与肿瘤转移的新生血管有关的纤连蛋白的ed-a抗原的制作方法

专利名称：：与肿瘤转移的新生血管有关的纤连蛋白的ed-a抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及转移瘤的检测和治疗，即在不同于原发性肿瘤的部位的部位产生的继发性肿瘤的一企测和治疗。本发明涉及一种结合于纤连蛋白的ED-A同种型(isoform)的结合成员的应用，尤其是结合于纤连蛋白的结构域ED-A的结合成员。
背景技术：
：大多凄t与癌症有关的死亡涉及疾病的转移扩散(HanahanandWeinberg2000)并且有活力的新生血管是侵袭性肺瘤转移瘤的特征。肺瘤分为良性肺瘤或恶性肺瘤。恶性肿瘤能够从原发性部位(原发性肺瘤)扩散到身体的其它部位，而良性肺瘤则不能扩散。恶性肺瘤可以通过侵袭和转移自它们的原发性部位扩散。由于转移而形成的肺瘤纟皮称作，例如，转移瘤、继发性肿瘤、转移性病变或转移性病灶。血管生成描述了新血管从现有血管的生长。肺瘤可以通过分泌各种生长因子(例如血管内皮生长因子)而诱导血管生成。肿瘤血管生成4吏得肿瘤可以生长超过几毫米的直径并且还是胂瘤转移的先决条件。由于血管生成而形成的新血管会形成肺瘤或肿瘤转移瘤的*斤生血管。纤连蛋白(FN)是一种糖蛋白并且在各种正常组织和体液中广泛表达。它是细胞外基质(ECM)的一种成分，并在许多生物学过程中发挥作用，其中上述生物过程包括细胞粘附、细胞迁移、止血、血才全形成、伤口愈合、组织分化以及致癌性转化。不同的FN同种型是通过初级转录物FN前mRNA的三个区域(ED-A、ED-B、niCS)的可变剪接而产生的，是一种通过细胞因子和细月包夕卜pH^f直来调节的过禾呈(Balza1988;Carnemolla1989;Borsi1990;Borsi1995)。纤连蛋白包含两种可以经受可变剪4妾的III型J求^)犬额外结构i或ED-A和ED國B(ffrench画Constant1995,Hynes1990,Kasparetal.2006)。小鼠纤连蛋白和人纤连蛋白的ED-A的96.7%是相同的(在两个90个氨基酸的序列之间仅3个氨基酸不同，参见图5)。已才艮道了在m腦A水平(参见例如，Jacobsetal.2002,Matsumotoetal.1999,Oyamaetal.1989,Tavianetal.1994)、在分离蛋白的水平(Borsietal.1987)以及在免疫组织化学水平(Borsietal,1998,Heikmheimoetal.1991,Koukoulisetal.1993,Koukoulisetal.1995，Lohietal.1995，Scarpinoetal.1999),纟f连蛋白的ED画A在月中瘤细月包和实体月中瘤中的表达。Borsietal.，1998,ExpCellRes,240,244-251也已才艮道了ED-A存在于原发性肿瘤的新血管中。然而，先前并没有指出ED-A与肿瘤转移的新血管有关。我们在本文中表明，纤连蛋白的ED-A在肿瘤转移瘤的新生血管中选择性地表达。因为肿瘤血管容易受到静脉给予的治疗剂的作用(Neri和Bicknell2005,Rybaketal.2006，Thorpe2004,Trachsel和Neri2006),所以例如结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子的结合分子代表新型制剂，其可以用于制备用来治疗一种和/或多种肿瘤转移瘤的药物。肺瘤新血管(肿瘤血管^fe向)的疗法是一种用于治疗肺瘤转移瘤的有前途的方法。肿瘤血管把向的目的是破坏肿瘤本身内的血管，减少血流量以使肺瘤丧失氧和营养物，从而引起肿瘤细月包死亡。
发明内容本发明提供了抗ED-A抗体，其选择性地识别肺瘤转移瘤的新形成血管。本发明在一个方面涉及结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型(A-FN)的结合成员(例如抗体分子)在用于制备用来治疗一种和/或多种肿瘤转移瘤的药剂中的应用。在另一个方面，本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A的结合成员(例如抗体分子)在用于制备用来治疗一种和/或多种胂瘤转移瘤的药剂中的应用。在又一个方面，本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员(例如抗体分子)用于将结合(共轭或轭合)于该结合成员的分子递送到肿瘤转移瘤的新生血管的应用。在另一个方面，本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A的结合成员(例如抗体分子)用于将结合(共辄或轭合)于该结合成员的分子递送到肿瘤转移瘤的新生血管的应用。在其〗也的方面，该结合成员可以用于制备用来递送上述分子的药剂。在另一个方面，本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员(例如抗体分子)用于制备用于诊断肺瘤转移瘤的诊断产品的应用。在另一个方面，本发明涉及结合纤连蛋白的ED-A的结合成员(例如抗体分子)用于制备用于诊断肿瘤转移瘤的诊断产品的应用。本发明在一个方面还涉及在人或动物体内4企测或诊断肿瘤转移瘤的方法，包4舌以下步-骤(a)对人或动物乡合予结合成员，例如结合纤连蛋白的ED-A同种型的抗体分子，以及(b)确定在人或动物体内在远离由原发性肿瘤目前或以前占据部位的部位存在或不存在该结合成员；其中，在人或动物体内结合成员定位于远离目前或以前由原发性肺瘤占据部位的部位表明了肺瘤转移瘤的存在。本发明在另一个方面涉及在人或动物体内才佥测或it断肿瘤转移瘤的方法，包>^以下步艰《(a)对人或动物《合予结合成员，例如结合纤连蛋白的ED-A的抗体分子，以及(b)确定在人或动物体内在远离由原发性肿瘤目前或以前占据部^立的部^立存在或不存在该结合成员；其中，在人或动物中结合成员定位于远离目前或以前由原发性肿瘤占据部位的部位表明了肿瘤转移瘤的存在。本发明在一个方面还涉及治疗个体体内的肿瘤转移瘤的方法，包括症合予该个体治疗有效量的包含结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员(例如抗体分子)的药剂。在另一个方面，本发明涉及治疗个体体内的肺瘤转移瘤的方法，包括给予该个体治疗有效量的包含结合纤连蛋白的ED-A的结合成员(例如抗体分子)的药剂。在另一个方面，本发明涉及在人或动物体内将分子递送到肿瘤转移瘤的新生血管的方法，包括向人或动物给予结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员，例如抗体分子，其中该结合成员结合于上述分子。在又一个方面，本发明涉及在人或动物中将分子递送到肺瘤4争移瘤的新生血管的方法，包4舌向人或动物主会予结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，其中该结合成员结合于上述分子。本发明的结合成员可以是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED画A的#元体，包含4元体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9、或它们的变体的一个或多个互补决定区(CDR)。优选地，本发明的结合成员是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包含抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9、或它们的变体的一个或多个互^卜决定区(CDR)。最优选地，本发明的结合成员是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包含抗体F8或其变体的一个或多个互4卜决定区(CDR)。本发明的结合成员可以包含抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一组H和/或LCDR，或在所4皮露的H和/或LCDR组中具有10个或更少，例如，1、2、3、4、或5个氨基酉吏置4奐的#元体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一组H和/或LCDR。优选地，本发明的结合成员包含抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9的一纟且H和/或LCDR,其中在所才皮露的H和/或LCDR组中具有10个或更少，例如，1、2、3、4、或5个氨基酸置换。优选地，本发明的结合成员包含抗体F8的一组H和/或LCDR,其中在所4皮露的H和/或LCDR组中具有10个或更少，例如，1、2、3、4、或5个氨基酸置才奂。可以潜在地在CDR组内、以及可以在CDR1、CDR2和/或CDR3内的任4可残基处发生置换。例如，本发明的结合成员可以包含一个或多个CDR(如本文中描述的)，例如，CDR3,以及可选地CDR1和CDR2,以形成一组CDR。200本发明的结合成员还可以包含抗体分子，例如人抗体分子。结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。作为本发明的一部分，还^是供了结合成员的VH结构域。在每个VH和VL结构域内有互补决定区("CDR")、以及骨架区("FR")。VH结构i或包含一组HCDR,而VL结构i或包含一组LCDR。4元体分子可以包含抗体VH结构:威，抗体VH结构i或包含VHCDR1、CDR2和CDR3，以及骨架。它可以可一,纟奐地或还包括抗体VL结构域，抗体VL结构域包含VLCDR1、CDR2和CDR3,以及骨架。本文描述了抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的VH禾口VL结构i或和CDR。本文4皮露的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组、HCDR组以及LCDR组是供本发明之用的结合成员的方面和实施方式。如本文所描述的，"CDR组"包括CDR1、CDR2以及CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2以及HCDR3，而一组LCDR是指LCDR1、LCDR2以及LCDR3。除非另有说明，"CDR组"包括HCDR和LCDR。本发明的结合成员可以包括抗体VH结构域，该抗体VH结构i或包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及骨架，其中HCDR1是SEQID110:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113,以及其中可选;也HCDR2是SEQIDNO:4和/或HCDR3是SEQIDNO:5。优选地，HCDR1是SEQIDNO:23、33、43、53、73、83或103。最优选;也，HCDR1是SEQIDMO:83。通常，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，虽然如下文进一步描述的，VH或VL结构域可以单独地用来结合抗原。因此，本发明的结合成员可以进一步包括抗体VL结构域，该抗体VL结构域包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3,以及骨架，其中LCDR1是SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，以及其中可选地LCDR2是SEQIDNO:7和/或LCDR3是SEQIDNO:8。优选地，LCDR1是SEQIDNO:26、36、46、56、76、86或106。最优选地，LCDR1是SEQIDNO:86。在一个方面，本发明的结合成员是纤连蛋白的ED-A的分离的抗体分子，其包括VH结构域和VL结构域，其中VH结构域包括骨架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2以及HCDR3，并且其中VL结构i或包4舌互^卜决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及骨架，以及其中HCDR1具有氨基酸序歹'JSEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5,LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116;LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7;以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8。抗体的一个或多个CDR或一组CDR可以一皮移才直(4如汰，graft)到骨架，(例如人骨架)以纟是供本发明〗吏用的抗体分子。骨架区可以包含人类种系基因片段序列。因此，骨架可以被种系化，从而改变骨架内的一个或多个残基，以与最类似于人类种系骨架中的等效位置处的残基匹配。本发明的结合成员可以是具有VH结构i或的分离的抗体分子，该VH结构域包含人类种系骨架中的一组HCDR,例如DP47。通常，该结合成员还具有VL结构域，该VL结构域包含一纟且LCDR，例3口，在人类种系骨架中。VL结构i或的人类种系骨架可以是DPK22。本发明的VH结构域可以具有氨基S吏序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。4尤选i也，本发明的VH结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:21、31、41、51、71、81或101。最优选地，本发明的VH结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:81。本发明的VL结构域可以具有氨基酸SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。4尤选i也，本发明的VL结构i或具有氨基酸SEQIDNO:22、32、42、52、72、82或102。最优选地，本发明的VL结构i或具有氨基酸SEQIDNO:82。本发明的结合成员可以是单链Fv(scFv),其包含借助于连接肽(peptidelinker)相连的VH结构域和VL结构域。4支术人员可以选择连接肽的适当长度和序列，例如长度为至少5个或10个氨基酸，长度长达约15、20或25个氨基S臾。scFv可以由氨基酸序列SEQIDNO:9组成或包含氨基酸序列SEQIDNO:9。本发明的结合成员可以是双1介抗体(或双特异抗体，diabody)(WO94/13804;Holliger1993a)，该乂K介抗体是一种包含具有经由连4妄肽相连的VH结构i或和VL结构i或的第一多肽和具有经由连4妻肽相连的VH结构域和VL结构域的第二多肽的分子，其中第一多肽的VH结构域和VL结构域分别与第二多肽的VL结构域和VH结构域配对。该第一和第二多肽可以是相同的(从而配对形成二价分子)或不同的(乂人而配对形成双特异性分子)。才支术人员可以选才奪连4姿肽的适当长度和序列，例如，长度为5个或更少氨基酸。该连接肽可以具有氨基酸序列SEQIDNO:28。本发明的结合成员可以包含非抗体分子内的抗原结合位点，通常由一个或多个CDR^是供，例如，非抗体蛋白质支架中的一组CDR。在本文其它地方详细描述了结合成员，包括非抗体分子和抗体分子。本发明的结合成员可以结合于具有杀生物活性或细月包毒活性的分子。可替换地，本发明的结合成员可以结合于放射性同位素。作为进一步的替换方式，本发明的结合成员可以用可检测标记物力口以标记。下文更详细地描述了本发明的这些和其它方面。图1:A:示出了基于灌注的蛋白质组方法的示意图，其中基于灌注的蛋白质组方法用于比较分析来自健康小鼠肝脏和来自小鼠的F9肝專争移瘤中的可及蛋白(accessibleprotein)。B:示出了由F9肝转移瘤发展的较大的转移性病灶。C:示出了F9肝转移瘤(转移灶)的血管的选冲奪性和有效染色以及血管的强染色和正常肝脏(肝)中的一些窦状隙的标记。