用于治疗淀粉样蛋白相关疾病的组织激肽释放酶的制作方法

专利名称：：用于治疗淀粉样蛋白相关疾病的组织激肽释放酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗淀粉样蛋白相关疾病的方法，所述疾病包括阿尔茨海默病、阿尔茨海默病先兆遗忘型轻度认知缺损(Alzheimer'sprecursoramnesicmildcognitiveimpairment)及相关病症。
背景技术：
：阿尔茨海默病是一种致死性神经退化障碍，目前世界上超过2千万人患有此病，并且发病率正在增加。据估计，该病的发病率在未来30年中会翻倍从而使阿尔茨海默病成为导致老年人死亡的主要原因(vanLeeuwenetal.,NeurobiologyofAging,2000,21:879-891)。特征包括智力功能(记忆力、语言、视觉能力和问题解决能力)的下降和抽象推理的降低以及异常行为。阿尔茨海默病导致最终丧失运动功能、营养不足和死亡(Friedlanderetal.，ClinicalPractice2006，1371240-1251)。阿尔茨海默病通常发生于生命晚期，被称为“晚发”。阿尔茨海默病在65-74岁的人中的发生率为3%，而在75-84岁和85岁以上的人中的发生率分别为19%和47%(Friedlanderetal.，2006)。诊断患有阿尔茨海默病的个体的平均寿命为发病后8-10年(Friedlanderetal.，2006)。作为被诊断为阿尔茨海默病的先兆，许多人首先经历遗忘性轻度认知缺损(MCI)，其被认为是正常老化和阿尔茨海默病之间的过渡阶段或者阿尔茨海默病的前临床期(ArchNeurol.2004Jan;61(l):59_66)。当记忆丧失为主要特征时，这种类型的缺损被称为遗忘性MCI，其一般会随着认知下降的增加在一定时间后转变为阿尔茨海默病。阿尔茨海默病被分为七个阶段，每个阶段都被上一个阶段更虚弱。第一阶段的特征为回顾性分析，一旦阿尔茨海默病的症状发展为由营养不足和严重认知功能下降构成的最后阶段，经常需要专职家庭护理(Friedlanderetal.，2006)，造成巨大的护理支出。阿尔茨海默病的发生似乎与某些危险因素有关。这些危险因素包括头部外伤、种族、高热量高脂肪低叶酸饮食、教育程度有限、高胆固醇血症、糖尿病和久坐的生活方式。在约5%的表现家族性发病的病例中观察到了一种常染色体显性遗传模式(Friedlanderetal.，2006)。目前尚不了解阿尔茨海默病的确切原因，然而，该病是以极度复杂的方式通过多种通路被调控的。通路包括淀粉样蛋白(Αβ)的缺陷代谢、异常神经传递(谷氨酰胺、肾上腺素能、血清素和多巴胺)、炎症、激素和氧化通路(Franketal.,Ann.Clin.Psychiatry2005,17(4):269_286)。四种基因似乎与阿尔茨海默病有关。这些基因编码淀粉样前体蛋白(APP)、早老素1、早老素2和载脂蛋白E(Franketal.，2005)。由于存在纤维斑块或缠结，阿尔茨海默病的特征在于存在于脑区中。斑块是胞外沉积物，而在胞内可观察到缠结。斑块含有Αβ及其片段Αβ40和Αβ42，而缠结含有称为tau的微管相关蛋白(Franketal.，2005)。所述Αβ片段为包括APP(前体)的异常蛋白水解切割事件产物。斑块可在涉及记忆形成和信息获得的脑区形成。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体被认为涉及阿尔茨海默病的神经毒性事件，而Αβ可能直接参与。当tau蛋白被蛋白激酶在特异位点超磷酸化后聚集在一起时形成缠结。具体地，所述蛋白激酶糖原合成酶激酶_3β(GSK-3β)涉及tau的超磷酸化(ProcNatlAcadSciUSA.2005May10；102(19):6990_5)，导致缠结形成和轴突微管分解。Aβ已被证明在神经元内刺激GSK-3β的活性(Neuroscience2002；115(1)201-11)。微管的分解阻止轴突运输，导致突触的丧失和神经退化。对认知和功能下降的常规治疗方法包括胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。精神病和焦虑事件可用非典型抗精神病药物(如奥氮平和利培酮)和情绪稳定剂治疗。最后，抑郁和焦虑可用选择性血清素再吸收抑制剂、三环类抗抑郁药、去甲肾上腺素再吸收抑制剂和中央Q2肾上腺素自身受体和异身受体拮抗剂治疗(Friedlanderetal，2006)。对于普通人群，大多数人在年龄较大时才发生阿尔茨海默病，但唐氏综合症(也称为“21号染色体三体性”或“DS”)患者会更早地发生阿尔茨海默病。大多数患唐氏综合症的人在中年晚期发生阿尔茨海默病，并且斑块形成蛋白Αβ的沉积经常比大多数其他阿尔茨海默病患者更严重。
发明内容本发明提供组织激肽释放酶或其变体或活性片段在治疗阿尔茨海默病或其症状中和治疗遗忘性轻度认知缺损中的应用。本发明还提供组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于消化或切割淀粉样蛋白和治疗从淀粉样蛋白的消化或切割受益的病症的应用。本发明的一个方面提供一种治疗患有(a)阿尔茨海默病或其症状；或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段。在本发明的一个实施方案中，所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段与用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性轻度认知缺损的第二种治疗性化合物共同给药。本发明的另一个方面提供一种配制用于口服给药的药物组合物，其含有约1-约1000IU/天的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。本发明的另一个方面提供一种配制用于鼻内给药的药物组合物，其每个给药频率(dosagefrequency)含有约0.001-5000IU的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包括组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种佐剂。在本发明的另一个实施方案中，所述佐剂是一种乳化剂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包括组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及亲脂胶束。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物还包括用于治疗阿尔茨海默病的第二种治疗性化合物。本发明的另一个方面提供组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于制备治疗(a)阿尔茨海默病或其症状，或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的药物的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于治疗(a)阿尔茨海默病或其症状，或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的应用。在本发明的一个实施方案中，所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段的应用还包括与用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性轻度认知缺损的第二种治疗性化合物共同使用。在本发明的另一个实施方案中，所述第二种治疗性化合物包括一种乙酰胆碱前体、一种增强乙酰胆碱释放的化合物、一种乙酰胆碱酯酶抑制剂、一种毒蕈碱激动剂、一种抗氧化剂、一种抗炎药、一种激素、一种钙通道阻滞剂、神经生长因子、一种益智剂(nootropicagent)、一种神经营养因子小分子模拟物、NMDA受体拮抗剂、一种5-HT1A受体激动剂、一种抗淀粉样蛋白生成剂、一种抗组胺药、一种甲磺酸双氢麦角碱、银杏或石杉碱甲。在本发明的另一个实施方案中，所述乙酰胆碱酯酶前体选自胆碱、卵磷脂或乙酰-1-肉毒碱。在本发明的另一个实施方案中，所述增强乙酰胆碱释放的化合物为4-氨基吡啶或利诺吡啶(Iinopridine)。在本发明的另一个实施方案中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自毒扁豆碱、他克林(tacrine)、多奈哌齐(don印ezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(glanthamine)、舌夂百虫(metrifonate)、石杉碱甲或依其Jf的明(eptastigmine)。在本发明的另一个实施方案中，所述毒蕈碱激动剂选自米拉美林(milameline)、口占诺美林(xanomeline)、槟榔碱(arecoline)、氧化震亶员素(oxotremorine)、沙可美林(sabcomeline)或他沙利定(talsaclidine)。在本发明的另一个实施方案中，所述抗氧化剂选自维生素E、艾地苯醌(iedbenone)、辅酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或维生素C。在本发明的另一个实施方案中，所述抗炎药是一种非留类抗炎药。在本发明的另一个实施方案中，所述激素是雌激素或睾酮。在本发明的另一个实施方案中，所述益智剂是吡拉西坦(piracetam)。在本发明的另一个实施方案中，所述甲磺酸双氢麦角碱是氢化麦角碱。在本发明的另一个实施方案中，所述治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段是鼻内给药的。在本发明的另一个实施方案中，所述治疗有效剂量为每个给药频率约0.001-约5000国际单位(IU)。在本发明的另一个实施方案中，所述治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段是口服给药的。在本发明的另一个实施方案中，所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段的治疗有效量为每天约0.001-约1000IU。