4和T3到惰性反转T3和T2的新陈 代谢的增加，这看来AD的可能原因是由于甲状腺激素的负向调控的不足导致的APP 表达的增加。这一推测也被AD脑的高位病理区域中的TGFp水平被提高的事实所强化。 TGFJ3经由Smad被动反应元件活化了脱碘酶3型基因，这导致了增加的酶产物和增加
的T3和T4钝化比例。
根据一些具体实施方式
， 一方面不是试图通过诱导患者体内剧烈的甲状腺机能亢 进以降低A(3水平从而治疗AD，而是通过激素替换将相关CNS甲状腺机能减退恢复到 正常甲状腺机能范围从而将Ap水平恢复到正常或者稍微较低，或稍微较高。任何AP 中所需的减少都将通过这里所述的活化胰岛素降解酶而完成。
甲状腺激素以正向和负向调控基因表达。正向甲状腺反应元件(TREs)比负向 TREs更容易被表征。在激素缺失的正向TRE中，辅阻遏物SMRT和N-CoR通过受体 和间接基础转录水平被补充。结合到受体的甲状腺激素导致了辅阻遏物的分离和共活化 物的联合，这导致了抑制作用的反转和转录作用的活化。负向TREs已经证实被在基因 中编码生长激素、TSHe、PCl，c-myc,乙醇脱氢酶,PC2,脱碘酶1型，和转录因子E2F-1。
已经发现，APP基因第一外显子中的一个元件连结到甲状腺激素受体和视黄醇类 X受体。然而，由于自身原因，该元件在转染测定中不能通过甲状腺激素对指示机构有 负向调控。APP基因通过TGFP正向调控，并且观察到AD患者脑中和脑脊液中TGF卩 水平的增加。TGFP亚型通过丝氨酸-苏氨酸激酶受体TPR-I和TpR-II转导它们的生物 学信号，TpR-I和TPR-II活化Smad转录因子串联。记忆转录的Smad依赖调控通过 转录子辅激活因子和辅抑制子的相互作用被调节。TGF(3处理增加了 Smad3-Smad4-Spl 复合物的形成以及这些转录因子和APP基因反应元件的结合。Smad3和Smad4结合 到APP基因的+54/+74区域，而Spl结合到+75/+96区域。有趣的是，甲状腺激素受 体a(TRq)结合到+75Z+96区域，这表明Spl和TRa的结合位存在重叠。因为Smad3, Smad4，和Spl结合成一个复合物，因此甲状腺激素可以通过妨碍该结合而负向调控 APP基因的表达，从而通过TGFP的诱导正向调控该基因。这可以通过甲状腺激素使甲状腺激素受体4见黄醇类X受体的异源二聚体和APP元件结合的增加从而代替TGFP诱导的Smad和Spl结合而完成。该假设可以轻易地通过转染和胶质体转移测定证明。AD中TGFP的作用可能多少是不能理解的。小鼠的TGFp基因的遗传转移导致该基因的过表达并且显示了很高的斑负载。TGFp和其他细胞因子水平的增加在AD患者中被观测至ij。 TGFP还正向调控脱碘酶3型基因，从而引起T4和T3钝化的增加并且导致甲状腺机能减退。这使AD患者的CSP中观察到的现象得以明确，同时说明了在这些疾病中通过T3对APP负向调控的潜在不足。
在APP上游区域-320和+42之间存在了一个元件，其转染测定中，其通过荧光素酶指示结构给与负向调控(附图9)。 p53蛋白连结到mdm2蛋白，并且通过和mdm2的相互作用被定向降解。我们已经观察到，mdm2基因表达通过甲状腺激素在脑中被负向调控(附图7)。降低mdm2的表达将减少定向的p53降解，因而增强了 p53的稳态水平。这使得可以通过p53增加APP负向调控的量。因此，第二种APP表达负向调控可能的机理是间接地经由甲状腺激素对mdm2基因的作用。这个机理相对容易在激素处理后通过测定鼠脑中游离p53和mdm2复合的p53的水平而确定。
豕溜娜麟虔；魏少^/ *鍾要丝
己经发现的是，含有锌和CHP的药物组合物可以用于治疗、预防、或延缓哺乳动物AD或痴呆的发病。抛开任何现有理论的束缚，我们相信，锌和CHP的结合引起了增强的降解AP以及胰岛素的胰岛素降解酶(IDE)的活化作用。
一种用于AD或痴呆的特别药物治疗包括施用药物有效剂量的锌和环组氨酸脯氨酸(CHP)。该药物治疗可以用于在酶水平上活化IDE。 IDE是一种包含酶的锌，并且全酶与主酶比例的增加可以增加活性但不活化IDE基因表达。此外，CHP增强了锌通过肠并且进入组织的吸收，这可能是因为其具有螯合锌的能力。此外我们先前的研究还表明其对人和小鼠是无毒的。
我们已经观察到，胰岛素降解酶(IDE)降低了胰岛素和AP。此外，具有胰岛素抵抗性糖尿病的患者具有更高的胰岛素水平和更高的AP水平。因此， 一种增强IDE活性的方法的发现将减少AP的稳态并且减少斑的负载。为了这个目的，在基于这里研究出的用于降低胰岛素水平的方法之上，我们已经研究出一种方法以增加转基因小鼠脑中Ap的降解。
如我们在先研究中所示，CHP+锌(如美国专利1^ 5,834,032中所述，在此将其全部结合以作参考)已经被用来降低胰岛素水平，这作为一种方法用来治疗胰岛素抵抗性糖尿病。CHP是促甲状腺激素释放激素(TRH)的代谢产物，但是也可以直接从氨基酸或肽源制得。糖尿病患者中的CHP水平显著低于非糖尿病患者。单独的CHP不能降低胰岛素水平，然而CHP+锌以与锌的量相关的浓度依赖性的方式降低了胰岛素水平。CHP螯合锌，这剌激了锌的肠吸收和在肌肉组织中的摄取。伊汰微熟斷C朋必働邀合