染色对应于深色的线，并且它是在纟冬端麻醉(terminalanaesthesis)下用PBS(pH7.4)中的15ml的1.8mM石黄基琥珀酰亚胺基-6-[生物素-氨基]己酸酯(lmg/ml);容液(补充有10%右旋糖酐-40作为血浆增容剂)灌注荷瘤小鼠，接着用4连霉亲和素-石咸性-畴酸酶结合物进4亍组织化学染色而获得的。图2:A:示出了通过对正常小鼠肝脏(正常)和来自小鼠的F9肝專争牙多夕雷(月中夕窗)的纟千连"蛋白结斗勾i或纟吉片勾的-蛋白乂贡纟且分-木f戶斤冯角定的纤连蛋白肽的位置。B:对通过正常小鼠肝脏样品和来自小鼠的F9肝转移瘤的蛋白质组分析所鉴定的肽进行LC-MS/MS实验。通过HPLC首先分离肽，随后洗脱成192个流^分。每个流4分在MALDI目标板上标记为一个分离的点并且获得每个流份的MALDITOFMS语。针对三个重复的F9小鼠肝转移瘤样品(参见图片标记"肝转移")和正常小鼠肝脏的三个重复样品(参见图片标记"正常肝脏")示出了两种不同的特定HPLC流份(分别为上部的行和中间行)的质谱。按照内部标准将离子峰高度归一化(参见材料和方法)，因而使得可以半定量比较在不同样品中的相应的肽。在上部的行中，用箭头指示的峰(在示出的第一样品中标记为"FU")对应于肽FLTTTPNSLLVSWQAPR(SEQIDNo:15)，其书亍生自纤连蛋白的恒定区(纤连蛋白-in型结构域16)。此肽的离子峰在F9小鼠肝转移瘤样品(肝转移)中更高，4旦也存在于正常小鼠肝脏样品(正常肝脏)中，这表明纤连蛋白分子原则上存在于F9小鼠肝转移瘤和正常小鼠肝脏中，^旦似乎在F9小鼠肝转移瘤样品中更丰富。在中间4亍中，由右手箭头指示的峰(标记为"EDA")对应于肽IAWESPQGQVSR(SEQIDNO:16)，其书f生自纤连蛋白的可变剪接的额外结构域A。此ED-A肽仅在F9小鼠肝转移瘤样品(肝转移)可4企测到而在正常小鼠肝脏才羊品(正常肝脏)则4企测不到。由左手箭头指示的参比肽(标记为"ref')用来鉴定其中ED-A肽洗脱的HPLC流yf分。这意味着，在正常小鼠肝脏样品(正常肝脏)的谱中参比肽的峰的存在表明，示出了其中ED-A肽是可检测的流份的质谱(如果它存在于正常小鼠肝样品中)。最下一行示出了在ED-A肽离子峰的位置(由箭头指示)处质谱的放大视图，其证明在正常肝脏样品中不存在这种肽。图3:A:具有flag-标记亲代抗ED-A抗体(抗ED-A)的F9肝转移瘤和相邻正常小鼠肝脏组织的免疫组织〗匕学染色(深色的线)展示出了在转移瘤中强烈染色的血管样式，而在相邻的正常肝脏组织中则检测不到任何特异性染色。在阴性对照(对照)中，省略了flag-标i己的亲4戈抗ED-A抗体。4昔助于flag-标记亲^抗ED-A抗体7见测到的染色才羊式类似于借助于flag-标记的抗ED-BscFv(L19)才元体(抗EDB)只见测到的染色才羊式，flag-标i己的抗ED画BscFv(L19)抗体(抗EDB)识别纤连蛋白额外结构域B，是新生血管结构的一种既定标记。B:示出了Svl90小鼠的器官(脾脏、心脏、肺脏以及具有两个转移瘤的肝部分)，其中上述小鼠一皮注射F9DR肺瘤细胞，并在三周以后进一步在尾静脉被注射(200(il/小鼠，即60pg抗体/小鼠)Alexa750-标记的亲抗ED-A抗体(终浓度为0.3mg/ml)。在注射Alexa750-标i己的亲^U元ED-A抗体后6小时，切除小鼠器官。利用国产的红外线荧光成像仪(Birchleretal.1999)来可一见化Alexa750-标记的亲K抗ED-A抗体染色，其中该成傳Z义装备有卣鴒灯、专门用于Alexa750的激发和发射滤光片、以及单色CCD照详目才几。图4:示出了ED-A在人转移瘤中的表达。通过免疫组织化学，利用flag-标记的亲代抗ED-A抗体来评估ED-A在人转移瘤中的表达。虽然在省略flag-标记的亲代抗ED-A抗体的阴性对照(对照)中没有4企测到阳性染色并且对于具有flag-标记的亲代抗ED-A抗体的人正常肺组织切片(正常人肺)仅观测到非常弱的背景染色，但人肺转移瘤(RCC[肾细胞癌]的人肺转移)—皮flag-标记的亲代抗ED-A抗体(抗EDA)强烈阳性染色，如深色的线和阴影所示。flag-标记的亲代抗ED-A抗体的染色样式主要是血管染色并且类似于用flag-标记的抗ED-BscFv(L19)抗体(抗EDB)所7见测到的染色样式，该flag-标记的抗ED-BscFv(L19)抗体(抗EDB)识别纤连蛋白额外结构域B,是一种新生血管结构的既定标记。借助于flag-标记的亲代抗ED-A抗体并通过结肠直肠癌的人类肝脏转移瘤(CRC的人类肝转移)的免疫组织化学分析获得了类似结果。flag-标记的亲^抗ED-A抗体展示了结肠直肠癌的人类肝脏转移瘤的强烈血管和间质染色样式。图5:示出了人ED-A(上方序列)和小鼠ED-A(下方序列)之间的序列比对。星号表示人ED-A和小鼠ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。图6:A:示出了抗ED-A抗体H1重链(VH)的核普酸序列(SEQIDNO:12)。抗ED-A抗体HI的重链CDR1的核苷酸序列力口下划线。抗ED-A抗体HI的重《连CDR2的核苷酸序列以#f体示^并加7^厕。抗ED-A抗体HI的重《连CDR3的核香酸序列以黑体示出并加下划线。B:示出了抗ED-A抗体HI4妻头序列的核普酸序列(SEQIDNO:14)。C:示出了抗ED-A抗体HI轻链(VL)的核香酸序列(SEQIDNO:13)。抗ED-A抗体HI的轻《连CDR1的核苷酸序列加下划线。抗ED-A抗体HI的轻链CDR2的核苷酸序列以^爭伴示^#》口T^V戏'。抗ED-A抗体HI的轻《连CDR3的核苦酸序列以黑体示出并加下划线。图7:A:示出了抗ED-A抗体H1重链(VH)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。抗ED-A抗体HI的重《连CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:3)力口下划线。抗ED-A抗体HI的重链CDR2的氨基酸序歹'J(SEQIDNO:4)以#爭体示^7~^/錄。抗ED-A抗体HI的重链CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:5)以黑体示出并加下划线。B:示出了抗ED-A抗体H1接头序列的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。C:示出了抗ED-A抗体HI轻《连(VL)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。抗ED-A抗体HI的轻链CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:6)力口下划线。抗ED-A抗体HI的轻4连CDR2的氨基酸序列(SEQIDNO:7)以-爭伴示^#》口T^v/試。抗ED-A抗体HI的轻链CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:8)以黑体示出并加下划线。图8:示出了F8双价抗体在F9带瘤小鼠中的生物分布。4只F9带瘤小鼠一皮静力永注射1125标记的F8双j介抗体。在24小时以后处死小鼠并切除肺瘤、肝、肺、脾、心脏、肾、肠、尾以及血液。然后对肺瘤、肝、肺、脾、心脏、肾、肠、尾以及血液进行放射性计数。图8中示出了每克(g)肿瘤、肝、肺、脾、心脏、肾、肠、尾以及血液中4企测到的1125标记的F8双价抗体的注射剂量(ID)的百分比(％)。F9肺瘤(肿瘤)包含比所分析的任何其它小鼠组织多约4倍的ID。具体实施例方式术语如在本文其它地方所述，纤连蛋白是易遭受可变剪接的抗原，并且纤连蛋白的许多可变同种型是已知的。额外结构域-A(EDA或ED-A)还^皮称为ED、额外III型重复A(EIIIA)或EDI。Kornblihttetal.(1984)，NucleicAcidsRes.12,5853-5868和Paolellaetal.(1988):NucleicAcidsRes.16,3545-3557已经^>布了人ED-A的序列。人ED-A的序列还可以获自SwissProt凄t寺居库，4乍为以登录号P02751保藏的氨基S臾序列的氨基酸1631-1720(纤连蛋白III型12;额外结构域2)。小鼠ED-A的序列可获自SwissProt数据库，作为以登录号PI1276保藏的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(纤连蛋白III型13;额外结构i或2)。纤连蛋白的ED-A同种型(A-FN)包含额外结构域-A(ED-A)。人A-FN的序列可以由相应的人纤连蛋白前体序列推断得到，该前体序列可获自SwissProt数据库，登录号为P02751。小鼠A-FN的序列可以由相应的小鼠纤连蛋白前体序列推断得到，该前体序列可获自SwissProt数据库，登录号为PI1276。A-FN可以是纤连蛋白的人ED-A同种型。ED-A可以是人纤连蛋白的额外结构域-A。ED-A是90个氨基酸序列，其通过可变剪接而被插入纤连蛋白(FN)中并^立于FN的结构i或11和12之间(Borsietal.，1987,J.CellBiol.,104,595-600)。ED-A基本上不存在于血浆形式的FN中，但匸在胚胎发生、组织重构、纤维4匕、心脏移才直以及实体肺瘤生长期间却是丰富的。22可变剪接是指发生DNA的初级RNA转录物以产生不同的mRNA的剪接存在不同模式。在切除内含子以后，可以确定选择哪些外显子一皮一起剪4妄以形成mRNA。可变剪4妻导至丈产生包含不同的外显子和/或不同凄t目的外显子的不同同种型。例如，一种同种型可以包含对应于一个或多个外显子的另外的氨基酸序列，其可以包含一个或多个结构^t潜合颠其描述彼此结合的一对分子的一个成员。结合对的成员可以是来自天然的或全部或部分地合成产生的。分子对的一个成员具有在其表面上的区域、或空腔，其结合于并因而互补于上述分子对的另一成员的特定的空间和才及性组织。结合对类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。结合成员通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是抗体分子或包含抗原结合位点的非抗体蛋白。抗原结合位点可以通过以下方式来4是供排列在非抗体蛋白支架如纤连蛋白或细月包色素B等上的互4卜决定区(CDR)(Haan&Maggos，2004;Koide1998;Hygren1997)，或随才几化或突变在蛋白支架内的环的氨基酸残基以赋予对于预期靶的结合特异性。Nygren等(1997)已详细综述了用于在蛋白质中设计新结合位点的支架。WO/0034784披露了抗体模拟物的蛋白支架，其全部内容以引用方式结合于本文，其中发明人描述了包括具有至少一个随才几化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植一个或多个CDR(例如，一组HCDR)的适宜支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员来提供。该支架可以是人类蛋白或非人蛋白质。非抗体蛋白支架的一个优点在于，它可以在支架分子中提供抗原结合位点，其中该支架分子比至少某些抗体分子更小和/或更容易制造。小尺寸的结合成员可以赋予有用的生理学特性，如进入细胞、深入渗透到组织中或达到其它结构内的靶标的能力，或在蛋白质内结合耙抗原的空腔的能力。Wess,2004综述了抗原结合位点在非抗体蛋白支架中的应用。蛋白质通常具有稳定的骨架以及一个或多个可变环，其中该一个或多个环的氨基酸序列发生特异性地或随才几地突变以产生结合靶抗原的抗原结合位点。这样的蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S."MM)的蛋白A、运铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如，第10个纤连蛋白III型结构域)以及脂质运载蛋白(lipocalins)的IgG结合域。其它方式包括合成基于植物环蛋白(cyclotides)的"樣吏体(Microbodies)，，(SelecoreGmbH)，it植物环蛋白是具有分子内二硫键的小蛋白。除抗体序列和/或抗原结合位点以外，根据本发明的结合成员可以包含其它氨基酸，例如，形成肽或多肽，如折叠结构域，或赋予分子除结合抗原能力之外的另一种功能特点。本发明的结合成员可以携带可一企测标记，或可以结合于毒素或革巴标部分或酶(例如，经由肽4建(peptidylbond)或接头)。例如，结合成员可以包含催化部位(例如，在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合于抗原并因而使催化部位靶向于抗原。催化部位可以例如通过切割来抑制抗原的生物学功能。如前所述，虽然非抗体支架可以携带CDR，j旦用于携带本发明的CDR或CDR组的结构将通常是抗体重链或轻链序列或其实质部分，其中CDR或CDR组位于对应于由重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变i或的CDR或CDR组的位置。可以通过参考Kabat1987及其更新来确定免疫J求蛋白可变i或的结构和^f立置，现可获自互4关网(在immuno.bme.nwu.edu或利用任何搜索引擎查找"Kabat")。CDR区或CDR用来指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如由Kabat等(1987)(Kabat1991a，以及最新片反本)所定义的。抗体通常包含3个重《连CDR和3个轻链CDR。本文中的术语CDR(才艮据情况)用来指这些区域之一、或这些区域的若干或甚至全部，这些区域包含负责通过抗体对于它所识别的抗原或表位的亲和力而进行结合的大多数氨基酸残基。在6个短CDR序列中，重《连的第三CDR(HCDR3)具有4交大的尺寸可变性(基本上是由于产生它的基因的排列机制而具有较大的多样性)。它可以短至2个氨基酸，虽然已知的最长尺寸是26个氨基酸。功能上，HCDR3在确定抗体的特异性方面具有部分作用(Segal1974;Amit1986;Chothia1987;Chothia1989;Caton1990;Sharon1990a;Sharon1990b;Kabatetal.,1991b)。拔体为\子其描述了免疫球蛋白，不管是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还涵盖包含抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白质。这里必须明了，本发明并不涉及天然形式的纟元体，即抗体并不处于它们的天然环境中，而是已能够通过乂人天然来源纯化、通过基因重组、或通过化学合成而分离或获得，因而它们包含如后文将描述的非天然氨基酸。包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于抗体分子如Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fd,以及双价抗体。可以采用单克隆抗体和其它抗体并使用重组DNA技术来产生结合靶抗原的其它抗体或嵌合分子。这样的技术可以涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区、或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区、或恒定区加上骨架区。参见，例如，EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400、以及大量随后的文献。可以4吏产生抗体的杂交瘤或其它细力包经受基因突变或其它变化，这会4吏所产生的抗体的结合特异性发生改变或不发生改变。由于可以用许多方式来^f奮饰抗体，所以术语"抗体分子，，应被解释为涵盖具有所需要的特异性的抗体抗原结合位点和/或结合于抗原的任何结合成员或物质。因此，此术语涵盖抗体片革殳和书f生物，包括包含抗体抗原结合位点的任何多肽，不管是天然的或是全部或部分合成的。