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于消化或切割需要所述治疗的患者体内的淀粉样蛋白的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者的神经脉管系统的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者的脑部氧摄取的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者的脑部血流的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者脑中斑块清除的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者的脑部葡萄糖摄取的应用。本发明的另一个方面提供治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于降低需要所述治疗的患者脑中tau磷酸化的应用。图1为显示组织激肽释放酶(KLKl)在体外切割淀粉样蛋白原纤维的质谱图。A)只有β-淀粉样蛋白(Αβ)；B)只有KLKl；和OKLKl和Αβ。图2为显示组织激肽释放酶在体外切割可溶性淀粉样蛋白的质谱图。Α)只有可溶性Αβ；B)可溶性Aβ和KLKl。图3是显示对经组织激肽释放酶处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在ΑβH2(10μM终浓度)损伤之前24小时和30分钟时向细胞中加入组织激肽释放酶。数据表示为相对基础值(10μMAβ㈠孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。***ρ<0.0001(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(vehicle)(=10μMAβ^42)组相比存在统计意义上的显著差异。图4是显示经组织激肽释放酶处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的神经元存活的柱状图。在Αβ^αΟμΜ终浓度)损伤之前24小时和30分钟向细胞中加入组织激肽释放酶。在与10μMAβi_42接触48小时后计算NeuN-免疫活性神经元的数量。此数据表示为存活神经元的百分比，以平均值+SD的形式表示。<0.0001(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(=ΙΟμΜΑβ^)组相比存在统计意义上的显著差异。图5是显示对经组织激肽释放酶处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在ΑβH2(IC)μM终浓度)损伤之前-30分钟和Aβ^损伤之后24小时向细胞中加入组织激肽释放酶。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μΜNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。***ρ=0.0002(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(=ΙΟμΜΑβ^)组相比存在统计意义上的显著差异。图6是显示经组织激肽释放酶处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的神经元存活的柱状图。在Αβi_42损伤之前30分钟和Αβi_42损伤之后24小时向细胞中加入组织激肽释放酶。在与10μMAβi_42接触48小时后计算NeuN-免疫活性神经元的数量。此数据表示为存活神经元的百分比，以平均值+SD的形式表示。<0.0001(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(=ΙΟμΜΑβ^42)组相比存在统计意义上的显著差异。图7是显示对经10μg/ml组织激肽释放酶处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在Aβ卜42损伤之前24小时和30分钟(研究方案Α)、在Aβ卜42损伤之前30分钟和损伤之后24小时(研究方案B)、以及在Αβi_42损伤之前24小时和30分钟及之后24小时(研究方案C)向细胞中加入激肽释放酶。数据表示为相对基础值(10μM八旦⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。<0.0001(单因素ANOVA)表示与空白溶剂(=ΙΟμΜAβ^42)相比存在统计意义上的显著差异。图8是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在八^_42损伤之前30分钟和24小时向细胞中加入胰激肽。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜΑβ^孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。图9是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在AβH2损伤之前30分钟和Aβ^42损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。图10是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在六^吣损伤之前24小时和30分钟以及损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜAβ工^孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。图11是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的细胞计数的柱状图。在ΑβH2损伤之前24小时和30分钟向细胞中胰激肽。在与10μMAβH2接触48小时后计算NeuN-免疫活性神经元的数量。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜAβ^42孔)的存活神经元的百分比，300μΜNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。图12是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的细胞计数的柱状图。在AβH2损伤之前30分钟和AβH2损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。在与10μMAβH2接触48小时后计算NeuN-免疫活性神经元的数量。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜ八^^孔)的存活神经元的百分比，300μΜNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表不。图13是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的细胞计数的柱状图。在Ai^_42损伤之前24小时和30分钟以及损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。在与10μMAβ卜42接触48小时后计算NeuN-免疫活性神经元的数量。数据表示为相对基础it(ΙΟμΜ六日^孔)的存活神经元的百分比，300μΜNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。图14是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在々^_42损伤之前24小时和30分钟向细胞中胰激肽。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜ八旦⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。<0.0001(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(=ΙΟμΜAβ^42)组相比存在统计意义上的显者差升。图15是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在六日㈠损伤之前30分钟和六日㈠损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。数据表示为相对基础值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。*p<0.05(单因素ANOVA)表示与空白溶剂(=10μMAβ^42)组相比存在统计意义上的显著差异。图16是显示对经胰激肽处理的大鼠混合皮层培养物(RMCC)的LDH测量的柱状图。在^㈠损伤之前24小时和30分钟以及损伤之后24小时向细胞中加入胰激肽。数据表示为相对基础值(10μMAβ工⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA设定为100%，数据以平均值+SD的形式表示。*#ρ<0.0001(单因素AN0VA)表示与空白溶剂(=10μMAβ^42)组相比存在统计意义上的显著差异。图17是显示各种浓度的激肽释放酶的淀粉样蛋白β切割的百分比的对数线图。具体实施方案定义“组织激肽释放酶”或"KLKl"是一种最初由于其通过将激肽原切割为赖氨酰舒缓激肽(胰激肽)来控制高血压的作用而被注意到的丝氨酸蛋白酶(Yousefetal.，EndocrineRev.2001；22184-204)。由于在KLK家族包括很多酶，本发明人认为KLKl似乎是遍在的或多标靶作用的酶，除了其已知的在高血压调控中的作用以外，还可对于治疗阿尔茨海默病起明确的作用。本文所用的术语“组织激肽释放酶”是下列术语的同义词血管舒缓素(callicrein)、舒血管素(glumorin)、胰激肽释放酶(padreatin)、帕杜丁(padutin)ffJfiliW^(kallidinogenase)>bradykininogenase、月夷(panceatickallikrein)、onokreinP、血管舒缓素D(dilminalD)、d印ot-Padutin、尿血管舒缓素(urokallikrein)或尿激月太释放Sl(urinarykallikrein)。如上所述，“胰激肽”是指赖氨酰舒缓激肽。激肽释放酶将激肽原切割为胰激肽。