我们相信，甲状腺激素、CHP + Zn、或甲状腺激素和CHP + Zn的组合的介入引起了哺乳动物体内一种或多种以下的效应增强的IDE活性，A(3的清除，减少的A卩斑负载，和增强的知觉。这个得到了数据的支持，数据显示，CHP + Zn增强了脑IDE活性，从而导致了可溶的和不溶的Ap 1-40和1-42水平的下降；和T4治疗减少了 APPmRNA禾卩APP蛋白；和降低了总的A卩1-40和1-42水平。
本发明将以以下实验数据的形式进一步说明，实验数据是出于图示的目的，而不是为了以任何的方式限定本发明的范围，本发明的范围由权利要求定义。
实验数据
甲状腺激素处理
A. T3对人神经母细胞瘤细胞中APP分泌的作用
我们已经测定了三碘甲腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)下调APP基因表达的能力。在第一个研究中，我们测定三碘甲腺原氨酸(T3)下调SH-SY5Y和LA-N-5人神经母细胞瘤细胞系中以及NHNP二乙基溴乙酰胺祖细胞中APP对碘氧基苯甲醚分泌作用的能力。附图1显示的是24小时处理以后证实甲状腺激素对分化型(+RA)和非分化型(-RA)SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中APP分泌作用的西部吸印技术。如图1所示，所有测定的人细胞系都显示了相似的浓度依赖性方式的APP分泌负向激素调控。
B. T4对正常小鼠的作用
在第二个研究中，我们发现，甲状腺激素处理下调了正常小鼠中APP基因的表达。在这个研究中，我们通过诱导这些动物中甲状腺激素亢进和甲状腺激素机能减退将我们的组织培养观测扩展到脑组织。9只小鼠的三个组进行如下处理在对照组中，同正常食物一起灌输假手术颗粒；在甲状腺机能亢进组中，同正常食物一起灌输甲状腺激素(T4; L-甲状腺素)21天持续释放的颗粒(0.025 mg/颗粒，Innovative Research of America,Sarasota, FL);在甲状腺机能减退组中，同含有0.15。/。丙基硫氧嘧啶(Harlan Teklad，Madison, WI)的碘不足食物一起灌输假手术颗粒。在第21天，杀死动物，移出全脑并且切半，用于蛋白质和RNA分析，同时收集血清进行T4分析。相比对照小鼠(4.32±0.30 ug/dl)，激素处理小鼠的增加的T4血清水平(10.73士1.27ug/dl，平均值±SD)证实甲状 腺机能亢进。相比对照小鼠(4.32 ± 0.30 ug/dl)，激素处理小鼠的减少的T4血清水平(0.03 ± 0.02 ug/dl)证实甲状腺机能减退。
在附图2中，RT-PCR分析显示，在甲状腺机能亢进的小鼠中，APPmRNA水平 相比对照动物(泳道l)降低了 (泳道2和3)。相反地，甲状腺机能减退的小鼠相比 对照显示出APP 751 mRNA水平的增加(泳道4和5)。相关强度在附图3中进一步显 示。这些结果表示，甲状腺激素还赋予了活体内小鼠APP基因表达的负向调控。
附图4中，西部吸印技术通过在来自切半脑的提取物的蛋白质上使用抗APP抗体 而完成。相对于甲状腺机能正常的动物，甲状腺机能亢进的动物(泳道3和4)全部表 现出APP亚型表达的降低，而甲状腺机能减退的动物(泳道5和6)表现出APP亚型表 达的增加。
C. HuAPP小鼠上T4处理的AB降低的水平
在另一个研究中，我们发现，甲状腺激素因人APP基因下调了小鼠遗传转移中 的Api-40和1-42。由于正常小鼠不会形成与人相似的含有斑的A(3或表现出其他AD 的特定神经病理学，因此我需要测定缓和的甲状腺机能亢进是否可以因人APP基因而 调节转基因小鼠中的Ap合成。R1.40人APP转基因小鼠含有全部的具有酵母人工染色 体的人APP基因。R1.40小鼠形成细胞外AI3沉着物，并且表现出类似人阿尔茨海默氏 病的神经病理学。
这些研究中使用的小鼠具有完全的人APP基因(huAPP),包括5'上游启动子区， 插入的酵母人工染色体(YAC)结构，这些小鼠被称作huAPP-YAC转基因小鼠(R1.40品 种)。这些小鼠中的huAPP包括瑞典突变并且在高病理学脑区域表达。
如附图5中所示，18个月的huAPP小鼠脑包含Ap-和硫磺素S阳性斑并且含有 反应性的星细胞。HuAPP小鼠表现出在9个月时低至无AD病状但是在存活第二年 (14-18个月)时的高病状，包括全部huAPP亚型的高表达(770,751，695),可溶的AP(40 和42)， A(3阳性和硫磺素S阳性斑，增强的氧化应激，强烈的炎症，脑血管变化，认 知障碍和显著的早老素影响，这使得该动物模型因为它们相关的神经病理学的APP基 因调节和加工研究而完美。
huAPP小鼠的冷冻切片通过如下所述制备我们将快速冷冻处死的小鼠的左脑半 球，使用恒冷切片机切片，融裱，然后在-80。C再冷冻以待后用。藏薪,S染色，将固定的切片浸渍在0.25%的高锰酸钾溶液中20分钟，然后在水中清洗，漂白2分钟，再在水中清洗，然后在H202封存20分钟，接着置于0.25%的醋酸溶液中5分钟，接着在水中冲洗，然后在硫磺素S中孵化3-5分钟。然后用甘油凝胶将载波片包埋。在ZeissAxioskop 2加显微镜上用荧光获得IOX的数字图像，并且用Axiovision软件处理。