因而包括融合于另一种多肽(例如，来自另一物种或属于另一种抗体类型或子类)的包含抗体抗原结合位点的嵌合分子、或等^介物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023、以及大量的随后文献中描述了嵌合抗体的克隆和表达。在抗体工程领域可获得的其他技术已经使得分离人类抗体和人源化抗体称为可能。例如，可以才艮据Kontermann和Dubel(2001)的描述来制备人杂交瘤。噬菌体展示是另一种用于产生结合成员的已知4支术，其已在许多出版物中有详细描述，如WO92/01047(下文进一步"i仑述)详口美国专矛JUS5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404以及Kontermann和Dubel(2001)。專争基因小鼠可以用于分离人抗体，其中小鼠抗体基因被灭活并且功能上由人抗体基因替换并同时完全保留小鼠免疫系统的其它成分(Mendezl997)。核苷酸产生的基因来产生合成的抗体分子，例如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所4苗述的。已表明，整个抗体的片段能够实现结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)Fab片段，其含有VL、VH、CL以及CH1结构域；(ii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)Fv片段，其由单一抗体的VL和VH结构i或纟且成；(iv)dAb片,殳(Ward1989;McCafferty1990;Holt2003)，其由VH或VL结构i或纟且成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其为一种二价片段，包含两个相连的Fab片段；(vii)单4连Fv分子(scFv)，其中VH结构i或和VL结构域通过连4妻肽相连，该连接肽使得两个结构域可以if关合以形成抗原结合位点(Bird1988;Huston1988);(viii)双特异性单《连Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)"双价抗体"，其是通过基因融合构造的多价或多特异性片l殳(WO94/13804;Holliger1993a)。可以通过加入连才妻VH和VL结构域的二石克桥来稳、定Fv、scFv或双1"介抗体分子(Peiter1996)。包含连孑妄于CH3结构域的scFv的樣吏抗体(minibody)也是可以力口以制备的(Hu1996)。结合片段的其它实例是Fab'，其与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基，包括来自抗体4交《连区的一个或多个半月光氨酸，以及Fab'-SH，其是一种Fab'片段，其中恒定域的半胱氨酸残基携带一个游离的巯基。可以由本文描述的任何抗体分子起始来获得本发明的抗体片孚殳，例如，包含本文描述的4壬4可抗体的VH和/或VL结构i或或CDR的抗体分子，通过一些方法如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化、和/或借助于化学还原的二碌^桥的切割。在另一种方式中，本发明的抗体片革殳可以通过本领域^支术人员同样众所周知的基因重组4支术或通过月太合成(4昔^力于例长口自动肽合成4义，长口由AppliedBiosystems等公司提供的)、或通过核酸合成和表达来获得。根据本发明的功能抗体片段包括任何功能片段，该功能片段的半衰期通过化学々务饰、尤其通过聚乙二醇化、或通过结合到脂质体中而增力口。dAb(结构域抗体)是抗体的小单体(monomeric)抗原结合片段，即抗体重纟连或轻链的可变区(Holt2003)。VHdAb天然存在于^^驼(例如，^^驼、美洲驼)体内并且可以通过用靶抗原免疫-格驼、分离抗原特异性B细胞以及直接克隆来自个体B细胞的dAb基因来产生。还可以通过细胞培养来产生dAb。它们的小尺寸、良好的可;容性以及温度稳定性4吏它们在生理上尤其有用的并且适合用于选择和亲和力成熟。本发明的结合成员可以是dAb,其包含基本上如在本文中陈述的VH或VL结构i或，或包含基本上如在本文中陈述的一纟且CDR的VH或VL结构i或。如在本文中所7吏用的，短语"基本上如陈述的"是指与本文描其序列的特定区域相同或高度类似。如本文所描述的，相对于一个或多个可变结构域的特定区域，短语"高度类似的"是指，在CDR和/或VH或VL结构i或中可以进4亍1至约5个，例如1至4个，包4舌1至3个，或1个或2个，或3个或4个氨基酸置才奐。双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同可变区净皮结合在相同分子中(Holliger1999)。冲艮据它们补充新效应子功能或靶向在胂瘤细胞表面上的若干分子的能力，已证明了它们在诊断领域和治疗领域的应用。在使用双特异性抗体的情况下，它们可以是常规的双特异性抗体，其能够用多种方法加以制备(Holliger1993b),例如，4匕学制备或由二次杂交瘤(hybridhybridoma)制备，或可以是任何上述双特异性抗体片4殳。这些抗体可以通过4b学方法(Glennie1987;Repp1995)或体细月包方法(Staerz1986;Suresh1986)获得，但同样可以通过基因工程技术获得，其会迫4吏异二聚体形成并因而促进所寻找抗体的纯化过程(Merchand1998)。双特异性抗体的实例包4舌BiTETM纟支术的那些双特异性抗体，可Jv28柔性肽直接连接。这样就将两种抗体结合在一个短的多肽单链上。可以构造双《介抗体和scFv而没有Fc区，其中^叉利用可变结构域，乂人而潜在地降低抗独特型反应的影响。双特异性抗体可以^皮构造成整个IgG、乂又特异性Fab'2、Fab'PEG、双1介抗体或双特异性scFv。另外，可以利用本领i或已知的常*见方法来连接两个双特异性抗体以形成四价抗体。相对于双特异性全长抗体，双特异性双链抗体也可以是特别有用的，因为它们可以容易构建并表达在大肠杆菌(Eco//)中。利用，寇菌体展示(WO94/13804)，可以容易地/人文库选才奪具有适当结合特异性的双价抗体(和许多其它多肽如抗体片段)。如果双价抗体的一个臂保持恒定，例如，具有指向靶抗原的特异性，那么就可以建造文库，其中另一个臂是变化的并选择具有适当特异性的抗体。可以通过如在Ridgeway1996中所描述的其他/没计方法来制备双特异性全长抗体。在本领域可以利用多种方法来获得针对耙抗原的抗体。抗体可以是单克隆抗体，尤其是人、鼠、嵌合或人源化起源的单克隆抗体，其可以4要照本领域4支术人员熟知的标准方法来获4寻。通常，为了制备单克隆抗体或它们的功能片段(尤其是鼠来源的)，可以参照尤其是在手册"Antibodies"(Harlow和Lane1988)中描述的4支术或参照由Kohler和Milstem，1975描述的由杂交瘤制备的技术。单克隆抗体可以获自，例如，于A-FN、或其片段之一加以免疫的动物细胞，其中该片段包含由所述单克隆抗体识别的表位，例如，包含ED-A或由ED-A组成的片l殳、或ED-A的肽片l殳。A-FN、或其片,殳之一尤其可以4安照通常的工作方法加以制备，其中通过起29始于核酸序列(包含在为A-FN或其片段编码的cDNA序列中)的基因重组，通过起始于包含在A-FN和/或其片段的肽序列中的氨基酉臾序列的力太合成。可以例如用亲和柱来纯〗匕单克隆抗体，在亲和4主上已预先固定A-FN或包含由所述单克隆抗体识别的表^立的片l殳之一，例如包含ED-A或由ED-A组成的片段或ED-A的肽片革殳。单克隆抗体的纯化可以如下进4亍在A蛋白和/或G蛋白上的层冲斤，4妻着进4亍或不进行离子交换层析，其目的在于除去其自身残留的蛋白质污染物以及DNA和LPS,接着进行或不进行在琼脂糖凝胶上的排阻层析以除去由于存在二聚体或其它多聚体而引起的潜在聚集物。可以同时或接连使用所有这些技术。抗肩/#合位,《抗体分子中，它纟皮称为抗体抗原结合位点，并且包含结合于并且互补于所有或部分的乾"抗原的那部分抗体。在抗原4交大的情况下，抗体可以〗又与抗原的特定部分结合，该部分4皮称作表位。抗体抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗体抗原结合位点可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重《连可变区(VH)。分离的其是指这样的状态，其中本发明的结合成员或编码上述结合成员的核酸将通常是与本发明一致的。因此，本发明的结合成员、VH和/或VL结构域可以分离和/或纯化自例如它们的自然环境，并且为基本上纯的或均匀的形式，或者，对于核酸而言，没有或基本上没有不同于编码具有所需功能的多肽的序列的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸将不含有或基本上不含有与其天然伴随的物质，如其它多肽或核酸，在它们的自然环境中，或它们-故制备的环境中(例如细胞培养)其与这样的物质相伴存在，上述制备是通过体外或体内实施的重组DMA纟支术而进^f亍的。可以用稀释剂或佐剂来配制成员和核酸并仍然用于^皮分离的实际用途，例如，如果用来涂布供免疫测定之用的微量滴定板，则通常会使得成员与明胶或其它载体混合，或当用于诊断或治疗时则将其与药用载体或稀释剂混合。结合成员可以#皮#唐基化，天然一唐基化或通过异源真核细月包(例如CHO或NSO(ECACC85110503细月包))的系统^皮并唐基化，或它们可以是(例如如果通过在原核细胞中的表达所产生)非糖基化的。包含4元体分子的异质制剂(heterogeneouspreparation)也形成本发明的一部分。例如，上述制剂可以是抗体与全长重^t连和缺少C端赖氨酸的重链的混合物，并具有不同程度的糖基化和/或具有衍生氨基酸，如N端谷氨酸的环化以形成焦谷氨酸残基。抗原的一种或多种结合成员，例如，纤连蛋白的A-FM或ED-A,可以通过下述方式获得使才艮据本发明的结合成员的文库接触抗原或其片4殳，例如包含ED-A或由ED-A组成的片段或ED-A的肽片l殳，然后选l奪能够结合该抗原的文库的一种或多种结合成员。可以利用IterativeColonyFilterScreening(ICFS)来筛查4元体文库。在ICFS中，包含编码若干结合特异性的DNA的细菌生长在液体培养基中，并在已达到指数生长期以后，使数以十亿计的细菌分布在由适合的预处理薄膜滤器组成的生长载体上，对其进行温育直到出现完全汇合的细菌菌落。第二捕获衬底(trapsubstrate)包括另一个薄膜滤器，其被预加湿和覆盖有所期望的抗原。然后将捕获薄膜滤器放置在平板上，该平板包含适宜的培养基并覆有生长过滤器，其表面覆盖有朝上的细菌菌落。在室温下温育如此获得的夹层大约16小时。因此可以获得编码抗体片段scFv(具有扩散作用)的基因的表达，以致那些特异性地结合于存在于捕获膜上的抗原和片賴:被捕获。然后借助于通常用于此目的的比色才支术处理捕获膜以示出结合的抗体片段scFv。据捕获过滤器上着色斑点的位置可以追溯到存在于生长膜上并产生捕获的抗体片段的相应细菌菌落。聚集上述菌落并生长，然后将几百万细菌分布在新的培养力莫上并重复上述程序。然后进4亍类似的循环直到在捕获膜上的阳性信号对应于单个阳性菌落，每一个阳性菌落都是指向在选择中所用抗原的单克隆抗体片段的潜在来源。ICFS描述在例如WO0246455中，其以引用方式结合于本文。文库还可以在颗粒或分子复合物上展示，例如，可复制的基因组(geneticpackage)如噬菌体(例如T7)颗粒，或其它体外展示系统，每种颗粒或分子复合物包含编码展示在其上的抗体VH可变域的核S臾，以及可选地还包含展示的VL结构i或(3口果存在的i舌)。噬菌体展示描述于WO92/01047和例如美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US61据71、US6172197、US6225447、US6291650、US6492画以及US6521404,其全部内容以引用方式结合于本文。在选4奪能够结合抗原的结合成员并展示在噬菌体或其它文库颗粒或分子复合物上以后,核酸可以获自展示所述选4奪的结合成员的噬菌体或其它颗并立或分子复合物。这样的核酸可以用于随后的通过从核酸表达来产生结合成员或抗体VH或VL可变结构域，该核酸具有获自展示所述选才奪的结合成员的噬菌体或其它颗粒或分子复合物的核酸的序列。的抗体VH可变域可以分离的形式提供，正如包含上述VH结构域的结合成员可以分离的形式4是供一样。可以进一步测-试结合A-FN或纤连蛋白的ED-A或其它革巴:阮原或同种型的能力，例如，与例如抗ED-A4元体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9中的4壬4可一种竟争寸生结合于A-FN或A-FN的片4殳，例如纤连蛋白的ED-A,的能力。本发明的结合成员可以4争异性』也结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。本发明的结合成员可以结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A,并且亲禾口力坤目同于^元ED-A^t体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9(例如具有scFv格式)，或具有更好的亲和力。本发明的结合成员可以结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A,其中KD为3xl(T8M或具有更好的亲和力。优选地，本发明的结合成员以Ko为2x10—SM或更好的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。更4尤选i也，本发明的结合成员以Ko为1.7xl(T8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。还要更优选地，本发明的结合成员以Ko为1.4xl(T8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。最优选地，本发明的结合成员结合纤连蛋白的A-FN和/或ED-A,其中K。为3xl0一M或具有更好的亲和力。本发明的结合成员可以与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9—才羊结合于A-FN和/或纤连蛋白的ED-A上的相同表位。本发明的结合成员可以不显示4壬4可显著结合于不同于A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的分子。尤其是该结合成员可以不结合纤连蛋白的其它同种型，例如纤连蛋白的ED-B同种型和/或IIICS同种型。可以产生本文披露的抗体分子的变体并用于本发明。在CDR、抗体VH或VL结构域以及结合成员的氨基酸序列内进行置换所需要的纟支术是本纟支术领域通常可获知的。借助于置换可以构建变体序列，并测试结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力和/或测试4壬4可其它所期望的性能，其中置换可以或不可以预测是否对活性具有最小或有利影响。如所讨论的，根据本发明，可以采用本文具体披露了其序列的VH和VL结构域中的任一种的可变结构域氨基酸序列变体。特定的变体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的加入、缺失、置换和/或插入)，可以少于约20个改变，少于约15个改变，少于约10个文变或少于约5个支变，可以是5、4、3、2或1个改变。可以在一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中进4亍改变。上述改变通常并不导致功能丧失，所以包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可以保留结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。