激肽释放酶可激活舒缓激肽2受体，其被已知增加基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。MMP-9也可切割淀粉样蛋白。组织激肽释放酶多肽的序列如下(SEQIDN0:1)NP_001001911GI:50054435野猪(Susscrofa)1-17信号肽18-24前肽25-263成熟肽>giI50054435|refINP_001001911.1激肽释放酶1[野猪]MWSLVMRLALSLAGTGAAPPIQSRIIGGRECEKDSHPWQVAIYHYSSFQCGGVLVDPKWVLTAAHCKNDNYQVWLGRHNLFENEVTAQFFGVTADFPHPGFNLSLLKNHTKADGKDYSHDLMLLRLQSPAKITDAVKVLELPTQEPELGSTCQASGWGSIEPGPDDFEFPDEIQCVELTLLQNTFCADAHPDKVTESMLCAGYLPGGKDTCMGDSGGPLICNGMWQGITSWGHTPCGSANKPSIYTKLIFYLDWINDTITENPAnotherembodimentincludesNP_002248GI4504875Homosapiens另一个实施方案包括NP_002248GI4504875人类(Homosapiens)1-18信号肽19-24前肽25-262成熟肽>giI4504875|ref|NP_002248.11激肽释放酶1前蛋白原[人类]MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGF匪SLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCV⑶SGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQIDNO2)术语“活性片段”是指保留全长KLKl多肽活性的KLKl多肽的较小部分。起始或参照多肽的“变体”或“突变体”是一种这样的多肽，所述多肽1)具有与所述起始或参照多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列和2)通过自然或人工(人造)突变从所述起始或参照多肽衍生而来。这些变体包括，例如，在目的多肽的氨基酸序列中删除和/或插入和/或取代残基。在此背景下，变体氨基酸是指与起始或参照多肽序列(如一个源抗体或抗原结合片段的多肽序列)中对应位置上的氨基酸不同的氨基酸。可进行删除、插入和取代的任意组合以获得最终的变体或突变构建体，只要所述最终构建体具有所需的功能特性。所述氨基酸改变也可影响所述多肽的翻译后加工，如改变糖基化位点的数量或位置。产生多肽的氨基酸序列变体的方法在美国专利No.5，534，615被描述，该公开明确地以引用的方式纳入本文中。“野生型”或“参照”序列或“野生型”或“参照”蛋白/多肽的序列可为通过引入突变衍生出变体多肽的参照序列。通常，特定蛋白的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是自然界中最常见的基因的序列。突变可通过自然加工或通过人为诱导手段被引入“野生型”基因中(并因此引入到该基因编码的蛋白中)。这些加工的产物为原始“野生型”蛋白或基因的“变体”或“突变”形式。本文指定多肽的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列和在必要时引入间隙以达到最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性取代当作序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参照序列中的氨基酸残基相同的百分比。为确定氨基酸序列同一性百分比的比对可通过属于本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MegAlign(DNASTAR)软件。本领域技术人员确定适合用于测量比对的参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。所述ALIGN-2程序是公众可通过Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,California获得的。出于本文的目的，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(也可表述为给定氨基酸序列A具有或包含的与给定氨基酸序列B的某个氨基酸序列同一性％)的计算如下100乘以分数X/Y，其中X是被序列比对程序在该程序的A和B的比对中认定为相同匹配的氨基酸残基的数量，其中Y是B的氨基酸残基的总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性％不等于B与A的氨基酸序列同一性％。“核酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列和在必要时引入间隙以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中与编码参照多肽的核酸序列中核苷酸相同的核苷酸的百分比。”为确定核酸序列同一性百分比的比对可通过属于本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或MegAlign(DNASTAR)软件。可通过已知的方法确定用于测量比对的合适参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，给定核酸序列C与给定核酸序列D的核酸序列同一性％(也可表述为给定核酸序列C具有或包含的与给定核酸序列D的某个核酸序列同一性％)的计算如下100乘以分数W/Z，其中W是被序列比对程序在该程序的C和D的比对中认定为相同匹配的核苷酸的数量，而其中ζ是D的核苷酸的总数。应理解，当核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度时，C与D的核酸序列同一性％不等于D与C的核酸序列同一性％。术语“氨基酸”使用其最广泛的意义并意图包括天然La-氨基酸或残基。本文使用了常用的天然氨基酸的一个和三个字母的简写(Lehninger，A.L.，Biochemistry,2ded.,pp.71-92,(1975),WorthPublishers,NewYork)。该术语包括所有的D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸如氨基酸类似物、蛋白通常不包含的天然氨基酸如正亮氨酸和具有本领域已知的氨基酸特性的化学合成的化合物。例如，氨基酸的定义包括苯基丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物，其使得所述肽化合物与天然Phe或Pro有相同的构象限制。这些类似物和模拟物在本文中被称为氨基酸的“功能等价物”。Roberts和Vellaccio在ThePeptidesAnalysis,Synthesis,Biology,GrossandMeiehofer,Eds.,Vol.5p341,AcademicPress,Inc,N.Y.1983中列出了氨基酸的其他实例，所述文献以引用的方式纳入本文中。术语“蛋白”的氨基酸序列比肽要长。“肽”含有2到约50个氨基酸残基。术语“多肽”包括蛋白和肽。蛋白的实例包括但不限于，抗体、酶、凝集素和受体；脂蛋白和脂多肽；以及糖蛋白和糖多肽。“融合蛋白”和“融合多肽”是指含有两个共价连接部分的多肽，其中所述两个部分中的每个均是具有不同性质的多肽。所述性质可为生物学性质，例如体外或体内活性。所述性质也可为简单的化学或物理性质，如与标靶抗原结合、反应催化作用等。所述两个部分可通过一个单肽键直接相连，或通过一个含有一个或多个氨基酸残基的肽接头相连。通常，所述两个部分和所述接头互在对方的阅读框内。优选地，所述多肽的两个部分来自异种或不同的多肽。术语“治疗有效量”是指有效“减轻”或“治疗”受试者或哺乳动物中疾病或障碍的本发明组合物的量。通常，疾病或障碍的减轻或治疗包括减轻与所述疾病或障碍有关的一种或多种症状或医学问题。在某些实施方案中，“治疗有效量”是改善神经脉管系统、氧摄取、血流、斑块清除、葡萄糖摄取、原纤维切割、斑块分解、斑块负荷、降低tau磷酸化或它们的组合的量。术语“治疗”和“处理”是指抑制、减轻和治愈淀粉样蛋白相关疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、遗忘性MCI和它们的病症或症状。“治疗”和“处理”是指治疗性治疗和预防或防止方法，其目标是防止或减缓(减轻)标靶生理病症或障碍。治疗可通过给予治疗有效量的至少一种本发明的化合物进行。本文所用的“治疗有效量”包括预防量，例如有效减轻或治愈上述疾病或其症状的量。这些评估所述疾病的成功治疗和改善的参数可通过医师熟悉的常规方法容易地测量。术语“改善的神经脉管系统”是指血管密度的增加和通过血管网络对脑部营养递送的增加。使用本领域技术人员所知的高分辨率的磁共振成像(MRI)可建立成像脑部的三维(3D)脉管网络图。使用内源血氧水平依赖的对比和外源对比剂可使所述3D图像中的动脉和静脉结构可视化(Bolanet.al，2006)。在治疗前、治疗中和治疗后比较所述脉管网络，使得可评估被治疗的某个阿尔茨海默病患者的神经脉管系统的改善。“增加”是指血管密度或对脑部的营养递送比治疗前的血管密度或营养递送更高。术语“改善的氧摄取”是指增加的对脑部和脑细胞的氧递送，而术语“改善的血流”是指循环流过脑部的血液体积的增加。使用本领域建立的功能MRI可使脑中的血流可视化(Daviset.al，1998)。处于活动状态的脑区需要氧气以帮助葡萄糖代谢产生能量。这是通过血流的大量增加实现的，从而克服了氧气的扩散限制并将充足的氧气供给处于活动状态的脑组织。这种血流的增加和伴随的氧气增加是通过以下方式检测的利用功能MRI的内源血氧水平依赖对比中的变化。然后增加的信号被用于推出血流以及氧摄取和代谢的增力口。通过对阿尔茨海默病患者的脑中血流和氧摄取不足区域的绘图，可用年龄匹配的非阿尔茨海默病患者为对照在治疗中或治疗后评估改善。“增加”是指治疗后患者中氧摄取或血流比治疗前患者中的氧摄取或血流更多。术语“斑块清除”是指斑块区域的可测量的减少。正电子发射断层显像(PET)和使用对斑块有特异性的对比剂(如硫磺素衍生的匹兹堡化合物B，PIB)(Khmketal,2004)是本领域已知的使阿尔茨海默病患者的脑中的斑块沉积可视化的方法。通过生成斑块负荷的图像，人们可评估斑块清除的改善，作为与治疗前相比以及与年龄匹配的未患阿尔茨海默病的对照受试者相比的治疗结果。