资资织众学，在即将免疫染色之前，切片将1: 1的甲醇丙酮中-2(TC固定10分钟；在0.5%的H202、 1: l的甲醇PBS溶液中处理5分钟以抑制内源性过氧化物酶，然后用3%的马血清处理2小时以阻挡非特异的背景。然后用识别Ap片断1-17的主要抗体6E10(Signet)孵化切片，这在检测这些小鼠的斑时已经给出(参见附图1A)。结合的抗体使用ABC染色试剂盒检测(Vector)。 100-400X数字图像在Zeiss Axioskop 2加显微镜上用荧光获得并且用Axiovision软件处理。图像将输入到ImageJ软件中用于分析。如附图5中所示，这些片断显示出使用单克隆抗体6E10的AP染色(A;海马的CA1区域)，硫磺素S阳性斑(B;海马的CA1区域)，和GFAP阳性星细胞(C;皮质)(苏木精复染色)。
给R1.40小鼠植入含有3周缓释颗粒的T4，并且人Ap ELISA特异性利用来自小鼠脑胞质溶胶的表转化蛋白完成。我们观察到人A(31-42水平30%的降低和用丁4处理三周的小鼠的AP 1-40水平25%的降低。此外，小鼠首先被给与碘不足的PTU饮食而具有三周的甲状腺机能减退，然后用T4代替以反转甲状腺机能减退，从而表现出与正常小鼠相似的A(3水平，然而如附图6中所示甲状腺机能减退的动物证明了脑Ap水平的增加。huAPP转基因小鼠中总的人AP42和Ap40的脑水平在用T4处理以后用ELISA测定是显著降低的(n-9个动物每组士SD)。那些表现出正常T4血清浓度的、表现出了 CNS特异性甲状腺机能减退的AD患者使之明显，这说明适当的T4处理作为代替疗法可以减少A卩产物。
执行血清T4RIA测定以确定甲状腺激素状态(表l)
表l
总甲状腺素的放射免疫测定
对照4.77 ± 0.24 ug/dl
甲状腺机能亢进9.43 ± 1.27 ug/dl
甲状腺机能减退0.02 ± 0.02 ug/dl
19根据上述数据，组织培养中和正常小鼠脑中观察到的甲状腺激素对APP基因的 负向调控还延伸至转基因小鼠中APP基因的表达和最终的Ap水平。
D. 与HuAPP小鼠上T4处理相关的减少的mdm2基因表达
在另一个研究中，得自对照和甲状腺素处理小鼠脑的RNA用于在甲状腺机能正 常和甲状腺机能亢进条件下定量mdm2水平。附图7证实在21天颗粒植入后单个小鼠 脑的转录物含量下降，这支持了我们在组织培养试验中早期所观测到的。
为了评估甲状腺激素对mdm2基因的直接作用，我们将小鼠mdm2基因第一内含 子的+356/+755区域克隆到了 pGL3-启动因子载体(pGL3MDM2)以用于转染测定。该区 域包含结合TRa单体和二聚体的元件、以及TRa和RXR(3异二聚体。如附图8中所示， LA-N-5成神经瘤细胞和p53阴性HCC1806乳癌细胞的转染分析显示，该区域给与 pGL3启动因子方面指示表达的负向调控。
E. p53肿瘤抑制基因负向调控APP基因
在另一个研究中，我们发现p53肿瘤抑制基因负向调控APP基因。APP-322/+42 区域被克隆到pGL3中形成指示结构。该区域包括APP启动子区域和潜在的五个增强子 序列。如附图9中所示，具有野生型和突变型p53的该结构的共转染表明野生型p53给 与了 APP结构上的负向调控。Mdm2连结到p53并且对其降解定向，从而降低了稳态p53 的水平。因为甲状腺处理负向调控脑中mdm2的表达，所以推测认为通过附图7中鉴定 的序列中的一个元件，较少的mdm2就可以用于定向p53的降解。因此，甲状腺激素处 理可以有效地增加p53水平，这导致了附图2和3中所示APP基因的负向调控的增强 和较低的APP转录物水平。
F. huAPP小鼠中T4处理导致增强的空间记忆
在另一个研究中，甲状腺激素处理增强了 huAPP转基因小鼠的空间记忆。为了 测试这个，我们使用了 Morris水迷宫(Morris water maze),其使用了具有顺动的循环 水池，并且使用了 SDI SMART视频跟踪系统(San Diego Instruments)捕获的数据。实 验在每天上午8点和中午之间对照和处理小组交替迸行持续14天。7天的采集阶段包括 每天4个60秒的五分钟间隔的试验。动物被引入到面对壁的池中，在东西位置之间进 行交替。当动物到达平台以后试验结束，然后在平台上停留15秒。在第8天，用单个 60秒探针试验评估学习力，其中平台被移除，并且动物在东部位置被引入迷宫。在第9 和第10天，为了再教育小鼠使之到达北部位置，如在采集阶段中那样对动物每天重复4个60秒的试验。第11-13天构成了反转阶段，其中平台的位置变换到了对角相反象限 中的南部位置。在第14天，小鼠进行4个60秒的信号试验，其中放置在南部象限的黑 色和白色环状条纹的平台升高到水上1.5cm并且用标志进行可视标记。通过4个试验/ 天的平均得到结果并且以日平均值的形式表达。因变量是潜在的并且与到达平台存在距 离。变量重复测定分析(AN0VA)分别用于分析采集阶段(l-7天)和反转阶段(11-13天)， 其中使用药物处理作为中间对象，天数作为内部对象变量。此后用Tukey's多次对比试 验进行对比。9个月的huAPP转基因小鼠被分成2个组，每组3个动物，并且按以下处理对 照，灌输假手术颗粒；T4，灌输甲状腺激素(T4; L-甲状腺素)90天持续释放的颗粒(0.1 mg/颗粒)(Innovative Research of America, Sarasota, FL)。