例如，它可以-f呆留与没有进4亍改变的结合成员相同的定量结合，例如，如在本文描述的测定中所测得的。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可以具有改善的结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。可以利用一种或多种所选VH和/或VL基因的随才几i秀变以在整个可变结构域内产生突变，从而产生本发明的新的携带CDR衍生序列的VH或VL区。在某些实施方式中，在CDR组的整个可变结构域内进行一个或两个氨基酸置换。可以使用的另一种方法是将诱变定向于VH或VL基因的CDR区。如前所述，基本上如本文陈述的CDR氨基酸序列可以作为在人抗体可变结构域中的CDR或其实质部分。基本上如本文陈述的HCDR3序列代表本发明的实施方式并且例如这些序列中的每一个可以4乍为人重链可变结构:威中的HCDR3或其实质部分。本发明采用的可变结构域可以获自或衍生自任何种系或重排的人可变结构i或，或可以是基于已知人可变结构i或的共有序列或实际序列合成的可变结构域。可变结构域可以衍生自非人抗体。利用重组DNA^支术，可以将本发明的CDR序列(例如CDR3)引入缺少CDR(例如CDR3)的全套的可变结构:威。例如，Marks等(1992)描述了产生全套抗体可变结构域的方法，其中位于或相邻于可变结构域区域的5'端的共有引物连同共有与1物一起用于人VH基因的第三骨架区以^是供在夹少CDR3的VH可变结构i或的基因i普型(repertoire)。Marks等进一步4翁述了上述基因i普型(repertoire)如何结合于特定抗体的CDR3。利用类似的4支术，本发明的CDR3衍生序列可以混合于缺少CDR3的VH或VL结构域的基因谱型，以及混合的完全VH或VL结构域结合于关写关VL或VH域以4是供本发明的结合成员。然后可以用适宜的宿主系统如WO92/01047的噬菌体展示系统(其全部内容以引用方式结合于本文)、或随后的大量文献的噬菌体展示系统，包4舌Kay、Winter&McCafferty(1996)，来展示上述抗体的基因谱型，以便可以选择适合的结合成员。该全套可以由来自4壬4可物种(anything)的104个以上的单独成员组成，例3。由至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少101G个成员组成。类似、:t也，可以爿寻一个或多个、或所有三个CDR移才直到全套的VH或VL结构域，然后对其进行筛选以获得纤连蛋白的A-FN和/或ED-A的一个或多个结合成员。可以采用4元体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的HCDR1、HCDR2以及HCDR3中的一种或多种，或HCDR纟且，禾口/或可以采用4元体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的XLCDR1、LCDR2以及LCDR3中的一种或多种，或抗体H1、B2、C5、D5、E5、CB、F8、Fl、B7、E8或G9的LCDR组。类4以i也，可以采用本文4皮露的其它VH和VL结构i或、CDR组以及HCDR组和/或LCDR组。纤连蛋白的A-FN和/或ED-A可以用于筛选例如抗体分子的结合成员，以用来制备用于治疗肿瘤转移瘤的药剂。如在本文其它地方所4皮露的，该筛选可以是基因i普型(r印ertoire)的筛选。在某些实施方式中，免疫球蛋白可变域的实质部分将包含至少三个CDR区、以及它们的间隔骨架区。该部分还可以包4舌至少约50%的第一和第四骨架区的一者或两者，该50%是第一骨架区的C端50。/。和第四骨架区的N端50。/。。在可变域的实质部分的N端或C端的另外的残基可以是那些并不通常伴随天然存在的可变域区的残基。例如，通过重组DMA技术制备的本发明的结合成员的结构可以导致引入由引入的接头编码的N端或C端残基，以便于进行克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括引入接头以将本发明的可变结构域连接于另外的蛋白质序列，该另外的蛋白质序列包括如在本文别处更详细讨论的抗体恒定区、其它可变结构域(例如在双-阶抗体的生产中)或可4企测/功能标记。虽然在本发明的某些方面中，结合成员包含一对VH和VL结构域，但基于VH或VL结构域序列的单个结合域则形成本发明的进一步的方面。已知，单个免疫^求蛋白结构域，尤其是VH域，能够以特异性的方式结合草巴抗原。例如，参见以上dAb的讨论。在^f壬一单个结合i或的情况下，这些结构i或可以用来筛选能够形成两结构域结合成员的互补结构域，该两结构i或结合成员能够结合纤连蛋白的A-FN和/或ED-A。这可以通过噬菌体展示筛选方法并利用如在WO92/01047中所4皮露的所谓分级双重组合方法(其全部内容以引用方式结合于本文)来实现，其中包含H或L链克隆的单个菌落用来感染编码其它链(L或H)的克隆的完全文库并且4安照噬菌体展示技术如在该参考文献中所描述的那些技术来选择所得到的双《连结合成员。此才支术还4皮露在Marks1992中。本发明的结合成员可以进一步包含抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C端连接于抗体轻链恒定域，其包括人CK或CX链，例如C人。类似地，基于VH结构域的结合成员可以在其C端连接于所有或部分(例如CH1域)的衍生自抗体同种型的免疫球蛋白重链，例如，IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同种型子类，尤其是IgGl和IgG4。具有这些性能并明的实施方式。本发明的结合成员可以标记有可4企测的或功能标记。标记可以是产生或可以被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光剂、》文射性标记、酶、化学发光剂或光壽丈剂。因此，可以通过纟企测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测量结合。可以利用本领域已知的常规化学性能来将可^r测标记附于本发明的抗体。存在i午多方法，z借助于这些方法，才示i己可以产生通过外部方式可4全测的信号，例如，通过目一见斗企查、电^兹辐射、热、以及化学试剂。该标记还能够与结合本发明的抗体的另一结合成员结合，或与载体结合。标记的结合成员例如标i己有可才企测标i己的scFv，可以用于体内或体外i貪断，和/或用于治疗。例如，放射性标记的结合成员(例如结合(共轭或轭合)于放射性同位素的结合成员)可以用于放射诊断和放射治疗。可以结合(共辄或辄合)于本发明的结合成员的放射性同位素包括以下同位素，如一Tc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、川In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、卯Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh以及"7Lu。例如，标记有可4企测标记的本发明的结合成员可以用来4企测、-珍断或监测人或动物体内的一种和/或多种肿瘤转移瘤。可以将结合成员给予人或动物，通常是人类患者,然后可以确定人或动物体体内在远离由原发性肺瘤目前或以前占据部位的部位是否存在抗体；抗体分子定位于人或动物体内在远离由原发性肺瘤目前或以前占据部位的部位则表明存在一种和/或多种肿瘤转移瘤。本发明的结合成员可以用于制造供诊断肿瘤转移瘤之用的诊断产品。法，包纟舌以下步-骤(a)纟会予人或动物本发明的结合成员，例如标记有可4佥测标记的结合成员，其结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A,以及(b)确定在人或动物体体内在远离由原发性肺瘤目前或以前占据部位的部位是否存在结合成员；其中结合成员定位于人或动物体内在远离由原发性肿瘤目前或以前占据部位的部位则表明存在肿瘤转移瘤。在结合成员标记有可才企测标i己的情况下，可以通过冲企测标^己来确定可才企测标i己的存在或不存在。如本文所描述的结合成员还可以用于在竟争性测定中测量抗原水平，即在竟争性测定中通过采用如由本发明提供的结合成员来测量样品中抗原水平的方法。这样就不需要将结合与未结合抗原进4亍物理分离。将净艮道分子连4妄于结合成员以致结合时会发生物理或光学变化是一种可能性。报道分子可以直接或间接地产生可检测信号，该信号可以是可量化的。报道分子的连接可以是直接或间接的，38共价的，例如借助于肽键，或非共价的。借助于肽键的连接可以是由于编码抗体和才艮道分子的基因融合的重组表达。竟争性测定还可以用于表位作图。在一个实例中，表位作图可以用来鉴定由结合成员结合的表位。这样的表位可以是线性的或构象的。构象表^立可以包含纤连蛋白的A-FN或ED-A的至少两个不同的片,史，其中当纤连蛋白的A-FN或ED-A^L折叠成其三级或四级结构时，所述片賴:;波此4妄近地定位以形成^皮纤连蛋白结合成员的A-FN或ED-A所识別的构象表位。在测试竟争性时，可以采用抗原的肽片段，尤其是包括感兴趣的表位的肽或基本上由感兴趣的表^立的肽组成的肽片,殳。可以4吏用在4壬一未端具有表^f立序列加上一个或多个氨基酸的肽。才艮据本发明的结合成员这样就可以4吏它们与抗原的结合受到具有或包括:纟合定序列的肽的抑制。本发明的另外的方面采用结合物(或辄合物)或本发明的结合成员与对病变处的耙细胞施加杀生物性或细胞毒性作用的分子以及存在于上述病变处的针对细胞外基质成分的抗体之间的融合。例如，杀生物分子或细胞毒性分子可以是白细胞介素-2(IL-2)、多柔比星、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-y(IFN-y)、肿瘤坏死因子a(TMFa)或组织因子(优选截短的)。这样的结合物(轭合物)可以治疗上用于例如治疗如本文4是及的肺瘤转移瘤和/或肺瘤。例如在WO01/62298中描述了结合成员与杀生物分子或细胞毒性分子的融合或结合物(轭合物)的生产和应用，其以引用方式结合于本文。在一个方面，本发明提供了治疗一种和/或肺瘤转移瘤的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的包含本发明的结合成员的药物。结合成员可以是(i)通过细胞间相互作用对草巴细月包施加杀生物性或细胞毒性作用的分子的结合物(轭合物)和(ii)纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员的结合物(扼合物)。在另一个方面，本发明提供了本发明的结合成员用于制备药物的应用，该药物用于治疗一种和/或多种月中瘤專争移瘤。结合成员可以结合于或融合于如本文所描述的施加杀生物性或细胞毒性作用的分子。结合成员可以是(i)通过细胞间相互作用对靶细胞施加杀生物性或细胞毒性作用的分子的结合物和(ii)根据本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物。在又一个方面，本发明^是供了将(i)通过细胞间相互作用对靶细胞施加杀生物性或细胞毒性作用的分子的结合物和(ii)根据本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物用于治疗人或动物体的方法。这样的治疗可以是一种和/或多种胂瘤转移瘤的治疗。本发明的又一方面提供了(i)通过细胞间相互作用对靶细胞施加杀生物性或细胞毒性作用的分子的结合物和(ii)根据本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物。这冲羊的结合物优选包含融合蛋白(包含杀生物分子或细胞毒性分子)和所述结合成员，或者，其中结合成员是双链或多链的，融合蛋白包含杀生物分子或细胞毒性分子以及所述结合成员的多肽链成分。优选地，该结合成员是单链多肽，例如，单链抗体分子，如scFv。因此，本发明的进一步的方面提供了融合蛋白，其包含杀生物分子或细胞毒性分子以及本发明的单《连Fv抗体分子。通过细胞间相互作用对耙细胞施加其作用的杀生物分子或细胞毒性分子可以与靶细胞直接发生相互作用，可以与耙细胞上的膜结合受体相结合，或扰动细胞膜的电化学势。与膜结合受体相结合的分子包括趋化因子、细胞因子以及激素。扰动细胞膜的电化学势的化合物包括溶血素、离子载体、作用于离子通道的药物。在示例性的优选实施方式中，上述分子是白细胞介素-2、组织因子(优选截短的)或阿霉素。其它实施方式可以采用白细胞介素12、干扰素-y、IP-IO以及肿瘤坏死因子-a(TNF-a)。40正如下文将进一步讨i仑的，特异性结合成员优选为一种抗体或包含抗体抗原结合位点。便利地，特异性结合成员可以是单链多肽，如单《连抗体。这^f吏得可以方使j也生产包含单4连抗体和杀生物分子或细胞毒性分子(例如，白细胞介素-2或组织因子)的融合蛋白。在其它实施方式中，可以通过在分离的多肽中，例如在完整抗体中或在如Fab或双1介抗体的抗体片,殳中结合抗体VH结构域和抗体VL结构域，来提供抗体抗原结合位点。在特异性结合成员是双链或多《连分子(例如分别为Fab或整个抗体)的情况下，杀生物分子或细胞毒性分子可以被结合为具有特异性结合成员中的一个或多个多肽链的融合多肽。结合成员可以借助于肽4建而结合于杀生物分子或细胞毒性分子，即在融合多肽内包含所述分子和特异性结合成员或其多肽链成分。关于可用于制备包含IL-2的融合多肽的IL-2序列信息，参见Taniguchietal.(1983)Nature302,305-310;MaED-Aetal.(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115:1040-1047;Devosetal.(1983)Nucl.AcidsRes.11:4307-4323。Scarpatietal.(1987)Biochemistry26:5234-5238、以及Rufetal.(1991)J.Biol.Chem.226:15719-15725提供了关于截短的组织因子的序列信息。用于结合的其它方式包括化学结合，尤其是利用双功能试剂的交联(例如采用DOUBLE-PEAGENTSTM交写关剂选才奪指南(DOUBLE-PEAGENTSTMCross-linkingReagentsSelectionGuide),Pierce)。在期望緩释的情况下，例如，在杀生物分子或细胞毒性分子是阿霉素或扰动细胞膜的电化学势的其它分子的情况下，化学结合可以是借助于在特异性结合成员(多肽，如抗体或抗体片段)的伯氨基基团和杀生物分子或细胞毒性分子(如阿霉素)的氧化糖部分(六碳氨糖)之间形成席夫石咸(亚胺)。本发明进一步提供了一种编码本发明的结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个方面，本发明一是供了核酸，其编码如上述所定义的本发明的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构i或或抗体抗原结合〗立点或抗体分子，例如scFv或IgG,例如IgGl。优选的核香酸序列是编码本文4皮露的VH和/或VL结构域的核苷酸序列。本发明还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种如上所述的多核香酸。本发明还提供了重组宿主细胞，其包含如上所述的一种或多种构建体。编码"壬4可CDR或CDR《且或VH结构i或或VL结构i或或4元体抗原结合位点或抗体分子，例如所l是供的scFv或IgGl或IgG4，其本身形成本发明的一个方面，正如产生编码产物的方法形成本发明的一个方面一才羊，该方法包4舌来自编码核酸的表达。通过在适当条件下培养包含核酸的重组宿主细胞可以方便地实现表达。在通过表达进行生产以后，可以利用任何适宜的技术来分离和/或纯化VH或VL结构i^、或结合成员，然后在适当情况下4吏用。分合成的。除非上下文另有要求，如本文所述的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并包括具有其中用U替换T的特定序列的RNA分子。又一个方面纟是供了生产纟元体VH可变结构i或的方法，该方法包括引起来自编码核酸的表达。这才羊的方法可以包括在用于生产所述抗体VH可变结构域的条件下培养宿主细胞。