术语“改善的葡萄糖摄取”是指脑部利用来自血流的葡萄糖的能力增强。阿尔茨海默病的特征之一是脑部细胞的葡萄糖摄取和代谢的降低(代谢减退)；这种疾病发作的标志是通过用氟标记的葡萄糖对比剂(FDG-PET)进行的脑部PET成像测定的(Buckneret.al，2005)。通过比较在治疗之前、期间和之后用此方法生成的图像，在用年龄匹配的未患阿尔茨海默病的受试者作为对照时，可评估到到以前表现葡萄糖摄取下降的阿尔茨海默病患者脑区中葡萄糖摄取的提高。术语“改善的原纤维切割”是指蛋白水解消化原纤维的能力增强。术语“斑块分解”是指原纤维的蛋白水解切割的结果。术语“斑块负荷”是指构成斑块的聚集原纤维的总量。术语“tau磷酸化的下降”是指脑部细胞内的tau蛋白磷酸化的量下降。治疗阿尔茨海默病和遗忘性轻度认知缺损的方法本发明提供了治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段在治疗阿尔茨海默病或其症状中的应用。在本发明的一个实施方案中，所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段可与第二种用于治疗阿尔茨海默病的治疗性化合物共同给药。下面更详细地讨论用于治疗阿尔茨海默病的化合物的实例。治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段可口服给药或更优选地鼻内给药。下面更详细地讨论给药方法。本发明还提供组织激肽释放酶或其变体或活性片段在治疗阿尔茨海默病相关病症中的应用，其中所述病症包括神经学病症如记忆、语言、视觉能力和问题解决，以及心理学病症如情感淡漠、易怒、焦虑、沮丧、妄想、幻觉、失眠、厌食、精神空虚、失禁或回避社交。阿尔茨海默病与胰岛素和信号转导机制的脑部特异性异常有关(Lester-Colletal.,J.AlzheimersDis.2006,9(1)13-33(只有摘要))。动物模型示出了由于磷酸化tau蛋白和Αβ的水平上升以及编码tau蛋白和淀粉样前体蛋白的基因的上调表达而导致的神经退化。这些基因表达的改变直接导致编码胰岛素、胰岛素样生长因子II和多种胰岛素相关受体(胰岛素受体、胰岛素样生长因子I受体、胰岛素受体底物-I、胰岛素样生长因子II受体受体)的基因的表达下降以及与所述胰岛素受体结合的配体减少(Lester-Colletal.，2006)。阿尔茨海默病患者经常具有由胰岛素异常导致的脑细胞中葡萄糖摄取和代谢的下降。本发明的另一个实施方案包括治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善患者脑部葡萄糖摄取的应用。淀粉样斑块沉积是与阿尔茨海默病有关的主要病状。已发现，斑块清除可能与内源蛋白酶如基质金属蛋白酶9(MMP-9)有关(Yan，2006)。由于KLKl具有抗淀粉样蛋白攻击的保护能力，KLKl也可有益于治疗唐氏综合症患者。唐氏综合症是由21号染色体的额外拷贝引起的，这可导致某些蛋白的过表达。可被切割而形成Αβ(APP)的淀粉样前体蛋白位于21号染色体上，并且推测其产生的增加促进了唐氏综合症患者的阿尔茨海默病的早发。KLKl可直接切割纤维淀粉样蛋白斑块。切割这些淀粉样蛋白相关疾病的标记的能力可减少阿尔茨海默病和唐氏综合症中的斑块。这些纤维淀粉样斑块的直接切割可治疗这些疾病，例如帮助与阿尔茨海默病有关的认知下降。本发明的另一个实施方案是治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于消化或切割淀粉样蛋白的应用。本发明的另一个实施方案是治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者脑中斑块清除的应用。组织激肽释放酶或其变体或活性片段可用于改善原纤维的切割。原纤维的蛋白水解切割导致构成纤维淀粉样斑块的聚集原纤维的总量降低并因此导致染病患者脑中斑块清除的改善。GSK-3β激酶的活性是通过其对tau和APP的磷酸化在阿尔茨海默病的发展中起重要作用的因子。Tau磷酸化导致的缠结的形成造成神经退化，而磷酸化有利于APP转变为Αβ的过程，从而导致淀粉样蛋白斑块的形成。用特异抑制剂如锂对GSK-3i3的直接抑制可减少tau磷酸化、缠结、神经退化和APP转变为Aβ的过程(Biochemistry2004Jun8；43(22)6899-908；ProcNatlAcadSciUSA.2005May10；102(19):6990_5)。本发明的另一个实施方案是治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于减少需要所述治疗的患者脑中tau磷酸化的应用。GSK-3β的活性通常受Akt的丝氨酸9磷酸化的调控。值得注意的是，由激肽激活的舒缓激肽Β2受体信号转导通路(JBiolChem.2005Mar4；280(9):8022_30)和NGF-乙酰胆碱通路(JNcurosci.19935印；13(9)3956-63；NeurobiolAging2006Mar；27(3)413-22.)导致GSK-3i3磷酸化增加。这两种通路都被认为受胞外蛋白酶包括KLKl的调控(FEBSLett.1990Jul16；267(2)207-12；Hypertension2006Apr；47(4):752_61)。本发明的另一个实施方案是治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于减少需要所述治疗的患者脑中tau磷酸化的应用。已知神经脉管系统功能障碍促进阿尔茨海默病的病理和发展。神经脉管系统功能障碍可能会是由不良斑块清除导致的发炎引起。本发明的另一个实施方案是治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要所述治疗的患者的神经脉管系统的应用。在另一个实施方案中，所述应用包括需要所述治疗的患者脑部血流的改善和/或氧摄取的改善。遗忘性MCI代表正常认知和见于阿尔茨海默病的痴呆之间的中间状态。因此，不足为奇地，遗忘性MCI的神经病理学表达显示其自身为向阿尔茨海默病发展的过渡状态。具体地，在遗忘性MCI发现了脑内侧颞叶结构内的tau缠结的优势表达和更类似于正常健康个体中存在的淀粉样负荷(ArchNeurol.2006May；63(5):665_72)。如此，在所述阿尔茨海默病病理学中涉及的机制也在遗忘性MCI中起作用，因此KLKl用于治疗阿尔茨海默病的治疗作用也同样适用于治疗遗忘性MCI和向阿尔茨海默病的发展。如此，通过给予KLK1、其变体或活性片段来治疗阿尔茨海默病或遗忘性MCI的方法可改善脑中的斑块清除。本发明的另一个方面包括治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于治疗遗忘性MCI的应用。一个实施方案包括一种通过口服或更优选地通过鼻内给予治疗有效量的组织激肽释放酶来治疗哺乳动物中遗忘性MCI的方法。在另一个实施方案中，所述组织激肽释放酶可与第二种用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性MCI的治疗性化合物共同给药。下面更详细地描述这些化合物的实例。组织激肽释放酶的给药治疗脑部营养疾病(aliment)的的传统给药模式包括口服以及静脉内给药途径。这些模式并非总是理想的。化合物的口服给药导致有限的生物利用度(溶解性、首过肝脏降解、血脑屏障限制)以及时间释放问题和潜在的不希望的肠胃副作用。然而，组织激肽释放酶(KLKl)似乎能够通过并可绕开血脑屏障以对脑部产生作用。静脉内(i.v.)给药需要经过训练的医务专业人员，这对卫生保健系统来说是费时和昂贵的。其还会导致患者顺应性问题。与静脉内给药有关的风险包括注射点的感染以及对患者和给予所述剂量的专业人员都存在的安全问题。然而，在受控环境下，静脉内给药可为有效的。鼻内给药允许药物“快速作用”，因为其能够通过更直接的途径到达脑部。鼻内给药很方便并且实际上消除了见于静脉内给药时的患者顺应性问题。嗅觉上皮细胞是选择性透过的。因此，蛋白如KLKl可通过并可经鼻内途径绕过血脑屏障。因此KLKl的鼻内给药可直接对脑部产生作用——从而也使外周作用最小化。这是由于在鼻通道上部的嗅觉区域的参与。鼻内给药的物质可在嗅觉区域遵循两种可能的途径——神经元内和神经元外卜。神经院内途径包括将肽摄取到嗅觉神经元中，其中肽沿着轴突移动以绕开血脑屏障。通过嗅觉区域上皮细胞中唯一的细胞间裂是一种允许肽扩散到蛛网膜下隙的胞外途径。由于能够快速到达脑部、避开神经元内途径包括的蛋白水解降解(Bornetal.,Nat.Neurosci.2002,5(6):514_6)以及在脑部多个位点上快速诱发生物学作用(Throneetal.，2004)，因此胞外途径是更加优选的。鼻内给药相对于口服给药的一个优点在于可将KLKl更直接地递送到所需的作用位点(脑部)。药物组合物可通过口服或鼻内给药。适于鼻内给药的制剂包括软膏剂、乳剂、洗齐、贴剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油剂等。溶液或悬浮液可通过传统工具例如点滴器、移液器或喷雾器直接施用于鼻腔。制剂可以单次或多次剂量的形式提供。对于用点滴器或移液器的后一种情况，可通过给予患者合适的预设体积的所述溶液或悬浮液实现。喷雾剂包括一个定量雾化喷雾泵。用于气雾剂给药，特别是给予包含鼻腔和嗅觉区域的上呼吸道，的制剂的给药方式包括鼻内给药。活性成分被装在一个带有合适的推进剂的加压包中，所述推进剂包括但不限于含氯氟烃(CFC)、二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或者二氧化碳或其他合适的气体。气雾剂也可包含一种表面活性剂如卵磷脂。药物剂量可通过定量阀来控制。或者活性成分可以干粉的形式提供。所述化合物的粉末混合物可存在于合适的粉末基质如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP))中。所述粉末空白溶剂可在鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以单位剂量的形式存在，所述单位剂量的形式包括但不限于胶囊或药筒(如可通过吸入器给予其中所述粉末的明胶或泡状包)。口服给药包括溶液、片剂、缓释胶囊、肠衣胶囊、口服崩解片剂和糖浆的经肠给药。“有效量”或“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需效果的药物或试剂的量。在一种组合治疗中，所述组合的一种成分的“有效量”是当所述化合物与所述组合的其他成分组合使用时可有效提供所需效果的量。“有效”的量会随受试者的不同而变动，依赖于个体的年龄和综合情况、一种或多种特定活性试剂等。