在第12个月，动物接受Morris Water Maze并且在第1-7天测定到平台的平均距离，第8天的探针期，第9-10天的重 复采集，第11-13天的反转阶段，以及第14天的可视平台信号阶段。如附图10中所示， 通过Tukey多重比较试验(11=3个动物每组± SEM)在3-5天、12-13天时观察到了空间 记忆的显著提高。F.预示实施例和试验/仏存基尿功^^伊犹嚴激#水乎红嫁定虜^^座游#教應處蒋麽教摩處々AM浙通过植入持续90天T4释放的药丸浓縮物对小鼠进行处理。为了优化反应，需要 0.10 mg的颗粒以与21天0.025 mg的颗粒的相同剂量接近。我们以以下的剂量植入甲 状腺素卯天释放的颗粒0.5 mg/颗粒，0.1 mg/颗粒，0.025 mg/颗粒，和0.006 mg/颗粒。 在卯天的处理后，处死老鼠并且得到切开脑的蛋白提取物和RNA分离物。脑在50 mM 三羟甲基氨基甲垸、0.2M蔗糖、pH7.4中均质，蛋白质分割形成核、薄膜、和细胞溶 质部分。薄膜和细胞溶质部分用于ELISA以定量人Apl-40和1-42。生物源ELISA试 剂盒对人A卩特异，并且还可从1-42辨别1-40。此外，RNA通过胍盐硫氰酸/苯酚提 取法(49)分离，并且人特异性引发剂用于RT-PCR以测定处理和未处理小鼠中的APP-695， -751，和-770转录物。A卩水平和APP转录物水平与T4的处理剂量相关。此外， 所有组的血清总丁4通过RIA定量，并且其水平与处理和未处理小鼠的人特异性Ap肽 和APP转录物水平相关。对数据迸行分析，并且根据长期处理确定合适的T4颗粒剂量。 M.伊層丝游伊微撒,維舒摆默议避必潘舒,縦週游虔力縱着众。
由于斑的形成是Ap聚集的结果，因而推测Ap产物的减少将减少斑的形成。为 了确定有初步斑的小鼠连续处理是否能够抑制斑的形成，人APP表达转基因小鼠(品系 R1.40), (12只对照，12只处理的)用如上所述最大化的持续释放的T4颗粒在我们观察到 这些老鼠中我们观察到斑形成的9-16月大小期间处理。每3个月用90天持续释放颗粒 对动物进行植入。在第13和第16个月大小时，获取血清用于T4 RIA分析，并且将脑 切半用于组织学和蛋白质提取。
为了确定斑的负载，脑半球被切开并且使用恒冷切片机迅速冷冻，融裱，然后在 -80°C冷冻以待后用。硫磺素S染色将固定的切片浸渍在0.25%的高锰酸钾溶液中20 分钟，然后在水中清洗，漂白2分钟，再在水中清洗，然后在&02封存20分钟，接着 置于0.25%的醋酸溶液中5分钟，接着在水中冲洗，然后在硫磺素S中孵化3-5分钟。 然后用甘油凝胶将载波片包埋。在Zeiss Axioskop 2加显微镜上用荧光获得10X的数字 图像，并且用Axiovision软件处理。應ig^^ 众学，在即将免疫染色之前，切片将在1: l的甲醇丙酮中-20'C固定IO分钟；在0.5%的&02、 h l的甲醇PBS溶液中处理 5分钟以抑制内源性过氧化物酶，然后用3%的马血清处理2小时以阻挡非特异的背景。 然后用对抗不同A卩片断(Signet, Calbiochem, Santa Cruz)的主要抗体孵化切片以检测斑。 通过ABC染色试剂盒(Vector)完成目测。10X数字图像在Zeiss Axioskop 2加显微镜上用 荧光获得并且用Axiovision软件处理。图像将输入到ImageJ软件中用于分析。如附图5 中所示，在T4处理和对照小鼠之间进行斑负载水平比较。此外，对包括额皮质和海马 的脑高病理学区域进行斑负载定量(CA1-CA3， Dentate,等)。
EUSA:将AP 1-40和l-42水平定量化并且按照该延伸处理与对照迸行比较以将 它们的降低与该处理中观测到的斑形成中的任何变化关联。在处理期间将AP定量化， 于是它们能精确地与斑负载相关联。紧接着处死之后，按上述将脑半球均质并且分割用 于蛋白质分析。胞质溶胶和薄膜部分如制造商(Biosource)所述通过ELISA进行AP 1-40 和l-42定量化。通过ANOVA和Newmans-Keulst-检测对ELISA数据进行分析。
RNA定量在激素处理后我将人APP转录物(770,751，和695)中的变化定量化。 我们用人特异性引发剂将R1.40转基因小鼠中APP转录表达的变化定量化。提取的RNA 用于cDNA分析并且执行PCR。 PCR产物进行电泳移动并且在AlphaInnotech凝胶文件 编制系统上定量化。APP转录水平与A卩和斑负载相关。 / C基脾表,定伊拔微,飯座i/f
22APP基因的+54/+83区域通过TGFP给与荧光素酶表达显示结构的正向调控，并 且与复合的Smad-Spl复合物(32)结合。APP的+79/+96区域甲状腺激素受体和视黄醇 类X受体的异二聚体结合，这意味了存在一些重叠。我们相信，甲状腺激素通过TGF卩 抑制APP基因的正向调控从而负向调控APP基因。AD大脑和CSF中的TGFP水平是 增加的。