作为本发明的进一步的方面，4是供了生产VL可变结构域和包含VH和/或VL结构域的结合成员的类似方法。生产方法可以包4舌产物的分离和/或纯步-骤。生产方法可以包括将产物配制成组合物，该组合物包括至少一种另外的成分，如药用赋形剂。用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。适宜的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、一直物细胞、丝状真菌、酵母菌和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。在本领域已很好确立了抗体和抗体片段在原核细胞中的表达。关于综述，参见例如Pliickthun1991。一种常用细菌宿主是大肠杆菌(￡.co//)。.邻戮仪个八贝ioi可^作为一种选择来生产结合成员，例如Chadd&Chamow(2001)、Andersen&Kmmmen(2002)、Larrick&Thomas(2001)。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细月包、海拉细胞(HeLacells)、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细月包、YB2/0大鼠骨髓瘤细月包、人胚肾细胞、人胚胎一见网膜细月包以及许多其他细胞。可以选4奪或构建适宜的载体，其包含适当的调节序列，包括启动子序列、终止序列、多&i苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及在适当的情况下包括其他序列。在适当情况下载体可以是质粒例如p藍菌4立，或病毒例如p盆菌体。关于进一步的详'lt,参见例如，Sambrook&Russell(2001)。例如在制备核酸构建物、i秀变、测序、DNA引入细胞和基因表达、以及蛋白质分析中，用于l喿作核酸的许多已知4支术和实-睑方案详细描述在Ausubel1999中。本发明的进一步的方面提供了一种宿主细月包，其包含如本文所披露的核酸。这样的宿主细胞可以是体外的并且可以是在培养物中的。这样的宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在可以便于本发明的结合成员细胞内表达为"胞内抗体(intrabody)，，或细胞内抗体。胞内抗体可以用于基因治疗。又一个方面提供了一种方法，该方法包括将本发明的核酸引入宿主细胞中。上述引入可以采用任何可获得的技术。对于真核细胞，适宜的技术可以包括磷酸钙转染、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)、电穿孔、脂质体介导的转染和转导，其中利用逆转录病毒或其他病毒，例如牛痘，或对于昆虫细胞为杆状病毒。在宿主细胞，尤其是在真核细月包中引入核酸可以-使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以被附加地保持或可以净皮掺入到宿主细胞或人工染色体中。掺入可以通过在单个或多个基因座处随机或定向整合一个或多个拷贝来实现。对于细菌细胞，适宜的技术可以包括氯化4丐转化、电穿孔以及利用噬菌体的转染。引入以后，可以4妻着引起或使得核酸表达，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。可以借助于本领域技术人员已知的方法来纯化表达的产物。根据本发明，本发明的核酸可以被整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以按照标准技术通过包括促进与基因组重组的序列来促进整合。本发明还提供了一种方法，该方法包括在表达系统中使用如上所述的构建物以表达如上所述的结合成员或多肽。本发明的结合成员被设计用于在人或动物受试者(例如人)中进行诊断或治疗的方法。结合成员可以用于一种和/或多种肿瘤转移瘤的it断或治疗。44因此，本发明的进一步的方面提供了治疗方法，该方法包括给予如所提供的结合成员、包含这样的结合成员的药物组合物、以及这样的结合成员用于制备所给予的药物的应用，例如在包括将结合成员与药用赋形剂配制在一起的制备药剂或药物组合物的方法中。药用载体是众所周知的并由本领域^支术人员才艮据所选4奪的活性化合物的特性和给予方式来采用。通常以药物组合物的形式《合予本发明的结合成员，该药物组合物可以包含除结合成员以外的至少一种成分。因此才艮据本发明并才安照本发明使用的药物组合物除活性组分之外还可以包含药用赋形剂、载体、緩冲剂、稳定剂或本领域4支术人员熟知的其他物质。这才羊的物质应该是无毒的并且不应干护G活性组分的效力。载体或其他物质的准确特性将取决于纟会予途径，其中纟合予途径可以是口月l、吸入或通过注射，例3。静月永内注射。本发明还设想了用于口服的药物组合物，例如纳米抗体(nanobody)等。这样的口服制剂可以是片剂、胶嚢剂、散剂、液体或半固体形式。片剂可以包含如明胶或佐剂之类的固体载体。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油(或石蜡油)、动物油或才直物油、矿物油或合成油。可以包4舌生理盐水溶液、葡萄糖或其^4t〉容液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射、或在痛苦部位的注射，活性组分将具有胃肠道外用水溶液的形式，其是无热原的并且具有适宜的pH、等渗性以及稳、定性。本领域:技术人员能够4艮好地制备适宜的溶液，其中利用例如，等、渗载体3口氯4匕钠注射、液(SodiumChlorideInjection)、沐木才各氏注射液(Ringer'sInjection)、孝LS^/f匕才木才各氏:;主射-液(LactatedRinger'sInjection)。才艮才居需要，可以采用防腐剂、牙急定剂、纟爰冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。用于制备药物制剂的许多方法是本领域技术人员已知的。参见例如，Robinson,1978。可以单独主会予或耳关合其他治疗、同时或相继或作为与另一种治疗剂或多种治疗剂的联合制剂，来给予组合物，这取决于要治疗的病症。纤连蛋白的A-FN和/或ED-A的结合成员可以连同一种另外的药用成分用作联合治疗的一部分。联合治疗可以用来提供显著的协同效应，尤其是结合纤连蛋白的A-FN和/或ED-A的结合成员与一种或多种其4也药物的耳关合。可以同时会会予或相继^合予或作为与另一种治疗剂或多种治疗剂的联合制剂来^^予纤连蛋白的A-FN和/或ED-A的结合成员，以用于治疗本文所列的一种或多种病症。例如，本发明的结合成员可以和现有治疗剂一起用于治疗一种和/或多种肺瘤转移瘤。用于治疗一种和/或多种肿瘤转移瘤的现有治疗剂包括多柔比星、紫杉醇、吉西他滨、索拉非尼、美法伦、以及阿瓦其斤丁。本发明的结合成员和一种或多种上述另外的药物成分可以用于制备药剂。该药剂可以用于单独《会予或组合纟会予个体，因而可以包含结合成员和作为联合制剂或作为单独制剂的其他成分。单独的制剂可以用来^f更于分开给予和顺序给予或同时给予，并^f吏得可以通过不同途径来给予上述成分，例如通过口力良和肠胃外给予。根据本发明，可以将所提供的组合物给予哺乳动物。可以"治疗有效量，，给药，这足以显示出对患者的益处。这样的益处可以至少是至少一种症状的改善。给予的实际量、以及给予的速率和时间过程(time-course)将取决于待治疗病症的性质和严重性、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床症状、病因、组合物的递送部位、结合成员的类型、给予的方法、给药的时间安排以及医生已知的其他因素。治疗处方，例如剂量的确定等，是全科医生和其他医生的责任，并且可以才艮据4寺治疗疾病的症状的严重性和/或进展来确定处方。在本领i或中，抗体的适当剂量是众所周知的(Ledermann1991以及Bagshawe1991)。在适当情况下，可以4吏用在本文、或在《医师桌上手册》(Physician'sDeskReference(2003))中4十对要纟会予的药剂类型所指定的具体剂量。可以通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定本发明的结合成员的治疗有效量或合适剂量。将在小鼠和其他试验动物中的有效剂量类推到人类的方法是已知的。精确剂量将取决于若干因素，包括抗体是否是用于诊断、预防或用于治疗、要治疗区域的大小和位置、抗体(例如整个抗体、片段或双价抗体)的精确特性、以及任何可4企测标记或连接于抗体的其他分子的特性。对于系统应用，典型的抗体剂量范围是100pg至1g，而对于局部应用是1昭至1mg。可以给予最初專交高的负荷剂量，接着给予一次或多次较低剂量。抗体可以是整个抗体，例如IgGl或IgG4同种型。这是用于成人患者的单一治疗的剂量，对于儿童和婴儿可以4安比例;也调节，并且只t于其它^t体形式(antibodyformat)还与分子量成比例地加以调节。才艮据医生的决定，可以以每曰、每周两次、每周或每月间隔进行重复治疗。对于皮下给予，治疗可以是每两周至每四周一次，而^j"于静"永内主合予，则治疗可以是每四周至八周一次。在本发明的某些实施方式中，治疗是周期性的，并且主会予之间的期间为约两周或更长时间，例如约三周或更长时间，约四周或更长时间，或约每月一次。在本发明的其它实施方式中，可以在外并牛手术以前和/或以后纟合予治疗，并且可以直4妻纟会予或施用于手术治疗的解剖部位。技术人员来说，本发明的另外的方面和实施方式将是显而易见的。实验材料与方法动物模型动物实-验由瑞士耳关邦兽医局(SwissFederalVeterinaryOffice)i午可并4要照J离士动净勿^f呆护条例(SwissAnimalProtectionOrdinance)进行。定期监测小鼠。当显示疼痛或痛苦的任何征兆时、或在体重损失>15%的情况下，对动物实施安乐死。雄性Svl29小鼠(RCC,Fiillingsdorf,瑞士)接受静脉内注射约106突变F9鼠畸胎癌细胞(Terranaetal.1987),其由DarioRusciano(SIFI，Catania,意大利)友情提供。小鼠在肿瘤细胞注射以后3周用于体内生物素化、耙向试—验或用于免疫组织化学的器官切除。体内生物素化^口先前4翁述的(Roeslietal.2006,Rybaketal.2005),进4亍体内生物素化实-险。筒言之，通过正中胸骨切开术对麻醉小鼠实施开胸。用灌注针对左心室实施穿刺并在右心房形成小切口以使灌注溶液可以流出。其后立即进4亍体循环的灌注，其中压力为lOOmmHg，流速为1.5ml/分钟。在第一步骤中，用15ml生物素化溶液(预热至38。C)实施灌注，其中该生物素^f匕-容、液包含在PBS中的1mg/ml石黄基画NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL，USA)，pH7.4,并补充有1C)o/o(w/v)右旋糖酐-40(AmershamBiosciences,Uppsala,瑞典)作为血浆增容剂。/人而，可与生物素化反应竟争的血液成分在灌注白(以及某些糖脂和磷脂)可以被生物素共价修饰。为了中和未反应的生物素化J式剂，体内生物素4b以后用50mMTris、10%(w/v)右旋糖酐-40(在PBS中，pH7.4，预热至38。C)进行洗涤步骤10分钟。在用生物素化试剂灌注期间(以及在接着用淬灭溶液(quenchingsolution);蘀';主的最#刀3分4中内)，用50mMTris(在PBS中)，pH7.4(38。C)洗J条心脏周围的区i或，以淬灭;危出的未反应的生物素化试剂并避免在器官表面分子的不希望的标记。在灌注以后，切除器官和肺瘤，才羊品^皮新鲜速冻以用于制备器官匀浆或一皮包埋在4氐温包埋化合物(Microm,Walldorf,德国)中并在液氮中冷冻于异戊烷中以用于制备用于组织化学分析的冰冻切片。未灌注小鼠用作用于蛋白质组分析的阴性对照。蛋^^^纽为\沐的蛋冷炎取#的*备将样品再悬浮于40ial/克组织的裂解緩沖液(2%SDS、50mMTris、10mMEDTA、完全E蛋白酶承卩制剂〉'昆合物(RocheDiagnostics,Mannheim,德国)，在PBS中，pH7.4)中，然后利用Ultra-TurraxT8分散器(IKA-Werke,Staufen,德国)力口以匀4b。利用Vibra-cell(Somes,NewTown,CT，USA)对匀浆进行超声处理，接着在99。C温育15分钟并在15000xg下离心20分钟。上清液用作总蛋白提耳又物。利用BCA蛋白;农度测定^式剂盒(BCAProteinAssayReagentKit(Pierce))来确定蛋白质浓度。兰^》,化蛋白的^化只于于每个才羊品，用纟爰沖液A(NP401%、SDS0.1%，在PBS中)洗:条960pi4连霉亲和素-琼脂#唐凝月交(AmershamBiosciences,Uppsala,瑞典)淤浆三次，制成颗粒并与15毫克总蛋白l是取物混合。在RT下在旋转混合器中进行生物素化蛋白的捕获持续两小时。除去上清液并用緩沖液A洗涤树脂三次，用緩冲液B(NP400.1%,NaCl1M,在PBS中)洗涤两次，并用50mM碳酸氢铵洗涤一次。最后，将树脂再悬浮于400pi的50mM碳酸氬铵溶液并添加20(al测序级改性猪胰蛋白酶(在50mM碳酸氢铵中40ngVl的贮存液)(Promega，Madison,WI,USA)。在37。C和不断净觉4半下进4亍蛋白酶消4匕过夜。用C18樣W主(ZipTipCI8，Millipore,Billerica,MA,USA)对肽进行脱盐、纯化和浓缩。在冻干以后，将肽储存在-20。C。劲术毛细管-7/尸丄C，其^动化在錄流份定位fM4丄D/^标我通过反相高效液相色i普法(RP-HPLC)来分离力夷蛋白酶肽，其中利用UltiMate纳米尺度LC系统和FAMOS微型自动采样器(LCPackings,阿姆斯特丹，荷兰)，其通过Chromeleon软件(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)力口以4空制。流动相A由水中的2%乙腈和0,1%三氟乙酸(TFA)组成，流动相B则由水中的80%乙腈和0.1%TFA组成。流速是300nl/分钟。将来自生物素化蛋白(亲和纯化自1.5mg总蛋白)的消化的冻干肽溶解于5nl緩冲液A并装填在柱(内径75拜，长度15cm,填充有C18PepMap100,3,,100人微珠；LCPackings)上。用梯度为0-30%的B洗脱肽7分钟，用30-80%的B洗脱67分钟，用80-100%的B洗脱3分钟，然后用100%的B洗脱5分钟；在分析下一个才羊品前，用100%A对柱进4亍平4軒20分钟。将洗脱流份与3mg/mla-氰基-4-羟基肉桂酸、277pmol/ml神经降压肽(内部标准)、0.1%TFA、以及70%的乙腈水溶液混合，然后力文置在利用在线Probot系统(Dionex)的192孑LMALDI目标板上。MALDI基质溶液的流量设置为1.083(al/分钟。因此，在20秒期间内收集的每个流^f分包含361nlMALDI基质溶液和100nl样品。神经降压肽的最终浓度是100fmol/孔。M4丄D/画rOF/r(9Fl潘法用4700蛋白质纟且分4斤4义(AppliedBiosystems,Frammgham，MA,USA)进一亍MALDI-TOF/TOF质"i普分析。对于前体离子选^奪，在进4亍MS/MS以前，以MS方式测量所有部分。选冲奪最多15个前体/样品斑点用于随后的石皮碎，其中通过碰撞诱导离解。由GlobalProteinServerWorkstation(AppliedBiosystems)只寸i普进4亍处J里和分才斤，其4吏用内部MASCOT(MatrixScience,London,UK)寿欠件，用于将MS和MS/MS数据匹配于珪消化蛋白的婆t据库。相对于下载自NCBI主页(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)小鼠凝:据库筛查所获得的数据。借助于MASCOT软件进行的蛋白质鉴定被认为是对于最好的肽离子在95%置4言区间内的正确调用。