对于任何个案，合适的“有效”量可用常规实验确定。用于治疗上述疾病或其症状的本发明化合物的治疗有效量可在所述疾病或症状发作之前、发作同时或发作之后给药。本发明的化合物可在所述疾病或症状发作的同时给药。本文所用的“共同给药”和“同时给予”包括以混合物的形式(如以药物组合物或以溶液的形式)给予本发明的多肽和另一种治疗剂，或分别给予本发明的化合物和另一种治疗齐U，例如相继、同时或在不同时间给予单独的药物组合物或溶液，但所述不同时间之间不能相距远到使本发明的化合物和另一种治疗剂不能相互作用和不能给予较低剂量的活性成分。本发明的另一个方面包括如本文所述的一种方法，所述方法还包含共同给予另一种用于治疗阿尔茨海默病的治疗性化合物。阿尔茨海默病的治疗性化合物包括但不限于乙酰胆碱前体、增加一种乙酰胆碱前体、一种增强乙酰胆碱释放的化合物、一种乙酰胆碱酯酶抑制剂、一种毒蕈碱激动剂、一种抗氧化剂、一种抗炎药、一种激素、一种钙通道阻滞齐U、神经生长因子、一种益智剂、一种神经营养因子小分子模拟物(Massaetal.,.J.Mol.Neurosci.2002,19107-111)、NMDA受体拮抗剂、一种5-HT1A受体激动剂、一种抗淀粉样蛋白生成剂如tramiprosate(Alzemed)、一种抗组胺药如迪姆朋(Dimebon)、一种甲磺酸双氢麦角碱(HYDERGINE)、银杏或石杉碱甲。这些化合物也可用于治疗遗忘性MCI。本发明的另一个方面包括一种可为胆碱、卵磷脂或乙酰-1-肉毒碱的乙酰胆碱前体。—种增强乙酰胆碱释放的化合物包括但不限于4-氨基吡啶或利诺吡啶。一种乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChE)包括但不限于毒扁豆碱、他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏(RAZADYNE)、敌百虫、石杉碱甲或依斯的明。一种毒蕈碱激动剂包括但不限于米拉美林、咕诺美林、槟榔碱、氧化震颤素、沙可美林或他沙利定。一种抗氧化剂选自但不限于维生素E、艾地苯醌、辅酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或维生素C。一种抗炎药包括非留类抗炎药。一种激素包括但不限于雌激素或睾酮。一种益智剂包括但不限于吡拉西坦、阿尼西坦(aniracetam)、法索西坦(fosracetam)、奈非西坦(nefiracetan)、普拉西坦(pramiracetam)、奈拉西坦(nebracetam)禾口奥拉西坦(oxiracetam)。一种NMDA受体拮抗剂包括但不限于美金胺(memantine)；克他命(ketamine)；MK-801；L-70U324；L_689、560；GV196771A；2-氨基-5-膦酰基戊酸(AP5)；(R)-CPP-ene；和(2S*，3R*)-l-(联苯基-4-羰基)哌嗪_2，3-二羧酸(PBPD)。“治疗”和“处理”是指防止、抑制和/或减轻疾病及相关症状，以及治愈侵染哺乳动物器官和组织的疾病病症或症状。本发明的组合物可在任何提及的病症发生之前、期间和之后以治疗有效量被给药。药物组合物本发明提供适于口服或鼻内给药的包含组织激肽释放酶或其变体或活性片段的药物组合物在治疗阿尔茨海默病、遗忘性MCI及其症状中的应用。本发明的一个方面提供一种配制用于口服给药的药用组合物，其每个给药频率含有约0.001-约1000国际单位(IU)的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种鼻内给药剂量可为约0.001-100IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种鼻内给药剂量可为约0.001-10IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种鼻内给药剂量可为约0.Ol-IOiuo组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种鼻内给药剂量可为约0.Ol-Iiuo组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种鼻内给药剂量可为约0.1-Iiuo本发明的另一个方面提供一种配制用于鼻内给药的药用组合物，其每个给药频率含有约0.001-约5000IU的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.001-500IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.001-50IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.01-50IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.01-5IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.1-5IU。组织激肽释放酶或其变体或活性片段的一种口服剂量可为约0.I-1IU所述药物组合物还可包含如上所述的第二种可用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性MCI的治疗性化合物。本发明的药物组合物口服或鼻内给药的制剂。适于鼻内给药的制剂包括粉末剂、粒剂、溶液、滴剂、软膏剂、乳剂、洗剂、贴剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、油剂等。本发明的溶液或悬浮液可通过传统工具如点滴器、移液器或喷雾器直接施用于鼻腔。制剂可以单次或多次剂量的形式提供。溶液可为无菌、等渗或低渗的，或者适于通过注射或其他方式给药并可含有合适的佐剂、缓冲液、防腐剂和盐。溶液如滴鼻剂可含有抗氧化剂、缓冲液等。粉末或颗粒形式的药物组合物可与溶液以及与稀释剂、分散剂和/或表面活性剂结合。用于气雾剂给药的制剂包括被设计用于鼻内给药的制剂。活性成分可被装在一个带有合适的推进剂的加压包中，所述推进剂包括但不限于含氯氟烃(CFC)(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他合适的气体。气雾剂也可包含一种表面活性剂如卵磷脂。药物剂量可通过定量阀来控制。或者活性成分可以干粉的形式被提供，例如存在于合适的粉末基质如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP))中的所述化合物的粉末混合物。所述粉末空白溶剂可在鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以单位剂量的形式存在，如在胶囊或药筒(如可通过一种装置给予其中所述粉末的明胶或泡状包)中。一种配制用于鼻内给药的药物组合物包含约0.001-约5000IU的KLKl或其变体或活性片段，任选地还包含一种药学可接受的赋形剂。适于口服给药的制剂包括液体、丸齐、溶液、片剂、缓释胶囊、肠衣胶囊或糖浆。一种配制用于口服给药的药物组合物包含约0.001-1000IU的KLKl或其变体或活性片段，任选地还包含一种药学可接受的赋形剂。在一个实施方案中，一种配制用于口服给药的药物组合物包含至少约ι.Oμg/ml的KLKl或其变体或活性片段，任选地还包含一种药学可接受的赋形剂。一种组合物可包含至少约2.0μg/ml、2.5μg/ml,5μg/ml、7.5μg/ml或10μg/ml的KLKl或其变体或活性片段。用于鼻内给药的药物组合物及其应用本发明的一个方面包括一种配制用于鼻内给药的组合物，其包含约0.001-约5000IU的KLKl或其变体或活性片段，任选地包含一种药学可接受的赋形剂。一种组合物可对人类或其他哺乳动物的鼻腔给药，通过所述嗅觉神经通路到达脑部的患病区域。本方法可采用一种能够将KLKl转运到脑部患病神经元的药物组合物。一种本发明的方法可通过逆行和顺行跨神经元转运机制将化合物递送到脑部患病区域。通过该转运系统将神经试剂向脑部的递送可以数种方式实现。一种技术包含将一种神经试剂单独递送到鼻腔。在这种情况下，KLKl的化学特征可促进其到脑部患病神经元的转运。可利用所述嗅觉神经通路的外周神经细胞来将KLKl递送到与嗅球相连的脑部区域中受损神经元处。KLKl可单独对鼻腔给药，或结合第二种可用于治疗阿尔茨海默病的治疗性化合物给药。KLKl可结合空白溶剂和/或其他佐剂以形成一种药物组合物。可能的佐剂包括但不限于，GM-1、磷脂酰丝氨酸(PS)和乳化剂(如聚山梨醇酯80)。其他补充物质包括但不限于亲脂性物质如神经节糖苷和磷脂酰丝氨酸(PS)。一种本发明的方法将KLKl递送到哺乳动物的鼻腔中。优选地，将KLKl递送到鼻腔上三分之一的嗅觉区域，特别是递送到嗅觉上皮细胞以促进所述试剂被转运到外周嗅觉神经元中而不是呼吸上皮细胞内的毛细血管中。从而将KLKl通过神经系统转运到脑部和脑中的受损神经元。在本发明方法的一个实施方案中，KLKl可与由亲脂性物质构成的胶束结合。这些胶束可改变鼻黏膜的渗透性并增强所述试剂的吸收。亲脂性胶束包括神经节糖苷，特别是GM-I神经节糖苷，以及磷脂酰丝氨酸(PS)。一旦KLKl通过嗅觉上皮细胞，本发明还提供KLKl沿嗅觉神经通路的转运。KLKl能够在嗅觉系统内移动。具体地，已经证明神经营养物质和神经轴突生长物质可快速进入神经细胞膜和具有对神经细胞受体位点的亲和性。为将KLKl转运到嗅觉神经元，可将KLKl单独或结合其他物质作为一种药物组合物给药到位于鼻腔上三分之一的嗅觉区域。可用注射器、packtail、棉棒(pledget)或粘膜下输注通过软管或导管将所述组合物以粉末或液体的鼻喷雾剂、滴鼻剂、凝胶或软膏剂形式分散给药到鼻内。鼻内给药的药物组合物可被配制为粉末、颗粒、溶液、软膏剂、乳剂、气雾剂、粉末或滴剂。溶液可为无菌、等渗或低渗的，或者适于通过注射或其他方式给药。除了KLK1，溶液可含有合适的佐剂、缓冲液、防腐剂和盐。粉末或颗粒形式的药物组合物可与溶液以及与稀释剂、分散剂和/或表面活性剂结合。溶液如滴鼻剂可含有抗氧化剂、缓冲液等。所述嗅觉系统提供外部环境和脑部的直接连接，因此可快速和方便地递送KLKl用于治疗阿尔茨海默病和遗忘性轻度认知缺损。此外，鼻内应用药物组合物的方式可为多种形式，如粉末、喷雾剂、或滴鼻剂，这些形式可省却静脉或肌肉注射并且简化治疗性药剂的给药。本发明将就多种具体和优选的实施方案和技术进行描述。然而，应理解在本发明的精神和范围之内还可进行许多变化和改进。实施例实施例1体外淀粉样蛋白切割测定原纤维的制备将合成人淀粉样蛋白Αβ1-42或Αβ1_40溶解于二甲基亚砜(DMSO)(Sigma,St.Louis,MO)至5mM浓度，然后在即将使用前在MilliQ水中稀释至终浓度25mM。