代表APP基因+48/+108区域的、在侧位有两个屈ol限制位点的双链寡核苷酸结 合到含有用于转染研究的SV40启动子序列的pGL3启动子载体中。MvlLu细胞，其能 迅即感应TGF(3信号，用于转染。为了评估甲状腺激素及其受体在抑制TGFP诱导上的 作用，适当的转染组合被使用。用控制之下的Smad3， Smad4,和Spl和TGFp处理对细 胞进行转染，以证明TGFp诱导。进一步用带或不带TGFP的TRa, RXR, Smad3， Smad4, 和Spl，在存在或不存在甲状腺激素时对细胞进行转染。用TR(3代替TRa重复试验。
执行凝胶移动检测以确定在存在和不存在甲状腺激素时TRa和TRP是否能够 干扰结合到反应元件的转录因子复合物Smad3/Smad4/Spl。上述代表双链区域的寡核苷 酸使用DNA多聚酶的Klenow片段以[a，P]dCTP末端标记。Smad3, Smad4， TRa, RXR， TRP，和Spl蛋白通过向Promega转录和翻译系统分别加入适当的质粒而产生。在缓冲 溶液中37°C下20分钟的孵化后，复合物在含有TBE的5%的聚丙烯酰胺凝胶上分解， 将凝胶干燥，并进行Molecular Dynamics镜检，然后在Molecular Dynamics Phosphorimager上可视化。在存在和不存在甲状腺激素时，在凝胶移动检测中对 TRa/RXR and TRp/RXR异二聚体抑制Smad3/Smad4/Spl结合的能力进行评估。执行超 移动分析以证实数据。如果TNT产生的蛋白的数据不易于解释，还会在凝胶移动试验中 使用核提取物和转录因子/受体的抗体。
含有负向p53反应元件的APP基因上游区域通过执行代表APP上游区域的较小 区域的p53表达载体和元件的转染被鉴定。将代表候补元件的寡核苷酸结合，并且利用 在转染分析和凝胶移动分析中使该区域表现突变的寡核苷酸进一步验证负向元件。通过 使用PromegaTNT系统中产生的p53蛋白完成凝胶移动分析。
确定对照组和甲状腺激素处理组小鼠脑中胞质溶胶和细胞核中的稳态p53蛋白的 水平。如甲状腺激素处理降低小鼠脑中mdm2水平，以及mdm2定向p53的降解，我们 相信，较低的mdm2水平会获得甲状腺处理过的脑中较高的稳态p53水平。这样可以通 过APP基因中p53的负向应答下调APP表达。细胞溶质和细胞核部分的蛋白质提取物 在激素处理和对照的条件下进行西部吸印技术处理以将表达中的潜在变化定量化。此外，在无变性情况下在mdm2-p53合成物上完成下拉分析以确定在甲状腺激素处理后较 少的p53是否可被定向以进行蛋白酶降解。
II. Zinc & CHP处理
A. HuAPP小鼠上由Zn+CHP处理引起的降低的AB水平
根据我们的研究，CHP结合锌盐可以因为人APP基因的转入降低小鼠中的A卩
I- 40和1-42。我们用1.0 mg/ml CHP和10mg/L Zn的饮水处理人APP转基因小鼠5周 并且将人AP 1-40和1-42定量化。如附图12中所示，五周时间后，CHP和Zn引起细 胞溶质AP 1-40 60%的减少以及A|3 1-42 25%的减少。
B. Increased IDE Levels of AB bv Treatment of Zn+CHP on HuAPP Mice
此外，如附图13中所示还观察到IDE酶活性的增加。包含于对照动物细胞溶质 脑样品的IDE需要超过20分钟才能降解放射标记的胰岛素，而CHP + Zn处理的动物显 示出增强的IDE活性，其100%的胰岛素在20分钟内降解完(左边)。定量法显示，有在 处理以后CHP + Zn疗法引起了大约30%IDE的活性增力口(右边)(11=6个动物每组± SD)。
C. HuAPP小鼠上由Zn+CHP处理引起的减少的可溶性AIW和ABp
通过ELISA测定我们还发现，huAPP小鼠中脑的可溶的和不溶的人Ap42和A(34o 水平在用CHP + Zn处理后明显降低。如附图14中所示，与对照组相比，用l.Omg/LCHP + 10111§^211处理的转基因动物中，我们证实了可溶的和不溶的AJ3"和A(34o水平的显 著降低，而用Zn或CHP单独处理的动物的Ap水平则没有表现出显著变化(数据没有显 示),(n-9个动物每组± SD; *=p^).05)。
D. huAPP小鼠的Zn+CHP处理导致增强的空间记忆
在另一个研究中(附图15)，显示CHP + Zn处理增强了huAPP转基因小鼠的空 间记忆。HuAPP转基因小鼠(9个月)分成2组，每组3个动物，并且进行如下处理在 对照组中，只将H20随意的供给动物；在0/尸+ Z"组中。随意的将含有1.0mg/LCHP + 10 mg/L Zn的水供给动物。在第12个月，动物接受Morris Water Maze (如上所述)， 并且在第1-7天测定到平台的平均距离，第8天的探针期，第9-10天的重复采集，第
II- 13天的反转阶段，以及第14天的可视平台信号阶段。如Tukey多重比较测试确定 的那样，在第3-5天、和第12-13天中观察到空间记忆的明显提高。该数据显示，当锌水平最大化，并且将10mg/LZn和1.0 mg/L CHP引入到含有 人APP基因的转基因小鼠的饮水中时，胞质的A(31-40和1-42分别减少了 60%和30%。 在一些具体实施方式
中，更高的剂量也是有效的。
IH.甲状腺激素和CHP+Zn组合疗法