利用4700蛋白质纟且分4斤4义(AppliedBiosystems)进4亍MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF质i普分冲斤。在750至4000m/z的范围内获得肽质量，其中焦点质量(focusmass)为2000m/z。MSi普总、纟吉自2000个;款光散沣立，其来自在355nm,口200Hz下才喿4乍的Nd:YAG激光器。在6个才交准孔中利用5个肽标准(质量900-2400m/z;AppliedBiosystems)进4亍自动的4反才交准。》匕*反才交准用来更tf仪器默认的用于所有MS和MS/MS谱的质量校准。另外，利用力口入MALDI基质的内部标准肽进4亍每个MSi普的内部冲交准。自动选择信噪比〉100的最多15个前体/样品孔用于随后的破碎，其中通过碰撞诱导离解。MS/MS谱总结自2500至5000个激光散粒。由GlobalProteinServerWorkstation(AppliedBiosystems)对谱进行处理和分析，其4吏用内部MASCOT(MatrixScience)專欠件，用于将MS和MS/MS数据匹配于硅消化蛋白数据库。MASCOT搜索参数是(i)2006年9月9曰下载自欧洲生4勿4言息学十办会(EuropeanBioinformaticsInstitute(EBI))主页(ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/SPproteomes/fasta/proteomes/59.M_musculus.fasta.gz)的小鼠数据库；(ii)酶胰蛋白酶和半胰蛋白酶(semi-trypsin);(iii)允许的若干错误切割1;(iv)可变翻译后寸'务饰蛋氨酸氧化；(v)肽容差±30ppm;(vi)MS/MS容差±0.2Da;(vii)肽电荷+1;(viii)用于肽的最低离子评分C.I.%:95以及(ix)排名最高肽1。另夕卜，使用了用以下参数过滤的MS/MS峰(i)质量51范围低于前体质量60Da至20Da;(ii)最小信噪比6;(iii)峰值密度过滤器最多30个峰值/200Da以及(iv)最大数量的峰/谱65。拔#先前已描述了抗ED-B抗体片革殳scFv(L19)的分离(Pinietal.1998)。利用发布的禾呈序(Giovannom，Nucleic.AcidResearch,2001,29(5):E27),乂人ETH-2文库分离亲4戈抗ED-A抗体。在以下部分描述了亲代抗ED-A抗体的亲和力成熟，产生高亲和力抗ED-A抗体。￡Z)-y4拔伴的,;fp力成熟亲代抗ED-A抗体(ETH-2书亍生抗体)用作构建亲和力成熟文库的才莫才反。在VHCDR1的位置31、32和33以及在VLCDR1的位置31、31a和32产生随才几突变的过程中，通过PCR在文库的VHCDR1(DP47种系)和VLCDR1(DPK22种系)中引入序列变异性，其中对于VH4吏用部分简并引物AGGTGAATCCAGA誦3'(SEQIDNO:17)而对于VL4吏用ACACTCTGACTGGCCCTGC画3'(SEQIDNO:18)(所有寡核芬酸购买自德、国考牛隆的OperonBiotechnologies)。通过PCR装配以scFv格式对VHVL组合进行组装，其中利用引物LMB31ong(5'画CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3')(SEQIDNO:19)和fdseqlong(5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3')(SEQIDNO:20),并利用凝月交纯化的VH和VL节,殳作为才莫^反。用NcoI/NotI双重消化组装的VH-VL片,殳并克隆到NcoI/NotI消化的pHENl噬菌粒载体(Hoogenboometal.，1991)。按照(Vitietal"2000)将获得的连接产物电穿孔到电感受态大肠杆菌TG-l细胞，产生包含1.5xl(^个个体抗体克隆的文库，其对具有改善的亲和力结合ED-A的抗体进行筛查。戎五ZX4it体的逸举筛查上述抗体文库，以获得比亲代抗ED-A抗体具有更大亲和力结合ED-A的抗体，其中利用BIAcore分才斤。在BIAcore分牙斤中所4吏用的抗原(11A12)包含人纤连蛋白的ED-A结构域并具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:120):TLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQIDNO:121)如下atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaacagcattagtgtcaagtqgctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaaaaatggacc3gg3ccaacEi犯犯cte^actgc3ggtcc3gatc犯3C3g33atg3ctattg犯ggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctcttccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacactgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaagqacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa通过PCR并利用引物来扩增抗原的核苷酸序列，其中引物在5'和3'分另'J包含BamHI和BglII限制酶切4立点。用BamHI和BglII限制性内切核酸酶消化获得的PCR产物和载体pQE12(QIAGEN),随后在包含3:1的插入片段与载体的反应中加以连接。对所获得的载体进4亍测序以斥佥查序列的正确斗生。抗原的制备如下在有1pi的11A12的DNA樣史量制剂存在的条件下，在10ml2TY、Amp、1%葡萄糖中TG1电感受态预培养物一皮电穿孔。然后预培养物-波稀释i:ioo(8ml在800ml的2TY、Amp、0.1°/。葡萄#唐中)并生长至0.4-0.6的OD600,然后一皮IPTGi秀导过夜。第二天翁:转沉淀细月包并过滤上清'液(Millipore0.22jam)。在离心并澄清液体i咅养基以后，利用在FPLC上的Hitrap柱纯化11A12。Ni/柱的再生如下用5个柱容积(CV)的H20,4妻着用3CV的0.5MEDTA/0.2MTrispH8对柱进行沖洗以从柱洗出用过的4臬。接着用5CV的H20冲洗柱。然后用2CV的100mMNiSO4重新装填柱，4妻着用若干CV的H20冲洗柱。然后用5CV裂解纟爰冲液(20mM。米峻/250mMNaCl/PBSpH7.4)对柱进一亍平tf。过滤细月包裂解液(Millipore0.45pm)并装填到柱上(手动)。然后将柱放回到FPLC上并使(约3CV)裂解緩沖液流动，直到UV信号变得稳定(恒定)。然后开始洗脱程序在5CV中，梯度从0%至100%的洗脱緩冲液(400mM口米唑/250mMNaCl/PBSpH7.4)。汇聚包含洗脱抗原的流l分，然后在PBS中透才斤过夜。抗ED-A抗体的表达和纯4匕抗ED-A抗体的表达和纯4b如下在有1nl的抗ED-A抗体之一的DNA《效量制剂存在的条件下，在10ml2TY、Amp、1%葡萄糖中，将TG1电感受态预培养物电穿孔。然后预培养物被稀释1:10054(8ml在800ml的2TY、Amp、0.1%葡萄4唐中)并生长至0.4-0.6的OD600，然后纟皮IPTGi秀导过夜。第二天》走转沉淀细力包并过滤上清液(Millipore0.22pm)。用蛋白-琼脂冲唐;疑月交柱纯化scFv并且三乙胺用来/人柱洗脱scFv。在4°C下在PBS中透析包含洗脱scFv的流份过夜。然后将scFv流伤"故置在Superdex75柱上，其中PBS以0.5ml/分钟流过并收集0.25ml流4分。单体流-除用于BIAcore分4斤。BIAcore分析1用HBS-EP纟爰冲液BIACORE、0.01MN-2-羟乙基哌口秦画N'画2画乙火克石黄酉臾(Hepes)pH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005%表面活性剂P20(用于测定的相同緩冲液)以5(al/分钟的流速沖洗BIAcore芯片过4复。抗原(11A12)在醋酸盐》爰沖液(pH4.0)中一皮稀释至50pg/ml的浓度并且通过注射50pi的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和乙基-N-(二曱基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)的混合物来激活芯片上的COOH基团。将40jil的11A12^元原注射到芯片上并用30pl乙醇胺封闭剩余的游离COOH基团。在0.22(im过滤以后，将20pl每一个体细菌上清液注射到芯片上并实时监测与抗原的相互作用。BIA匿e分析2利用表面等离子体共振评价了亲代抗ED-A抗体和抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9的k。n、k。ff以及KD。用在测定期间使用的相同的緩沖液平衡芯片过夜，其中緩沖液流速为5(il/分钟。以上述流速进行整个涂布程序。用醋酸盐緩冲液pH4.00(由BIACORE才是供)稀释(1:25)抗原11A12至20pg/ml的终浓度。然后混合NHS和EDC并注射50pl以激活CM5芯片上的COOH基团。接着是注射40pi的抗原(持续约40")。然后注射30pi的乙醇胺以阻断最终游离的COOH的反应性。以20pl/分钟的流速测定每个才羊品。注射20pi未《希释的单体蛋白(它来自凝胶过滤)。离解时间为约200"。然后注射10pl的HC110mM以再生芯片。以不同牙希释度，即1:2稀释度(在PBS中)重复注射单体蛋白，接着用HC1再生。接着以1:4的稀释度第三次注射蛋白，接着再次用HC1再生。利用BIA评价软件评价了每种抗ED-A抗体的k。n、k。ff以及KD^直。遂织化孛为了i正实成功的体内生物素化，如在(Rybaketal.2005)中所描述的，之后进4亍生物素化结构的染色。乂人新鲜冷冻4羊品切割切片(10nm),用丙酮固定，依次用《连霉亲和素生物素化』成性^粦酸酶复合物(Biospa,Milano，意大矛J)禾口用Fast-RedTP(Sigma)温育[在有1mM左旋咪唑存在的条件下来抑制内源性碱性磷酸酶],然后用苏木素溶液(Sigma)复染。如先前描述的(参见例如，(Bracketal.200c))，用scFv國抗体(其携带FLAG标记)进行免疫组织化学染色。简言之，同时用scFv片,殳(终浓度为2-10!ig/mL)和用单克隆抗Flag抗体M2来温育切片。用兔4元鼠免疫3求蛋白#元体(Dakocytomation,Glostrup,丹麦)，接着用小鼠单克隆石威性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物(Dakocytomation)来才企测结合的4元体。FastRed(Sigma)用]乍石粦酸酶底物，并且用苏木素(Sigma)7于切片实施复染。用Glycergel(Dakocytomation,Glostrup，丹麦)去于固,斤有^刀片并4昔助于AxiovertSI00TV显樣M竟(CarlZeiss,Feldbach,瑞士)并利用Axiovision库欠4牛(CarlZeiss)进4亍分才斤。/#勿于拔五Z)-v4戎体迷/f谬^7定位用商用红外荧光团书f生物AlexaFluor750羧酸琥珀酰亚胺酯(Invitrogen)并4要照供应商的实-验方案来标记该亲4戈抗ED-A抗体scFv。通过凝月交过滤并利用PD-10一主(GEHealthcare)将标^己的抗体与未反应的染泮+分离。接照Invitrogen标记实-验方案估计的标记程度为5个染料分子/抗体分子。在注射F9DR肿瘤细胞三周后，在Svl90小鼠的尾请争月永注射Alexa750标记的亲代抗ED-AscFv抗体(纟冬;农度为0.3mg/ml)(200pl/小鼠，即60pg#元体/小鼠)。在注射标记的抗体6小时以后，切除小鼠器官并用国产(home-built)的红外线荧光成像4义(Birchleretal.1999)成像，其中上述成4象仪装备有卣鴒灯、专门针对Alexa750的激发和发射滤光片、以及单色CCD照相机。FS双,拔体的兰F8双^介抗体包含与抗ED-A抗体F8相同的VH和VL结构域，例如，采用scFv才各式。F8只又《介抗体和抗ED-AscFvF8在VH和VL结构域之间具有不同的接头序列。F8双价抗体接头的氨基酸序列是GSSGG(SEQIDNO:28)(核苷酸序列gggtccagtggcggt[SEQIDNO:29])。因此，F8双价抗体接头序列的长度为5个氨基酸，而在抗ED-AscFvF8中接头长度为20个氨基酸(参见SEQIDNO:11)。在VL和VH结构域之间接头长度的减小意味着有利于VL和VH结构域的分子间而不是分子内配对。因此，对于一个F8多肽的VL结构域而言，和它西己对的相同F8多肽的VH结构域相比，更可能与另一个F8多肽的VH结构域配对。在大肠杆菌TGI细胞中表达F8双价抗体，具体如下利用电穿孔，将编码F8双《介抗体的DNA引入电感受态大肠杆菌TGI细胞中。在10ml2YT培养基、Amp、1%葡萄糖中预培养该电穿孔的大肠杆菌细月包。将预培养物稀释1:100成800ml2YTi咅养基、Amp、0.1%葡萄糖并且培养物生长至0.6的密度(OD600nm)。然后利用1mM的IPTG"i秀导F8双-阶抗体的表达。用1251标记表达的F8双价抗体，具体如下将10pl无菌PBS加入非水溶性」碘化试剂(iodogen)管(涂布有50fil溶氯仿中的0.1mg/ml非水溶性石舆化试剂)，4妻着添力卩21251石典化钠(约200pCi)并在室温(RT)下温育5分钟。然后一夸在OD0.2处(约60fig)的400jal的F8只又1"介4元体力口入石典原管并在RT下温育25分钟。收集1/100的上述混合物以测量在混合物中包含的》丈射性(称作'INPUT')。然后将标记的F8双-f介抗体装填在尺寸排阻层对斤柱(PD10:SephadexG-25M,GEHealthcare)上以将石典化的F8双《介抗体与游离石典分离。测量所收集的石典化F8双价抗体的放射性并且计算得到的掺入F8双价抗体中的碘的百分比(石典化F8双价抗体的CPM[每分钟计凄幻/CPMINPUT)为30-40%。将四只F9荷瘤小鼠;改置在Lugol上两天(600pl变成300ml)以封闭甲状腺并且对每只小鼠静脉注射200|al^典化F8双价抗体(约5-8lag石典4匕F8双^N元体[18^Ci]/小鼠)。在24小时以后，处死小鼠并切除肿瘤、肝脏、肺脏、脾脏、心脏、肾脏、肠、尾以及血液(本文中统称为小鼠'组织，)并用于方文射性计^L利用Perkin，计数器测量每个组织样品中的放射性水平。通过注射剂量(以CPM为单位)的百分比除以组织的重量(以克为单位)来计算'输出，(%ID/g)。58结果^弄衷这蛋^和f接f伴的鉴定在图1A中描述了基于灌注的化学蛋白质组方法，其用于在肝脏和在F9肝转移瘤中可及蛋白的比4交分析(Terranaetal，1987)。这些肺瘤在小鼠肝表面和内部发展成较大的转移性病灶(图1B)。在终端麻醉下，对荷瘤小鼠灌注15ml的1.8mM石黄基琥珀酰亚胺基-6-[生物素酰氨基]己酸酯(1mg/ml)在PBS中的〉容液，pH7.4，其补充有10%右旋糖酐-40作为血浆增容剂。该程序(其通常持续10分钟)使得可以从大循环的所有器官除去血液并选择性地使可及蛋白生物素化(在血管的腔和近腔方面)。借助于这种程序，高效率和选纟奪性地标记了F9肝转移瘤和几乎所有血管，如通过用链霉亲合素-碱性磷酸酶结合物进行的组织化学染色所证实的(图1C)。在正常肝脏中，血管^皮强染色，^f旦还才企测到某些窦状隙的标记，其与肝脏的生理过滤功能并不沖突(图1C)。通过灌注包含伯胺的;容液来淬灭体内生物素化。其后，乂人肝脏切除肝转移瘤样品，匀化并在有强洗涤剂SDS存在的条件下通过用链霉亲合素树脂的亲和层析来回收生物素化蛋白(图1A)。