为制备淀粉样蛋白原纤维(fAβ)，将5mM的Aβ1-42或Aβ1-40的DMSO溶液在IOmMHCl中稀释至100μM(对于Aβ1-42)或200福(对于々01-40)，涡旋混合30s，在37°C下孵育5天。原纤维的消化KLKl(Sigma)用于在下列缓冲液中进行消化反应ECE、0.IMMES,0.IMNaCl(pH6.0)；IDE、50mMTrisUMNaCl(pH7.5)；ΝΕΡ、0·IMMES(pH6.5)；禾口MMP_9、50mMTris-HCKpH7.5)UOmMCaCl2、150mMNaCl.O.05%Brij35。将其在37°C下孵育4小时到5天。消化后，用质谱分析所述反应。原纤维切割的分析将所述样品加入50mM甘氨酸(pH9.2)/2mM硫磺素T(ThT)(Sigma)中，终体积为2ml。荧光用分光光度计测量，激发和发射波长分别为435和485nm。分析说明KLKl可切割淀粉样蛋白原纤维(图1)和可溶性淀粉样蛋白寡聚物(图2)。在图1中，图A只示出了Αβ，其中有大块淀粉样蛋白原纤维并且无小片段出现。图B只示出了KLK1，其中无明显的小肽片段。然而，在图C中，在约2423Μ/Ζ(质量与电荷比)处有一个明显的峰，这说明发生了切割。在图2中，图A示出了可溶性淀粉样蛋白在约4000-5000M/Z之间有可见峰。在图B中，当将KLKl加入至可溶性淀粉样蛋白时无可见峰。这说明KLKl将可溶性淀粉样蛋白切割为更小的片段。该结果显示KLKl可切割原纤维和可溶形式的淀粉样蛋白，表明KLKl可用于治疗与原纤维斑块和可溶性淀粉样蛋白有关的疾病。实施例2组织激肽释放酶对Αβ丨在大鼠混合皮层培养物中毒件的作用研究了用组织激肽释放酶预处理是否可保护大鼠混合皮层培养物免于接触人淀粉样β肽(Αβ^)。通过一种细胞坏死的标志——LDH释放分析了细胞死亡，并通过神经细胞计数分析了细胞存活率。第一(研究方案Α)，进行Ah_42损伤前(-24小时和-30分钟)将组织激肽释放酶加入所述细胞中。而在第二部分(研究方案B)中，在Ah_42损伤之前(-30分钟)以及损伤之后+24小时将组织激肽释放酶加入所述细胞中。在+24小时的时间点不更换细胞培养基(将组织激肽释放酶或相应量的空白溶剂加入至孔中)，而在-24小时和-30分钟的时间点更换细胞培养基。TffeRNAC细胞培养.从E18Wistar大鼠胚胎(NationalAnimalCenter,Kuopio,Finland)获得混合皮层培养物。将所述皮层解剖取出，并将该组织切成小片。通过用DNA酶(DNase)和木瓜蛋白酶孵育15分钟分离所述细胞。通过离心(1500rpm，5分钟)收集所述细胞。用移液器将所述组织研碎，并将所述细胞以300000个细胞/cm2的密度置于聚-L-赖氨酸包覆的48孔板上，补加有2mM谷氨酰胺、0.1μg/ml庆大霉素、10%热灭活的胎牛血清(FBS-HI)和10%热灭活的马血清(HS-HI)的MEM(2g/L葡萄糖)中。3_4小时后，将所述培养基更换为补加有2mM谷氨酰胺、0.1μg/ml庆大霉素、5%HS-HI的MEM(2g/L葡萄糖)。体外培养三天后，对所述细胞更换补加有谷氨酰胺、庆大霉素、和5%的两种血清的MEM(2g/L葡萄糖)培养基。在体外培养的第6天，通过加入胞嘧啶阿拉伯糖苷(10μM终浓度)抑制不想要的细胞分化24小时。在实验前对所述培养物重新添加补加有谷氨酰胺、庆大霉素和5%HS-HI的MEM(2g/L葡萄糖)。ΑβH2接触.将组织激肽释放酶(SEQIDNO1)溶于补加有葡萄糖、谷氨酰胺、庆大霉素和5%HS-HI的MEM并用此培养基进一步稀释。作为全部神经元死亡的对照，使用300μMN-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)孵育48小时和10μMAβ^42孵育48小时来诱导大约30-50%的细胞死亡。只用培养基处理过的孔用作0-对照。在加入10μMAβ!_42前-24小时和-30分钟将组织激肽释放酶或空白溶剂用移液器加入细胞中。在接触后+24小时再次将组织激肽释放酶或空白溶剂用移液器加入细胞中。LDH测量.48小时后，收集全部孔的培养基，并通过离心(13000rpm，3分钟)除去可能的细胞残骸。将100μ1的等分试样用移液器加入微量滴定板中作为多个重复，再向这些孔中用移液器加入等量的LDH试剂。然后立即在MultiskanELISA读出器中用3分钟动力学检测法测量340nm处的吸光度。测定吸光度/分的改变，此结果与所释放的LDH成正比。剩下的上清液(50μ1)在干冰中速冻以贮存。神经元存活的免疫细胞化学。为进行神经元计数，用含有4%多聚甲醛的0.OlMPB将所述培养物固定30分钟，然后用PBS洗涤两次。所固定的细胞首先被通透化，然后通过用含有牛血清白蛋白和0.3%TritonX-100的PBS封闭缓冲液孵育30分钟来封闭非特异性的结合。抗神经细胞核抗体(抗-NeuN，稀释度1500，Chemicon,Temecula,CA)用作第一抗体。所述细胞用第一抗体孵育48小时，然后用生物素化的第二抗体(1200，VectorLabs)孵育2小时，再用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC-试剂，1200，VectorABCEliteKit,VectorLabs)孵育2小时。使用Ni-增强的DAB作为底物(DABSubstratekit,VectorLabs)使阳性细胞可视化。NeuN免疫阳性神经元用光学显微镜进行计数。总共地，对每孔的2个视野进行计数。此结果表示为存活神经元的百分比。数据分析。所用的每种化合物浓度的孔数为6(η=6)。在两个研究方案中都研究T5种组织激肽释放酶的浓度(0.001，0.01，0.1，1，10μg/ml)。统计分析用StatsDirect统计软件进行。先用单因素方差分析再用Durmet检验分析所得数值(与空白溶剂处理组相比)。结果以平均值士标准偏差(SD)的形式表示，并且P<0.05水平的差异被认为是在统计意义上显著的。MM组织激肽释放酶结果。(研究方案A)只在AiBp42损伤(10μM终浓度)之前-24小时和-30分钟将组织激肽释放酶加入所述细胞中。在-24小时和-30分钟的时间点更换细胞培养基。以NMDA对照导致的LDH释放为100%，在不存在组织激肽释放酶的情况下AβH2导致39.14%的LDH释放。浓度为0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml禾口1.0μg/ml的组织激肽释放酶不改变Aβ工吣损伤后的LDH释放(图3)。然而，10μg/ml的组织激肽释放酶显著地降低了LDH释放。同样，较低浓度的组织激肽释放酶不影响AβH2损伤后的(存活)细胞计数(图4)。与被Ai^_42损伤并无组织激肽释放酶的RMCC相比，l.Oyg/ml和10μg/ml的组织激肽释放酶的保护使RMCC计数增加。10μg/ml的保护是在统计意义上显著的。(研究方案B)在AβH2损伤(10μM终浓度)之前(-30分钟)和Aβ卜42损伤之后+24小时将组织激肽释放酶加入所述细胞中。在+24小时的时间点，不更换细胞培养基(将组织激肽释放酶或相应量的空白溶剂加入孔中)，而在-30分钟的时间点更换细胞培养基。以NMDA对照导致的LDH释放为100%，在不存在组织激肽释放酶的情况下Aβ卜42导致43.87%的LDH释放。浓度为0.001μg/ml、0.01μg/ml和0.1μg/ml的组织激肽释放酶不改变Aβi_42损伤后的LDH释放(图5)。然而，1.0μg/ml和10μg/ml的组织激肽释放酶减少了LDH释放，且给予10μg/ml的组织激肽释放酶使LDH释放产生了在统计意义上显著的降低。同样，较低浓度的组织激肽释放酶不影响Aβ工吣损伤后的(存活)细胞计数(图6)。与被Aβ!_42损伤并且无组织激肽释放酶的RMCC相比，当对RMCC应用1.0μg/ml和10μg/ml的组织激肽释放酶时可观察到细胞计数的增加。10μg/ml的保护是在统计意义上显著的。如通过测量LDH释放和神经细胞计数(两个试验都是统计意义上显著的)确定的，在两种组织激肽释放酶给药方案(上述研究方案A和研究方案B)中，10μg/ml的组织激肽释放酶都降低了Αβi_42诱导的神经元死亡。这些结果表明组织激肽释放酶的预处理(-24小时和-30分钟)以及组织激肽释放酶的结合预处理(-30分钟)与后处理(+24小时)可保护大鼠皮层培养物免于Aβi_42诱导的细胞死亡。实施例3使用不同处理方案时10μR/ml的组织激肽释放酶对Aβ在大鼠混合皮层培养细胞中毒件的作用还检测了10μg/ml的组织激肽释放酶对Aβ^42在大鼠混合皮层培养物(RMCC)中毒性的作用。用于检测激肽释放酶作用的方法与在实施例2中用于检测组织激肽释放酶的方法相同。检测了三种不同的激肽释放酶(10μg/ml)对RMCC的给药方案——研究方案A)在Aβ卜42损伤前24小时和30分钟，研究方案B)在Aβ卜42损伤前30分钟和在Aβ卜42损伤后24小时，以及研究方案C)在Aβi_42损伤前24小时和30分钟并且在Aβ^42损伤后24小时。结果示于图7。用10μg/ml的激肽释放酶处理RMCC确实保护了免于Aβ^损伤，因为在全部三种处理方案中均观察到LDH释放在统计意义上显著的降低。这些结果表明用固定浓度的组织激肽释放酶(10μg/ml)的预处理(-24小时和-30分钟)，结合预处理(-30分钟)与后处理(+24小时)，和结合预处理(-24小时和-30分钟)与后处理(+24小时)可保护大鼠皮层培养物免于Aβi_42诱导的细胞死亡。实施例4:胰激肽(InM-IOOnM)对Aβ丨在大鼠混合皮层培养物中毒件的作用还检测了胰激肽对Αβ工吣在大鼠混合皮层培养物RMCC)中毒性的作用。用于检测胰激肽作用的方法与实施例2中用于检测组织激肽释放酶的方法相同。检测了三种不同的胰激肽对RMCC的给药方案——研究方案Α)在Αβi_42损伤前24小时和30分钟，研究方案B)在Aβ卜42损伤前30分钟和在Aβ卜42损伤后24小时，以及研究方案C)在Aβ卜42损伤前24小时和30分钟并且在AβH2损伤后24小时。在研究方案A、B和C中，用胰激肽(ΙηΜ、5nM、10nM、50nM和IOOnM)处理RMCC不改变Aβ^42损伤后的LDH释放(图8_10)并且不影响Aβ^42损伤后的(存活)细胞计数(图11-13)。这是反直觉的，因为胰激肽激活舒缓激肽Β2受体，这会引起可切割淀粉样蛋白的ΜΜΡ-9表达的增加。人们会推测，由胰激肽给药引起的ΜΜΡ-9增加会导致对淀粉样蛋白的切割并且抵御Aβi_42诱导的细胞死亡。实施例5胰激肽(1μΜ-100μΜ)对Aβ卜42在大鼠混合皮层培养物中毒性的作用根据实施例4的方法和研究方案再次检测了塍激肽对AβH2在大鼠混合皮层培养物(RMCC)中毒性的作用。