在以下实验中，转基因动物用CHP + Zn，或T4力n CHP十Zn在9-18个月大小 之间时进行处理。在14和18个月大小时，对小鼠进行空间记忆测试，然后将其处死并 进行IDE活性、A卩1-40禾B 1-42水平和斑负载的组织分析。通过Morris Water Maze测 定认知力。通过放射性配体分析测定IDE活性，通过ELISA和西部吸印技术测定可溶 的和不溶的A|3，而通过硫磺素S染色、或/和A卩免疫组织化学分析定量斑负载。
HuAPP转基因小鼠(9个月大)分成3组，每组12个动物(总共36个动物)， 并且进行如下处理在对照组中，只将H20随意的供给动物；在C/P + Z"组中。随意 的将含有1.0 mg/L CHP + 10 mg/L Zn的水供给动物，在T4加CHP +Zn组中，将甲状 腺激素90天持续释放的颗粒(0丄0 mg/颗粒)植入动物，并且随意的将含有1.0 mg/L CHP + 10 mg/L Zn的水供给动物。
使用Morris Water Maze以测定CHP + Zn和T4加CHP + Zn带来的空间记忆 的变化。在第14和18个月，我们使用具有顺动水池的Morris water maze试验小鼠并 且使用SDI SMART视频跟踪系统(San Diego Instruments)捕获数据。简要地说，实验在 每天上午8点和中午之间进行，对照组和处理组交替进行，持续14天，7天的采集阶 段包括每天4个60秒的2分钟间隔的试验。动物被引入到面对壁的池中，在东西位置 之间进行交替。当动物到达平台以后试验结束，然后在平台上停留15秒。在第8天， 用单个60秒探针试验评估学习力，其中平台被移除，并且动物在东部位置被引入迷宫。 在第9和第10天，为了再教育小鼠使之到达北部位置，如在采集阶段中那样动物每天 反复4个60秒的试验。第11-13天构成了反转阶段，其中平台的位置变换到了对角相 反象限中的南部位置。在第14天，小鼠进行4个60秒的信号试验，其中放置在南部象 限的黑色和白色环状条纹的平台升高到水上1.5cm并且用标志进行可视标记。结果通过 4个试验/天的平均得到并且以日平均值的形式表达。因变量是潜在的并且与到达平台存 在距离。变量重复测定分析(ANOVA)分别用于分析采集阶段(l-7天)和反转阶段(11-13 天)，其中使用药物处理作为中间对象，天数作为内部对象变量。此后用Tukey's多次对 比试验进行对比。测定CHP + Zn和T4力卩CHP + Zn处理带给huAPP小鼠脑中IDE活性性的 变化。空间测试后在14个月(5个月的处理)和18个月(9个月的处理)大时，我们 将来自各组的6个动物处死。从中，将右脑半球均质并且分离形成有核的、可溶的和不 可溶的部分用于蛋白质分析。在蛋白质定量化后，将O.l jxg的可溶性蛋白加入到60 ^ 的含有0.1 M磷酸缓冲溶液和放射示踪的[125] I-胰岛素或放射示踪的[125] IAP 1-40的 反应溶液中。以需要的倍数进行等分试验并且用20 ^tl 8%的SDS加样缓冲溶液终止反 应。将样品煮沸并且在12。/。的聚丙烯酰胺SDS凝胶上分解，然后将凝胶干燥。将干燥的 凝胶置于带有放射示踪胰岛素的分子动力学荧光屏，从而用分子动力学影像将其可视化 和定量化。对各组胰岛素的降解进行计算，并且通过ANOVA和Newmans-Keuls进行 统计分析，由此完成试验。
测定CHP + Zn和T4加CHP + Zn带给huAPP小鼠脑中Ap水平的变化。如 上所述对动物进行处理、试验和处死。
五Z/5^:根据制造商(Biosource)的说明通过ELISA对可溶的和不溶的部分就A(3 1_40和l-42可溶的和不溶的形式进行分析。
^^r级伊i^^:将可溶的和不溶的部分煮沸5分钟，在12,000XG下旋转20分钟， 并且用12.5 % SDS-PAGE分离(200昭每泳道)。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF)薄膜并且用5% (w/v)的奶粉在TBS中阻滞两小时。阻滞的PDVF薄膜在4'C用 主要抗体过夜孵化，然后用第二抗体清洗和孵化。通过ECL (Pierce)检测带状物并且将 其曝光于X射线胶片(Kodak)。扫描西部吸印技术带状物并且将其输入ImageJ软件用于 测定以肌动蛋白染色份作为常规参数的平均射线值。并且通过ANOVA和 Newmans-Keuls对ELISA数据和西部吸印技术带状物进行分析，由此完成试验。
测定CHP + Zn和T4加CHP +Zn带给huAPP小鼠脑中Ap斑的变化。我们 将快速冷冻处死的小鼠的左脑半球，使用恒冷切片机切片，融裱，然后在-80。C再冷冻 以待后用。凝^^^S染经，将固定的切片浸渍在0.25%的高锰酸钾溶液中20分钟，然 后在水中清洗，漂白2分钟，再在水中清洗，然后在H202封存20分钟，接着置于0.25% 的醋酸溶液中5分钟，接着在水中冲洗，然后在硫磺素S中孵化3-5分钟。然后用甘油 凝胶将载波片包埋。在ZeissAxioskop2加显微镜上用荧光获得10X的数字图像，并且 用Axiovision软件处理。^资遂织众学.*在即将免疫染色之前，切片将在1: 1的甲醇 丙酮中-20'C固定IO分钟；在0.5%的&02、 1: l的甲醇PBS溶液中处理5分钟以抑 制内源性过氧化物酶，然后用3%的马血清处理2小时以阻挡非特异的背景。然后用识