为了将转移瘤蛋白在宿主肝脏中的扩散风险降低到最小程度，来自体内生物素化的健康小鼠的肝脏用于研究正常肝血管。来自F9荷瘤小鼠的宿主肝脏的应用也是有问题的，这是由于几乎没有残余的Y建康组织并且难以以肉眼排除没有微小转移。总计利用来自7只体内生物素化的健康小鼠和9只体内生物素化的F9荷瘤小鼠的样品用于蛋白质组分析。另外，来自2只1^康小鼠和3只荷转移瘤非生物素4b小鼠的^^羊品用作阴性对照。来自F9转移瘤和正常肝(并4于处理)的链霉亲合素捕获蛋白的严格洗涤程序和在树脂上胰蛋白酶消化产生了肽的集合，其可以#皮分离、鉴定和比4交，其中利用纳米HPLC和MALDI-TOF/TOF质谱程序(Roeslietal"2006)。总共鉴定了1291种不同的肽0950/。Mascot置信水平)，通过Mascot软件将其分为480个不同肽组。在来自非生物素化小鼠的阴性对照样品中也发现了几个这样的肽组(如羧化酶，其携带内源性生物素作为辅因子，角蛋白作为污染物，或非常丰富的蛋白质如血清白蛋白)。其余的435个鉴定的肽《且中的331个可以通过Mascot软件明白地注解为单种蛋白，而104个肽组被注解为多种(总计为358种)蛋白。在大多数情况下，注解为相同肽组的多种蛋白属于相关蛋白家族(例如，免疫球蛋白)或甚至可以是具有不同数据库条目(databaseentry)的相同蛋白。在435个不同肽组中，117个只存在于转移瘤样品中，193个仅存在于健康肝脏样品中以及125个存在于两种类型的《且织中。例如，匹配于纤连蛋白的肽(美国国家生物技术信息中心[NCBI]登录号为P11276)存在于4个健康肝脏样品中以及8个转移瘤才羊品中。存在于1"建康肝脏和转移瘤样品中的蛋白(例如纤连蛋白)可以以显著不同的水平存在于两种样品中。如果是这样的话，这应由在其中检测到蛋白的样品数目来反映，和/或由在肝脏和转移样品中观测到的肽数目来反映(以及归一化的肽信号强度；(Scheureretal.2005,Scheureretal.2005))。例如，来自纤连蛋白(NCBI登录号为P11276)的38种月夷蛋白酶肽V叉存在于转移瘤才羊品中，而一种肽仅存在于健康肝脏样品中。11种肽存在于两种典型的样品中。尽管肝脏是纤连蛋白生物合成的部位，但在肝脏转移瘤中4企测到的纤连蛋白衍生肽的显著丰度促使我们研究了纤连蛋白衍生肽的相对丰度的差异以及可变剪接域的过度表达。表1列出了在蛋白质组分析中鉴定的所有纤连蛋白肽。小鼠纤连蛋白包含两个可以经受可变剪4妄的III型J求4犬额夕卜结构i或ED-A和ED-B(ffrench-Constant1995,Hynes1990，Kasparetal.2006)。jt匕夕卜，IIICS节段在小鼠和人类中经受不同的剪接模式。有趣的是，仅在肿瘤样品中观测到所有三种ED-A衍生肽以及IIICS衍生肽。在此分析中看不到ED-B书f生肽，这是由于ED-B不包含赖氨酸残基而两个4青氨酸产生的力太的尺寸太大以致^r测不到。图2A示出了在肿瘤样品(肿瘤)和健康肝脏样品(正常)中鉴定的肽在纤连蛋白域结构上的位置。图2B示出了两种纤连蛋白衍生肽的归一化MS信号的相对强度位于ED-A结构域内的IAWESPQGQVSR(SEQIDNO:16),以及^立于结构i或14中的FLTTTPNSLLVSWQAPR(SEQIDNO:15)。后一种肽在转移瘤样品中更加丰富，j旦在正常肝只于应物中也明确可斥企测到。相比之下，ED-A书亍生肽在转移瘤才羊品中产生强信号，j旦在正常肝脏中则完全才企测不到(即，4氐〉10(H咅的信号)。龙瘦逸织化夢在肝脏结构和转移性新生血管之间观测到纤连蛋白的ED-A和ED-B结构:威的最显著区别。在两种情况下，均见测到转移性血管的强和特异性染色，而在此免疫组织化学分碎斤中正常肝脏和几乎所有正常器官(除在增生期的子宫内膜和卵巢的有些血管之外)均为负分(图3A)。重要的是，还发现在人肺转移瘤和肝脏转移瘤的新血管中，ED-A一皮强烈表达(图4)。为了测试ED-A作为用于转移瘤的基于配体的血管耙向的耙标的有效性，利用近红外荧光成i象进行体内靶向试验。用AlexaFluor750标记亲^抗ED-AscFv抗体并l争月永注射到F9荷转移瘤小鼠。切除器官的近红外荧光成像揭示了在转移性病变中靶向剂的显著累积(图3B)。61拔^我体的逸斧BIAcore分析1BIAcore分析产生每种抗ED-A抗体的图l象，对其加以分析以推断抗体对抗原的亲和力，具体如下每幅图j象的X轴对应于时间而y轴对应于共才展单位(ResonanceUnit)(—种度量，其指示所测试抗体对于涂布在BIAcore芯片上的抗原的结合亲和力)。每幅图示出了3个峰和1个对应于緩沖液的变化的斜坡(dig)，因而与结果的解释无关。每幅图的上升部分表示结合期。在图4象的此部分曲线越陡峭，则抗体与抗原的结合得越快。每幅图的下降部分表示抗体与抗原的离解期。在此图^象部分曲线越平坦，则抗体与抗原的离解越十曼。由亲4、抗ED-A抗体书亍生的抗ED-A抗体HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9均显示出比亲4戈抗ED-A抗体更平坦的离解曲线，这表明它们以比亲代抗ED-A抗体更大的亲和力结合ED-A，因而还结合A-FN。4元体E5、Fl、F8以及H1的图4象显示出所测试的所有抗ED-A抗体的最平坦的离解曲线。抗体Hl、C5、D5、E5、C8、F8以及F1的结合曲线比4十只寸亲^U元ED-A抗体所7见测到的结合曲线更平坦，而抗体B2、B7、E8以及G9所)現测到的结合曲线与亲4戈抗ED-A抗体所7见测到的结合曲线一样陡峭。然而，当IPTG诱导的大肠杆菌TG-1细胞的细菌上清液用于抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的BIAcore分析时，所测试的抗体样品的浓度是未知的，但最有可能低于用于比砵交的亲^R抗ED-A抗体才羊品的浓度。因此，抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的结合曲线可以^皮人为地降低，这是由于在用于BIAcore分析的样品中的抗体浓度较低。然而，由于在BIAcore分析中浓度并不显著影响抗体与其靶抗原的离62解，所以针对抗体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9所7见测到的平坦的离解曲线表明这些抗体结合ED-A，并且和亲代抗ED-A抗体相比具有至少相等、以及可能更高的亲和力。因此，当利用亲代抗ED-A抗体进行相同体内和免疫组织化学研究时(如在本文其它地方所描述的)，抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9才及有可能产生相同或更好的结果。因此，利用亲代抗ED-A抗体获得的体内和免疫组织化学数据提供了抗ED-A抗体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9可以用于治疗肺瘤转移瘤的i正据。BIAcore分析2利用BIA评价软件评价了每种抗ED-A抗体的k。n、k。ff以及KXH直。亲^U元ED-A抗体和抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9对于抗原11A12的k。n、koff以及KD^f直详细列在表3中。由亲代抗ED-A抗体书亍生的抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9对于抗原11A12均比亲代抗ED-A抗体具有更好的KD值，这表明它们以比亲代抗ED-A抗体更大的亲和力结合ED-A,因而还结合A-FN。因此，当利用亲代抗ED-A抗体进行相同体内和免疫组织化学研究时(如在本文其它地方所描述的)，抗ED-A4元体B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9才及有可能产生相同或更好的结果。因此，利用亲代抗ED-A抗体获得的体内和免疫组织化学数据提供了抗ED-AB2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9可以用于治疗肿瘤转移瘤的i正据。FS双/介^t体的_^參为、布每克(g)小鼠组织中才全测到的1125标记(;碘化)F8双价抗体的注射剂量(ID)的百分比(％)非常类似于肝脏、肺脏、脾脏、心脏、肾脏、肠、尾以及血液，并且除肾脏之外均显示小于2%ID/g(图8)。相反，F9肿瘤比所分析的任何其它小鼠组织平均包含多约四倍的ID(图8)。这表明，F8双j介抗体^皮选4奪性地靶向于F9小鼠肿瘤。在其他组织中4企测到的ID的百分比最有可能表示小鼠体内存在的F8双价抗体或其他小鼠组织的非特异性标记的背景负载(backgroundload)。如在本文其他地方所描述的，利用四只小鼠进行生物分布实验，并且虽然每只小鼠组织中才企测到的ID的百分比是不同的(参见图8中的误差条线)，^f旦在F9肿瘤中才全测到的F8双1"介抗体的百分比一致地高于所测试的^f壬何其他小鼠组织。对F9原发性肿瘤进4亍了生物分布研究，结果表明，才艮据本发明的抗ED-A抗体被选择性地靶向于体内肿瘤组织。结果进一步表明，当利用亲代抗-ED-A抗体进行相同的体内和免疫组织化学研究时(如在本文其它地方描述的)，本发明的抗ED-A抗体可以用来获得相同或更好的结果。承#抗ED画A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9均是scFv4元体，并利用常头见方法力口以测序。4元ED-A4元体Hl的核苷酸序列示于图6中。抗ED-A抗体H1的氨基酸序列示于图7中。编码抗ED-A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的VH和/或VL的优选的核苷酸序列与编码抗ED-A抗体Hl的VH和/或VL的核苷S臾序列相同，只'是编码轻(VL)和重(VH)链的HICDR1的核苦酸序列被编码相应抗体轻《连(VL)和重链(VH)CDR1(列在表2中)的核苷酸序列取代。编码抗ED-AF8双1"介抗体的VH和/或VL结构i或的某些优选的核苷g交序列与编码抗ED-A抗体Hl的VH和/或VL结构域的核苷酸序列相同，只是编码轻链(VL)和重链(VH)的HICDR1的核苷酸序列一皮编码抗ED-A抗体F8的轻链(VL)和重链(VH)CDR1(列在表2中)的核香酸序列取代。编码接头(其连接抗ED-AF8双价抗体的VH和VL结构域)的一个优选核苷酸序列是gggtccagtggcggt(SEQIDNO:29)。抗ED画A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9具有与抗ED-A抗体HI相同的氨基酸序列，只是轻链(VL)和重《连(VH)的HICDR1的氨基S吏序列^皮相应抗体的轻《连(VL)和重链(VH)CDR1(列在表2中)的氨基酸序列取代。抗ED-AF8双1介抗体的VH和VL结构i或的氨基酸序列与抗ED-A抗体HI的氨基酸序列相同，只是轻(VL)和重(VH)链的HICDR1的氨基酸序列一皮抗ED-A抗体F8的轻4连(VL)和重《连(VH)CDR1(歹'J在表2中)的氨基酸序列取代，以及在H1中的接头的氨基酸序列被接头氨基酸序列GSSGG(SEQIDNO:28)耳又代。抗ED-A抗体B2VH结构i或的氨基酸序歹'J(SEQIDNO:21)与抗ED-A抗体HI的VH结构i或的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:23代替HI的VHCDR1。抗ED-A抗体C5VH结构i或的氨基酸序列(SEQIDNO:41)与抗ED-A抗体HI的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:43代替HI的VHCDR1。抗ED-A抗体D5VH结构域的氨基酸序列(SEQIDMO:51)与抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:53代替HI的VHCDR1。抗ED-A抗体E5VH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:61)与抗ED-A抗体HI的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:63代替HI的VHCDRl。抗ED-A抗体C8VH结构域的-氤基酸序列(SEQIDNO:71)与抗ED-A抗体HI的VH结构域的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:73代替HI的VHCDR1。抗ED-A抗体F8VH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:81)与抗ED-A抗体HI的VH结构域的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:83^R^齐HI的VHCDRl。抗ED-AF8只又^f介抗体的VH结构i或具有与抗ED-AscFv抗体F8的VH结构域相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:81)。抗ED-A抗体FlVH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:91)与抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:93代替HI的VHCDRl。抗ED-A抗体B7VH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:101)与抗ED-A抗体HI的VH结构i或的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:103替HI的VHCDRl。抗ED-A抗体E8VH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:111)与抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:113代替HI的VHCDRl。抗ED-A抗体G9VH结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:31)与抗ED-A抗体H1的VH结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:33代替HI的VHCDRl。抗ED-A抗体B2VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:22)与抗ED-A抗体HI的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:26代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体C5VL结构域的氨基S吏序列(SEQIDNO:42)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:46代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体D5VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:52)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:56代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体E5VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:62)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基S交序列相同，只是由SEQIDNO:66代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体C8VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:72)与抗ED-A抗体HI的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:76代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体F8VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:82)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:86^^齐HI的VLCDRl。