结果示于图14-16的研究方案Α、Β和C中。用IyM和IOyM的胰激肽处理RMCC确实在研究方案Α、Β或C中改变了AβH2损伤后的LDH释放。然而，非常意外的是，与只有Aβ^42损伤相比，用100μM的適激肽处理RMCC显著地造成了Aβ^42损伤后的细胞死亡，表明此浓度的塍激肽对RMCC具有毒性。这是反直觉的，因为塍激肽激活舒缓激肽Β2受体，这会引起可切割淀粉样蛋白的ΜΜΡ-9表达的增加。人们会推测，由胰激肽给药引起的ΜΜΡ-9增加会导致对淀粉样蛋白的切割并目.抵御Aβ1-42诱导的细胞死亡。^MM6鼻内組jR激肽释放勿代i射云力力学研究此研究的目的是确定对麻醉大鼠鼻内给药后到达中枢神经系统和外围组织的组织释放激酶(KLKl)的量。在KLKl给药后30分钟，先用冰冷盐溶液再用多聚甲醛固定剂经心脏灌注动物，然后将组织切下。利用Y计数确定每个组织样品中的放射标记的KLKl的量，并用组织重量和给药溶液标准品的Y计数计算组织浓度。动物使用成年雄性SpragueDawley大鼠(η=10，平均335.4g±4.57gSE)进行此研究。将动物分组饲养在地区医院动物养殖实验所(RegionsHospitalAnimalCareFacility)，自由取食和进水。动物保持在12小时光照循环下。全部实验过程都由地区医院的动物养殖和使用委员会(AnimalCareandUseCommittee)根据IACUC规程号08-022批准。MM将组织激肽释放酶送入Perkin-Elmer中进行125I-标记(QuoteNEX-084，lotC1541583)。也使用了来自Sigma的未标记的KLKl(cat#K3627-lKU，lot018K1441)。将未标记的KLKl溶于IXPBSdOXPBS,Sigma,cat#P5493,lot027K8405稀释在无菌水中)中。平均剂量为48.1μL、75μCi和2.6mg。a.麻醉前，对每只大鼠进行称重。b.制备麻醉混合物并根据动物体重以含有30mg/kg激肽释放酶、6mg/kg甲苯噻唑和lmg/kg乙酰丙嗪的全剂量计算全麻醉剂量、半麻醉剂量和1/4麻醉剂量。c.装配配有25G或27G，1/2英寸针头的l_cc注射器并将全剂量吸入注射器以用于注射。d.如下将大鼠控制在一块毛巾中。将大鼠腹部朝下置于一块手巾中间。将毛巾围绕头部和肩部包裹以进行控制。将包裹的动物保持腹面朝下，同时固定左后腿。e.将左后腿拉向一边并将针头恰好插入大腿上方的皮肤下(皮下)。确保针头位于皮下(而非肌肉内)后，注射全剂量。将大鼠置于鼠笼中并记录注射时间。动物应在5分钟内被麻醉。f.通过捏掐后爪或尾巴评估反射，从而在在整个过程中监控麻醉。如果存在反射，根据需要再给予半剂量或1/4剂量加强麻醉。g.在给药期间，动物在第一次给药约20-25分钟后接受半剂量加强麻醉。mI-KLKl的鼻内转运a.将被麻醉大鼠的背部向下置于金属手术托盘中的加热垫中。所述加热垫与恒温器相连，基于直肠探头的连续测量进行自动调节以保持37°C。b.将2"χ2"纱布垫紧紧地卷成一个枕头，绑在一起并置于颈下以使颈部保持与操作台水平的正确位置。c.将铅浸渍的屏蔽板置于所述手术托盘和实验者之间以保护实验者免于辐射。溶液、移液器、吸头和废物容器都置于所述屏蔽板后以便于使用。d.在所述屏蔽板后将6μL液滴装入所述移液器。e.使用以石蜡膜包覆的棉签完全堵塞一个鼻孔(将所述棉签的平头部分轻推入所述鼻孔以阻挡气流)，而将所述6μL液滴从所述移液器(与大鼠中线保持45°)慢慢推出，在所述吸头上形成一个液滴。将所述液滴滴到开放鼻孔中以被吸入。f.两分钟后，将本来开放的鼻孔堵塞并以相同的方式给予本来堵塞的鼻孔6μL液滴。g.每隔两分钟按照如上所述交替给予鼻孔一滴，直至14分钟后总共给予8滴(每鼻孔4滴)。h.记录每滴的给药时间以及关于动物呼吸或给药成功的任何细节。对每种给药溶液的三个3μL等分试样进行Y计数以确定测量的比活。经心脏灌注a.在所需终点时间之前两分钟，将被麻醉动物的背部向下平放在金属手术托盘中。移除所述加热垫、直肠探头和颈枕。使用胶带以将前肢固定在托盘上。将所述托盘的背部轻微抬高以使血液从动物中流出。b.通过切开皮肤使胸骨暴露。用止血钳夹住胸骨并横向切开胸廓，使横膈膜暴露。c.横向切开横膈膜以暴露胸膜腔。d.用手术剪剪开胸廓朝向动物腋下的一侧，制造一个暴露心脏的V型切口。e.将夹住胸骨的止血钳绑在头上以保持胸腔打开。f.用钝手术钳稳定心脏，同时在左心室上开一个小切口。将带有18G，1〃钝针头的Icc注射器插入左心室并抽出大约0.Iml血液并置于预先称重的试管中以进行γ计数。g.将与注满60cc盐溶液的延长管连接的第二个18G钝针头经过左心室插入动脉。h.将一把大动脉夹置于心脏上方的动脉上，固定所述钝针头的位置。i.用注射泵以15ml/min的速率对所述动物先灌注60mL盐溶液再灌注360mL的多聚甲醛。脑部解剖a.在整个实验过程中，遵守严格的注意事项以防止动物组织、手术器具和设备的辐射污染。盖革计数器置于每个工作地点以连续检测工具、工作区和工作人员。一直都要穿戴个人保护装置包括双层手套、实验服、眼防护物、面具和护士帽。铅浸渍的屏蔽板用于将辐射照射减至最低。工作人员还要在整个实验过程中佩戴放射性监测标记以确定照射量。b.收集后，立即将每个组织样品放入预先标记和预先称重的Y试管中用于随后的测量。c.为除去头，用手术刀恰好在肩胛骨的上方切开颈部周围的皮肤和肌肉，并用一把大剪刀剪下所述动物的头，切开时从背面向腹面进行以避免来自气管和食道的污染。d.为暴露脑部，在颅骨的背面切开一个中线切口，然后剥去皮肤，并用一把直头止血钳打破骨头，注意使背面硬脑膜保持连接。e.收集背部硬脑膜。f.为从所述颅骨上取出脑组织，将头倒转，并用一把小铲将脑组织与脑腔分离。在接近脑组织处剪断后视神经和三叉神经。然后将脑组织置于干净的培养皿中以进行解剖。g.通过在腹面颅骨壁上用手术钳刮擦从所述颅骨的基底上收集腹面硬脑膜。收集垂体、视交叉和三叉神经。所述三叉神经的前部由颅骨中的可见分支之前的部分构成，而包含三叉神经节的剩余部分被看做后部。然后将头放在一边并用kimiipe纸盖住用于随后的解剖。h.使用手术钳、显微手术剪和30G针头将基底动脉和大脑动脉环取出并置于预先称重的纸上(使用纸是因为此组织重量很小)。针头用于抬起所述血管以与脑组织分开，手术钳用于固定，显微手术剪用于进行剪切。收集后立即将此组织称重，然后将整片纸褶皱并置于试管底部。i.用刀片以自然角度切下嗅球，然后将脑组织置于冠状基质(coronalmatrix)中。j.在所述冠状脑基质中，将一个刀片插在之前除去视交叉的区域中央，以将每只动物标准化到相同的位置(前因)。从所述第一个刀片开始，每隔2mm再放入一个刀片，产生6个2mm的薄片，3个视交叉嘴侧的和3个视交叉尾侧的。k.取下刀片，将组织从每个薄片(1-6)切下。并将任何剩余的脑组织也从每个薄片切下。1.将皮层和海马的剩余部分从所述基质中的剩余脑组织中切下并置于不同试管中。m.收集上颈部脊髓。η.然后将剩余脑组织沿中线剖开，并切成中脑、脑桥、延髓和小脑。ο.回到头部，将颈部的腹侧向前切开并将皮向后剥开，以暴露淋巴结、唾液腺和颈部肌肉。p.将浅表淋巴结、深颈淋巴结、颈动脉和甲状腺切下并清除结缔组织。q.用刀片将颅骨沿中线剖开。收集嗅觉上皮和呼吸上皮。躯干解剖a.收集后，立即将每个组织样品放入预先标记和预先称重的Y试管中用于随后的测量。a.将躯干背面向下放置并用手术刀向下打开腹腔至膀胱。b.收集肝(浅部右叶)、肾(左侧顶端)、肾动脉、脾(顶端)、肺(右侧上叶)和心的3mm2的样品。c.收集约0.1-0.2mL的尿液。d.将躯干翻转使腹面向下，沿动物纵向向下从肩膀到臀部沿脊柱切开一个浅表切口。将两侧的皮肤与下面的组织剥离开以暴露肩胛骨。e.将腋下的腋窝淋巴结切下并清除立即结缔组织。f.收集一片右侧三角肌肌肉(约3mm2)。g.用手术刀将脊柱上的肌肉划开。为暴露脊髓，将一把小止血钳插入脊柱并且用于夹下上面的椎骨和组织。用一把小压舌刀将脊髓从脊髓腔中弄松，用手术钳将脊髓取出并置于培养皿中。用手术刀将硬脊膜从脊髓中剥下。将脊髓切为下颈部、胸部和腰部。丢弃下颈部顶端的约2mm。h.从躯干上切下2cm段的食管和器官并将结缔组织除去。丢弃两者顶端的0.5cm(最靠近斩首点的部分)。组织计数将装有样品的预先称重的、管重新称重以确定组织重量。用COBRAII自动、计数器对来自全部大鼠的样品进行计数(标准125I规程，5分钟计数时间，升降机位置1)。每周校准所述计数器以确保计数效率等于或大于80%。对于全部大鼠都使用一个背景方案，其中从用所述Y计数器测量的计数中自动减去平均测量的背景计数。数据分析和计算计算每种组织的nM浓度的平均值和标准偏差。每种组织的平均值的两个标准偏差以外的任何值都被认为是异常值而被从所在数据组中除去。异常值在动物数据表中被标记为“X”Excel电子表格用测量的给药溶液的比活、每种组织的CPM和每种组织的体积(假设Ig=ImL)自动计算出每种组织的nMKLKl浓度。样品计算nM浓度=组织计数(CPM)/测量的比活(cpm/fmol)/组织体积(mL)/IO3(fmol/pmol)示例嗅球的KLKl(4130CPM)/(2.76CPM/fmol)/(0.07734mL)/(103fmol/pmol)=19.35pmol/mL=19.35nMMM结果汇总于表1。KLKl有效地到达以下标靶区域以治疗神经疾病1)额叶皮质、颞叶皮质、海马和其他已知的涉及阿尔茨海默氏症神经病理学的区域；2)脑血管壁、在阿尔茨海默病中淀粉样蛋白血管病的位点；和3)对于治疗神经性炎症可能重要的淋巴系统的颈淋巴节。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>BE0200)按照每个试剂盒的说明重组为1.Oμg/mL。在PBS中制备组织激肽释放酶(SEQID1)的原液和约0.5摩尔当量的大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma，T6522)，连续稀释成hAi342肽的固定浓度为500pg/mL的同样的三份。将溶液分别孵育3和18小时，每次孵育后添加蛋白酶(1/100稀释度的蛋白酶抑制剂混合溶液，SigmaP8340)。按照每个试剂盒的说明，加入50μL上述样品，并将ELISA板在4°C下孵育过夜。ELISA板发展的剩余步骤根据每个试剂盒的说明进行，然后用多孔ELISA板读出器在450nm读数。切割百分数的确定如下100-[(平均KLKl-平均空白)/(平均对照-平均空白)X100]=切割％MM表2-KLK1对淀粉样蛋白β的切割百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>多种浓度的KLKl对淀粉样蛋白β的切割百分数可在图17中找到。