26别Ap片断l-17的主要抗体6E10孵化切片(Signet),这在检测这些小鼠的斑时已经给出。 结合的抗体使用ABC染色试剂盒检测(Vector)。 100-400X数字图像在Zeiss Axioskop 2 加显微镜上用荧光获得并且用Axiovision软件处理。图像将输入到ImageJ软件中用于 分析。
结果
我们测定了降低的A卩水平，降低的A卩斑水平，增强的IDE活性，和提高的CHP + 211处理动物的空间记忆，以及T4加CHP + Zn处理动物的协同作用。虽然这些试验 中使用的甲状腺水平是低的，但是甲状腺机能亢进在动物模型中引起不需要的负作用的 可能性是始终存在的。为了最小化这些潜在的负作用，我们对小鼠的常规基础特征进行 了观测以注意其体重、粘液水肿、或活动力方面任何的变化。虽然有一些数据表明高水 平的Zii是有毒的，但是这些研究中使用的水平在每日供给量以下并且不会成为问题。 然而，动物会被定期就昏睡、癲痫、饮水增加、或共济失调的任何信号进行评估。
其他支持所述结果的数据可以在O，Barr等，Thyroid Hormone Regulates Endogenous Amyloid-beta Precursor Protein Gene Expression and Processing in Both In Vitro and In Vivo Models, 7%,0/《16,12 (2006)中找到，在此将其全部引入以作参考。
上述各种方法和技术提供了完成本发明的一系列途径。当然，可以理解的是，没 必要所有所述的目的或优点都可以根据任何这里所述的优选的具体实施方式
实现。
此外，本领域技术人员将认识到不同具体实施方式
不同特征的可互换性。相似地， 上述的不同的特征和步骤，以及其他公知的这些特征或步骤的同等物可以被本领域技术 人员组合并实施以完成符合本发明精神的方法。
虽然本发明通过上下文中某些具体实施方式
和实施例被公开，本领域技术人员可 以理解的是，本发明由特别公开的具体实施例延伸至其他可选的具体实施方式
和/或其明 显的修改和替换。相应地，本发明不被这里优选的具体实施方式
的特定公开内容所限定。
权利要求
1、一种治疗、预防或延缓哺乳动物阿尔茨海默氏病或痴呆的方法，所述方法包括至少一天一次将含有锌盐和环组氨酸脯氨酸的药物组合物给与哺乳动物；其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约1∶100-约100∶1。
2、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:10-约100:1。
3、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:6-约5:l。
4、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约1:15-约20:1。
5、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:30-约4:l。
6、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约1:8-约4:1。
7、 权利要求l的方法，其中锌和环组氨酸脯氨酸的重量比为约l:40-约40:l。
8、 权利要求l的方法，还包括给哺乳动物施用药物有效剂量的甲状腺素。
9、 一种治疗、预防或延缓哺乳动物阿尔茨海默氏病或痴呆的方法，所述方法包括 给与哺乳动物施用药物有效剂量的锌盐和环组氨酸脯氨酸。
10、 权利要求9的方法，其中以引起哺乳动物中胰岛素降解酶的血清水平增加的剂 量施用锌盐和环组氨酸脯氨酸。
11、 权利要求9的方法，其中以引起哺乳动物中淀粉样蛋白p的血清水平减少的剂 量施用锌盐和环组氨酸脯氨酸。
12、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约0.01-约4mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
13、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约0.01-约1.5mg/kg/天的剂量给 与哺乳动物。
14、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约0.01-约0.4mg/kg/天的量给哺 乳动物。
15、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约O. l-约2mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
16、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约2-约4mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。
17、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约1-约10 mg/kg/天的剂量给与哺乳动物。