抗ED-AF8双l介抗体的VL结构i或具有与抗ED-A抗体F8的VL结构域相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:82)。抗ED-A抗体FlVL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:92)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:96代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗体B7VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:102)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:106HI的VLCDR1。抗ED-A抗体E8VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:112)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:116代替HI的VLCDR1。抗ED-A抗体G9VL结构域的氨基酸序列(SEQIDNO:32)与抗ED-A抗体H1的VL结构域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:36代替HI的VLCDRl。可选地，长口图7A所示，在#元ED-A4元体Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9的VH结构i或的^f立置5处的氨基酸可以是亮氨酸残基(L)而不是缬氨酸残基(V)。此外或可替换地，如图7C所示，在抗ED画A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9的VL结构域的位置18处的氨基酸可以是精氨酸残基(R)而不是赖氨酸残基(K)。参考文献在本说明书中任何地方引用的所有参考文献，包括那些在上述有目的。Amitetal.(1986),Science,233:747-753.Andersenetal.(2002)CurrentOpinionmBiotechnology13:117.Ausubeletal.(1999)4theds.，ShortProtocolsmMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons.BagshaweK.D，etal.(1991)Antibody,ImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915-922Balzaetal.(1988),FEBSLett"228:42-44.Birchleretal.(1999)，J,Immunol.Methods,231,239-248.Birdetal.(1988)Science,242，423-426Borsietal.(1987)，J.Cell.Biol"104,595-600.Borsietal.(1990),FEBSLett.,261:175-178.Borsietal.(1995)，J.Biol,Chem.,270:6243-6245.Borsietal.(1998),Exp.CellRes"240,244-251.Bracketal.(2006)，Clin.CancerPes.,12，3200-3208.Carnemollaetal.(1989),J.Cell.Biol"108:1139-1148.Catonetal.(1990),J.Immunol"144:1965-1968.Chaddetal.(2001)，CurrentOpinioninBiotechnology12:188-194Chothiaetal.(1987)，J，Mol.Biol"196:901-917.Chothiaetal.(1989)，nature,342:877-883.Devosetal.(1983),Nucl.AcidsRes.11:4307-4323.ffrench-Constant(1995),Exp.CellRes.,221，261-271.69Research,2001,29(5):E27.Gle皿ieMJetal.，1987J.Immunol.139,2367-2375Haanetal.(2004),BioCentury,12(5):A1-A6.Hanahanetal.(2000),Cell200,57-70.HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborKornblihttetal.(1984)，NucleicAcidsRes.12,5853-5868.Laboratory,ColdSpringHarborN.Y.,pp.726，1988Heikmheimoetal.(1991)，VirchowsArch.BCellPathol.Incl.Mol.Pathol"61,101-109.HolligerandBohlen1999Cancerandmetastasisrev.18:411-419.Holligeretal.(1993a)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448.Holligeretal.(1993b),CurrentOpinionBiotechnol4,446-449.Holtetal.(2003)TrendsinBiotechnology21，484-490.Hoogenboometal.(1991)，NucleicAcidsRes.,19(15)4133-7.Huetal.(1996)，CancerRes"56，3055-3061.Hustonetal.(1988)PNASUSA,85,5879-5883.Hynes,R.O.(1990).Fibronectins(NewYork:Springer-Verlag).Jacobsetal.(20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应用，其中LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116,LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7，以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL结构域包含一组在所述互补决定区LCDR1、LCDR2以及LCDR3内具有IO个或更少的氨基酸置才奐的互4卜决定区。16.根据权利要求14或15所述的应用，其中，所述VL结构域骨架是人种系骨架。17.才艮据权利要求16所述的应用，其中，所述VL结构域具有氨基卧臾序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。18.根据权利要求14至17中任一项所述的应用，其中，所述结合成员是单链Fv。19.根据权利要求14至17中任一项所述的应用，其中，所述结合成员是双j介抗体。20.—种结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员，包含VH结构域，其中所述VH结构域包含骨架和一组互补决定区HCDRl、HCDR2以及HCDR3，其中HCDRl具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、·33、43、53、63、73、83、93、103或113,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4,以及HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;或其中所述VH结构域包含一组在所述互补决定区HCDRl、HCDR2以及HCDR3内具有10个或更少的氨基酸置换的互补决定区。21.才艮据4又利要求19所述的结合成员，其中，所述VH结构域骨架是人种系骨架。22.根据权利要求20所述的结合成员，其中，所述VH结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。23.根据权利要求19至21中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员进一步包含VL结构域，其中所述VL结构域包含一组互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及骨架。24.根据权利要求22所述的结合成员，其中，LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116,LCDR2具有氨基酉交序列SEQIDNO:7,以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL结构域包含一组在所述互补决定区LCDRl、LCDR2以及LCDR3内具有IO个或更少的氨基酸置才奂的互4卜决定区。25.根据权利要求22或23所述的结合成员，其中，所述VL结构域骨架是人种系骨架。26.根据权利要求24所述的结合成员，其中，所述VL结构域具有氛基酉交序歹11SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。27.根据权利要求22至25中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员是单链Fv。28.根据权利要求22至25中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员是双价抗体。29.根据权利要求19至26中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员结合于可检测标记。30.根据权利要求19至26中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员结合于具有杀生物活性或细胞毒活性的分子。31.根据权利要求19至26中任一项所述的结合成员，其中，所述结合成员结合于放射性同位素。32.—种结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员用于制造i貪断肿瘤转移瘤的诊断产品的应用。33.根据权利要求30所述的应用，其中，所述结合成员结合纤连蛋白的ED-A。34.根据权利要求19至27中任一项所述的结合成员用于制造诊断肿瘤转移瘤的诊断产品的应用。35.—种用于在人或动物中4企测或i貪断肿瘤转移瘤的方法，包括以下步骤(a)将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给予所述人或动物，以及(b)确定在所述人或动物体中在远离由原发性肿瘤目前或以前占据部^立的部位是否存在所述结合成员；其中在所述人或动物中所述结合成员定位于远离由所述原发性肺瘤目前或以前占据部位的部位则表明肿瘤转移瘤的存在。36.4艮据权利要求33所述的方法，其中，所述结合成员结合纤连蛋白的ED-A。37.根据权利要求33或34所述的方法，其中，所述结合成员结合于可才全测标i己。38.才艮据4又利要求33或34所述的方法，其中，所述结合成员结合于放射性同位素。39.—种用于在个体中治疗肺瘤转移瘤的方法，包括给予所述个体治疗有效量的包含结合成员的药剂，其中所述结合成员结合纤连蛋白的ED-A同种型。40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述结合成员结合纤连蛋白的ED-A。41.根据权利要求37或38所述的方法，其中，所述结合成员结合于可才企测冲示i己。42.根据权利要求37或38所述的方法，其中，所述结合成员结合于具有杀生物活性或细胞毒活性的分子。43.根据权利要求37或38所述的方法，其中，所述结合成员结合于》文射性同位素。44.一种在人或动物中将分子递送到肺瘤转移的新生血管的方法，包括将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给予所述人或动物，其中所述结合成员结合于所述分子。45.根据权利要求42所述的方法，其中，所述结合成员结合纤连蛋白的ED-A。46.根据权利要求42或43所述的方法，其中，所述分子是可检测标记。47.根据权利要求42或43所述的方法，其中，所述分子具有杀生物活性或细月包毒活性。48.根据权利要求42至43中任一项所述的方法，其中，所述分子是放射性同位素。49.根据权利要求33至46中任一项所述的方法，其中所述结合成员包含VH结构域，以及其中所述VH结构域包含骨架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2以及HCDR3，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4,以及HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;或其中所述VH结构域包含一组在所述互补决定区HCDR1、HCDR2以及HCDR3内具有10个或更少的氨基酸置才奐的互4卜决定区。50.根据权利要求47所述的方法，其中，所述VH结构域骨架是人种系骨架。51.根据权利要求48所述的方法，其中，所述VH结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。52.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中，所述结合成员进一步包含VL结构域，其中所述VL结构域包含一组互才卜决定区LCDR1、LCDR2,口LCDR3，以及骨架。53.才艮据4又利要求50所述的方法，其中，LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116,LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7,以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL结构i或包含一《且在所述互^卜决定区LCDR1、LCDR2以及LCDR3内具有10个或更少的氨基酸置换的互补决定区。54.才艮据权利要求51所述的方法，其中，所述VL结构域骨架是人种系骨架。55.根据权利要求52所述的方法，其中，所述VL结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。56.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中，所述结合成员是单链Fv。57.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中，所述结合成员是双价抗体。全文摘要本发明涉及一种结合成员，其结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型，用于治疗肿瘤转移瘤。文档编号A61K39/395GK101687923SQ200880018310公开日2010年3月31日申请日期2008年3月31日优先权日2007年4月2日发明者乔瓦尼·内里,亚历山德拉·维拉,克里斯托夫·勒斯利,达里奥·内里,雅舍·雷巴克申请人:菲洛根股份公司