权利要求一种治疗患有(a)阿尔茨海默病或其症状；或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段。2.根据权利要求1的方法，其中所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段与第二种用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性轻度认知缺损的治疗性化合物共同给药。3.根据权利要求2的方法，其中所述第二种治疗性化合物包括一种乙酰胆碱前体、一种增强乙酰胆碱释放的化合物、一种乙酰胆碱酯酶抑制剂、一种毒蕈碱激动剂、一种抗氧化剂、一种抗炎药、一种激素、一种钙通道阻滞剂、神经生长因子、一种益智剂(nootropicagent)、一种神经营养因子小分子模拟物、NMDA受体拮抗剂、一种5-HT1A受体激动剂、一种抗淀粉样蛋白生成剂、一种抗组胺药、一种甲磺酸双氢麦角碱、银杏或石杉碱甲。4.权利要求2的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶前体选自胆碱、卵磷脂或乙酰-1-肉毒碱。5.权利要求2的方法，其中所述增强乙酰胆碱释放的化合物为4-氨基吡啶或利诺吡啶(Iinopridine)。6.权利要求2的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自毒扁豆碱、他克林(tacrine)、多奈哌齐(don印ezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(glanthamine)、舌夂百虫(metrifonate)、石杉碱甲或依其Jf的明(eptastigmine)。7.权利要求2的方法，其中所述毒蕈碱激动剂选自米拉美林(Hiilameline)Ji诺美林(xanomeline)、槟榔碱(arecoline)、氧化震亶员素(oxotremorine)、沙可美林(sabcomeline)或他沙利定(talsaclidine)。8.权利要求2的方法，其中所述抗氧化剂选自维生素E、艾地苯醌(iedbenone)、辅酶Q-10、n-乙酰半胱氨酸或维生素C。9.权利要求2的方法，其中所述抗炎药是一种非留类抗炎药。10.权利要求2的方法，其中所述激素是雌激素或睾酮。11.权利要求2的方法，其中所述益智剂是吡拉西坦(piracetam)。12.权利要求2的方法，其中所述甲磺酸双氢麦角碱是氢化麦角碱。13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中所述治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段是鼻内给药的。14.根据权利要求13的方法，其中所述治疗有效剂量为每个给药频率约0.001-约5000国际单位(IU)。15.根据权利要求1-12任一项的方法，其中所述治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段是口服给药的。16.根据权利要求15的方法，其中组织激肽释放酶或其变体或活性片段的治疗有效量为每个给药频率约0.001-约1000IU。17.一种配制用于口服给药的药物组合物，其每个给药频率含有约0.001-约1000IU的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。18.一种配制用于鼻内给药的药物组合物，其每个给药频率含有约0.001-约5000IU的组织激肽释放酶或其变体或活性片段，以及一种药学可接受的赋形剂。19.根据权利要求18的药物组合物，其中所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段与一种佐剂结合。20.根据权利要求19的药物组合物，其中所述佐剂是一种乳化剂。21.根据权利要求18的药物组合物，其中所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段与亲脂性胶束结合。22.根据权利要求17-21任一项的药物组合物，还包含第二种用于治疗阿尔茨海默病或遗忘性轻度认知缺损的治疗性化合物。23.根据权利要求22的药物组合物，其中所述第二种治疗性化合物包括一种乙酰胆碱前体、一种增强乙酰胆碱释放的化合物、一种乙酰胆碱酯酶抑制剂、一种毒蕈碱激动剂、一种抗氧化剂、一种抗炎药、一种激素、一种钙通道阻滞剂、神经生长因子、一种益智剂、一种神经营养因子小分子模拟物、NMDA受体拮抗剂、一种5-HT1A受体激动剂、一种抗淀粉样蛋白生成剂、一种抗组胺药、一种甲磺酸双氢麦角碱、银杏或石杉碱甲。24.权利要求23的药物组合物，其中所述乙酰胆碱酯酶前体选自胆碱、卵磷脂或乙酰-1-肉毒碱。25.权利要求23的药物组合物，其中所述增强乙酰胆碱释放的化合物为4-氨基吡啶或利诺吡啶。26.权利要求23的药物组合物，其中所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自毒扁豆碱、他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏、敌百虫、石杉碱甲或依斯的明。27.权利要求23的药物组合物，其中所述毒蕈碱激动剂选自米拉美林、咕诺美林、槟榔碱、氧化震颤素、沙可美林或他沙利定。28.权利要求23的药物组合物，其中所述抗氧化剂选自维生素E、艾地苯醌、辅酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或维生素C。29.权利要求23的药物组合物，其中所述抗炎药是一种非留类抗炎药。30.权利要求23的药物组合物，其中所述激素是雌激素或睾酮。31.权利要求23的药物组合物，其中所述益智剂是吡拉西坦。32.权利要求23的药物组合物，其中所述甲磺酸双氢麦角碱是氢化麦角碱。33.组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于制备治疗(a)阿尔茨海默病或其症状，或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的药物的应用。34.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于治疗(a)阿尔茨海默病或其症状，或(b)遗忘性轻度认知缺损或其症状的应用。35.根据权利要求34的应用，其中所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段的应用还包括与第二种用于治疗阿尔茨海默病或治疗遗忘性轻度认知缺损的治疗性化合物共同使用。36.权利要求35的应用，其中所述第二种治疗性化合物包括一种乙酰胆碱前体、一种增强乙酰胆碱释放的化合物、一种乙酰胆碱酯酶抑制剂、一种毒蕈碱激动剂、一种抗氧化齐U、一种抗炎药、一种激素、一种钙通道阻滞剂、神经生长因子、一种益智剂、一种神经营养因子小分子模拟物、NMDA受体拮抗剂、一种5-HT1A受体激动剂、一种抗淀粉样蛋白生成剂、一种抗组胺药、一种甲磺酸双氢麦角碱、银杏或石杉碱甲。37.权利要求36的应用，其中所述乙酰胆碱酯酶前体选自胆碱、卵磷脂或乙酰-1-肉毒碱。38.权利要求36的应用，其中所述增强乙酰胆碱释放的化合物为4-氨基吡啶或利诺吡啶。39.权利要求36的应用，其中所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自毒扁豆碱、他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏、敌百虫、石杉碱甲或依斯的明。40.权利要求36的应用，其中所述毒蕈碱激动剂选自米拉美林、咕诺美林、槟榔碱、氧化震颤素、沙可美林或他沙利定。41.权利要求36的应用，其中所述抗氧化剂选自维生素E、艾地苯醌、辅酶Q-10、η-乙酰半胱氨酸或维生素C。42.权利要求36的应用，其中所述抗炎药是一种非留类抗炎药。43.权利要求36的应用，其中所述激素是雌激素或睾酮。44.权利要求36的应用，其中所述益智剂是吡拉西坦。45.权利要求36的应用，其中所述甲磺酸双氢麦角碱是氢化麦角碱。46.根据权利要求34-45任一项的应用，其中治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段被配制用于鼻内给药。47.根据权利要求46的应用，其中所述治疗有效剂量为每个给药频率约0.001-约5000IU。48.根据权利要求34-45任一项的应用，其中治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段被配制用于口服给药。49.根据权利要求48的应用，其中所述组织激肽释放酶或其变体或活性片段的治疗有效量为每个给药频率约0.001-约1000IU。50.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于在需要治疗的患者体内消化或切割淀粉样蛋白的应用。51.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要治疗的患者的神经脉管系统的应用。52.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要治疗的患者的脑部氧摄取的应用。53.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要治疗的患者的脑部血流的应用。54.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要治疗的患者脑中斑块清除的应用。55.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于改善需要治疗的患者的脑部葡萄糖摄取的应用。56.治疗有效量的组织激肽释放酶或其变体或活性片段用于降低需要治疗的患者脑中tau磷酸化的应用。全文摘要本发明涉及治疗阿尔茨海默病或其症状以及遗忘性轻度认知缺损或其症状的方法。本发明的方法包括给予治疗有效量的组织激肽释放酶、其变体或其活性片段。本发明还涉及组织激肽释放酶或者其变体或活性片段用于消化或切割淀粉样蛋白的应用和治疗会受益于对淀粉样蛋白的消化或切割的病症的应用。本发明还涉及配制用于口服或鼻内给药的包含治疗有效量的组织激肽释放酶、其变体或其活性片段的药物组合物。文档编号A61K38/48GK101801406SQ200880107033公开日2010年8月11日申请日期2008年7月18日优先权日2007年7月20日发明者M·威廉姆斯申请人:基因塞斯投资有限公司