18、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约3-约8mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。
19、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约4-约7mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。
20、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约7-约10 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
21、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约0.01-约0丄8 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。
22、 权利要求9的方法，其中将锌盐的锌阳离子以约1-约1.5 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
23、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.007-约1.4 mg/kg/天的剂量 给与哺乳动物。
24、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.01-约5 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
25、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.01-约2 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
26、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约2-约7mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。
27、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约3-约5mg/kg/天的剂量给与哺 乳动物。
28、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约7-约10 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
29、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.5-约2mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
30、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.2-约4mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
31、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约0.8-约3 mg/kg/天的剂量给与 哺乳动物。
32、 权利要求9的方法，其中将环组氨酸脯氨酸以约l-约6mg/kg/天的剂量给与哺乳动物环。
33、 一种治疗、预防或减少哺乳动物阿尔茨海默氏病或痴呆的方法，所述方法包括:至少一天一次将含有L-甲状腺素、锌阳离子和阴离子、和环组氨酸脯氨酸的药物组合物给与哺乳动物；其中将L-甲状腺素以约0.1-约15)ag/kg〃天的剂量给与哺乳动物；和其中将锌阳离子以约0.01-约10mg/kg/天的剂量给与哺乳动物；和其中将环组氨酸脯氨酸以约0.001-约10mg/kg/天的剂量给与哺乳动物。
34、 一种治疗、预防或减少哺乳动物阿尔茨海默氏病或痴呆的方法，所述方法包括将药物有效剂量的L-甲状腺素、锌阳离子和阴离子、和环组氨酸脯氨酸给与哺乳动物。
35、 一种治疗、预防或减少哺乳动物阿尔茨海默氏病或痴呆的方法，所述方法包括给与包含甲状腺激素的药物组合物。
36、 权利要求35的方法，其中以药物有效剂量给与甲状腺激素以降低A(3蛋白质血清水平。
全文摘要
本发明涉及一种治疗、预防、或延缓哺乳动物阿尔茨海默氏病和/或痴呆的方法。更特别地，本发明涉及含有对治疗、预防、或延缓哺乳动物阿尔茨海默氏病和/或痴呆有用的确定化学物质的组合物的给药方法。在一些具体实施方式
中，用于这些方法相关的组合物包含1)甲状腺激素，和2)环组氨酸脯氨酸和锌盐中的一种或多种。该组合物还可以用于治疗代谢综合症和脑血管病。
文档编号A61K38/05GK101674842SQ200880006749
公开日2010年3月17日 申请日期2008年2月29日 优先权日2007年3月2日
发明者史蒂夫·奥巴尔, 穆恩·K·桑, 詹姆斯·约翰·舒尔茨 申请人:普瑞芬医药有限公司